도 1은 본 발명의 전체적인 과정을 보여주는 흐름도이다.

도 2는 본 발명의 유전자-LDH 나노복합체의 형성 구조를 예측한 도식도이다:

a: 거대 유전자-LDH 나노복합체; 및,

b: 광학 유전자-LDH 나노복합체.

도 3은 유전자-LDH 나노 복합체의 X선 회절도를 나타낸 도이다:

a: LDH;

b: 거대 유전자-LDH 나노복합체; 및,

c: 광학 유전자-LDH 나노복합체.

도 4는 유전자-LDH 나노 복합체의 투과 전자 현미경 이미지를 나타낸 도이다:

[왼쪽 패널: 표면분석(morphology), 오른쪽 패널: 내부 구조 분석(cross-section)]

a: LDH;

b: 거대 유전자-LDH 나노복합체; 및,

c: 광학 유전자-LDH 나노복합체.

도 5는 광학 유전자-LDH 나노복합체의 투과 전자 현미경 이미지를 나타낸 도이다:

a: 광학 유전자;

b: 박리화된 LDH; 및,

c: 광학 유전자-LDH 나노하이브리드 무기캡슐.

도 6은 광학 유전자-LDH 나노복합체의 자외선 스펙트럼 결과를 나타낸 도이다:

a: 광학 유전자;

b: 박리화된 LDH; 및,

c: 광학 유전자-LDH 나노하이브리드 무기캡슐.

도 7은 유전자-LDH 나노 복합체의 효소에 대한 안정성 평가 결과를 나타낸 전기영동 이미지이다:

a: 거대 유전자-LDH 나노복합체; 및,

b: 광학 유전자-LDH 나노복합체.

도 8은 순수한 잉크로 날인한 [S]의 이미지이다:

a: 사진; 및,

b: 광학 이미지.

도 9는 광학 유전자-LDH 나노복합체가 첨가된 나노하이브리드 잉크로 날인한 [S]의 이미지이다:

a: 사진; 및,

b: 광학 이미지.

도 10은 본 발명의 광학 유전자 코드 식별 시스템으로 광학 유전자 코드를 판독한 결과를 나타낸 도이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은

i) 셀(shell)로서, 양이온성 전하를 띄는 나노물질; 및,

ii) 코어(core)로서, 5' 말단에 1차 형광체가 표지된 센스 단일가닥 광학 유전자 및 상기 센스 단일가닥 광학 유전자에 상보적인 염기서열을 갖고, 5' 말단에 상기 1차 형광체와 다른 형광 특성을 갖는 2차 형광체가 표지된 안티센스 단일가닥 광학 유전자가 상보적으로 결합하여 형성된 이중가닥 광학 유전자;

로 구성된 나노복합체를 포함하는 광학 유전자 코드 식별용 조성물을 제공한다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 단일가닥 유전자가 헤어핀 루프(Hairpin loops)나 자가 이량체(Self dimer)를 형성하지 않고, 35 bp 정도 길이의 서로 상보적인 염기서열의 5' 말단에 각각 다른 색의 형광체가 부착된 이중가닥 광학 유전자를 설계 및 합성하였다. 구체적으로, 5' 말단에 녹색 형광체가 부착된, 35 bp 길이의 서열번호 1로 기재되는 단일가닥 광학 유전자(Cy3-A); 및 적색 형광체가 부착된, 상기 서열번호 1에 상보적인, 서열번호 2로 기재되는 단일가닥 광학 유전자(Cy5-B)를 제작한 후 혼성화하여 이중가닥 광학 유전자를 합성하였다.

상기 단일가닥 광학 유전자를 포름아마이드에 박리화된 LDH(Layered Double Hydroxide) 나노입자 콜로이드 용액에 첨가함으로써 나노하이브리드 식별자인 광학 유전자 무기캡슐을 합성하였다. 이때, 상기 유전자의 길이는 35 bp로 제한되지 않고, 10 내지 3000 bp 정도의 길이일 수 있다. 이는, 포름아마이드에 박리화된 LDH를 담체로 2500 bp 또는 35 bp 길이의 유전자를 캡슐화할 경우(도 2 참조), 무정형 또는 코어-셀 구조의 유전자-LDH 나노복합체를 형성하였고(도 3 및 4 참조), 외부 환경에 대한 안정성을 획득하여(도 7 참조), 유전자의 보관, 전달 및 기능의 증가가 가능해졌기 때문이다. 또한, 5' 말단에 형광체가 표지된 유전자도 포름아마이드에 박리화된 LDH에 의해 캡슐화되어서(도 5 및 6 참조), 안정적으로 보관되는 것을 확인하였다(도 7b의 오른쪽 패널 참조). 상기와 같이 안정적인 캡슐구조가 확인된 광학 유전자-LDH 나노복합체는 임의의 매체에서 우수한 분산성을 확보하여 적용 분야를 극대화시키고 장기적/항구적으로 안정성을 유지할 수 있다.

