<1>本発明の細菌
 本発明の細菌は、L-システイン生産能を有� �、かつ、tolC遺伝子によりコードされるタン� ��ク質の活性が増大するように改変された腸� ��細菌科に属する細菌である。ここで、L-シ� �テイン生産能とは、本発明の細菌を培地中� �培養したときに、培地中または菌体内にL-シ ステインを生成し、培地中または菌体から回 収できる程度に蓄積する能力をいう。また、 L-システイン生産能を有する細菌とは、野生� ��または親株よりも多い量のL-システインを� �産し培地に蓄積することができる細菌を意� �し、好ましくは、0.05g/L以上、より好ましく� ��0.1g/L以上、特に好ましくは0.2g/L以上の量のL -システインを生産し培地に蓄積することが� �きる微生物を意味する。

 微生物が産生したL-システインは、培地� �で、ジスルフィド結合によって一部がL-シス チンに変換することがある。また、後述する ように、L-システインと培地に含まれるチオ� ��酸との反応によってS-スルホシステインが� �成することがある(Szczepkowski T.W., Nature, vol. 182 (1958))。さらに、細菌の細胞内で生成した L-システインは、細胞中に存在するケトン又� ��アルデヒド、例えばピルビン酸と縮合し、� ��ミチオケタールを中間体としてチアゾリジ� ��誘導体が生成することがある(特許第2992010� �参照)。こられのチアゾリジン誘導体及びヘ� ��チオケタールは、平衡混合物として存在す� ��ことがある。したがって、L-システイン生� �能とは、L-システインのみを培地中又は菌体 内に蓄積する能力に限られず、L-システイン� ��加えて、L-シスチン、又はそれらの誘導体� �しくは前駆体、又はこれらの混合物を培地� �に蓄積する能力も含まれる。前記L-システイ ン又はL-シスチンの誘導体としては、例えばS -スルホシステン、チアゾリジン誘導体、及� �ヘミチオケタール等が挙げられる。また、L- システイン又はL-シスチンの前駆体としては� ��例えばL-システインの前駆体であるO-アセチ ルセリンが挙げられる。L-システイン又はL-� �スチンの前駆体には、前駆体の誘導体も含� �れ、例えばO-アセチルセリンの誘導体である N-アセチルセリン等が挙げられる。

 O-アセチルセリン(OAS)はL-システイン生合� ��の前駆体物質である。OASは細菌や植物の代� ��物質であり、セリンアセチルトランスフェ� ��ーゼ(SAT)の酵素反応によりL-セリンのアセチ ル化によって生じる。OASは細胞内で更にL-シ� ��テインへと変換される。

 L-システイン生産能を有する細菌として� �、本来的にL-システイン生産能を有するもの であってもよいが、下記のような微生物を、 変異法や組換えDNA技術を利用して、L-システ� ��ン生産能を有するように改変したものであ� ��てもよい。尚、本発明においてL-システイ� �とは、特記しない限り、還元型L-システイン 、L-シスチン、前記のような誘導体もしくは� ��駆体、またはこれらの混合物を指すことが� ��る。

 本発明に用いる細菌としては、エシェリ� ��ア属、エンテロバクター属、パントエア属� ��クレブシエラ属、セラチア属、エルビニア� ��、サルモネラ属、モルガネラ属など、腸内� ��菌科に属する細菌であって、L-アミノ酸を� �産する能力を有するものであれば、特に限� �されない。具体的にはNCBI(National Center for B iotechnology Information)データベースに記載され� ��いる分類により腸内細菌科に属するものが� ��用できる(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/ wwwtax.cgi?id=91347)。改変に用いる腸内細菌科の� ��株としては、中でもエシェリヒア属細菌、� ��ンテロバクター属細菌、パントエア属細菌� ��エルビニア属、エンテロバクター属、又は� ��レブシエラ属を用いることが望ましい。

 エシェリヒア属細菌としては、特に限定� ��れないが、具体的にはNeidhardtらの著書(Backma nn, B. J. 1996. Derivations and Genotypes of some m utant derivatives of Escherichia coli K-12, p. 2460-2 488. Table 1. In F. D. Neidhardt (ed.), Escherichia� �coli and Salmonella Cellular and Molecular Biology/Se cond Edition, American Society for Microbiology Press,  Washington, D.C.)に挙げられるものが利用でき� ��。その中では、例えばエシェリヒア・コリ� ��挙げられる。エシェリヒア・コリとしては� ��体的には、プロトタイプの野生株K12株由来� ��エシェリヒア・コリ W3110 (ATCC 27325)、エシ ェリヒア・コリ MG1655 (ATCC 47076)等が挙げら� ��る。

 これらを入手するには、例えばアメリカ� ��・タイプ・カルチャー・コレクション(住所  12301  Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852P.O.  Box 1549, Manassas, VA 20108, United States of Ame rica)より分譲を受けることが出来る。すなわ� ��各菌株に対応する登録番号が付与されてお� ��、この登録番号を利用して分譲を受けるこ� ��が出来る(http://www.atcc.org/参照)。各菌株に対 応する登録番号は、アメリカン・タイプ・カ ルチャー・コレクションのカタログに記載さ れている。

