Introducción Los tensioactivos son moléculas orgánicas de amplia y versátil utilización que contienen dos grupos funcionales con características opuestas : un grupo hidrófilo (soluble en agua) y un grupo hidrófobo insoluble. Las actuales exigencias europeas, tanto de rentabilidad de procesos como ecológicas, hace imprescindible la investigación de nuevos productos que protejan el medio ambiente y la calidad de vida asi como de alternativas que mejoren los procesos de producción.

Una de las estrategias que existe actualmente para conseguir tensioactivos ecológicamente aceptables es la preparación de moléculas cuya estructura molecular mimetiza la de los tensioactivos naturales : lipoaminoácidos, fosfolipidos y glicerolípidos (J. H. Fender, 1989"Membrane Mimetic Chemistry, John Wiley & Son). Desde el año 84, el equipo que dirige la Dra. Infante, pionero en España de estas investigaciones, se ha interesado en la síntesis, estudio y desarrollo de lipoaminoácidos (amidas, esteres y acilos) de muy diversas estructuras y características iónicas, caracterizados por contener en su parte hidrófila o polar un aminoácido o péptido y en la parte hidrófoba o apolar una o más cadenas grasas condensadas al aminoácido por sus funciones a-amino o carboxilo terminal.

Por otra parte, los glicerolípidos entre los que destacan los mono y diacilglicéridos (conocidos como monodiacilglicéridos) constituyen actualmente, debido a sus excelentes propiedades emulsificantes y vehiculizantes (Zhu, Y., Masuyama, A., Kirito, Y., Okahara, M., Rosen, M. J., 1992, J. Am. Oil. Chem. Soc., 69 : 6269), el 75% de los emulsionantes empleados en la industria alimenticia, siendo los monoacilglicéridos los más importantes debido a su mayor funcionalidad y su carácter más competitivo. Dentro de este grupo, los compuestos más ampliamente estudiados y empleados son los esteres alquilicos de glicerol ya que se obtienen fácilmente mediante una glicerolisis de los triacilglicéridos o una esterificación del glicerol mediante ácidos grasos (Lipid Technologies and Applications, 1997, Ed. Gunstone, F. D., Padley, F. B., New York.). Los monoacilglicéridos son compuestos con muy baja solubilidad en agua, por lo que

generalmente se añaden a las formulaciones junto con otros emulsionantes de carácter mas polar.

La presente invención pretende llevar a cabo la sintesis de una nueva familia de monoacilglicéridos y diacilglicéridos derivados de arginina análogos a los clásicos monodiacilglicéridos pero de características más hidrófilas. Estos tensioactivos están constituidos por un esqueleto central de glicerol que une la parte hidrófoba formada por una o dos cadenas de ácido graso de longitud variable y la parte hidrófila formada por el aminoácido arginina o acetil-arginina unido al glicerol por su hidroxilo terminal a través de un enlace éster. Estas nuevas estructuras presentarán ciertas ventajas sobre los monodiacilglicéridos convencionales : a) la introducción de la arginina como parte polar de la molécula anfifila aumentará la solubilidad de éstos en medio acuoso, y mejorará sus propiedades tensioactivas en agua, b) la presencia de arginina aportará características catiónicas al tensioactivo y por tanto se obtendrán compuestos con actividad antimicrobiana y c) en función de la naturaleza y número de las cadenas hidrófobas es de esperar que en agua las nuevas moléculas se agreguen espontáneamente formando cubosomas y/o liposomas útiles para el transporte y liberación de biomoléculas.

ESTADO DE LA TÉCNICA Los tensioactivos derivados de aminoácido son compuestos muy interesantes debido a su multifuncionalidad e inocuidad (Takehara, M. 1989, Colloids and Surfaces, 38 : 149 ; Selve, C., Mansuy, L., Allouch, M., 1992, J. Chem. Res. 22 : 401). Estas características han sido las responsables de que en los últimos años se haya llevado a cabo la síntesis y estudio de propiedades de una gran variedad de tensioactivos derivados de aminoácido, de carácter iónico, catiónico, no iónico y anfótero (Takehara, M. 1989, Colloids and Surfaces, 38 : 149 ; Sagawa, K., Yokota, H., Ueno, I., Miyosi, T., Takehara, 1986, M., A7V Congreso IFSCC). En esta linea nuestro equipo ha sintetizado mediante metodologías químicas y enzimáticas lipoaminoácidos monocatenarios, dicatenarios y compuestos geminales de muy variada estructura en los cuales la cadena grasa estaba unida al aminoácido por enlaces acilo, éster o amida. Este estudio ha dado lugar a un gran número de patentes y publicaciones (ES9500061 (1995) ; PI 9500027 (1995) ; PCT/ES96/00026 (1996) ; ES 9700520 (1997) ; ES 9900739 (1999) ; M. R. Infante, J. Molinero, P. Erra, (1992), JAOCS, vol. 69, n°7 ; J. Molinero, M. R. Juliá, P. Erra, M. Robert,

