B e s c h r e i b u n g

Die Erfindung betrifft einen Inhibitor für den nuklearen Transkriptionsfaktor kappa B (NFKB).

Der nukleare Transkriptionsfaktor kappa B - kurz NFKB - fördert Tumorwachstum und Metastasierung, spielt eine Rolle in der Pathogenese chronisch entzündlicher Darmerkrankungen, ischämischer Erkrankungen, Kachexie, sowie bei Autoimmunerkrankungen und bei der Regulation der Expression des HIV-I Gens. NFKB ist ein Heterodimer, bestehend aus den Proteinuntereinheiten p50 und p65. Im inaktiven Zustand liegt NFKB gebunden an seinen inhibierenden Proteinkomplex I-AB im Cytosol vor. Zur Aktivierung von NFKB wird I-AB nach Phosphorylierung durch IKB Kinase-Komplexe (IKK) mittels des 26-S Proteasoms abgebaut und NFKB wird freigesetzt. Anschließend gelangt NFKB in den Zellkern, wo es an die DNA bindet und die Transkription aktiviert. Auf diese Weise werden überwiegend Gene exprimiert, welche für die Bildung von proinflammatorischen Zytokinen (TNF-α, Interleukine), induzierbarer Stickstoffmonoxidsynthase (iNOS), Adhäsionsmolekülen und für Proteine mit anti-apoptotischer Wirkung (sogenannte antiapoptotische Mediatoren) kodieren. Antiapoptotische Mediatoren spielen eine Rolle bei der Ausbildung von Apoptoseresistenz und der damit verbundenen Entstehung bestimmter Tumoren.

Im Stand der Technik werden bereits verschiedene Substanzen zur Hemmung der NFKB Aktivierung eingesetzt. Diese Substanzen hemmen entweder die Translokation von NFKB in den Zellkern, oder die DNA-Bindung oder die Transaktivierung von NFKB, ihre Wirkung ist jedoch insbesondere hinsichtlich der Spezifität nicht (voll) zufriedenstellend. Der vorliegenden Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, einen neuen NFKB- Inhibitor bereitzustellen, der spezifisch und effektiv die NFKB- Aktivierung und/oder NFκB-Aktivität hemmt.

Eine Lösung dieser Aufgabe besteht in der Angabe der Substanz Tyrosinkinase TNKl zur Verwendung als Inhibitor der Transaktivierung von NFKB in eukaryontischen Zellen.

Die Tyrosinkinase TNKl ist eine Tyrosinkinase, die urprünglich aus foetalen CD34+/Lin-/CD38-B-Zell Vorläufern isoliert wurde (Hoehn et al. 1996). TNKl ist überwiegend in embryonalen Geweben im Rahmen der Organogenese/-differenzierung exprimiert, sowie in einigen Tumorzellen und fetalem Blut (Hoehn et al., 1996, Brey, A., Adler G., SeufFerlein T., unveröffentlichte Daten). TNKl hat ein Molekulargewicht von 72 kDa und wird in die ACK Familie der Tyrosinkinasen eingruppiert. Die Kinase besitzt die für diese Familie typische Anordnung von Subdomänen, bei der die Kinasedomäne am N-Terminus lokalisiert ist. Darüber hinaus befinden sich C-terminal zwei putative Proteininteraktionsdomänen (src homology domain 3 und proline rieh strefc/2-Domänen, Sequenz siehe Anhang 2). Die Aktivierung/Autophosphorylierung von TNKl erfolgt bereits bei deren Expression. Als Interaktionspartner von TNKl wurde bislang die SH3 Domäne von PLCgammal etabliert (Felschow et al, 2000). Die Aktivität der Kinase wird durch endogene Faktoren nicht wesentlich moduliert (Hoehn et al., 1996).