상기 나노물질은 음이온성 전하를 갖는 광학 유전자를 캡슐화하는 경우에는 양이온성 전하를 띄는 것이 바람직하며, 상기 양이온성 전하를 띄는 나노물질에는 고분자, 생분해성 고분자, 리포좀 및 무기 나노입자 등이 사용될 수 있다. 무기 나노입자는 실리카 또는 양이온성 금속 등이 사용될 수 있는데, 양이온성 층전하를 띄는 박리화된 금속 이중층 수산화물(LDH: Layered Double Hydroxide)을 이용하는 것이 바람직하며, 양이온성 층전하를 띄는 박리화된 LDH가 음이온성 광학 유전자와 강한 정전기적 인력에 인한 자가조립(self-assembly)을 통해 재조합되는 특성을 이용하면 광학 유전자 분자를 캡슐화시켜 안정성을 극대화할 수 있다.

구체적으로, 상기 박리화된 LDH는 하기 화학식 1의 층상형 LDH를 전구체(pristine)로 하며,

화학식 1

(상기 화학식 1에서,

M ²⁺ 는 2가 금속 양이온이고,

N ³⁺ 는 3가 금속 양이온이며,

상기 A는 음이온계 게스트(Guest) 화학종이며,

n은 A의 음이온의 전하수이며,

x는 0.1 초과 0.4 미만의 수이며,

z와 y는 0을 초과하는 양수이다).

M은 마그네슘(Mg ²⁺ ), 니켈(Ni ²⁺ ), 구리(Cu ²⁺ ) 및 아연(Zn ²⁺ )으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을,

N은 알루미늄(Al ³⁺ ), 철(Fe ³⁺ ), 바나듐(V ³⁺ ), 티타늄(Ti ³⁺ ) 및 갈륨(Ga ³⁺ )으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 한다.

상기 단일가닥(Single-stranded) 유전자는 자가 헤어핀 루프(Hairpin loops) 및 자가 이량체(Self dimer)를 형성하지 않도록 설계되는 것이라면 무엇이든지 사용 가능하고, 그 염기서열의 길이는 10 내지 3000 bp의 넓은 범위도 사용가능하다. 그러나 본 발명의 이중가닥 광학 유전자로 구성된 나노복합체가 눈으로 식별할 수 없을 정도의 '나노' 크기인 것이 바람직하므로, 나노단위(일반적으로 500 ㎚)에 해당하는 복합체를 제조하기 위해서는 유전자는 10 내지 1500 bp 정도가 바람직하며, 더욱 바람직하게는 15 내지 1000 bp, 더욱더 바람직하게는 20 내지 500 bp, 가장 바람직하게는 25 내지 300 bp 정도일 수 있다. 참고로, 이중가닥 유전자의 경우 1 bp가 0.34 ㎚이므로 1500 bp 유전자의 길이는 510 ㎚이며, 일반적으로 적어도 10 bp이하의 길이의 프로브는 선택성이 없으므로 제작을 하지 않는다.

하지만 유전자 코드 식별 시스템에 적용하기 위해서는 10 내지 300 bp 정도가 바람직하며, 더욱 바람직하게는 20 내지 200 bp, 가장 바람직하게는 25 내지 50 bp 정도일 수 있다.

또한 상기 이중가닥 유전자는 몇 개의 짧은 단일가닥 유전자와 긴 단일가닥 유전자의 혼성체의 형태도 가질 수 있다. 길이가 짧은 여러 개의 단일가닥 유전자의 상보적인 염기서열을 이용하면 독특한 2차, 3차 구조의 다중가닥 유전자로 코드화도 가능하며, 플라스미드(Plasmid) DNA와 엔지니어드(Engineered) DNA도 정보를 부여할 수 있다. 그 이외에도 RNA, 인공 DNA 유사체인 PNP(Peptide Nucleic Acid) 등도 이용할 수 있다. 이러한 다중 코드화는 특정 염기서열의 조합 코드와 형광체의 구조/색상/개수 등의 조합 코드로 방대한 정보/암호 코드를 디자인 및 생산할 수 있다.

