CATHEPSIN D INHIBITOREN

Die vorliegende Erfindung betrifft Verbindungen der Formel I und

insbesondere Arzneimittel enthaltend wenigstens eine Verbindung der Formel I zur Verwendung bei der Behandlung und/oder Prophylaxe von physiologischen und/oder pathophysiologischen Zuständen, an deren

Auslösung Cathepsin D beteiligt ist, insbesondere zur Verwendung bei der Behandlung und/oder Prophylaxe von Arthrose, traumatischen

Knorpelverletzungen, Arthritis, Schmerz, Allodynie oder Hyperalgesie.

Hintergrund der Erfindung

Arthrose ist die weltweit am weitesten verbreitete Gelenkserkrankung und radiologische Hinweise auf Arthrose findet man in der Mehrheit der über 65- Jährigen. Trotz dieser wesentlichen Bedeutung für das Gesundheitssystem bleiben die Ursachen der Arthrose bislang unklar und wirksame

vorbeugende Maßnahmen weiterhin ein entferntes Ziel. Die Verringerung des Gelenkspaltes (bedingt durch die Zerstörung des Gelenkknorpels), verbunden mit Veränderungen im subchondralen Knochen und

Osteophytenbildung sind die radiologischen Charakteristiken der

Erkrankung. Für den Patienten stehen jedoch Schmerzen

(belastungsabhängige und nächtliche Ruheschmerzen) mit nachfolgenden Funktionseinschränkungen im Vordergrund. Diese sind es auch, die den Patienten in die soziale Isolierung mit entsprechenden Folgeerkrankungen treiben.

Der Begriff Arthrose bezeichnet nach einer nicht-amtlichen Definition in Deutschland einen„Gelenkverschleiß", der das altersübliche Maß übersteigt. Ursächlich werden ein Übermaß an Belastung (etwa erhöhtes

Körpergewicht), angeborene oder traumatisch bedingte Ursachen, wie Fehlstellungen der Gelenke oder auch knöcherne Deformierungen durch Knochenerkrankungen wie Osteoporose gesehen. Die Arthrose kann ebenfalls als Folge einer anderen Erkrankung, beispielsweise einer

Gelenkentzündung (Arthritis) entstehen (sekundäre Arthrose) oder mit überlastungsbedingter Ergussbildung (sekundäre Entzündungsreaktion) einhergehen (aktivierte Arthrose). Die anglo-amerikanische Fachliteratur unterscheidet zwischen der Osteoarthrose (engl. Osteoarthritis [OA]), bei welcher die Zerstörung der Gelenkflächen wahrscheinlich hauptsächlich auf Belastungseinwirkungen zurückzuführen sind, und der Arthritis (engl, arthritis, rheumatoid arthritis [RA]), bei welcher die Gelenkdegeneration durch eine Entzündungskomponente im Vordergrund steht.

Grundsätzlich unterscheidet man die Arthrose auch nach ihrer Ursache. Der Arthrosis alcaptonurica liegt eine vermehrte Ablagerung von

Homogenitinsäure in Gelenken bei vorbestehender Alkaptonurie zugrunde. Bei der hämophilen Arthrose liegen regelmäßige intraartikuläre Blutungen bei Hämophilie (Blutergelenk) vor. Die Arthrosis urica wird durch den mechanischen Einfluss von Uratkristallen (Harnsäure) auf den gesunden Knorpel hervorgerufen (W. Pschyrembel et al.: Klinisches Wörterbuch mit klinischen Syndromen und einem Anhang Nomina Anatomica. Verlag Walter de Gruyter & Co, 253. Auflage, 1977).

Klassische Ursache einer Arthrose stellt die Dysplasie von Gelenken dar. Am Beispiel der Hüfte wird deutlich, dass die mechanisch am meisten belastete Zone bei einer physiologischen Hüftstellung eine deutlich größere Fläche darstellt, als bei einer dysplastischen Hüfte. Die Belastungen durch die auf das Gelenk einwirkenden Kräfte sind von der Gelenkform jedoch weitgehend unabhängig. Sie verteilen sich im Wesentlichen auf die

Hauptbelastungszone(n). Dadurch wird bei einer kleineren Zone eine höhere Druckbelastung als bei einer größeren auftreten. Die biomechanische Druckbelastung des Gelenkknorpels ist somit bei einer dysplastischen Hüfte größer als bei physiologischer Hüftstellung. Diese Gesetzmäßigkeit wird allgemein ursächlich für das gehäufte Auftreten arthrotischer Veränderungen an von der anatomischen Idealform abweichenden, tragenden Gelenken gesehen.