Die Erfindung basiert auf der überraschenden Erkenntnis, daß der Transkriptionsfaktor NFKB durch diese Tyrosinkinase TNKl in seiner Wirkung gehemmt werden kann. Es konnte ein in vitro Modell etabliert werden, das im wesentlichen aus humanen embryonalen Nierenzellen HEK293 besteht, in denen TNKl durch Tetrazyklin induzierbar exprimiert wird. (Da TNKl normalerweise kaum in HEK293 Zellen exprimiert wird, entspricht diese induzierte Expression von TNKl quasi einer de novo Expression). Die Zellen zeigen bei Expression von TNKl ein verlangsamtes Zellwachstum und eine Abnahme der Zellzahl. Als Target für die TNKl Wirkung wurde der NFKB Signalweg identifiziert: TNKl hemmt durch Phosphorylierung von Tyrosinresten der p65-Untereinheit des NFκB-Dimers dessen Transaktivierungseigenschaften. Die Bindung von NFKB an die DNA wird durch TNKl dagegen nicht gehemmt. Es wurde zudem eine hohe Wirkungsspezifität der TNKl festgestellt, nämlich eine selektive Wirkung auf NFKB, während andere Transkriptionsfaktoren von TNKl in ihrer Wirkung nicht beeinflußt werden.

Die erfindungsgemäße Verwendung von TNKl als Inhibitor des Transkriptionsfaktors NFKB eröffnet ein völlig neues Prinzip zur Therapie von Erkrankungen, die mit erhöhter NFκB-Aktivierung verbunden sind, d.h. die mit einer erhöhten NFKB Aktivierung einhergehen und/oder durch diese erhöhte NFKB Aktivierung entscheidend beeinflusst werden. Hierzu gehören beispielsweise Tumorwachstum und Metastasierung, chronisch entzündliche Darmerkrankungen, ischämische Erkrankungen, Kachexie, Autoimmunerkrankungen und die Regulation der Expression des fflV-1 Gens. Die erfindungsgemäße Verwendung von TNKl als Inhibitor des Transkriptionsfaktors NFKB ist daher außerdem dazu geeignet, die Wirkung einer Chemo- oder Strahlentherapie, die zu einer gegenregulatorischen Hochregulation von NFKB im Tumorgewebe führt, zu verstärken. Desweiteren ist die Verwendung von TNKl als Inhibitor des Transkriptionsfaktors NFKB auch zur Facilitierung von zellulärer Apoptose geeignet. Das heißt: zelleigene Programme, die natürlicherweise eine Apoptose auslösen, im konkreten Fall jedoch durch eine (wodurch auch immer bedingte) hohe NFKB -Aktivierung in ihrer Wirkung blockiert sind, können durch eine TNKl -induzierte Hemmung der NFKB -Aktivierung wieder planmäßig ablaufen. Die Hemmung von NFKB durch Expression von TNKl ist ausreichend, um die mRNA-Expression von NFκB-regulierten anti-apoptotischen Zielgenen wie z.B. XIAP zu inhibieren.

Eine bevorzugte Ausführungsform der erfmdungsgemäßen Verwendung ist dadurch gekennzeichnet, daß die TNK 1 mittels Gentransfer in die NFKB exprimierenden Zellen eingebracht wird. Dieser Gentransfer ist vorzugsweise induzierbaren und/oder konstitutiv, weiter vorzugsweise entweder transient oder dauernd und weiter vorzugsweise entweder viral oder nicht viral.

Die Erfindung wird im folgenden anhand von Figuren und Ausfuhrungsbeispielen näher erläutert. Bei den Figuren zeigen:

Fig. 1: Domänenstruktur von TNKl: Eine N-terminale Kinasedomäne, gefolgt von einer SH3 Domäne und einer C-terminalen Prolin-reichen Domäne.

Fig. 2: Zellwachstum von HEK293 Zellen in An-/ Abwesenheit von TNKl und unter Stimulation mit TNFα in An-/ Abwesenheit von TNKl. Zellen, die TNKl exprimieren, sind an Tag 7 nicht mehr nachweisbar, wenn sie zusätzlich mit TNFα inkubiert wurden.