 エンテロバクター属細菌としては、エン� ��ロバクター・アグロメランス(Enterobacter aggl omerans)、エンテロバクター・アエロゲネス(Ent erobacter aerogenes)等、パントエア属細菌として はパントエア・アナナティス(Pantoea ananatis)� �挙げられる。尚、近年、エンテロバクター� �アグロメランスは、16S rRNAの塩基配列解析� �どにより、パントエア・アグロメランス(Pant oea agglomerans)又はパントエア・アナナティス( Pantoea ananatis)、パントエア・スチューアルテ ィ(Pantoea stewartii)に再分類されているものが� ��る。本発明においては、腸内細菌科に分類� ��れるものであれば、エンテロバクター属又� ��パントエア属のいずれに属するものであっ� ��もよい。

 特に、パントエア属細菌、エルビニア属� ��菌、エンテロバクター属細菌は、γ-プロテ� ��バクテリアに分類される細菌であり、分類� ��的に非常に近縁である(J Gen Appl Microbiol 19 97 Dec;43(6) 355-361, International Journal of Systema tic Bacteriology, Oct. 1997,p1061-1067)。近年、DNA-DN Aハイブリダイゼーション実験等により、エ� �テロバクター属に属する細菌には、パント� �ア・アグロメランス(Pantoea agglomerans)又はパ� ��トエア・ディスパーサ(Pantoea dispersa)等に再 分類されているものがある(International Journal� �of Systematic Bacteriology, July 1989;39(3).p.337-345)� ��また、エルビニア属に属する細菌にはパン� ��エア・アナナス(Pantoea ananas)、パントエア� �スチューアルティに再分類されているもの� �ある(International Journal of Systematic Bacteriology , Jan 1993;43(1), p.162-173 参照)。

 エンテロバクター属細菌としては、エンテ� ��バクター・アグロメランス(Enterobacter agglome rans)、エンテロバクター・アエロゲネス(Entero bacter aerogenes)等が挙げられる。具体的には、 欧州特許出願公開952221号明細書に例示された 菌株を使用することが出来る。
 エンテロバクター属の代表的な株として、� ��ンテロバクター・アグロメランスATCC12287株� ��挙げられる。

 パントエア属細菌の代表的な菌株として、� ��ントエア・アナナティス、パントエア・ス� ��ューアルティ(Pantoea stewartii)パントエア・� �グロメランス、パントエア・シトレア(Pantoea  citrea)が挙げられる。
 パントエア・アナナティスとして具体的に� ��、パントエア・アナナティスAJ13355株、SC17� �が挙げられる。SC17株は、静岡県磐田市の土� ��から、低pHでL-グルタミン酸及び炭素源を含 む培地で増殖できる株として分離された株AJ1 3355(FERM BP-6614)から、粘液質低生産変異株と� �て選択された株である(米国特許第6,596,517号) 。
 パントエア・アナナティスAJ13355株は、平成 10年2月19日に、通産省工業技術院生命工学工� ��技術研究所(現名称、産業技術総合研究所特 許生物寄託センター、住所 郵便番号305-8566  茨城県つくば市東1丁目1番地1中央第6)に、受� ��番号FERM P-16644として寄託され、平成11年1月 11日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移� ��され、受託番号FERM BP-6614が付与されている 。尚、同株は、分離された当時はエンテロバ クター・アグロメランス(Enterobacter agglomerans) と同定され、エンテロバクター・アグロメラ ンスAJ13355として寄託されたが、近年16S rRNA� �塩基配列解析などにより、パントエア・ア� �ナティス(Pantoea ananatis)に再分類されている� ��

 エルビニア属細菌としては、エルビニア� ��アミロボーラ、エルビニア・カロトボーラ� ��挙げられ、クレブシエラ属細菌としては、� ��レブシエラ・プランティコーラが挙げられ� ��。

 以下、腸内細菌科に属する細菌にL-シス� �イン生産能を付与する方法、又はこれらの� �菌のL-システイン生産能を増強する方法につ いて述べる。

 細菌にL-システイン生産能を付与するに� �、栄養要求性変異株、アナログ耐性株又は� �謝制御変異株の取得や、L-システインの生合 成系酵素の発現が増強された組換え株の創製 等、従来、コリネ型細菌又はエシェリヒア属 細菌等の育種に採用されてきた方法を適用す ることができる(アミノ酸発酵、(株)学会出版 センター、1986年5月30日初版発行、第77-100頁� �照)。ここで、L-システイン生産菌の育種に� �いて、付与される栄養要求性、アナログ耐� �、代謝制御変異等の性質は、単独でもよく� �2種又は3種以上であってもよい。また、発現 が増強されるL-システイン生合成系酵素も、� ��独であっても、2種又は3種以上であっても� �い。さらに、栄養要求性、アナログ耐性、� �謝制御変異等の性質の付与と、生合成系酵� �の増強が組み合わされてもよい。

 L-システイン生産能を有する栄養要求性� �異株、L-システインのアナログ耐性株、又は 代謝制御変異株を取得するには、親株又は野 生株を通常の変異処理、すなわちX線や紫外� �の照射、またはN-メチル-N'-ニトロ-N-ニトロ� �グアニジン(NTG)もしくはエチルメタンスルフ ォネート(EMS)等の変異剤処理などによって処� ��し、得られた変異株の中から、栄養要求性� ��アナログ耐性、又は代謝制御変異を示し、� ��つL-アミノ酸生産能を有するものを選択す� �ことによって得ることができる。

 具体的には、L-システイン生産菌として� �、フィードバック阻害耐性のセリンアセチ� �トランスフェラーゼ(SAT)をコードする複数種 のcysEアレルで形質転換されたE. coli JM15(米� �特許第6,218,168号)、細胞に毒性の物質を排出� ��るのに適したタンパク質をコードする過剰� ��現遺伝子を有するE. coli W3110 (米国特許第5 ,972,663号)、システインデスルフヒドラーゼ活 性が低下したE. coli株 (特開平11-155571号公報) 、cysB遺伝子によりコードされるシステイン� �ギュロンの正の転写制御因子の活性が上昇� �たE. coli W3110 (WO01/27307)などのエシェリヒア 属に属する株が挙げられるが、これらに限定 されない。