Sind die Folgen einer Verletzung für einen vorzeitigen Verschleiß

verantwortlich, so spricht man von einer posttraumatischen Arthrose. Als weitere Ursachen einer sekundären Arthrose werden mechanische, entzündliche, metabolische, chemische (Chinolone), trophische, hormonelle, neurologische und genetische Gründe diskutiert. In den meisten Fällen wird als Diagnose jedoch eine idiopatische Arthrose angegeben, womit der Arzt ein scheinbares Fehlen einer ursächlichen Erkrankung zum Ausdruck bringt (H. I. Roach und S. Tilley, Bone and Osteoarthritis F. Bronner und M. C. Farach-Carson (Editors), Verlag Springer, Band 4, 2007).

Medikamentöse Ursachen für eine Arthrose können beispielsweise

Antibiotika vom Typ der Gyrasehemmer (Fluorchinolone, wie Ciprofloxacin, Levofloxacin) sein. Diese Arzneimittel führen in schlecht vaskularisierten Geweben (hyaliner Gelenkknorpel, Sehnengewebe) zu einer Komplexierung von Magnesium-Ionen, was zur Folge hat, dass irreversible Schäden am Bindegewebe entstehen. Diese Schäden sind bei Kindern und Jugendlichen in der Regel in der Wachstumsphase ausgeprägter. Tendopathien und

Arthropathien sind bekannte Nebenwirkungen dieser Medikamentenklasse. Beim Erwachsenen führen diese Antibiotika nach Informationen von unabhängigen Pharmakologen und Rheumatologen zu einem

beschleunigten physiologischen Abbau des hyalinen Gelenkknorpels (M. Menschik et al., Antimicrob. Agents Chemother. 41 , 1997, S. 2562-2565; M. Egerbacher et al., Arch. Toxicol. 73, 2000, S. 557-563; H. Chang et al., Scand. J. Infect. Dis. 28, 1996, S. 641-643; A. Chaslerie et al., Therapie 47, 1992, S. 80). Auch eine langjährige Behandlung mit Phenprocoumon kann durch Abnahme der Knochendichte bei Belastungen der

Gelenkbinnenstruktur eine Arthrose begünstigen. Neben dem Alter sind mechanische Überbelastungen, (Mikro-) Traumata, durch Verlust der Sicherungsmechanismen verursachte Destabilisierungen der Gelenke, sowie genetische Faktoren als Risikofaktoren für

Osteoarthrose bekannt. Jedoch sind weder die Entstehung noch

Interventionsmöglichkeiten vollständig geklärt (H. I. Roach und S. Tilley, Bone and Osteoarthritis F. Bronner und M. C. Farach-Carson (Editors), Verlag Springer, Band 4, 2007).

In einem von Arthrose betroffenen Gelenk ist der Gehalt von

Stickstoffmonoxid zeitweise erhöht. Ähnliches konnte durch hohe

mechanische Reizung von Knorpelgewebe beobachtet werden (P. Das et al., Journal of Orthopaedic Research 15, 1997, S. 87-93. A. J. Farrell et al. Annais of the Rheumatic Diseases 51 , 1992, S. 1219-1222; B. Fermor et al., Journal of Orthopaedic Research 19, 2001 , S. 729-737), wohingegen eine mäßige mechanische Stimulation sich eher positiv auswirkt. Damit sind mechanische Krafteinwirkungen ursächlich an dem Voranschreiten der Osteoarthrose beteiligt (X. Liu et al., Biorheology 43, 2006, S. 183-190).