Fig. 3: A: Konzentration des in den Apoptoseprozeß involvierten Enzyms Effektorcaspase 3 nach 6 und 12 Stunden [h] Inkubation mit TNFα in Zellen mit verstärkter TNK 1 Expression infolge Inkubation mit Tetracylin (Spuren "TNK") und in Zellen ohne (signifikant nachweisbare) TNK 1 Expression infolge Inkubation ohne Tetracylin (Spuren "-") B: Konzentration des 89 kDa-Fragments des DNA Reparaturenzyms PARP (PoIy ADP-Ribose Polymerase) infolge Spaltung durch die Effektorcaspase 3. Spur "-" = Zellen, die weder TNKl exprimieren, noch mit TNFα behandelt wurden Spur "TNKl" = Zellen, die TNKl exprimieren ohne TNFα Stimulation Spur "TNFα" = Zellen, die nur mit 400U/ml TNFα stimuliert wurden Spur "TNKl/ TNFα" = Zellen, die TNKl exprimieren und mit 400U/ml TNFα stimuliert wurden C: Konzentration der feien Nukleosomen (DNA-Histon-Komplexe) im Zytosol infolge des Abbaus der genomischen DNA. Spur "TNKl-/ TNFa-" = Zellen, die weder TNKl exprimieren, noch mit TNFa behandelt wurden Spur "TNK1+/ TNFa-" = Zellen, die TNKl exprimieren, ohne TNFa Stimulation Spur "TNKl-/ TNFa+" = Zellen, die nur mit 400U/ml TNFa stimuliert wurden Spur "TNKl +/ TNFa+" = Zellen, die TNKl exprimieren und mit 400U/ml TNFa stimuliert wurden

Fig. 4: Luziferase-Aktivität bzw. NFκB-Aktivität von HEK293 -Zellen, die mit dem Plasmid ρcDNA4-TO-TKNl transfiziert sind, von HEK293 -Zellen, die mit der Kinase-defizienten Plasmid-Mutante K148R-TNKl-pcDNA3 transfiziert sind, und von HEK293 -Zellen, die mit einem GAL-p65-Fusionsplasmid mit inregriertem GAL4 Luciferase Reportersystem transfiziert sind A: HEK293 Zellen wurden mit 0.1 μg/ml eines 6x HIV-NF-κB Reporter Konstrukts, 50 ng/ml eines Renilla-Plasmids und 1 μg/ml Wildtyp- bzw. K148R-TNK1 pcDNA3 Plasmids (unter der Kontrolle des CMV Promotors) für 24 h unter Verwendung von FuGene, Roche, nach Herstellerangaben transfiziert. 4h vor Zelllyse wurden die Zellen mit 400 U/ml TNFα inkubiert. Zur Messung der NF-κB Aktivität wurde der Dual-Luciferase Assay Kit (Promega) eingesetzt. B: HEK293 Zellen wurden mit 0.1 μg/ml eines NF-κB2 Reporter Konstrukts, 50 ng/ml eines Renilla-Plasmids und 1 μg/ml Wildtyp- bzw. K148R-TNK1 pcDNA3 Plasmids (unter der Kontrolle des CMV Promotors) für 24 h unter Verwendung von FuGene, Roche, nach Herstellerangaben transfiziert. 4h vor Zelllyse wurden die Zellen mit 400 U/ml TNFα inkubiert. Zur Messung der NF-κB Aktivität wurde der Dual-Luciferase Assay Kit (Promega) eingesetzt. C: HEK293 Zellen wurden mit 0.1 μg/ml eines pFR-Luc Reporter Konstrukts, 50 ng/ml eines Renilla-Plasmids, 1 μg/ml Wildtyp- bzw. K148R-TNK1 pcDNA3 Plasmids (unter der Kontrolle des CMV Promotors) sowie 0,1 μg/ml eines Galp65 Konstruktes für 24 h unter Verwendung von FuGene, Roche, nach Herstellerangaben transfiziert. Zur Messung der Aktivität des GaI- Promoters wurde der Dual-Luciferase Assay Kit (Promega) eingesetzt.