 E. coliでは、システインデスルフヒドラー� �活性を有するタンパク質として、シスタチ� �ニン-β-リアーゼ(metC産物、特開平11-155571号� �Chandra et. al., Biochemistry, 21 (1982) 3064-3069))� ��トリプトファナーゼ(tnaA産物、特開2003-169668 、(Austin Newton et. al., J. Biol. Chem. 240 (1965)  1211-1218))、O-アセチルセリン スルフヒドリ� ��ーゼB(cysM遺伝子産物、特開2005-245311)、及び� ��malY遺伝子産物(特開2005-245311)が知られてい� �。これらのタンパク質の活性を低下させる� �とにより、L-システイン生産能が向上する。
 本発明において、「タンパク質の活性が低� ��する」とは、同タンパク質の活性が野生株� ��は親株等の非改変株に対して低下している� ��とを意味し、活性が完全に消失しているこ� ��を含む。

 システインデスルフヒドラーゼ活性を有� ��るタンパク質の活性を低下させるような改� ��は、例えば、同タンパク質をコードする遺� ��子の発現を低下させることによって達成さ� ��る。具体的には例えば、染色体上の標的遺� ��子のコード領域の一部又は全部を欠損させ� ��ことによって、前記タンパク質の細胞内の� ��性を低下させることができる。標的遺伝子� ��プロモーターやシャインダルガルノ(SD)配列 等の発現調節配列を改変したりすることなど によっても、発現を低下させることができる 。また、発現調節配列以外の非翻訳領域の改 変によっても、遺伝子の発現量を低下させる ことができる。さらには、染色体上の遺伝子 の前後の配列を含めて、遺伝子全体を欠失さ せてもよい。また、染色体上の標的遺伝子の コード領域にアミノ酸置換(ミスセンス変異)� ��導入すること、また終始コドンを導入する� ��と(ナンセンス変異)、あるいは一~二塩基付� ��・欠失するフレームシフト変異を導入する� ��とによっても達成出来る(Journal of Biological� �Chemistry 272:8611-8617(1997) Proceedings of the Natio nal Academy of Sciences,USA 95 5511-5515(1998), Journa l of Biological Chemistry 266, 20833-20839(1991))。

 また、標的タンパク質の活性が低下する� ��うな改変であれば、X線もしくは紫外線を照 射、またはN-メチル-N'-ニトロ-N-ニトロソグア ニジン等の変異剤による通常の変異処理によ る改変であってもよい。

 発現調節配列の改変は、好ましくは1塩基 以上、より好ましくは2塩基以上、特に好ま� �くは3塩基以上である。また、コード領域を� ��失させる場合は、標的タンパク質の機能が� ��下又は欠失するのであれば、欠失させる領� ��は、N末端領域、内部領域、C末端領域のい� �れの領域であってもよく、コード領域全体� �あってよい。通常、欠失させる領域は長い� �が確実に遺伝子を不活化することができる� �また、欠失させる領域の上流と下流のリー� �ィングフレームは一致しないことが好まし� �。

 標的遺伝子のコード領域に他の配列を挿� ��する場合も、遺伝子のいずれの領域であっ� ��もよいが、挿入する配列は長い方が、確実� ��遺伝子を不活化することができる。挿入部� ��の前後の配列は、リーディングフレームが� ��致しないことが好ましい。他の配列として� ��、コードされるタンパク質の機能を低下又� ��欠損させるものであれば特に制限されない� ��、例えば、抗生物質耐性遺伝子やL-システ� �ン生産に有用な遺伝子を搭載したトランス� �ゾン等が挙げられる。

 染色体上の標的遺伝子を上記のように改� ��するには、例えば、遺伝子の部分配列を欠� ��し、正常に機能するタンパク質を産生しな� ��ように改変した欠失型遺伝子を作製し、該� ��伝子を含むDNAで細菌を形質転換して、欠失� ��遺伝子と染色体上の遺伝子とで相同組換え� ��起こさせることにより、染色体上の遺伝子� ��欠失型遺伝子に置換することによって達成� ��きる。欠失型遺伝子によってコードされる� ��ンパク質は、生成したとしても、野生型タ� ��パク質とは異なる立体構造を有し、機能が� ��下又は消失する。このような相同組換えを� ��用した遺伝子置換による遺伝子破壊は既に� ��立しており、「Redドリブンインテグレーシ� ��ン(Red-driven integration)」と呼ばれる方法(Datse nko, K. A, and Wanner, B. L. Proc. Natl. Acad. Sci . U S A. 97:6640-6645 (2000))、Redドリブンイン� �グレーション法とλファージ由来の切り出し システム(Cho, E. H., Gumport, R. I., Gardner, J.� �F. J. Bacteriol. 184: 5200-5203 (2002))とを組合わ せた方法(WO2005/010175号参照)等の直鎖状DNAを用 いる方法や、温度感受性複製起点を含むプラ スミド、接合伝達可能なプラスミドを用いる 方法、宿主内で複製起点を持たないスイサイ ドベクターを利用する方法などがある(米国� �許第6303383号、または特開平05-007491号)。

