技术领域

本发明涉及中草药提取多糖，更具体地说，涉 及一种从金银花 (；¾w o«/ce _ra e) 中提取得到的 α-1,4-葡聚糖、其制备方法以及其在制备治疗� �尔兹海默症的药物中 的应用。 背景技术

随着糖化学与糖生物学的深入发展， 植物多糖作为一类重要的生物活性物质， 通过大量研究已被证实具有免疫调节、 抗肿瘤、 抗病毒、 抗氧化及抗感染等多种 生物活性， 且对机体的毒副作用小。 因此， 具有生物活性的多糖已日益受到重视。

目前， 以糖类为基础的药物研究和开发已逐渐成为国 内外医药界的前沿课题。 而糖类物质， 尤其是中草药来源的多糖物质基于生物功能广 泛， 毒副作用小、 资 源丰富等诸多优势， 也受到各国研发人员的极大重视， 具有潜在广泛的应用前景。

金银花作为一种重要的传统中药， 为藤蔓植物忍冬的干燥花蕾， 据 《神农本 草经》 记载， 其性寒， 味甘， 有清热解毒、 疏风散热之功效， 临床上主要用于治 疗风热感冒、 痈肿疖毒、 热毒血痢、 痔漏便血等。 金银花富含多种活性成分且组 成复杂， 药理研究表明这些化合物具有广谱抗菌、 抗病毒、 抗肿瘤、 增强免疫及 解热抗炎、 保肝利胆、 抗溃疡等多种生物活性。

多糖物质作为金银花药效的重要组成部分， 目前研究较少。 现有的几项对于 金银花多糖的研究仅限于对其粗多糖的提取 ^[1 — ^3] 及抑菌抗氧化生物活性等的初步 筛选 ^[4 — ^6] 。 金银花多糖在治疗神经系统疾病中的作用， 尚无报道。 阿尔茨海默病 (Alzheimer's disease, AD ) 亦称为早老性痴呆， 是一种慢性进行性的神经退行性 疾病， 主要表现为渐进性的记忆能力下降， 认知功能障碍以及失去生活独立自理 能力。 随着人口老龄化的不断加剧， AD的发病率也逐年升高， 已成为最重要的公 众关注的健康问题之一 ^[7] 。

β淀粉样蛋白 (； β-amyloid protein, Αβ)在脑内的异常表达和沉积是目前认为引发 AD的核心环节 ^[8] 。 在 AD患者中， 由于 AD相关基因突变、 金属离子浓度增加及 pH改变等因素， 导致脑内微环境改变， 从而引发淀粉样蛋白的构象发生变化， 即 由 α-螺旋转变为易于聚集成纤维状的 β-折叠， 从而可干扰 Ca ²⁺ 稳态、 引发氧化应 激、 线粒体功能障碍、 炎症反应、 诱导 Tau蛋白过度磷酸化和导致神经元丢失等 级联神经毒性， 而最终导致痴呆 ^[9] 。 因此， 基于 Αβ的神经毒性， 以 Αβ为作用靶 点， 寻找减少 Αβ形成、 抑制 Αβ聚集和加速 Αβ降解的药物是目前治疗 AD药物 的研究热点 ^[1Q] 。

我们实验发现， 中药金银花来源的多糖可在体外显著抑制 Αβ ₄₂ 聚集， 并在人 神经瘤母细胞水平上抑制 Αβ ₄₂ 聚集诱导的细胞毒性， 具有潜在的治疗阿尔兹海默 症的作用。

[1]张玉， 马力， 陈文. 醇析水提法提取金银花多糖 [J]. 医药导报, 2006, 25(11): 1 118-1 120.

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[3] 赵鹏， 李稳宏， 朱骤海， 等. 响应面法优化金银花多糖超声提取工艺研究 [J]. 食品科学， 2009, 30(20): 151-154

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[5]林雄平， 陈晓清， 苏育才， 等. 金银花和苦丁茶多糖提取物抗菌活性研究 [J]. 亚热带植物科学， 2008, 37(1): 51-53.