Beispiel 1: Nachweis von Tyrosinkinase TNKl als Inhibitor der Aktivität des Transkriptionsfaktor NFKB im Zellkulturmodell

A) Etablierung eines in vitro Zellkulturmodells mit humanen embryonalen Nierenzellen

Das Zellmodell besteht aus humanen embryonalen Nierenzellen HEK293, die stabil mit einem Tetrazyklin Repressor pcDNA6-TR Plasmid transfiziert sind. Eine Transfektion dieser Zellen mit dem „gene of interest" - im vorliegenden Fall: Flag-getaggte TNKl - in einem pcDNA4-TO-Plasmid erlaubt die Expression dieses Gens nach Zugabe von Tetrazyklin, da der durch das ρcDNA6-TR-Plasmid codierte Repressor des Genpromotors verdrängt wird. Die Integrität beider Plasmide bis zur chromosomalen Rekombination wird durch Zugabe selektiver Antibiotika gemäß den Angaben des Herstellers gewährleistet. Stabil mit dem Repressor transfizierte HEK293 Zellen sind kommerziell bei der Fa. Invitrogen erhältlich (T-Rex HEK293 System. Cat. No: R710- 07).

In die HEK293 Zellen wurde das aus einer humanen embryonalen Nierenzelllinie isolierte und in das pcDNA4-TO Plasmid klonierte TNKl-Protein (vgl. Fig. 1) mit der im Sequenzprotokoll SEQ ID NO: 1 dargestellten Aminosäuresequenz eingeschleust. Mit anderen Worten: diese HEK293 Zellen wurden mit einem pcDNA4-TO Plasmid transfiziert, das die im Sequenzprotokoll SEQ DD NO, 2 dargestellte c-DNA umfaßt und für das TNKl- Protein mit der im Sequenzprotokoll SEQ ID NO: 1 dargestellten Aminosäuresequenz kodiert. Anstelle der konkret genannten Aminosäuresequenz bzw. Nukleotidsequenz eignen sich auch solche Aminosäuresequenzen bzw. Nukleotidsequenzen, die zu der genannten Sequenz SEQ ID NO. 1 bzw. SEQ ID. NO. 2 wenigstens 90 % Homologie im Bereich der Kinasedomäne aufweisen und ein funktionelles Protein hervorbringen (bilden), das hinsichtlich seiner physiologischen Funktion und Wirkung mit der Tyroxinkinase TNK 1 übereinstimmt. Die Transfektion erfolgte mit den im Stand der Technik bekannten Verfahren der Lipid-basierten Transfektion. Vorzugsweise wurden die HEK293 Zellen mit dem Lipid-basierten Transfektionsreagenz FuGene (Roche) nach den Angaben des Herstellers mit lμg/ml ρcDNA4-TO-TNKl transfiziert.

Durch Zugabe/Verabreichung von Tetrazyklin war in diesen Zellen die Expression der TNKl induzierbar.

B) Wirkung der TNKl -Expression

In dem unter (A) beschriebenen Zellkulturmodell wird die TNKl-Expression durch die Zugabe von Tetrazyklin zum Kulturmedium (Endkonzentration: lμg/ml) induziert. Da TNKl normalerweise kaum in HEK293 Zellen exprimiert wird, entspricht diese induzierte signifikant starke Expression von TNKl quasi einer de novo Expression Die erfolgreich induzierte Expression von TNKl ist über die Detektion des N-terminalen Flag-Tags (Flag-TNKl) mittels eines kommerziell erhältlichen anti-Flag Antikörpers (Sigma) nachweisbar. Die signifikant stark TNKl exprimierenden Zellen zeigen ein verlangsamtes Zellwachstum und eine Abnahme der Zellzahl (siehe Fig. 2), Bei gleichzeitiger Inkubation dieser (Tetracyclin-induzierten und infolgedessen) stark TNKl exprimierenden Zellen mit dem Zytokin TNFςx, kommt es zu einem wesentlich verstärkten Zelluntergang /Apoptose ( programmierten Zellsterben), während bei einer Inkubation von nicht induzierten Zellen ohne (signifikante) TNK 1 -Expression mit TNFα kein Zelluntergang (programmiertes Zellsterben)/ keine Apoptosse feststellbar ist (siehe Fig. 2). Als Ursache für den Zelluntergang nach Inkubation und damit Stimulation mit TNFα wurde die Induktion von Apoptose identifiziert, und zwar (A) anhand des Anstiegs der Konzentration bzw. der Aktivität des in den Apoptoseprozeß involvierten Enzyms Effektorcaspase 3, (B) anhand des Ausmaß der Spaltung des DNA Reparaturenzyms PARP (PoIy ADP-Ribose Polymerase) durch die Effektorcaspase 3, die das 116 kDa große Protein in zwei Fragmente von 89 kDa und 24 kDa spaltet und dadurch inaktiviert und (C) anhand des Abbaus bzw. der Fragmentierung genomischer DNA bzw. des daraus resultierenden Anstiegs freier Nukleosomen im Zytosol.