상기 형광체는 온도, pH 변화, 열 등의 외부조건으로부터 안정적인 것은 무엇이든지 사용 가능하며, 그 종류에는 유기계 형광체 혹은 퀀텀(Quantum) 효과를 갖는 무기계 형광체 등이 있다. 상기 유기계 형광체의 구체적인 예로는 CY ^TM , Fluorescein, Alexa Flur ^® , Bodipy ^® , CAL Fluor ^® , Oregon Green, Oyster ^® , 로다민(Rhodamine), TAMRA ^TM 및 WellRED 등 다양하게 있고, 무기계 형광체 역시 금 나노입자, ZnS, CdSe, CdTe, CdS 등 다양하며, 유전자와 직접적인 공유결합이나 스페이서(Spacer)를 사용하여 5', 3' 또는 중간에 부착이 가능하다. 이때, 형광체 자체가 코드의 단위로 사용할 수 있어서, 상기 1차 형광체와 2차 형광체가 서로 다른 형광 특성(예, 다른 성분, 구조 및 색상)을 갖도록 조합하면 다양한 코드 디자인이 가능하여, ① 형광체에서 발광하는 광학 신호는 광학 유전자로 구성된 나노복합체의 삽입 여부 판별에 이용될 수 있고; 또는 ② 광학 유전자의 염기서열 판독에 쓰이는 분자 센서 요소 및 탐침의 역할도 할 수 있다.

상기 이중가닥 광학 유전자의 염기서열과 형광체 사이에 스페이서를 추가로 함유할 수 있는데, 상기 스페이서는 광학 유전자의 혼성화에 영향을 주지 않고 유전자와 형광체를 연결할 수 있는 어떤 분자도 가능하며, 예컨대, C-3 링커(linker), C-6 링커, C-6 TFA 링커, C-5 아미노 변형기(amino modifier), C-12 링커, 아미노 dT C2 링커, 아미노 dT C6 링커, 5' 티올(Thiol) C-2 링커, 5' 티올 C-6 링커, 5' 티올 C-6 S-S 등을 포함할 수 있다.

본 발명의 이중가닥 광학 유전자로 구성된 나노복합체는 염기서열로 코드화된 정보 및 광학 탐침을 안정적으로 보관할 수 있으므로 보안기술, 상품식별기술, 진위판별기술, 이력추적시스템, 위조복제 방지기술 등에 적용될 수 있는 나노하이브리드 식별자로 유용하게 이용될 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 조성물을 i) ID카드, 여권 등 위조 및 복제가 쉬운 보안 제품; ii) 진품, 명품 등 도난 위협이 있는 고가 제품; iii) 제품 이력이 조작 및 둔갑할 수 있는 유통과정에서 품질 관리가 필요한 제품; 등의 다양한 매개체 및 매체에 물리적, 화학적으로 분산 및 도포하여 적용하는 것이 바람직하다. 예를 들면, 본 발명의 조성물을 보안 제품의 제조를 위한 기기감응물질(Machine readable materials), 미세추적물질(Micro tracer), 주화용 신소재, 위·변조 방지용 특수 잉크·안료·페인트·도료 등에 혼합하고 분산시켜 사용하는 방법과 특수 인쇄 보안용지, 제지용 특수 섬유, 고내구성지(Durable papers)에 직접 삽입하는 방법, 이외에도 물리적·화학적 흡착으로 적절하게 개체 및 포장지에 직접 도포하는 방법 등으로 표지하여 사용할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 조성물 및 도료를 포함하는 광학 유전자 코드 식별 시스템용 잉크 조성물을 제공한다.

상기 도료는 위·변조 방지용 특수 잉크, 상용의 잉크, 안료, 염료 및 페인트 등을 포함한다.

또한, 본 발명은 상기 조성물이 포함된 광학 유전자 코드 식별 시스템용 라벨을 제공한다.

상기 조성물은 라벨에 도포되거나, 라벨 제조시 첨가되거나, 라벨에 인쇄되어 포함될 수 있다. 예를 들면, ① 용매에 분산하여 라벨에 도포하는 방법, ② 종이 등의 상품 제조시 직접 심어 넣는 방법, ③ 페인트나 도료 등에 혼합하여 사용하는 방법 등을 모두 포함한다.

또한, 본 발명은

(i) 상기 센스 단일가닥 광학 유전자에 상보적인 염기서열이 순차적으로 연결된 안티센스 단일가닥 유전자 프로브; 또는,

(ii) 상기 안티센스 단일가닥 광학 유전자에 상보적인 염기서열이 순차적으로 연결된 센스 단일가닥 유전자 프로브;

가 고형기질에 점적된, 광학 유전자 코드 식별용 바이오센서를 제공한다.