 標的遺伝子の転写量が低下したことの確� ��は、同遺伝子から転写されるmRNAの量を野生 株、あるいは非改変株と比較することによっ て行うことが出来る。mRNAの量を評価する方� �としては、ノーザンハイブリダイゼーショ� �、RT-PCR等が挙げられる(Molecular cloning(Cold spr ing Harbor Laboratory Press, Cold spring Harbor (USA) , 2001))。

 標的タンパク質の量が低下したことの確� ��は、抗体を用いてウェスタンブロットによ� ��て行うことが出来る(Molecular cloning(Cold sprin g Harbor Laboratory Press, Cold spring Harbor (USA),� �2001))。

 本発明においては、L-システイン生産菌� �、フィードバック阻害耐性の変異型SATを保� �していることが好ましい。エシェリヒア・� �リに由来する、フィードバック阻害耐性の� �異型SATとして具体的には、256位のメチオニ� �残基がグルタミン酸残基に置換された変異� �SAT(特開平11-155571)、256位のメチオニン残基が イソロイシン残基に置換された変異型SAT(Denk,  D. and Boeck, A., J. General Microbiol., 133, 515- 525 (1987))、97位のアミノ酸残基から273位のア� ��ノ酸残基までの領域における変異、又は227� ��のアミノ酸残基からC末端領域の欠失を有す る変異型SAT(WO97/15673号国際公開パンフレット� ��米国特許第6218168号)、野生型SATの89~96位に相 当するアミノ酸配列が1又は複数の変異を含� �、かつ、L-システインによるフィードバック 阻害が脱感作されている、変異型SAT(米国特� �公開第20050112731(A1))等が知られている。実施� ��に記載した変異型SATをコードするcysE5は、� �生型SATの95位及び96位のVal残基及びAsp残基が� ��各々Arg残基及びPro残基に置換されている。

 SAT遺伝子は、エシェリヒア・コリの遺伝子� ��限られず、SAT活性を有するタンパク質をコ� ��ドするものであれば、使用することができ� ��。また、L-システインによるフィードバッ� �阻害を受けないシロイヌナズナ由来のSATア� �ソザイムが知られており、これをコードす� �遺伝子を用いることもできる(FEMS Microbiol. L ett., 179 (1999) 453-459)。
 細菌に変異型SATをコードする遺伝子を導入� ��れば、L-システイン生産能が付与される。� �菌への変異型SAT遺伝子の導入は、通常のタ� �パク質発現に用いられる種々のベクターを� �いることができる。このようなベクターと� �ては、pUC19、pUC18、pHSG299, pHSG399, pHSG398, RSF1 010, pBR322, pACYC184, pMW219等が挙げられる。

 SAT遺伝子を含む組換えベクターを細菌に� ��入するには、D.A.Morrisonの方法(Methods in Enzym ology 68, 326 (1979))あるいは受容菌細胞を塩化 カルシウムで処理してDNAの透過性を増す方法 (Mandel,M. and Higa,A.,J.Mol.Biol.,53,159(1970))、エレ� ��トロポーレーションによる方法等、細菌の� ��質転換に通常用いられている方法を用いる� ��とができる。

 また、SAT遺伝子のコピー数を高めること� ��よっても、SAT活性を上昇させるこができる� ��SAT遺伝子のコピー数を高めることは、上記� ��ようなベクターを用いてSAT遺伝子を細菌に� ��入することによって、又は、SAT遺伝子を細� ��の染色体DNA上に多コピー存在させることに� ��って達成できる。細菌の染色体DNA上にSAT遺� ��子を多コピーで導入するには、染色体DNA上� ��多コピー存在する配列を標的に利用して相� ��組換えにより行う。染色体DNA上に多コピー� ��在する配列としては、レペティティブDNA、� ��移因子の端部に存在するインバーテッド・� ��ピートが利用できる。あるいは、特開平2-10 9985号公報に開示されているように、SAT遺伝� �をトランスポゾンに搭載してこれを転移さ� �て染色体DNA上に多コピー導入することも可� �である。

 また、YdeDタンパク質をコードするydeD遺伝� �は、システイン経路の代謝産物の排出に関� �していることが知られており、YdeDタンパク� ��の活性を高めることによっても、L-システ� �ン生産能を向上させることができる(特開2002 -233384)。YdeDタンパク質の活性を増大させるよ うな改変は、例えば、ydeD遺伝子の発現を向� �させることによって達成される。ydeD遺伝子� ��発現の向上は、後述する、tolC遺伝子の発現 を向上させる改変と同様にして行うことがで きる。
 エシェリヒア・コリのydeD遺伝子は、例えば 、配列番号9、10に示す塩基配列を有するプラ イマーを用いたPCRにより、エシェリヒア・コ リ染色体DNAから取得することができる。

 また、セリンによるフィードバック阻害� ��受けない3-ホスホグリセレートデヒドロゲ� �ーゼ(PGD)を保持させることによっても、L-シ� ��テイン生産能を向上させることができる。� ��のような変異型PGDをコードする遺伝子とし� ��は、serA5遺伝子(米国特許第6,180,373号に記載) が知られている。

 また、硫酸塩/チオ硫酸塩輸送系タンパク 質群をコードするcysPTWAクラスター遺伝子の� �現が増強されるように改変されたエシェリ� �ア属に属するL-システイン生産菌(特開2005-137 369号公報、EP1528108号明細書)を使用すること� �できる。

 さらに、L-システイン生産能を有し、か� �、emrAB、emrKY、yojIH、acrEF、bcr又はcusA遺伝子� �発現が上昇するように改変されたエシェリ� �ア属細菌を使用することもできる(特開2005-28 7333号公報)。