Der Apoptoseprozess wird von hierarchisch angeordneten Faktoren gesteuert, die über die Aktivierung von spezifischen Nukleasen und Proteasen, darunter auch die Effektorcaspase 3, den Abbau der Zellen bewirkt. Der Anstieg der Konzentration aktiver und damit gespaltener Caspase 3 in den Zellen (als Maß für die Aktivität dieses Enzyms) wurde mittels der dem Fachmann bekannt und geläufigen Methodik der SDS- Polyacrylamid-Gelelektrophorese nachgewiesen. Aus den in Fig. 3 A dargestellten Ergebnissen ist ersichtlich, daß die Konzentration/ Aktivität der Effektorcaspase 3 in den Tetrazyklin-induzierten und damit verstärkt TNKl-exprimierenden Zellen bereits nach 6 - 8 h deutlich höher war als in den Kontrollzellen ohne Tetrazyklin-Induktion. Die Spaltung der PARP wurde anhand der Spaltprodukte, nämlich des 89 kDa- Fragments der mit der dem Fachmann bekannten und geläufigen Western-Blot- Analyse unter Einsatz (im Handel erhältlicher) PARP-spezifischer Antikörper nachgewiesen Fig. 3 B). Aus Fig. 3 B ist ersichtlich, daß in den Zellen, in denen ein Anstieg der Effektorcaspase-3 -Konzentration/Aktivität zu beobachten ist, auch eine Spaltung des DNA Reparaturenzyms PARP in seine Untereinheiten auftritt. Die Fragmentierung der genomischer DNA in frei Nukleosomen (DNA-Histon- Komplexe) wurde mittels der dem Fachmann bekannt und geläufigen Methodik des Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) unter Verwendung spezifischer Antikörper gegen DNA/Histon-Komplexe nachgewiesen (Fig. 3 C). Aus Fig. 3 C ist ersichtlich, wie die Konzentration der freien Nukleosomen (DNA-Histon-Komplexe) im Zytosol in denjenigen Zellen, die ohne TNFα-Stimulation TNKl exprimieren (Spur "TNK1+/ TNFa-") etwa doppelt so groß ist wie Zellen, die weder TNKl exprimieren, noch mit TNFα behandelt wurden (Spur "TNKl-/ TNFα -"). In denjenigen Zellen, die nur mit 400U/ml TNFα stimuliert wurden (Spur "TNKl-/ TNFa+"), ist die Konzentration der freien Nukleosomen (DNA-Histon-Komplexe) im Zytosol etwa 8 mal so groß wie in denjenigen Zellen, die weder TNKl exprimieren, noch mit TNFα behandelt wurden (Spur "TNKl-/ TNFα -"), und in denjenigen Zellen, die TNKl exprimieren und mit 400U/ml TNFα stimuliert Λvurden (Spur "TNK1+/ TNFa+") etwa 15 mal so groß.

In allen Fällen ist die Apoptose in Zellen, die TNKl exprimieren (also mit dem Plasmid pcDNA4-TO transfiziert sind und in Anwesenheit von Tetracyclin inkubiert werden/wurden), deutlich höher als in den Kontrollzellen ohne (verstärkte ) Induktion der TNK 1 Expression (also Zellen, die zwar mit dem Plasmid pcDNA4-TO transfiziert sind, jedoch in Anwesenheit von Tetracyclin inkubiert werden/wurden).