본 발명의 조성물은 형광체의 검출을 통해 1차 판독될 수 있다. 본 발명의 구체적인 실시예에서, 상기 나노하이브리드 식별자를 흑색 잉크와 혼합한 후, 상기 나노하이브리드 식별자가 포함된 나노하이브리드 잉크를 유리 슬라이드에 [S] 문자로 각각 날인하고, 광학 스캐너로 이미지를 수득한 결과, 순수한 잉크로 날인한 [S]는 형광물질을 포함하지 않았고(도 8 참조), 나노하이브리드 잉크로 날인한 [S]는 녹색과 적색 형광체가 병합된 황색 [S] 이미지를 나타내는 것을 확인하였다(도 9 참조). 이에, 상기 황색 [S]이미지의 검출을 통해, 나노 캡슐을 제거하지 않은 상태에서 나노하이브리드 식별자를 1차 판독할 수 있는 것을 확인하였다.

또한, 본 발명의 나노하이브리드 식별자는 상기 유전자와 상보적인 유전자 서열과의 혼성화 반응의 검출을 통해 2차 판독될 수 있다. 본 발명의 구체적인 실시예에서, 상기 광학 유전자와 상보적인 염기서열을 갖고, 5' 말단에 아민이 부착된 12개의 티민을 포함하는, 탐침 유전자가 적절히 적재된 바이오센서를 제작하였다. 이때, 상기 두 종류의 광학 유전자의 스팟 위치를 적절히 조절함으로써, 판독된 이미지가 녹색 바탕에 적색의 ⓢ 그래픽이 되도록 디자인하였다. 이후, 나노하이브리드 잉크가 [S]자로 날인된 유리 슬라이드로부터 광학 유전자만을 추출하여 혼성화 반응을 수행한 결과, 광학 이미지로 녹색 바탕에 적색의 ⓢ 그래픽을 수득함으로써, 신속·정확하게 광학 유전자 코드를 2차 판독할 수 있었다(도 10 참조).

이에 본 발명의 광학 유전자 코드 식별 시스템은 다색 광학 검출법 및 유전자 코드 판독의 2단계의 판독 과정을 거침으로써, 진위 판별 및 이력 추적 등에 있어서 접근성이 높은 식별 시스템으로 구축될 수 있다.

본 발명에서, 판독기로 이용하는 "바이오센서"는 생체분자의 고유한 기능을 이용하는 바이오칩(Biochip)과 흡사하다. 바이오센서는 고체 기질의 유리 슬라이드(Glass slide) 표면에 수천 혹은 수 만개 이상의 유전자를 고밀도로 집적화시키고 배열시켜 부착하여 제조한 것으로, 아주 빠르게 유전자 코드를 검색하고 정확하게 검출하는 기능이 있어서 코드화된 염기서열을 검출하고 분석하기 위한 기존의 "PCR기술"을 효과적으로 대체할 수 있는 획기적인 방법이다.

상기 바이오센서는 마이크로어레이 형식으로 유리 슬라이드에 알데하이드(Aldehyde; -CHO)를 사용하여 개질하고 여기에 아민(Amine; NH ₂ )이 말단에 부착되어 있는 탐침 유전자 프로브를 결합하여 제작하였다.

본 발명의 프로브와 고형기질 사이에 스페이서(spacer)를 추가로 함유할 수 있는데, 상기 스페이서는 혼성화에 영향을 주지 않고 프로브와 고형기질을 연결할 수 있는 어떤 분자도 가능하며, 예컨대, 아민-올리고 dT 링커(linker), C-3 링커(linker), C-6 링커, C-6 TFA 링커, C-5 아미노 변형기(amino modifier), C-12 링커, 아미노 dT C2 링커, 아미노 dT C6 링커, 5' 티올(Thiol) C-2 링커, 5' 티올 C-6 링커, 5' 티올 C-6 S-S 등을 포함할 수 있다.

상기 고형기질은 광학 검출을 허용하며 신호 방출을 심하게 간섭하지 않는다. 상기 고형기질은 이에 제한되지는 않지만 가소성 물질, 세라믹, 유리, 폴리스티렌, 메틸스티렌, 아크릴 중합체, 상자성 물질, 토리아 솔, 탄소 그래파이트, 이산화티탄, 라텍스 또는 가교-결합된 덱스트란 예컨대 세파로스, 셀룰로스, 나일론, 가교 결합된 마이셀(micelle) 및 테플론(Teflon)이 모두 사용될 수 있다. 고형기질의 표면은 개별 스팟에서 프로브의 부착을 허용하기 위해 개질될 수 있다. 구체적으로, 화학적 작용기, 예컨대 아미노기, 카르복시기, 옥소기 및 티올기의 패턴의 첨가는 일반적으로 해당 반응성 작용기 또는 링커 분자를 포함하는 프로브를 공유 결합시키는 데 사용될 수 있다. 본 발명의 구체적인 실시예에서는, 기질의 표면은 아민기를 갖도록 제조된 프로브가 기질에 용이하게 결합하도록 알데하이드로 개질되었다.