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本发明利用一种简单有效的多糖提取工艺和方 法， 以金银花为原料获得了一 种 α-1,4-葡聚糖， 药理实验表明， 所述 α-1,4-葡聚糖在 100 g/ml的浓度下， 在体 外可完全抑制 Αβ ₄₂ 的聚集，并在细胞水平上抑制 Αβ ₄₂ 聚集引发的细胞毒性，因此， 所述 α-1,4-葡聚糖有望开发成为一种治疗阿尔兹海� �症的糖类药物。

本发明的一个目的在于提供一种 α-1,4-葡聚糖， 其结构式如下：

-D-GJ cp-( I [™* 4 )- -D-G1c -( ί χ

- { [— 4)-α -D-GIc ~( I ]y ~*4-α- D-Glc ?-( 1 a- 其中， χ和 y为整数且 x + y = 14;

n为正整数；

重均分子量范围为： 约 10-100 kDa。

所述 α-1,4-葡聚糖的重均分子量优选为约 15-80 kDa， 更优选为 20-50 kDa。 本发明的另一目的是提供一种以金银花为原料 制备所述 α-1,4-葡聚糖的方法。 所述方法包括以下步骤：

a. 多糖提取： 干燥的金银花经乙醇脱脂、 水提、 过滤， 将所得滤液浓缩， 再 经 15%三氯乙酸脱蛋白， 中和、 透析、 浓缩、 醇沉、 离心、 真空干燥， 得水提金 银花粗多糖；

b. 多糖纯化： 将所述水提金银花粗多糖先用 DEAE纤维素阴离子柱进行初步 分级， 水洗脱得中性多糖组分， 进而用凝胶色谱柱纯化， 得 α-1,4-葡聚糖。

优选地， 所述方法包括以下步骤：

a. 多糖提取： 干燥的金银花经 75%-95%乙醇脱脂， 干燥， 加入去离子水， 加 热条件下提取， 过滤， 残渣再次用去离子水提取， 如此反复提取 2-6 次， 滤液合 并， 加热浓缩， 浓缩液经终浓度为 15%的三氯乙酸在 4 °C下脱蛋白， 离心， 上清 液经中和， 透析， 再浓缩， 加入 3倍于浓缩液体积的 75%-95%乙醇， 离心得沉淀， 沉淀经真空干燥得水提金银花粗多糖； b. 多糖纯化： 取所述金银花粗多糖， 水溶解， 离心， 上清液通过 DEAE纤维 素阴离子柱进行分离， 以蒸馏水洗脱， 硫酸 -苯酚检测， 收取合并洗脱液， 浓缩冷 冻干燥得水洗脱组分， 进而采用 G150凝胶色谱柱分离， 纯化得 α-1,4-葡聚糖。

更优选地， 所述方法包括以下步骤：

a. 多糖提取： 干燥的金银花经 95%乙醇脱脂 7-10 天， 室温自然干燥， 干燥 后的金银花加入 20倍重量的去离子水， 100 °C下提取 2-6次， 每次 5-7 h， 滤液合 并， 加热浓缩， 浓缩液经终浓度为 15%的三氯乙酸在 0-4 °C下脱蛋白， 离心， 上 清液经中和， 透析， 再浓缩， 加入 3倍于浓缩液体积的 95%乙醇， 离心得沉淀， 沉淀经真空干燥得水提金银花粗多糖；

b. 多糖纯化： 取所述金银花粗多糖， 加入 10倍重量的水中溶解， 离心， 上清 液通过 DEAE纤维素阴离子柱进行分离， 以蒸馏水洗脱， 硫酸 -苯酚检测， 收取合 并洗脱液， 浓缩冷冻干燥得水洗脱组分， 将该水洗脱组分溶于 0-0.2 mol/L NaCl， 离心后通过 G150凝胶色谱柱分离， 纯化得 α-1,4-葡聚糖。

多糖结构鉴定：

经高效凝胶渗透色谱法 (HPGPC)测定，根据本发明的 α-1,4-葡聚糖的重均分子 量范围约为 10-100 kDa。 将其进行糖组成分析， 即将多糖完全水解、 还原、 乙酰 化、萃取、浓缩后送入气相色谱仪分析。糖组 成分析结果显示，根据本发明的 α-1,4- 葡聚糖只含葡萄糖单元。 然后用碘甲烷进行反应至多糖完全甲基化， 再完全酸水 解、 还原、 乙酰化、 萃取、 浓缩后用气相色谱仪和质谱仪分析。 结合红外和核磁 共振分析 (参见图 2和 3)和甲基化结果， 确定根据本发明的 α-1,4-葡聚糖是以 α-1,4 连接的葡萄糖为主链， 并在 C6位伴有少量 α-1,4连接的葡聚糖分支结构， 平均每 16个葡萄糖残基含有 1个支链。

本发明的又一目的是提供根据本发明的 α-1,4-葡聚糖在制备治疗由 β-淀粉样 蛋白诱导的神经系统损伤的药物中的用途。 优选地， 本发明提供根据本发明的 α-1,4-葡聚糖在制备治疗阿尔兹海默症的药物� �的用途。