Grundsätzlich verfolgt die Therapie der Arthrose zwei Ziele. Zum einen die Schmerzfreiheit unter üblicher Belastung und zum anderen die Verhinderung mechanischer Einschränkungen oder Veränderungen eines Gelenkes. Diese Ziele können langfristig nicht durch eine Schmerzbehandlung als rein symptomatischer Therapieansatz erreicht werden, da durch diese das Voranschreiten der Erkrankung nicht aufgehalten werden kann. Soll letzteres erreicht werden, muss die Knorpelzerstörung gestoppt werden. Da sich der Gelenksknorpel beim erwachsenen Patienten nicht regenerieren kann, ist die Beseitigung pathogenetischer Faktoren wie Gelenkdysplasien oder Fehlstellungen, die zu vermehrter punktueller Druckbelastung des

Gelenkknorpels führen, zusätzlich enorm wichtig.

Schließlich versucht man mit medikamentöser Hilfe die

Degenerationsprozesse im Knorpelgewebe zu verhindern oder zu stoppen. Wesentlich für den Funktionszustand des Gelenkknorpels und damit für dessen Widerstandsfähigkeit gegenüber Belastungen ist die extrazelluäre Matrix, die in erster Line aus Kollagenen, Proteoglykanen und Wasser besteht. Zu den Enzymen, die an der Degradation der extrazellulären Matrix beteiligt sind, zählen vor allem die Metalloproteasen, Aggrecanasen und die Cathepsin-Enzyme. Aber auch weitere Enzyme können prinzipiell

Knorpelmatrix abbauen, beispielhaft werden Plasmin, Kallikrein,

Neutrophilelastase, Tryptase und Chymase genannt.

Cathepsine gehören der Papain-Superfamilie der lysosomalen Proteasen an. Cathepsine sind an der normalem Proteolyse und dem Umsatz von Zielproteinen und Geweben beteiligt, sowie an der Initiierung von

proteolytischen Kaskaden und Proenmzyaktivierungen. Darüber hinaus sind sie an der MHC Klasse II Expression beteiligt (Baldwin (1993) Proc. Natl. Acad. Sei., 90: 6796-6800; Mixuochi (1994) Immunol. Lett., 43: 189-193). Eine abnorme Cathepsin-Expression kann allerdings zu schwerwiegenden Erkrankungen führen. So konnte eine erhöhte Cathepsin-Expression in Krebszellen, beispielsweise bei Brust-, Lungen-, Prostata-, Glioblastom-, und Kopf- und Halskrebs nachgewiesen werden und es konnte gezeigt werden, dass Cathepsine mit einem ungenügenden Therapieerfolg bei Brust-, Lungen-, Kopf- und Halskrebs, sowie Gehirntumoren assoziiert sind (Kos et al. (1998) Oncol. Rep., 5: 1349-1361 ; Yan et al. (1998) Biol. Chem., 379: 113-123; Mort et al. ; (1997) Int. J. Biochem. Cell Biol., 29: 715-720;

Friedrick et al. (1999) Eur. J Cancer, 35: 138-144). Außerdem ist

augenscheinlich eine abnorme Cathepsin-Expression an der Ausbildung von entzündlichen und nicht-entzündlichen Erkrankungen beteiligt, wie

beispielsweise rheumatoider Arthritis und Osteoarthrose (Keyszer (1995) Arthritis Rheum., 38: 976-984).

Der molekulare Mechanismus der Cathepsinaktivität ist nicht vollständig aufgeklärt. Auf der einen Seite wurde gefunden, dass beispielweise eine induzierte Cathepsin-Expression B-Zellen, denen Serum entzogen wird, vor der Apoptose bewahrt und dass eine Behandlung der Zellen mit Antisense- Oligonukleotiden von Cathepsin B eine Apoptose induziert (Shibata et al. (1998) Biochem. Biophys. Res. Commun., 251 : 199-20; Isahara et at. (1999) Neuroscience, 91 : 233-249). Diese Berichte legen eine anti-apoptotische

Rolle der Cathepsine nahe. Diese stehen jedoch im genauen Gegensatz zu früheren Berichten, die Cathepsine als Apoptosemediatpren beschreiben (Roberts et al (1997) Gastroenterology, 13: 1714-1726; Jones et al. (1998) Am. J. Physiol., 275: G723-730).