 上記のようにして得られるL-システイン� �産能を有する細菌のうち、本発明において� �ましいのは、フィードバック阻害耐性の変� �型SATを保持する細菌、YdeDタンパク質の活性� ��高められた細菌、又はシステインデスルフ� ��ドラーゼ活性を欠損した細菌であり、より� ��ましいのは、フィードバック阻害耐性の変� ��型SATを保持し、かつ、YdeDタンパク質の活性 が高められた細菌、フィードバック阻害耐性 の変異型SATを保持し、かつ、システインデス ルフヒドラーゼ活性を欠損した細菌、又は、 YdeDタンパク質の活性が高められ、かつ、シ� �テインデスルフヒドラーゼ活性を欠損した� �菌であり、特に好ましいのは、フィードバ� �ク阻害耐性の変異型SATを保持し、システイ� �デスルフヒドラーゼ活性を欠損し、かつ、Yd eDタンパク質の活性が高められた細菌である� ��システインデスルフヒドラーゼ活性として� ��、トリプトファナーゼ活性であることが好� ��しい。

 本発明の細菌は、上述したようなL-システ� �ン生産能を有する腸内細菌科に属する細菌� �、tolC遺伝子によりコードされるタンパク質( 以下、「TolC」と記載することがある)の活性� ��増大するように改変することによって得る� ��とができる。ただし、TolCタンパク質の活性 が増大するように改変を行った後に、L-シス� ��イン生産能を付与してもよい。
 tolC遺伝子は、ECK3026、weeA、b3035、colE1-i、mtcB 、mukA 、refI、toc遺伝子と同義である。

 「tolC遺伝子によりコードされるタンパク質 の活性が増大する」とは、tolC遺伝子により� �ードされるTolCタンパク質の活性が野生株又� ��親株等の非改変株に対して増大しているこ� ��を意味する。
 TolCタンパク質の活性とは、具体的には、細 菌内の活性を増大させたときにL-システイン� ��産能が向上する活性を意味する。また、TolC タンパク質は、実施例に記載するように、発 現を増強することによって非改変株よりもシ ステイン耐性を高める活性を有することが明 らかとなった。したがって、他の定義によれ ば、TolCタンパク質の活性とはこのようなシ� �テイン耐性を高める活性を意味する。

 tolC遺伝子よりコードされるTolCタンパク� �の活性を増大させるような改変は、例えば� �tolC遺伝子の発現を増大させることによって� ��成される。

 tolC遺伝子の発現を増強するための改変は、 例えば、遺伝子組換え技術を利用して、細胞 中の遺伝子のコピー数を高めることによって 行うことができる。例えば、tolC遺伝子を含� �DNA断片を、宿主細菌で機能するベクター、� �ましくはマルチコピー型のベクターと連結� �て組換えDNAを作製し、これを細菌に導入し� �形質転換すればよい。
 前記ベクターとしては、宿主細菌の細胞内� ��おいて自律複製可能なベクターを挙げるこ� ��ができる。エシェリヒア・コリ細胞内にお� ��て自律複製可能なベクターとしては、pUC19� �pUC18、pHSG299、pHSG399、pHSG398、pACYC184(pHSG、pACYC は宝バイオ社より入手可)、RSF1010、pBR322、pMW2 19(pMW219はニッポンジーン社より入手可)、pSTV2 9(宝バイオ社より入手可)等が挙げられる。

 組換えDNAを細菌に導入するには、これま� ��に報告されている形質転換法に従って行え� ��よい。例えば、エシェリヒア・コリK-12につ いて報告されているような、受容菌細胞を塩 化カルシウムで処理してDNAの透過性を増す方 法(Mandel,M.and Higa, A., J. Mol. Biol., 53, 159 (1 970))があり、バチルス・ズブチリスについて� ��告されているような、増殖段階の細胞から� ��ンピテントセルを調製してDNAを導入する方� ��(Duncan, C. H.,Wilson, G. A. and Young, F. E., Ge ne, 1, 153 (1977))がある。あるいは、バチルス ・ズブチリス、放線菌類及び酵母について知 られているような、DNA受容菌の細胞を、組換 えDNAを容易に取り込むプロトプラストまたは スフェロプラストの状態にして組換えDNAをDNA 受容菌に導入する方法(Chang, S. and Choen, S.  N., Molec. Gen. Genet., 168, 111 (1979); Bibb, M. J ., Ward, J. M. and Hopwood, O. A., Nature, 274, 39 8 (1978); Hinnen, A., Hicks, J. B. and Fink, G. R. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929 (1978))も応 用できる。

 一方、tolC遺伝子のコピー数を高めること は、上述のようなtolC遺伝子を細菌のゲノムDN A上に多コピー存在させることによっても達� �できる。細菌のゲノムDNA上にtolC遺伝子を多� ��ピーで導入するには、ゲノムDNA上に多コピ� ��存在する配列を標的に利用して相同組換え� ��より行う。ゲノムDNA上に多コピー存在する� ��列としては、レペティティブDNA、転移因子� ��端部に存在するインバーテッド・リピート� ��利用できる。また、ゲノム上に存在するtolC 遺伝子の横にタンデムに連結させてもよいし 、ゲノム上の不要な遺伝子上に重複して組み 込んでもよい。これらの遺伝子導入は、温度 感受性ベクターを用いて、あるいはintegration� ��クターを用いて達成することが出来る。