M. R. Infante, 1988, JAOCS, Vol. 65, n°6 ; C. Solans, M. A. Pés, N. Azemar, M. R. Infante, 1990, Prog. Colloid Polym Sci, 81 pp 144-150 ; L. Pérez, J. L. Torres, A. Manresa, C. Solans, M. R. Infante, 1996, Langmuir, 12 (22), pp 5296-5301, Clapis, P., Moran, C., Infante, M. R, 1999, Biotechnol. Bioeng. 63, 3 pp333-343).

Con respecto a los monodiacilglicéridos, la bibliografia describe con gran detalle sus propiedades y aplicaciones (K. Larsson, 1994,"Lipids : Molecular Organization, Phisical Functions and Technical Applications"The Oily Press LTD). Estas propiedades se ven sensiblemente modificadas cuando el extremo hidroxilo libre de la molécula se funcionaliza con ácidos orgánicos del tipo ácido lactic, cítrico y acético ("Food Emulsions", 1997, Ed. by Stig E. Friberg and K. Larsson).

La síntesis de mono y diacilglicéridos derivados de arginina, objeto de la presente invención, requiere la obtención previa de los derivados del tipo 1-O-L-arginil esteres de glicerol. La bibliografia describe la síntesis de estos intermedios utilizando catalizadores químicos. Valivety et al. (Valivety, R., Gill, I. S., Vulfson, E. N., 1998, J. Surf. Deterg. 1 177-185), prepararon diversos compuestos del tipo 1-O-L-aminoacil esteres de glicerol a partir de la Na-Z-aminoácidos y glicerol en presencia de BF3-eterato. Sin embargo en ningún caso se trata de derivados de arginina.

Si bien la obtención de gliceril esteres con aminoácidos N-protegidos, como productos de partida, esta muy poco desarrollada, son numerosas las publicaciones basadas en la síntesis enzimática de enlaces esteres (Cantacuzene, D., Guerreiro, C., 1987, Tetrahedron Letters 28, 5153-5156 ; Kawashiro, K., Inhizaki, H., Sugiyama, S., Hayashi, H., 1993, Biotechnol. Bioeng., 42, 309-314 ; Kise, H., Hayakawa, A., Noritomi, H., 1987, Biotechnol. Lett. 9 543-548).

Mitin et al. (Mitin, Y. V., Braun, K., Kuhl, P., 1997, Biotech. and Bioeng 54, 287) describen la obtención de gliceril esteres de aminoácidos N-protegidos para su utilización en la síntesis de péptidos aunque no se encuentran en la literatura ejemplos de derivados de arginina.

En relación con la acilación de los grupos hidroxilo del glicerol se ha encontrado descrito la utilización de enzimas tipo lipasas (Valivety, R., Gill, I. S., Vulfson, E. N., 1998, J. Surf.

Deterg. 1 177-185).

Las principales novedades que aporta la presente invención es la combinación en una misma molécula de tensioactivos tipo mono y diacilglicéridos y tensioactivos derivados

de arginina asi como la utilización de enzimas como sustitutos de los catalizadores químicos convencionales.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a una nueva familia de tensioactivos derivados de arginina con una parte hidrófoba del tipo monodiacilglicerol asi como a los procedimientos de síntesis de estos compuestos. La fórmula estructural de estos compuestos se indica (I).

(1) Donde : Ri puede ser un hidrógeno o un grupo acetil (Ac).

R2 y R3 pueden ser un hidrógeno o una cadena lineal preferentemente larga saturada o no saturada. R2 y R3 pueden ser seleccionados de un grupo de cadenas lineales de 8, 9, 10, 12, 14, 16 y 18 átomos de carbono saturadas o no saturadas puras o sus mezclas.

Los materiales de partida pueden ser : -Derivados N-a protegidos de arginina, de calidad técnica o concretamente N- acetil-arginina.

-Glicerol -Ácidos, esteres o cloruros grasos lineales saturados o no saturados de distinta longitud -Catalizadores químicos de calidad técnica.

-Proteasas y lipasas de calidad técnica Se variará en las moléculas el n° de cadenas alquilicas (1 ó 2), el grado de insaturación, la longitud de las mismas lo cual dará lugar a compuestos con un diferente comportamiento en las propiedades de adsorción, autoagregación y biológicas. Debido a la procedencia de materias primas renovables e innocuas es de esperar que estos compuestos no sean peligrosos tanto desde el punto de vista biológico como medioambiental. La utilización del grupo acetil como grupo protector de la función amino de la arginina permite evitar posibles reacciones secundarias del tipo Maillard sin alterar el carácter biocompatible de los productos finales obtenidos.