본 발명의 바이오센서는 아주 높은 밀도, 높은 밀도, 중간 밀도, 낮은 밀도 또는 아주 낮은 밀도로 프로브가 점적된 스팟을 갖도록 제조될 수 있다. 아주 높은-밀도 바이오센서에 대한 범위는 바이오센서 당 약 10,000,000 내지 약 2,000,000,000 개의 스팟을 갖는다. 높은-밀도 바이오센서의 범위는 약 100,000 내지 약 10,000,000 개의 스팟을 갖는다. 중간 밀도 바이오센서의 범위는 약 10,000 내지 약 50,000 개의 스팟을 갖는다. 낮은-밀도 바이오센서는 일반적으로 10,000 부위 미만이다. 아주 낮은-밀도 바이오센서는 1,000 개 미만의 스팟을 갖는다. 프로브 스팟들은 패턴, 즉 규칙적인 디자인 또는 구성을 포함하거나, 또는 랜덤하게 분포될 수 있다. 규칙적인 패턴 스팟들은 X-Y좌표 평면상에 지정되도록 사용될 수 있다. 따라서 광학 유전자 코드 식별용 바이오센서는 광학 유전자 코드의 상보적인 염기서열이 혼성화되는 위치를 사전에 임의로 디자인하여 판독 결과가 광학 그래픽 이미지로 판독되는 것이 특징이다.

아울러, 본 발명은

1) 상기 광학 유전자 코드 식별 시스템용 라벨의 형광을 검출하는 단계;

2) 형광이 검출되지 않으면 위조로 판정하고, 형광이 검출된 경우에는 상기 라벨에 산성용액을 처리하여 박리화된 금속 이중층 수산화물로 형성된 캡슐을 분해하는 단계;

3) 캡슐이 분해된 라벨로부터 광학 유전자만을 추출하는 단계;

4) 추출된 광학 유전자를 변성시킨 후, 상기 바이오센서와 혼성화하는 단계;

5) 상기 혼성화된 바이오센서를 세척하여 결합하지 않은 광학 유전자를 제거하는 단계;

6) 상기 세척된 바이오센서를 건조한 후, 광학 이미지를 검출하는 단계; 및,

7) 상기 단계 6)에서 검출된 광학 이미지를 분석하여 위조 또는 정품인지를 판별하는 단계를 포함하는, 상기 광학 유전자 코드 식별용 바이오센서를 이용한 코드 식별 방법을 제공한다.

단계 2) 캡슐 분해는 pH 4 이하의 산성 완충 용액을 사용하여 2시간 내지 6시간, 바람직하게는 5시간 동안 용해시키는 것이 바람직하다. 유전자 코드가 변형되지 않도록 금속 이중층 수산화물만 선택적으로 녹여낸 후에, EDTA(Ethylene diamine tetra acetic acid)를 첨가하면 캡슐을 쉽게 제거하여 안전하게 광학 유전자 코드를 추출할 수 있다. 이중가닥 유전자는 강한 산성 용액에서 오랜 시간 동안 용해되어 있을 경우에 염기쌍 배열(A, T, C, G)이 양성자화(Protonation)되면서 구조적 변형이 일어난다. 그리고 금속 양이온의 존재 하에서는 이중가닥 유전자의 염기쌍과 금속 양이온의 상호작용으로 단일가닥으로 변형되거나, 인산기와의 상호작용으로 복합체를 형성하면서 집결되어 불용성 형태로 유전자가 불안정해진다(Muntean CM et al. , J. Raman Spectrosc. 36:1047-1051, 2005; Duguid J et al. , Biophys. J. 65:1916-1928, 1993). 따라서 산성 완충 용액으로 적절한 시간 동안 금속 이중층 수산화물만 선택적으로 녹여낸 후에 2가/3가 금속 양이온과 강하게 결합하여 킬레이트 화합물을 형성하는 약품으로 알려져 있는 EDTA를 첨가하면, 산성 용액에서 용해되어 생성된 금속 양이온과 킬레이트를 형성하여 쉽게 제거됨으로써 광학 유전자를 변형/변성의 위협으로부터 안전하게 추출할 수 있다.