Da TNKl alleine per se keine zelluläre Apoptose induziert sondern ein Modulator der TNFa-abhängigen pro- und anti-apoptotischen Signalwege ist, folgt aus den dargestellten Befunde, daß die Induktion der Apoptose durch TNFα über eine TNKl vermittelte NFκB-Blockierung erfolgt.

C) Nachweis des NFKB Signalwegs als Target für die TNKl Wirkung

In dem unter (A) beschriebenen und gemäß (B) zur verstärkten TKNl -Expression induzierten Zellkulturmodell wurden die HEK293 Zellen mit 0.1 μg/ml eines 6x HTV- NFKB Reporter-Promotor-Konstrukts (= artifizieller 6x HIV- bzw. NFκB-Promotor, dessen Aktivität direkt mit dem "Report" - hier der Aktivität der Luciferase - korreliert) 50 ng/ml eines Renilla-Plasmids und 1 μg/ml des TNKl-pcDNA3 Plasmids (unter der Kontrolle des CMV Promotors) transfiziert (FuGene, Roche). Parallel dazu wurden als Kontrolle (I) HEK293 Zellen mit 0.1 μg/ml eines 6x HTV- NFKB Reporter Konstrukts (artifizieller Promotor), 50 ng/ml eines Renilla-Plasmids und 1 μg/ml der Kinase-defizienten Plasmid-Mutante K148R-TNKl-pcDNA3 transfiziert. Ebenfalls parallel dazu wurde als Kontrolle (II) ein GAL-p65-Fusionsplasmid mit inregriertem GAL4 Luciferase Reportersystem konstruiert, in HEK293 Zellen transient transfiziert und untersucht. Vorzugsweise wurde hierfür das im Handel erhältliche Dual- Luciferase Assay Kit (Promega) eingesetzt. Bei diesem System bzw. Konstrukt erfolgt die Promotoraktivierung unter Umgehung der NFKB spezifischen Ko-Faktoren, indem eine an die p65-Untereinheit von NFKB fusionierte GAL4-DNA-Bindungsdomäne mit einem GAL4 Bindungselement auf dem Reporter in Interaktion tritt. Mit anderen Worten: in diesem System wird der NFKB Transkriptionskomplex umgangen, da die Protein/DNA Interaktion über das GAL4/Gal-Promotor System erfolgt. Die beobachteten Effekte sind folglich auf die Modifikation der Transaktivierungsdomäne von p65 zurückzuführen und nicht auf eine Änderung der Zusammensetzung des NFKB Transkriptionskomplexes, die die Protein/DNA Interaktion beeinträchtigt. Zur Messung der NFKB Aktivität wurde der Dual-Luciferase Assay Kit (Promega) eingesetzt. Die Ergebnisse dieses Luciferase Assays sind in Fig.4 graphisch dargestellt. Fig. 4 A zeigt die Luciferaseaktivität und damit die Pomotoraktivität derjenigen HEK293 Zellen, die mit 0.1 μg/ml eines 6x HIV-NF-κB Reporter-Promotor- Konstrukts, 50 ng/ml eines Renüla-Plasmids und 1 μg/ml Wildtyp- bzw. K148R-TNK1 pcDNA3 Plasmids (unter der Kontrolle des CMV Promotors) transfiziert und 4h vor der Zelllyse mit 400 U/ml TNFα inkubiert wurden. Fig. 4 B zeigt die Luciferaseaktivität und damit die Pomotoraktivität derjenigen HEK293 Zellen, die mit 0.1 μg/ml eines NF-κB2 Reporter-Promotor-Konstrukts, 50 ng/ml eines Renilla-Plasmids und 1 μg/ml Wildtyp- bzw. K148R-TNK1 ρcDNA3 Plasmids (unter der Kontrolle des CMV Promotors) transfiziert und 4h vor der Zelllyse mit 400 U/ml TNFα inkubiert wurden. Fig. 4 C zeigt die Luciferaseaktivität und damit die Pomotoraktivität derjenigen HEK293 Zellen, die mit 0.1 μg/ml eines pFR-Luc Reporter-Konstrukts, 50 ng/ml eines Renilla-Plasmids, 1 μg/ml Wildtyp- bzw. K148R-TNK1 ρcDNA3 Plasmids (unter der Kontrolle des CMV Promotors) sowie 0,1 μg/ml eines Galp65 Konstruktes transfiziert wurden.