La obtención de estos compuestos se ha llevado a cabo por metodologías químicas y enzimáticas. A continuación se describen las etapas involucradas en cada uno de los procedimientos : A) Procedimiento químico : la síntesis de estos compuestos por via química ha tenido lugar en 3 etapas : 1) Formación de los derivados de arginina Nα -protegidos, 1-O-N-(prot)-arginil- sn-glicerol éster (a los cuales se designará como OOR (prot). Como materias primas se utilizan glicerol, L-arginina protegida por el grupo a-amino y BF3- eterato como catalizador de la reacción de esterificación.

2) Formación de los derivados N'-protegidos 1-O-arginil éster 3-O- monoacilglicéridos o 1-O-arginil éster 2, 3-O-diacilglicéridos (designados como nnR (prot). La reacción tiene lugar a partir de OOR (prot) utilizando cloruros de ácidos grasos lineales de 8 a 18 átomos de carbono como agentes acilantes en un medio de piridina.

3) Si procede, formación de 1-O-arginil éster 3-O-monoacilglicéridos o 1-O- arginil éster 2, 3-O-diacilglicéridos (a los cuales se designará como nnR) mediante una hidrogenación catálitica en Pd/C o una acidolisis.

B) Procedimiento enzimático : la síntesis via enzimática se ha llevado a cabo análogamente en 3 etapas : 1) Obtención del OOR (prot). Reacción de condensación del glicerol con el grupo carboxilo/éster de la arginina Na-protegida, empleando como catalizador un enzima hidrolitico, proteasas y lipasas preferentemente, en un medio en ausencia de disolvente y con un determinado porcentaje de agua.

2) Obtención del nnR (prot). Reacción de acilación de el/los grupos hidroxilos libres del OOR (prot) con ácidos grasos libres o esteres de estos ácidos, empleando como catalizador una lipasa. La reacción tiene lugar en medios sin disolvente en presencia de un pequeño porcentaje de agua para activar el enzima. En el caso de que se utilice la acetil-arginina como grupo protector el producto final, nnR (acetil), no se someterá a la siguiente etapa.

3) Obtención del nnR. Si procede, eliminación del grupo protector N-a del derivado aminoácido mono o diacil glicérido, empleando técnicas convencionales rutinarias en síntesis peptidica (hidrogenación, tratamiento ácido o ß-eliminación catalizada por bases).

La presente invención se refiere a unos nuevos compuestos tensioactivos derivados de arginina del tipo mono y diaciglicéridos diseñados para que actúen como agentes de superficie con actividad antimicrobiana. Las variaciones de actividad serán función del n° de cadenas grasas y de su longitud.

La purificación de los productos intermedios y finales se lleva a cabo mediante extracciones liquido/liquido, liquido/sólido, cristalizaciones, cromatografia de intercambio iónico y fase reversa (HPLC).

Síntesis A modo de ejemplo y sin que ello limite el procedimiento, a continuación se detalla un ejemplo de la obtención de un tensioactivo del tipo diacil glicerol éster con cadenas grasas de 8 átomos de carbono por via química (88R) y uno del tipo monoacil glicerol éster de cadena grasa de 12 átomos de carbono por via enzimática (120R). En ambos casos el aminoácido utilizado es arginina y el compuesto se obtiene en forma de sal clorhidratada.

A) Procedimiento químico : El compuesto se prepara en 3 etapas tal como se ha mencionado anteriormente : 1) Preparación del OOR (Z). Se prepara una disolución 0. 8-1. 2 Molar de Z-Arg-OH en glicerol. Se añade un 10% en volumen de DMF y se calienta hasta una temperatura entre 45-60°C. A continuación se añade lentamente un 5% en volumen de BF3-eterato y se deja la reacción durante 5 horas. La solución se lleva a pH 6-6. 5 mediante la adicción de NaHCO3. El producto se aisla mediante una columna de intercambio iónico o bien mediante cromatografia liquida preparativa en fase reversa (HPLC).

2) Preparación de 88R (Z). Se prepara una disolución en el rango 0. 8-1. 1 Molar de OOR (Z) a la cual se añade cantidades catalíticas de una base orgánica terciaria (dimetil amino piridina, DMAP). A esta mezcla se le añade lentamente cloruro de octilo en una concentración 2. 5-3 Molar. La mezcla de reacción se mantiene en agitación durante 4-6 horas a una temperatura entre 15-25°C. Posteriormente se elimina el disolvente al vacío y la mezcla se purifica mediante la técnica de MPLC o de HPLC preparativo.