상기 단계 4)에서 바이오센서와 광학 유전자의 혼성화를 "1초" 동안 수행함으로써 혼성화된 결과 이미지를 얻을 수 있었고, 이를 통해 일순간(一瞬間)에 상보적인 유전자가 혼성화되어 형광 신호를 방출하고, 광학 이미지의 검출 유무를 통해 눈으로 확인/인식하여 정보의 일치 여부를 극단적으로 판단할 수 있다. 따라서, 본 발명의 상기 바이오센서는 정확하고 신속하게 광학 유전자 코드를 분석하여 사전에 부여한 정보/암호와 일치하는 경우에 생물학적 신호가 광학 신호로 전환되어 발신하는 다중 컬러 이미지 코드의 역할을 할 뿐만 아니라, 그 판독 정보를 부가 설명 없이도 누구나 쉽고 간단하게 육안으로 눈 깜짝할 사이에 인식(認識, Recognition)하여 일치 여부를 직감(直感, Intuition)적으로 판별할 수 있도록 사용된다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 거대 길이(~2500 bp)의 유전자가 캡슐화된 나노복합체 합성

<1-1> 박리화된 금속 이중층 수산화물의 합성

공침과 수열합성을 통하여 100 ㎚크기의 금속 이중층 수산화물을 합성하였다. 0.3 M Mg(NO ₃ ) ₂ ·6H ₂ O와 0.15M Al(NO ₃ ) ₃ ·9H ₂ O를 탄산 이온이 제거된 3차 증류수에 녹이고, pH가 10 내지 11이 될 때까지 0.5 M NaOH로 적정한 후, 상온에서 30분간 강하게 교반하여 금속 이중층 수산화물(LDH: Layered Double Hydroxide) 결정체를 얻었다. 공침된 LDH를 수열합성 용기에 넣고 100℃에서 12시간 동안 교반한 후, 원심분리기로 분리하며 세척과정을 통해 미반응 염을 제거하여 100 ㎚의 균일한 크기로 LDH를 얻었다. 상기 합성한 LDH를 포름아마이드에 0.05중량%로 분산시켜 상온에서 2일간 강하게 교반하여 박리화된 LDH 나노시트를 얻었다. 전 과정은 공기 중의 이산화탄소에 의한 탄산 이온(CO ₃ ^2- ) 생성을 방지하기 위하여 질소 분위기하에서 진행되었다.

<1-2> 거대 길이(~2500 bp)의 유전자의 캡슐화

상기 실시예 1-1에서 박리화된 LDH 콜로이드 용액에 50~2500 bp 크기의 이중가닥 청어 유전자(Herring testis DNA)를 1:1의 중량 비율로 혼합하여 상온에서 1시간 동안 교반시켰다. 반응이 끝난 후 원심분리기로 분리하며 세척과정을 통해 과량의 유전자를 완전히 제거하여 코어-셀 유전자-이중층 수산화물 나노복합체를 얻었다(도 2a). 전 과정은 공기 중의 이산화탄소에 의한 탄산 이온(CO3 ^2- ) 생성을 방지하기 위하여 질소 분위기하에서 진행하였다.

<실시예 2> 형광체가 부착된 유전자가 캡슐화된 나노복합체 합성

<2-1> 광학 유전자 코드화

녹색 형광체인 시아닌 3가 부착되고, 35 bp 길이의 서열번호 1[5'-(Cy3)ATT CGG ACG CTC ATC ATT CTG GTG TGG CTG CTG GC-3']로 기재되는 단일가닥 광학 유전자(Cy3-A); 및 적색 형광체인 시아닌 5가 부착되고, 서열번호 1에 상보적인, 서열번호 2[5'-(Cy5)GCC AGC AGC CAC ACC AGA ATG ATG AGC GTC CGA AT-3']로 기재되는 단일가닥 광학 유전자(Cy5-B)를 디자인한 후, 상기 단일가닥 광학 유전자를 Integrated DNA Technologies(미국)에 의뢰하여 합성하였다. 이때, 각각의 단일가닥 광학 유전자는 헤어핀 루프(Hairpin loops)나 자가 이량체(Self dimer)가 형성되지 않도록 제조되었다. 단일가닥 광학 유전자를 각각 STE 버퍼(10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 50 nM NaCl, 1 mM EDTA)에 용해시켜 같은 농도로 섞은 후, 94℃에서 2분간 가열한 후 상온에서 천천히 식힘으로써 이중가닥의 광학 유전자로 합성되었다.

<2-2> 광학 유전자-LDH 나노복합체 합성

실시예 2-1에서 준비한 광학 유전자 용액에 박리화된 LDH 콜로이드 용액을 첨가한 후(질량비=0.5~1.5, 부비피=1~2), 15℃에서 1시간 동안 교반시켜 나노하이브리드 식별자인 광학 유전자 무기캡슐을 합성하였다(도 2b). 전 과정은 공기 중의 이산화탄소에 의한 탄산 이온(CO ₃ ^2- ) 생성을 방지하기 위하여 질소 분위기하에서 진행되었다.