Aus Fig. 4 A und Fig. 4 B ist ersichtlich, daß infolge der verstärkten TNKl Expression die TNFα-abhängige, NFκB-vermittelte Transaktivierung des artifiziellen (6x HIV- Reporter; Fig. A) und des endogenen Promoters (NFκB2-Promotor; Fig. B) dereguliert (negativ reguliert, gehemmt) ist bzw. die transkriptionelle Aktivität von NFKB reprimiert, d.h. gehemmt oder ganz unterdrückt ist. Mit anderen Worten: Die Lipid-basierte Transfektion von TNKl in HEK293 Zellen fuhrt nach TNFα Stimulation 2x1 einer signifikanten Hemmung der Luciferaseaktivität sowohl eines artifiziellen (6x HIV-Promotor; Fig. 4 A) als auch eines natürlichen NFKB Promotor-Reportersystems (NFκB2-Promotor; Fig. 4 B). In allen Fällen zeigt die Kinase-defiziente Mutante K148R einen deutlich geringeren oder nicht nachweisbaren negativ-regulatorischen Effekt. Dies weist auf eine funktionelle Bedeutung der Kinaseaktivität von TNKl für die negative Regulation der TNF α-induzierten NF-κB Aktivität hin.

Stromaufwärts im NFKB Signalweg liegende Ereignisse wie z.B. die Ubiquitinierung von IkappaB alpha werden dagegen gemäß der ermittelten Daten durch die Expression von TNKl nicht gehemmt. Die Hemmung des NFKB Signalwegs erfolgt somit direkt durch Modulation der transkriptionellen/transaktivierenden Eigenschaften und nicht durch Modulation an aktivatorischen/inhibitorischen Ereignissen im Zytoplasma vor der Freisetzung von NFKB aus dem retendierenden IkB Komplex.

Die in Fig. 4 C dargestellten Ergebnisse zeigen weiter, daß der negativ regulatorische (reprimierende) Effekt infolge Tetrazyklin-induzierter und damit einsetzender Expression von TNKl auch bei dem GAL-p65-Fusionsplasmid nachweisbar ist, d.h. also auch dann, wenn die nativen Bestandteile des NFKB Transkriptionskomplexes umgangen werden (Kontrolle II), Damit kann eine Beteiligung von Ko-Faktoren des NFKB Transkriptionskomplexes bei der Inhibitor-Wirkung von TNKl auf NFKB ausgeschlossen werden.

Bei den mit der Kinase-defizienten Plasmid-Mutante K148R-TNK1 transfizierten HEK293 Zellen war kein negativer regulatorischer Effekt zu nachweisbar. Die Kinase- Aktivität ist folglich essentiell für die inhibitorischeWirkung von TNKl auf NFKB. Mit anderen Worten: Der reprimierende Effekt von TNKl auf NFKB ist auf die Tyrosinkinase-Aktivität zurückzuführen, wobei eine Phosphorylierung von Tyrosinresten potentieller Substrate besonders in Betracht kommt (D) Nachweis der inhibitorischen Wirkung von TNKl auf die p65-Untereinheit des NFκB-Dimers vermittels Tyrosinphosphorylierung Die gewonnen Ergebnisse zeigen, daß TNKl nicht die Bindung von NFKB an die DNA hemmt. Daraus folgt, daß die Repression der transkriptioneilen Aktivität von NFKB durch TNKl nicht über eine verminderte Bindung des Transkriptionsfaktors an die DNA vermittelt, sondern sehr wahrscheinlich über eine Modifikation der Transaktivierungsdomäne von p65 herbeigeführt wird.