 あるいは、特開平2-109985号公報に開示さ� �ているように、tolC遺伝子をトランスポゾン� ��搭載してこれを転移させてゲノムDNA上に多� ��ピー導入することも可能である。ゲノム上� ��遺伝子が転移したことの確認は、tolC遺伝子 の一部をプローブとして、サザンハイブリダ イゼーションを行うことによって確認出来る 。

 さらに、tolC遺伝子の発現の増強は、上記 した遺伝子コピー数の増幅以外に、国際公開 00/18935号パンフレットに記載した方法で、ゲ� ��ムDNA上またはプラスミド上のtolC遺伝子の各 々のプロモーター等の発現調節配列を強力な ものに置換することや、各遺伝子の-35、-10領 域をコンセンサス配列に近づけること、tolC� �伝子の発現を上昇させるようなレギュレー� �ーを増幅すること、又は、tolC遺伝子の発現� ��低下させるようなレギュレーターを欠失ま� ��は弱化させることによっても達成される。� ��えば、lacプロモーター、trpプロモーター、t rcプロモーター、tacプロモーター、araBAプロ� �ーター、ラムダファージのPRプロモーター、 PLプロモーター、tetプロモーター、T7プロモ� �ター、φ10プロモーター等が強力なプロモー� ��ーとして知られている。また、E.coliのスレ� ��ニンオペロンのプロモーターを使用するこ� ��もできる。また、tolC遺伝子のプロモーター 領域、SD領域に塩基置換等を導入し、より強� ��なものに改変することも可能である。プロ� ��ーターの強度の評価法および強力なプロモ� ��ターの例は、Goldsteinらの論文(Prokaryotic promo ters in biotechnology. Biotechnol. Annu. Rev., 1, 105 -128 (1995))等に記載されている。さらに、リ� �ソーム結合部位(RBS)と開始コドンとの間のス ペーサー、特に開始コドンのすぐ上流の配列 における数個のヌクレオチドの置換がmRNAの� �訳効率に非常に影響を及ぼすことが知られ� �おり、これらを改変することも可能である� �tolC遺伝子のプロモーター等の発現調節領域� ��、プロモーター検索ベクターやGENETYX等の遺 伝子解析ソフトを用いて決定することも出来 る。これらのプロモーター置換または改変に よりtolC遺伝子の発現が強化される。発現調� �配列の置換は、例えば温度感受性プラスミ� �を用いた方法や、Redドリブンインテグレー� �ョン法(WO2005/010175)を使用することが出来る� �

 エシェリヒア・コリのtolC遺伝子の塩基配列 、及び同遺伝子がコードするアミノ酸配列を 、それぞれ配列番号1及び2に示す。
 細菌が属する種又は菌株によって、tolC遺伝 子の塩基配列に差異が存在することがあるた め、改変するtolC遺伝子は、配列番号1の塩基� ��列のバリアントであってもよい。TolCのホモ ログは多数の細菌で知られており、データベ ースの検索により見つけることができる。配 列情報からE.coli K-12株のTolCタンパク質と相� �性の高いタンパク質を探す場合には、例え� �BLASTサーチ(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi) にて検索することができる。また、キーワー ドからホモログを探す場合には、例えばEntrez のサーチエンジン(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/g query)を用いてキーワードとして「tolC」や「ou ter membrane channel protein」を入力すれば、候� �となる配列が複数のデータベースから抽出� �れる。これらの候補をよく精査し、目的の� �モログ配列を見つけることができる。この� �うな方法で見つけられた多数のTolCホモログ� ��うち、以下の細菌のTolCホモログの遺伝子塩 基配列及びアミノ酸配列を、配列番号11~30に� ��す。カッコ内はNCBI (National Center for Biotech nology Information)データベースのアクセション� ��号、及び配列番号2のアミノ酸配列との同一 性(%)を示す。

 シゲラ・ボイディイ(Shigella boydii)Sb227(NCBI a ccession:YP_409239)、99%)
 シゲラ・フレクスネリ(Shigella flexneri) 2a st r. 2457T(NCBI accession:NP_838556、Identity:99%)
 サルモネラ・エンテリカ(Salmonella enterica)sub sp. enterica serovar Typhi Ty2(NCBI accession:NP_806790 、89%)
 シトロバクター・コセリ(Citrobacter koseri)ATCC  BAA-895(NCBI accession:YP_001455919、89%)
 クレブシエラ・ニューモニエ(Klebsiella pneumo niae)subsp. pneumoniae MGH 78578(NCBI accession:YP_00133 7075、83%)
 エンテロバクター・サカザキイ(Enterobacter s akazakii)ATCC BAA-894(NCBI accession:YP_001436507、80%)
 エルビニア・カロトボーラ(Erwinia carotovora)s ubsp. atroseptica SCRI1043(NCBI accession:YP_048456、76% )
 セラチア・プロテアマキュランス(Serratia pr oteamaculans)568(NCBI accession:YP_001480490、73%)
 アエロモナス・サルモニシダ(Aeromonas salmoni cida)subsp. salmonicida A449(NCBI accession:ABO88689、51 %)
 ビブリオ・ブルニフィカス(Vibrio vulnificus)YJ 016(NCBI accession:NP_933376、45%)