本发明的再一目的在于提供包含本发明的 α-1,4-葡聚糖和药学上可接受的载 体的药物组合物， 其中， 所述组合物中含有重量比为 0.01%-99.95%的 α-1,4-葡聚 糖作为活性成分。 该药物组合物优选含有重量比为 0.1%-99.9%的 α-1,4-葡聚糖作为活性成分， 较佳地， 含有重量比为 0.1%-99.5%的 α-1,4-葡聚糖作为活性成分， 更优选含有重 量比为 0.5%-95%的活性成分。

该药物组合物，含有治疗有效量的本发明 α-1,4-葡聚糖，具有显著的治疗由 β- 淀粉样蛋白诱导的神经系统损伤的功效。 本发明的药物组合物可用于制备治疗由 β -淀粉样蛋白诱导的神经系统损伤的药物。较� �地， 所述由 β -淀粉样蛋白诱导的 神经系统损伤为阿尔兹海默症。

可将 α-1,4-葡聚糖与可药用赋形剂、稀释剂等药学� �可接受的载体的混合物以 片剂、 胶囊、 颗粒剂、 散剂或糖浆剂的形式口服给药或以注射剂的形 式非口服给 药。 上述制剂可通过常规制药方法制备。 可用的药学上可接受的载体的例子包括 赋形剂 (；例如糖类衍生物如乳糖、 蔗糖、 葡萄糖、 甘露糖醇和山梨糖醇； 淀粉衍生 物如玉米淀粉、 土豆淀粉、 糊精和羧甲基淀粉； 纤维素衍生物如结晶纤维素、 羟 丙基纤维素、 羧甲基纤维素、 羧甲基纤维素钙、 羧甲基纤维素钠； 阿拉伯胶； 右 旋糖酐； 硅酸盐衍生物如偏硅酸镁铝； 磷酸盐衍生物如磷酸钙； 碳酸盐衍生物如 碳酸钙； 硫酸盐衍生物如硫酸钙等；)、粘合剂 (例如明胶、 聚乙烯吡咯烷酮和聚乙二 醇；)、 崩解剂 (例如纤维素衍生物如羧甲基纤维素钠、 聚乙烯吡咯烷酮；)、 润滑剂 (例 如滑石、 硬脂酸钙、 硬脂酸镁、 鲸蜡、 硼酸、 苯甲酸钠、 亮氨酸)、 稳定剂 (对羟基 苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯等；)、矫味� � (例如常用的甜味剂、酸味剂和香料等；)、 稀释剂和注射液用溶剂 (例如水、 乙醇和甘油等；)。

使用药物组合物时， 是将安全有效量的本发明 α-1,4-葡聚糖施用于哺乳动物， 其中该安全有效量通常至少约 1微克 /天， 而且在大多数情况下不超过约 10毫克 / 千克体重。 较佳地， 该剂量是约 1微克 /天-约 3毫克 /千克体重。 当然， 具体剂量 还应考虑给药途径、 病人健康状况等因素， 这些都是在熟练医师技能范围之内的。

此外， 本发明 α-1,4-葡聚糖可以单药使用， 也可以与其它药物联合使用。优选 的联合使用包括： 与外科手术联合使用， 与一种或多种西药联合使用， 与中草药 联合使用， 与放射性治疗联合使用。 本发明的药物组合物的给药途径没有特别限制 ， 其中包括但并不限于： 口服 给药， 注射给药， 瘤内给药， 植入给药， 腔内给药， 肛门给药， 透皮给药， 内外 敷； 优选的注射给药包括： 静脉注射， 肌肉注射， 皮下注射， 腔内注射。

本发明通过以下附图和实施例作进一步阐述， 但并不限制本发明的内容。 附图说明

图 1为实施例 1的 α-1,4-葡聚糖 LJW0F2的纯度鉴定图；

图 2为实施例 1的 α-1,4-葡聚糖 LJW0F2的红外光谱图 (infrared spectrogram,

IR) _;

图 3为实施例 1的 α-1,4-葡聚糖 LJW0F2的 ¹³ C NMR谱图；

图 4为实施例 1的 α-1,4-葡聚糖 LJW0F2抑制 Αβ ₄₂ 聚集活性测定结果； (图 4Α 为硫磺素荧光检测结果； 图 4Β为 Αβ ₄₂ 单独孵育 7天后原子力显微镜检测结果； 且图 4C为 LJW0F2与 Αβ ₄₂ 共孵育 7天后原子力显微镜检测结果）