Bei den mit der Kinase-defizienten Plasmid-Mutante K148R-TNK1 transfizierten HEK293 Zellen war kein wesentlicher reprimierender Einfluss auf die transkriptionelle Aktivität von NFKB nachweisbar. Daraus folgt, dass die Tyrosinkinaseaktivität von TNKl für den NFκB-inhibierenden Effekt erfoderlich ist, zumal in der Transaktivierungsdomäne von p65 mehrere Tyrosine vorhanden sind. HEK293 Zellen, die TNKl exprimieren zeigen eine massive Tyrosinphosphorylierung von endogenem NFKB p65, sowie von ko-transfϊziertem p65-YFP und einer p65-YFP- Deletionsmutante, die nur noch aus der Transaktivierungsdomäne besteht. Hierfür wurde eine Immunpräzipitation mit einem anti-p65 bzw. anti-GFP Antiörper durchgeführt und anschließend die Tyrosinphosphorylierung mittels eines anti-pY Antikörpers detektiert (Upstate, anti-pY, Klon 4Gl 0),

Die Zusammensetzung des heterodimeren NF-DB Transkriptionsfaktorkomplexes bleibt unter Expression von TNKl konstant. Die ermittelten und hier angegebenen Daten zur funktionellen Relevanz der Tyrosinkinaseaktivität von TNKl für die TNFα- induzierte NF-κB Aktivierung sowie die Tatsache, dass TNKl eine Tyrosinphosphorylierung von p65 induziert, weisen darauf hin, dass durch Mutagenese spezifischer Tyrosinreste an p65 eine Hemmung der transkriptionellen Aktivität des Transkriptionsfaktors NF-κB erzielt werden kann. Beispiel 2: Einsatz von TNKl als neues Prinzip zur Therapie von Erkrankungen, die mit erhöhter NFKB Aktivierung einhergehen bzw. durch erhöhte NFKB Aktivierung unterhalten werden

Es sind zahlreiche Erkrankungen bekannt, die mit einer erhöhten NPKB Aktivierung einhergehen und durch diese erhöhte NFKB Aktivierung entscheidend beeinflusst werden, Hierzu gehören Tumorwachstum und Metastasierung, chronisch entzündliche Darmerkrankungen, ischämische Erkrankungen, Kachexie, Autoimmunerkrankungen und die Regulation der Expression des HTV-I -Gens. Diese Krankheiten können durch einen induzierbaren, konstitutiven, transienten oder dauernden, viralen oder nicht viralen Gentransfer von TNKl beeinflusst werden, d.h. die erfindungsgemäße Verwendung von TNKl ermöglicht eine Therapie dieser Krankheiten. Durch den Einsatz von TNKl und die damit induzierte NFκB-Blockierung können zelleigene Programme, die eigentlich Apoptose auslösen, jedoch durch eine begleitende hohe NFκB-Aktivierung in ihrer Wirkung gehemmt sind, wieder in Gang gebracht, d.h. proapoptotisch wirksam gemacht werden.

Die erfindungsgemäße Verwendung von TNKl, d.h. die Durchführung eines induzierbaren, konstitutiven, transienten oder dauernden, viralen oder nicht viralen Gentransfers von TNKl ist außerdem dazu geeignet, die Wirkung einer Chemo- oder Strahlentherapie, die zu einer gegenregulatorischen Hochregulation von NFKB im Tumorgewebe führt, zu verstärken.

Ferner haben weitergehende Experimente in unterschiedlichen Tumorzellmodellen gezeigt, dass die Expression von TNKl zur Hemmung der in zahlreichen Tumorzellen zu beobachtenden konstitutiven NFKB Aktivierung führt und die betreffenden Zellen susceptibel für zytotoxische Therapieansätze macht. Literatur:

Felschow DM, Civin CI, Hoehn GT. Characterization of the tyrosine kinase Tnkl and its binding with phospholipase C-gammal. Biochem Biophys Res Commun. 2000;273:294-301.

Hoehn GT, Stokland T, Amin S, Ramirez M, Hawkins AL, Griffin CA, Small D, Civin CI. Tnkl: a novel intracellular tyrosine kinase gene isolated from human umbilical cord blood CD34+/Lin-/CD38- stem/progenitor cells. Oncogene. 1996;12:903-13.