 また、tolC遺伝子は、上記のようなTolCタ� �パク質又はTolCホモログのアミノ酸配列にお� ��て、1若しくは数個の位置での1若しくは数� �のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加等� �含む配列を有するタンパク質をコードする� �伝子であってもよい。前記「1若しくは数個� ��とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構� ��における位置やアミノ酸残基の種類によっ� ��も異なるが、具体的には好ましくは1~20個、 より好ましくは1~10個、さらに好ましくは1~5� �を意味する。上記の1若しくは数個のアミノ� ��の置換、欠失、挿入、または付加は、タン� ��ク質の機能が正常に維持される保存的変異� ��ある。保存的変異の代表的なものは、保存� ��置換である。保存的置換とは、置換部位が� ��香族アミノ酸である場合には、Phe、Trp、Tyr� ��で、置換部位が疎水性アミノ酸である場合� ��は、Leu、Ile、Val間で、極性アミノ酸である� ��合には、Gln、Asn間で、塩基性アミノ酸であ� ��場合には、Lys、Arg、His間で、酸性アミノ酸� ��ある場合には、Asp、Glu間で、ヒドロキシル� ��を持つアミノ酸である場合には、Ser、Thr間� ��お互いに置換する変異である。保存的置換� ��みなされる置換としては、具体的には、Ala� ��らSer又はThrへの置換、ArgからGln、His又はLys� ��の置換、AsnからGlu、Gln、Lys、His又はAspへの� ��換、AspからAsn、Glu又はGlnへの置換、CysからS er又はAlaへの置換、GlnからAsn、Glu、Lys、His、A sp又はArgへの置換、GluからGly、Asn、Gln、Lys又� ��Aspへの置換、GlyからProへの置換、HisからAsn� ��Lys、Gln、Arg又はTyrへの置換、IleからLeu、Met� ��Val又はPheへの置換、LeuからIle、Met、Val又はP heへの置換、LysからAsn、Glu、Gln、His又はArgへ� ��置換、MetからIle、Leu、Val又はPheへの置換、P heからTrp、Tyr、Met、Ile又はLeuへの置換、Serか� ��Thr又はAlaへの置換、ThrからSer又はAlaへの置� ��、TrpからPhe又はTyrへの置換、TyrからHis、Phe� ��はTrpへの置換、及び、ValからMet、Ile又はLeu� ��の置換が挙げられる。また、上記のような� ��ミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、または� ��位等には、遺伝子が由来する微生物の個体� ��、種の違いに基づく場合などの天然に生じ� ��変異(mutant又はvariant)によって生じるものも� ��まれる。

 さらに、上記のような保存的変異を有す� ��遺伝子は、コードされるアミノ酸配列全体� ��対して、80%以上、好ましくは90%以上、より� ��ましくは95%以上、より好ましくは97%以上、� ��り好ましくは98%以上、特に好ましくは99%以� ��の相同性を有し、かつ、野生型TolCタンパク 質と同等の機能を有するタンパク質をコード する遺伝子であってもよい。

 また、tolC遺伝子は、公知の遺伝子配列か ら調製され得るプローブ、例えば前記遺伝子 配列又はその相補配列とストリンジェントな 条件下でハイブリダイズし、TolCタンパク質� �同等の機能を有するタンパク質をコードす� �DNAであってもよい。ここで、「ストリンジ� �ントな条件」とは、いわゆる特異的なハイ� �リッドが形成され、非特異的なハイブリッ� �が形成されない条件をいう。一例を示せば� �相同性が高いDNA同士、例えば80%以上、好ま� �くは90%以上、より好ましくは95%以上、より� �ましくは97%以上、より好ましくは98%以上、� �に好ましくは99%以上の相同性を有するDNA同� �がハイブリダイズし、それより相同性が低� �DNA同士がハイブリダイズしない条件、ある� �は通常のサザンハイブリダイゼーションの� �いの条件である60℃、1×SSC、0.1% SDS、好まし くは、0.1×SSC、0.1% SDS、さらに好ましくは、6 8℃、0.1×SSC、0.1% SDSに相当する塩濃度、温度 で、1回、より好ましくは2~3回洗浄する条件� �挙げられる。

 プローブは、遺伝子の相補配列の一部で� ��ってもよい。そのようなプローブは、公知� ��遺伝子配列に基づいて作製したオリゴヌク� ��オチドをプライマーとし、これらの塩基配� ��を含むDNA断片を鋳型とするPCRによって作製� ��ることができる。例えば、プローブとして� ��300 bp程度の長さのDNA断片を用いる場合には 、ハイブリダイゼーションの洗いの条件は、 50℃、2×SSC、0.1% SDSが挙げられる。

 上記の遺伝子やタンパク質のバリアント� ��関する記載は、セリンアセチルトランスフ� ��ラーゼ、システインデスルフヒドラーゼ等� ��酵素やYdeDタンパク質、及びそれらをコード する遺伝子にも同様に適用される。

<2>本発明のL-システイン、L-シスチン、� �れらの誘導体もしくは前駆体、又はこれら� �混合物の製造法
 上記のようにして得られる本発明の細菌を� ��地中で培養し、該培地からL-システイン、L- シスチン、それらの誘導体もしくは前駆体、 又はこれらの混合物を採取することにより、 これらの化合物を製造することができる。L-� ��ステインの誘導体又は前駆体としては、前� ��したようなS-スルホシステイン、チアゾリ� �ン誘導体、同チアゾリジン誘導体に相当す� �ヘミチオケタール、O-アセチルセリン、又は N-アセチルセリン等が挙げられる。

 使用する培地としては、炭素源、窒素源� ��イオウ源、無機イオン及び必要に応じその� ��の有機成分を含有する通常の培地が挙げら� ��る。

 炭素源としては、グルコース、フラクト� ��ス、シュクロース、糖蜜やでんぷんの加水� ��解物などの糖類、フマール酸、クエン酸、� ��ハク酸等の有機酸類を用いることができる� ��

 窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩� ��アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無� ��アンモニウム塩、大豆加水分解物などの有� ��窒素、アンモニアガス、アンモニア水等を� ��いることができる。

 イオウ源としては、硫酸塩、亜硫酸塩、� ��化物、次亜硫酸塩、チオ硫酸塩等の無機硫� ��化合物が挙げられる、

 有機微量栄養源としては、ビタミンB1な� �の要求物質または酵母エキス等を適量含有� �せることが望ましい。これらの他に、必要� �応じてリン酸カリウム、硫酸マグネシウム� �鉄イオン、マンガンイオン等が少量添加さ� �る。

 培養は好気的条件下で30~90時間実施する� �がよく、培養温度は25℃~37℃に、培養中pHは5 ~8に制御することが好ましい。尚、pH調整に� �無機あるいは有機の酸性あるいはアルカリ� �物質、更にアンモニアガス等を使用するこ� �ができる。培養物からのL-システインの採取 は通常のイオン交換樹脂法、沈澱法その他の 公知の方法を組み合わせることにより実施で きる。

 上記のようにして得られるL-システイン� �、L-システイン誘導体の製造に用いることが できる。システイン誘導体としては、メチル システイン、エチルシステイン、カルボシス テイン、スルホシステイン、アセチルシステ イン等が含まれる。

 また、L-システインのチアゾリジン誘導体� �培地に蓄積した場合は、培地からチアゾリ� �ン誘導体を採取し、チアゾリジン誘導体とL- システインとの間の反応平衡をL-システイン� ��に移動させることによって、L-システイン� �製造することができる。
 また、培地にS-スルホシステインが蓄積し� �場合、例えばジチオスライトール等の還元� �を用いて還元することによってL-システイン に変換することができる。

 後記実施例に示すように、tolC遺伝子欠損 株は、非改変株に比べてL-システイン感受性� ��示す。また、tolC遺伝子欠損株は、O-アセチ� ��セリン(NAS)及びN-アセチルセリン(OAS)に対し� ��も感受性を示す。これらの結果から、TolCは L-システイン、並びにNAS及びOASを排出する外� ��の排出因子であると考えられる。従って、T olC活性の強化は、L-システインだけではなく� ��NASやOASの高生産をもたらすと考えられる。

 OASを発酵生産する方法は、特開平11-56381号� �特開2002-262896号に記載されている。細胞内の OAS濃度を高めるためには、フィードバック阻 害が低下した変異型SATを細菌に保持させるの がよく、細胞内から内膜を介した排出のため には内膜の排出ポンプYdeD(Dabler, T. et al., Mo l. Microbiol., 36, 1101-1112 (2000))の活性を増大� �せることが好ましい。したがって、変異型SA Tを保持し、かつ、YdeDタンパク質の活性が増� ��した細菌は、OASの生産にも適しており(特開 2002-262896)、特に本発明の細菌の一形態である 、TolC活性が増大し、変異型SATを保持し、か� �、YdeDタンパク質の活性が増大した細菌は、O ASの生産により適している。このような細菌� ��しては、例えば実施例に示すE. coli MG1655δt naA::Km ^r /pCEM256I/pYdeD/pLSTolCが挙げられる。上記のよう� ��、細胞内のOASの高濃度化と排出に関連した� ��膜の因子は知られていたものの、OASを効率� ��く該膜を透過させて培地中に排出するため� ��有効因子はこれまで知られていなかった。� ��れはL-システインについても同様である。� �膜を効率的に透過させるための有効な手段� �開発は、L-システイン及びOASについて共通の 課題であったが、いずれもTolC活性の増強に� �り達成されると考えられる。

 OASは比較的不安定な化合物であるため、� ��養中に不可逆的な化学反応によりNASに変換� ��れる可能性がある。したがって、中性付近� ��行われる発酵においては、培地中に、OASと� ��OASからの自然反応によってもたらされるNAS� ��混在して蓄積する場合がある。発酵によっ� ��専らOASを生産したい場合には、例えば培地� ��pHを酸性側に保つ方法をとることができる(� ��開2002-262896号)。また、専らNASを生産したい� ��合には、培地のpHをアルカリ側に保つこと� �、OASからの自然反応によってNASを生成させ� �ことができる。

 本発明の細菌を培地で適当な条件で培養� ��、培地に蓄積するNAS及び/又はOASを採取する ことにより、NAS及び/又はOASを製造すること� �できる。培養に用いる培地としては、前記� �ような培地、例えば実施例に記載したL-シス テイン生産培地や、特開2002-262896号に記載さ� ��た生産培地を利用することができる。培地� ��は、チオ硫酸などOASからL-システインへの� �胞内での反応を促進する物質は培地には添� �しないほうが、より多くのOASを生産させる� �めには好ましい。生産に適した条件は、培� �に蓄積したNAS及び/又はOASの量を測定するこ� ��により、適宜設定することができる。NAS及� ��/又はOASの定量は、疎水性カラム及びUV検出� ��を用いたHPLC等により行うことができる。前 記のように、培養や定量の最中にOASがNASに変 換される可能性がある。従って、発酵によっ て生産されたOASを全てNASに変換し、このNASの 量をHPLCで測定することで、発酵生産物をOAS� �NASの総和としてとらえるほうが発酵成績を� �察する上では好ましい。OASを全てNASに変換� �るためには、例えば培地をアルカリ200mMトリ スバッファー(pH9.0)と混ぜることでアルカリpH にすればよい(特開2002-262896号)。