<실시예 3> 나노복합체의 특징 확인

<3-1> X 선 회절 분석

상기 실시예 1 및 2에서 제조한 LDH 및 유전자-LDH 나노복합체의 결정 구조를 확인하기 위하여 X 선 회절(Rigaku, D/Max 2200, 일본) 분석을 수행하였다.

그 결과, 도 3에서 알 수 있는 바와 같이 LDH의 층간 간격은 0.79 ㎚로 질산 이온(NO ₃ )이 삽입되어 있는 전형적인 구조임을 확인하였고, 상기 유전자-LDH 나노복합체는 2θ<15°인 저각에서의 회절이 없으므로, 더 이상 다층상 구조의 나노복합체가 아닌 무정형 구조의 유전자-LDH 나노복합체임을 알 수 있었다.

<3-2> 투과 전자 현미경 분석

상기 실시예 1 및 2에서 제조한 LDH 및 유전자-LDH 나노복합체의 형상 및 결정 구조를 미세하게 확인하기 위하여 투과 전자 현미경(JEOL JEM-2000EXII, 일본) 분석을 수행하였다. 각각의 시편은 에폭시 수지에 고정하여 50 ㎚ 두께로 절단하여 염색 과정 없이 관찰하였다.

그 결과, 상기 LDH는 약 100 ㎚의 균일한 크기의 육각 형상의 입자이며, 층간 간격 약 0.8 ㎚로 질산 이온(NO ³ )이 삽입되어 있는 구조임을 확인하였다(도 4a).

상기 거대 유전자-LDH 나노복합체는 거대 유전자를 매우 얇게 박리화된 LDH 나노시트가 수 ㎛ 크기로 무질서하게 캡슐화함으로써, 카드집(House of card) 형태에 가까운 무정형 구조의 코어-셀 나노복합체가 형성되었음을 확인하였다(도 4b).

상기 광학 유전자-LDH 나노복합체는 박리화된 LDH 나노시트가 재조합되면서 약 10 ㎚ 두께로 무기 공동을 형성하였고, 유전자가 그 안에 캡슐화된 약 150 ㎚ 크기의 완벽한 코어-셀 구조의 유전자-LDH 나노복합체임을 확인하였다(도 4c).

<실시예 4> 광학 유전자-LDH 나노복합체의 캡슐화 확인

상기 실시예 1 및 2에서 제조한 광학 유전자, 박리화된 LDH 및 광학 유전자-LDH 나노복합체를 투과 전자 현미경 분석 및 자외선 스펙트로미터(Perkin Elmer Lambda 35, 미국)로 확인하였다.

*그 결과, 도 5 및 6에서 나타난 바와 같이 녹색(Cyanine 3)과 적색(Cyanine 5)의 형광체가 표지된 광학 유전자가 박리화된 LDH를 담체로 캡슐화되었음을 확인하였다.

<실시예 5> 유전자-LDH 나노복합체의 캡슐화인 안정성 평가 실험

*상기 실시예 1 및 2에서 제조한 유전자-LDH 나노복합체 내에 보존된 상기 유전자의 안정성을 효소 처리 반응으로 검사하였다.

상기 유전자-LDH 나노 복합체를 TE(Tris-EDTA) 완충용액 10 ㎕에 각각 10 ㎍ 씩 분산시킨 후, DNA 분해효소인 DNase I(1000 unit) 20 ㎕와 반응 완충용액(200 mM Tris-HCl, pH 8.3, 20 mM MgCl ₂ ) 20 ㎕를 첨가하여 37℃에서 1시간 인큐베이션하였다. 이후 반응 중지 완충용액(50 mM EDTA) 20 ㎕를 첨가하여 70℃에서 10분간 인큐베이션한 후 원심 분리하여 효소와 완충용액을 제거하였다.

효소 반응이 끝난 후에 pH 4의 염산 완충 용액에 분산시킨 후, 상온에서 5시간 동안 용해시켜 무기캡슐만을 선택적으로 분해하였다. 이후 EDTA를 처리함으로써 금속 양이온와 유전자 간의 상호작용을 최소화하여 순수한 광학 유전자만을 추출하였다. 광학 유전자의 경우, 상기 추출한 광학 유전자 5 ㎍을 뉴클레아제가 없는 혼성화 완충용액(30% 포름아마이드, 5X SSC, 0.1% SDS, poly A) 15 ㎕에 용해시킨 후, 95℃에서 5분간 가열함으로써 단일가닥 광학 유전자로 만들었다. 상기 추출된 유전자를 각각 1% 혹은 5% 아가로스 젤에서 전기영동한 후, 자외선 및 광학 이미지 분석기(Typhoon 9400, 미국)로 스캔하여 전기영동 이미지를 수득하였다.