Cathepsine werden als inaktive Zymogene an Ribosomen synthetisiert und ins lysosomale System überführt. Nach proteolytischer Abspaltung des N- terminalen Propeptids steigt die Cathepsinkonzentration im sauren Milieu der Lysosomen auf bis zu 1 mM an und die Cathepsine werden von den Lysosomen ins extrazelluläre Medium freigesetzt.

Bei den Cathepsinen unterscheidet man die Cysteincathepsine B, C, H, F, K, L, O, S, V und W, die Aspartylcathepsine D und E und das Serincathepsin G.

Beispiele für Cathepsin-Inhibitoren in der klinischen Entwicklung sind

Cathepsin K Inhibitoren zur Behandlung von Arthrose und Cathepsin S Inhibitoren zur Behandlung von Arthritis, neuropathischem Schmerz und Psoriasis.

Zu den Aspartylproteasen zählt man neben Cathepsin D auch die HIV

Aspartylprotease (HIV-1 Protease), Renin, Pepsin A and C, BACE (Asp2, Memapsin), Plasmepsine und die Aspartylhämoglobinasen (Takahashi, T. et al., Ed. Aspartic Proteinases Structure, Function, Biology and Biomedical Implications (Plenum Press, New York, 1995), Adams, J. et al., Ann. Rep. Med. Chem. 31 , 279-288, 1996; Edmunds J. et al., Ann. Rep. Med. Chem. 31, 51-60, 1996; Miller, D. K. et al., Ann. Rep. Med. Chem 31 , 249-268, 1996). Cathepsin D ist normalerweise an der Degradation von intrazellulären oder phagozytierten Proteinen beteiligt und spielt somit eine wichtige Rolle im Proteinmetabolismus (Heiseth, et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81 , 3302-3306, 1984), beim Proteinkatabolismus (Kay, et al., Intracellular Protein Catabolism (eds. Katunuma, et al., 55-162, 1989) und bei der

Antigenprozessierung (Guagliardi, et al., Nature, 343, 133-139, 1990; Van Noort, et al., J. Biol. Chem., 264, 14159-14164, 1989).

Erhöhte Cathepsin D-Spiegel werden mit einer Reihe von Krankheiten in Zusammenhang gebracht. So korrelieren erhöhte Cathepsin D-Spiegel mit schlechter Prognose bei Brustkrebs und mit erhöhter Zellinvasion und erhöhtem Risiko von Metastasen, sowie kürzerer rezidivfreien

Überlebenszeit nach Therapie und einer insgesamt niedrigeren

Überlebensrate (Westley B. R. et al., Eur. J. Cancer 32, 15-24, 1996;

Rochefort, H., Semin. Cancer Biol. 1 :153, 1990; Tandon, A. K. et al., N. Engl. J. Med. 322, 297, 1990). Die Cathepsin D-Sekretionsrate bei

Brustkrebs wird durch eine Überexpression des Gens und durch ein verändertes Processing des Proteins vermittelt. Erhöhte Spiegel von

Cathepsin D und anderer Proteasen, wie beispielsweise Kollagenase, hergestellt in unmittelbarer Nähe zu einem wachsenden Tumor, könnten dabei die extrazelluläre Matrix in der Tumorumgebung degradieren und hierdurch die Ablösung von Tumorzellen und die Invasion in neue Gewebe über das Lymph- und Kreislaufsystem vermitteln (Liotta L. A., Scientific American Feb:54, 1992; Liotta L. A. and Stetler-Stevenson W. G., Cancer Biol. 1 :99, 1990; Liaudet E., Cell Growth Differ. 6:1045-1052, 1995; Ross J. S., Am. J. Clin. Pathol. 104:36-41 , 1995; Dickinson A. J., J. Urol. 154:237- 241 , 1995).