3) Preparación de 88R. La tercera etapa consiste en la desprotección del grupo a- amino de la arginina mediante una hidrogenación catalítica en un medio metanólico utilizando Pd/C y a presión atmosférica durante 4-6 horas. El producto asi obtenido se disuelve en agua/HCI y se liofiliza con el fin de obtener los compuestos en forma de sales diclorhidratadas.

B) Procedimiento enzimático Como se ha mencionado en la memoria, el proceso consta de tres etapas : 1) Preparación del clorhidrato de OOR (Boc). En un reactor con cierre hermético se disuelve la tert-butiloxicarbonil arginina (1 eq) en glicerol (5 eq) conteniendo un 10 % de solución Bórico/NaOH 0. 1 M pH 8. 2. La homogeneización del medio tiene lugar mediante la introducción de agitación magnética. A la disolución se añade la proteasa papaina (1. 7U/g de sólido ; 1 unidad (U) de actividad corresponde, en este caso, a la cantidad de enzima que hidroliza lu. mol de benzoil arginina metil éster por minuto a pH 6. 2 y 25°C. La mezcla de reacción se mantiene bajo atmósfera inerte, en agitación de tipo vaivén (200 rpm) o equivalente y termostatizada a 50 °C en un baño de agua. La reacción se sigue por cromatografia liquida de alta eficacia en fase reversa (HPLC) hasta que todo el tert-butiloxicarbonil arginina metil éster se ha consumido ; aproximadamente unas 48 horas. El rendimiento en este punto y por HPLC es del 72%. A continuación se añade al medio de reacción un volumen igual de una mezcla metanoV ácido acético 4 : 1 y se filtra a través de un lecho de celita para separar el enzima del medio de reacción con el producto. El filtrado previamente evaporado se disuelve en agua y se adsorbe en un lecho combinado de celita/carbón activo 1 : 1. En una primera etapa tiene lugar la elución selectiva del glicerol presente en el medio por tratamiento con agua. Seguidamente se procede a la elución de 1-tert-butiloxicarbonil arginina-sn-glicerol por tratamiento con una mezcla metanol/agua 1 : 1. 2. Tras evaporación y liofilización se obtiene un sólido blanco que se identifica por espectrometría de masas y resonancia magnética nuclear de protón y carbono. El rendimiento final es del 55 %.

2a) Preparación del clorhidrato de 120R(Boc). En un reactor abierto conteniendo 00R(Boc) (1 eq) y ácido laúrico (2 eq) a 55°C conteniendo un 4 % (w/w) de agua, se añade la preparación comercial Novozym 435 manteniendo el medio en agitación y termostatizado a 55 C. La reacción se sigue por cromatografia liquida de alta eficacia en fase reversa (HPLC) hasta que todo el 1-tert-butiloxicarbonil arginina-sn-glicerol se haya consumido ; aproximadamente unas 72 horas. El rendimiento en este punto y por HPLC es de un 65 %. A continuación se añade al medio de reacción un volumen igual de una mezcla acetonitrilo/agua/ácido acético 80 : 19 : 1 y se filtra para separar el soporte que

contiene el enzima del medio de reacción con el producto. La obtención del producto final se consigue mediante técnicas convencionales de cristalización y/o de cromatografia.

3a) Obtención de diclorhidrato de 120R. Una vez purificado el clorhidrato de 120R (Boc), se procede a la desprotección de la función amina. El grupo tert-butiloxicarbonil se elimina mediante tratamiento ácido con ácido trifluoroacético (M. Bodansky, A.

Bodansky, The Practice of Peptide Synthesis. Springer-Verlag (Heidelberg) 1984).

Se ha evaluado por técnicas convencionales la concentración micelar critica de los compuestos, parámetro que indica la actividad superficial de los tensioactivos en disolución acuosa. Asimismo la actividad antimicrobiana se ha determinado sobre la base de los valores de concentración minima inhibitoria (MIC) expresada en u. g/mL. En la tabla 1 se indican a modo de ejemplo estos parámetros para uno de los compuestos reivindicados en esta patente.

Tabla 1. CMC y actividad antimicrobiana del tensioactivo 88R

Compuesto CMC MIC (jig/mL) M (25°C) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 88R 6. 3 x 10-3 64 16 32 4 4 32 16 32 16

1-Pseudomonas aeruginosa 47T2 2.-Streptococcusfaecalis 3.-Proteus mirabilis 4.-Escherichia coli 5.-Candida tropicalis 6.-Candida lipolitica 7.-Staphilococcus aureus 8.-Bacillus cereus 9.-Bacillus pumillus