그 결과, 거대 유전자-LDH 나노복합체는 DNA 분해효소로부터 상기 50~2500 bp의 유전자까지 보호되는 것으로 확인되었다(도 7a).

또한, 광학 유전자-LDH 나노복합체는 DNA 분해효소로부터 35 bp의 유전자가 안정적으로 보호된 것을 자외선 이미지(도 7b의 왼쪽 패널) 및 광학 이미지에서 확인되었다(도 7b의 오른쪽 패널).

이를 통해 본 발명의 코어-셀 유전자-LDH 나노복합체는 길이 및 구조에 관계없이 DNA 분해 조건으로부터 유전자 및 형광체를 보호할 수 있음을 확인하였다.

<실시예 6> 나노하이브리드 잉크 제조 및 1차 판독 시험

실시예 2에서 제조한 나노하이브리드 식별자를 흑색 스탬프 잉크(Shachihata사, 일본)에 1중량%로 첨가하여 분산시켜 나노하이브리드 잉크를 얻었다. 순수한 스탬프 잉크와 나노하이브리드 잉크를 유리 슬라이드에 [S] 문자로 각각 날인하고, 광학 스캐너(Typhoon 9400, 미국)로 이미지를 스캔하였다.

그 결과, 순수한 잉크로 날인한 [S]는 형광물질을 포함하지 않았고(도 8), 나노하이브리드 잉크로 날인한 [S]는 녹색과 적색 형광체가 병합된 황색 [S] 이미지를 나타내는 것을 확인하였다(도 9). 이에, 상기 황색 [S]이미지의 검출을 통해, 나노 캡슐을 제거하지 않은 상태에서 나노하이브리드 식별자를 1차 판독할 수 있는 것을 확인하였다.

<실시예 7> 바이오센서 제작

실시예 2의 단일가닥 광학 유전자 Cy3-A 및 Cy5-B에 각각 상보적인 염기서열을 갖고, 5' 말단에 아민이 부착된 12개의 티민을 포함하는, 47 bp 길이의 탐침 유전자 서열번호 3으로 기재되는 A' 및 서열번호 4로 기재되는 B'를 제조하였다. 유리 슬라이드 표면을 알데하이드로 개질한 후, 49 ㎟의 면적에 총 144개(가로 12 × 세로 12)의 스팟(spot)을 점적함으로써, 기존 방식과 유사한 바이오센서를 제작하였다. 이때, 하나의 스팟에는 한 종류의 탐침 유전자를 이용하였고, 상기 두 종류의 탐침 유전자의 스팟 위치를 적절히 조절함으로써, 판독된 이미지가 녹색 바탕에 적색의 ⓢ 그래픽이 되도록 디자인하였다(도 10 참조).

<실시예 8> 광학 유전자 코드 판독

실시예 6에서 제조한 나노하이브리드 잉크가 [S]자로 날인된 유리 슬라이드에 산성 완충 용액(pH4)을 상온에서 5시간 동안 처리한 후, EDTA를 처리함으로써 순수한 광학 유전자만을 추출하였다.

상기 추출한 광학 유전자 5 ㎍을 뉴클레아제가 없는 혼성화 완충용액(30% 포름아마이드, 5X SSC, 0.1% SDS, poly A) 15 ㎕에 용해시킨 후, 95℃에서 5분간 가열함으로써 단일가닥 광학 유전자로 만들었다.

실시예 4에서 제조한 바이오센서에 상기 단일가닥 광학 유전자가 포함된 용액 15 ㎕를 올려서 1초 동안 혼성화 반응을 진행한 후, 곧바로 1 내지 3차 세척(1차:SSC 및 SDS; 2차:SSC 및 SDS; 3차:SSC)을 하였다. 상기 세척된 바이오센서를 건조한 뒤, 광학 스캐너(Molecular Devices GenePix 4200B, 미국)로 이미지를 스캔하였다.

그 결과, 도 10에 나타난 바와 같이 나노하이브리드 식별자로부터 광학 유전자를 추출하여 바이오센서로 판독한 광학 이미지로 녹색 바탕에 적색의 ⓢ 그래픽을 수득함으로써, 신속·정확하게 광학 유전자 코드를 판독할 수 있었다. 이에 본 발명의 광학 유전자 코드 식별 시스템은 진위 판별 및 이력 추적 등에 있어서 접근성이 높은 식별 시스템으로 구축될 수 있다.