图 5为实施例 1的 α-1,4-葡聚糖 LJW0F2抑制 Αβ ₄₂ 聚集诱导的神经元细胞毒 性结果。 具体实施方式

实施例 1 : α-1,4-葡聚糖 LJW0F2的制备

a. 多糖提取：

干燥的金银花 （产地为山东省平邑县， 购自上海养和堂药业连锁经营有限公 司）， 用 95%的乙醇脱脂一周， 然后室温自然干燥。 干燥后的金银花 1000 g用沸 水 20 L提取 5次， 每次 6 h。 硫酸 -苯酚检测至无明显反应， 过滤， 将每次的提取 液合并后加热浓缩至 3 L， 冷却后加入约 500 g三氯乙酸使其最终浓度为 15%， 在 4 °C下脱蛋白， 后经离心， 上清液经 I mol/L NaOH中和至 pH值为 7.0， 然后对流 动水透析 72 h， 透析袋内液浓缩至 2 L体积， 在搅拌下加入三倍体积的 95%乙醇， 静置过夜， 倾去上清液， 离心分离， 所得沉淀用 2倍体积的无水乙醇洗涤， 离心 分离， 沉淀置 40°C下真空干燥， 得水提金银花粗多糖 LJW 75 g。

b. 多糖纯化： 取上述制备的金银花粗多糖 LJW IO g, 100 mL水溶解， 离心除去不溶物， 上 清液通过 C1—型 DEAE-纤维素柱 （GE Lifescience公司） 进行初步分离。 以蒸馏水 洗脱， 硫酸-苯酚法绘制洗脱曲线， 根据洗脱曲线收取合并洗脱液。 洗脱液经浓缩 以及冷冻干燥后得多糖 LJW0 2.4 g。 取 LJW0 200 mg加入 2 mL 0.2 M NaCl溶解 并离心， 上清液通过 G150凝胶色谱柱 （GE Lifescience公司） 进行纯化， 流速为 0.3 mL/min, 硫酸-苯酚法绘制洗脱曲线， 根据洗脱曲线分别收取合并洗脱液， 如 此反复纯化得到多糖组分 LJW0F2 100 mg。

实验实施例 1 : 多糖结构解析：

经高效凝胶色谱法 （； HPGPC)分析表明 LJW0F2 的相对重均分子量约为 37.1 kDa,其纯度测定图见图 1。糖组成分析表明 LJW0F2为一葡聚糖。红外图谱显示， 3403 cm— ¹ 为 O-H伸缩振动吸收峰， 2927 cm— ¹ 为 C-H伸缩振动吸收峰， 1000-1400 cm— ¹ 附近为 C-O和糖环振动信号， 1720 cm— ¹ 附近没有吸收峰， 表明该多糖不含有 糖醛酸（图 2)。 ¹³ C NMR谱中， 位于 δ100.98的碳信号， 为 α-葡聚糖的 C-1信号。 其他碳信号依次为 C-2(572.97), C-3(574.60), C-4(578.08), C-5(572.61)和 C6(561.70) (图 3 )。

多糖 LJW0F2 中糖残基连接方式的种类及比例可用甲基化分 析。 结果表明， LJW0F2 的葡萄糖残基有三种连接方式， 分别为 1,4-、 1,4,6-以及末端连接葡萄糖 基， 其比例为 14: 1: 1。 从上述比例可以发现， LJW0F2的主链结构应为 1,4-连接的 葡聚糖结构， 并且在主链的部分 C6位带有 1,4-连接的葡聚糖分支结构。

以上结果表明 LJW0F2的结构为：

0, D-Gic/J ( 1 [一 4)- ft- D- Gicp~( I ]x

6

- {|~*4)»α 4)-Glcp ( Ϊ ] 4 «.-D - Glc/?»( I -*} n- 其中， x和 y为整数且 x + y = 14;

实验实施例 2

抑制 0 ₄₂ 聚集试验

1 ) 硫磺素荧光标记实验 将 Αβ ₄₂ 粉末 （Rpeptide 公司） 溶于 110 μL无水 DMSO中 （浓度为 2 mM) , 配成母液。 取 ΙμΙ^该溶液溶于 19 μL磷酸缓冲液 (50 mM 磷酸盐， pH 7.5, 100 mM NaCl, 0.02% NaN ₃ )中， 或 1 该溶液加入 10 不同浓度的 LJW0F2多糖溶液 (0.5 mg/mL, 1.0 mg/mL, 2.0 mg/mL ) 再加入 9 μL PBS缓冲液， 37 °C共孵育 30 min，加入硫磺素溶液（6.25 μΜ硫磺素溶于 50 mM甘氨酸 -NaOH, pH 8.5 ) 80 L, 37 °C共孵育， 每隔 2 h用酶标仪检测 (Novostar, BMG labtech 公司）， 检测波长为 Ex=450/10 nm, Em=483/10■。

由图 4A可见， α-1,4-葡聚糖 LJW0F2在 100 g/mL的终浓度下， 能完全抑制 Αβ ₄₂ 的聚集。

2 ) 原子力显微镜检测实验

为进一步验证多糖 LJW0F2抑制 Αβ ₄₂ 聚集的结果， 采用原子力显微镜观察多 糖 LJW0F2对 Αβ ₄₂ 聚集形态的影响。 将 1 浓度为 2 mM的 Αβ ₄₂ , 10 μL浓度为 1.0 mg/mL的 LJW0F2多糖溶液溶于 89 μ 双蒸水中， 37 °C共孵育 7天。 将 1 浓度为 2 mM的 Αβ ₄₂ 溶于 99 μL Millipore 水中， 或将 10 μL浓度为 1.0 mg/mL的 LJW0F2多糖溶液溶于 90 L Millipore 水中， 37 °C孵育 7 天， 作为对照。取 5 将样品溶液滴在干净的云母片上并小心吹干， 在原子力显微镜下 （Nanoscope Ilia, Veeco Instrucments 公司） 的轻敲模式下进行测试。

由图 4B可观察到， Αβ ₄₂ 在单独孵育 7天后，出现大量寡聚体，而与多糖 LJW0F2 共孵育 7天后 （图 4C)， 未发现明显的聚集。 该结果与硫磺素荧光检测结果相吻 合， 证明多糖具有抑制 Αβ ₄₂ 聚集的活性。

实验实施例 3 :

α-1,4-葡聚糖 LJW0F2抑制 Αβ ₄₂ 聚集导致的神经元细胞毒性实验

1 ) 细胞培养

人神经母细胞瘤细胞 SH-SY5Y (购自中国科学院细胞库） 用体积比 1: 1 的 MEM和 Ham's F12 培养基（含 10%胎牛血清）于 5% CO ₂ 培养箱 37 °C培养， 2-3 天换液 1次。 细胞贴壁长满后， 用 0.25%胰蛋白酶 （Invitrogen公司） 消化后， 以 35000个细胞 /孔接种到 96孔细胞培养板， 每孔体积 100 37 °C培养 16 h， 使 细胞贴壁。 不同浓度的 α-1,4-葡聚糖 LJW0F2溶液 （0， 1000， 100， 10 g/mL ) 同 Αβ ₄₂ (200 μΜ)或者等体积的 DMSO, 37 °C水浴孵育 4天后，吸去培养过夜细胞上清， 加入用培养基稀释的上述孵育 4天的溶液， 每孔 100 L， 使 Αβ ₄₂ 终浓度为 2 μΜ， α-1,4-葡聚糖 LJW0F2终浓度为 （0， 10 g/mL， 1 g/mL， 0.1 g/mL)。 37 °C继续 培养 48 h， CCK-8测定细胞存活率。

2 ) 细胞计数试剂盒 (Cell Counting Kit-8， CCK-8)测定

每孔加 CCK-8溶液 10 继续孵育 4 h， 选择 450 nm波长， 在酶联免疫监 测仪上 (； Novostar, BMG labtech 公司;)测定各孔光吸收值，记录结果，计算细� ��存活 率。

如图 5所示， 1 ) Αβ ₄₂ 单独孵育 4天， 加入 SH-SY5Y细胞后， 该细胞存活率 较正常组下降 10%左右， 说明 Αβ ₄₂ 寡聚体对 SH-SY5Y细胞产生了细胞毒性。 2) 当 Αβ ₄₂ 与不同浓度 α-1,4-葡聚糖 LJW0F2共孵育 4天， 加入 SH-SY5Y细胞后， 该 细胞的存活率恢复到正常水平， 说明 α-1,4-葡聚糖 LJW0F2可抑制 Αβ ₄₂ 聚集诱导 的神经细胞毒性。 而 α-1,4-葡聚糖 LJW0F2单独加入 SH-SY5Y细胞， 对该细胞的 成活无明显影响。这些结果表明， α-1,4-葡聚糖 LJW0F2能够通过抑制 Αβ ₄₂ 的寡聚 化进而保护其对神经元细胞 SH-SY5Y的损伤。