Cathepsin D wird außerdem mit degenerativen Veränderungen im Gehirn in Verbindung gebracht, wie beispielsweise Alzheimer Krankheit. So ist

Catepsin D mit der Spaltung des Amyloid-ß-Protein-Vorläufers bzw. eines mutanten Vorläufers assoziiert, der die Expression des Amyloid-Proteins in transfizierten Zellen erhöht (Cataldo, A. M. et al., Proc. Natl. Acad. Sei. 87: 3861 , 1990; Ladror, U. S. et al., J. Biol. Chem. 269: 18422, 1994, Evin G. ₍ Biochemistry 34: 14185-14192, 1995). Das Amyloid-ß-Protein, das durch die Proteolyse des Amyloid-ß-Protein-Vorläufers entsteht, führt zur Bildung von Plaques im Gehirn und scheint für die Ausbildung der Alzheimer-Krankheit verantwortlich zu sein. Erhöhte Cathepsin D-Spiegel wurden auch in der Zerebrospinalflüssigkeit von Alzheimer-Patienten gefunden und es konnte eine hohe proteolytische Aktivität von Cathepsin D gegenüber dem mutanten Amyloid-ß-Protein-Vorläufer gezeigt werden (Schwager, A. L, et al. J.

Neurochem. 64:443, 1995). Darüber hinaus wird eine signifikante Zunahme der Cathepsin D-Aktivität in Biopsien von Chorea Huntington-Patienten gemessen (Mantle D., J. Neurol. Sei. 131 : 65-70, 1995).

Bei der Ausprägung einer Arthrose spielt Cathepsin D vermutlich auf verschiedenen Ebenen eine wesentliche Rolle. So werden in Hunden mit spontaner Arthrose im Vergleich gesunden Hunden im Gelenkknorpel des Hüftgelenkkopfes erhöhte mRNA-Spiegel von Cathepsin D gemessen (Clements D. N. et al., Arthritis Res. Ther.. 2006; 8(6): R158; Ritchlin C. et al., Scand. J. Immunnol. 40: 292-298, 1994). Auch Devauchelle V. et al. (Genes Immun. 2004, 5(8): 597-608) zeigen bei menschlichen Patienten unterschiedliche Expressionsraten von Cathepsin D bei Arthrose im

Vergleich zu rheumatoider Arthritis (siehe auch Keyszer G. M., Arthritis Rheum. 38: 976-984, 1995). Auch bei Mucolipidose scheint Cathepsin D eine Rolle zu spielen (Kopitz J., Biochem. J. 295, 2: 577-580, 1993).

Die lysosomale Endopeptidase Cathepsin D ist die am weitesten verbreitete Proteinase in den Chondrozyten (Ruiz-Romero C. et al., Proteomics. 2005, 5(12): 3048-59). Die proteolytische Aktivität von Cathepsin D ist zudem in kultiviertem Synovium aus Osteoarthrose-Patienten nachgewiesen worden (Bo G. P. et al., Clin. Rheumatol. 2009, 28(2): 191-9) und auch in

Synovectomiegewebe von Patienten mit rheumatoider Arthritis findet man eine erhöhte proteolytische Aktivität (Taubert H. et al., Autoimmunity. 2002, 35(3): 221-4). Lorenz et al. (Proteomics. 2003, 3(6): 991-1002) schreiben so auch, dass zwar die lysosomale und sekretierte Aspartylprotease Cathepsin D im Gegensatz zu den Cathepsinen B und L noch nicht bezüglich Arthritis und Arthrose im Detail studiert wurde, jedoch fanden Lorenz et al. höhere Proteinspiegel von Cathepsin D im Synovialgewebe von Patienten mit Arthrose im Vergleich zu Patienten mit rheumatoider Arthritis.

Gedikoglu et al. (Ann. Rheum. Dis. 1986, 45(4): 289-92) konnten ebenfalls eine erhöhte proteolytische Aktivität von Cathepsin D in Synovialgewebe und Byliss und Ali (Biochem. J. 1978, 171(1): 149-54) im Knorpel von Patienten mit Arthrose nachweisen.

Bei Arthrose kommt es zu einem lokalen Absinken des pH-Werts in

Bereichen des Knorpels. Dieses Absinken des pH-Werts ist für das

Verständnis der katabolen Prozesse im Knorpel von entscheidender

Bedeutung.

Bei Arthrose findet man so auch eine direkte Korrelation von niedrigem pH- Wert im Gelenkgewebe und der Schwere und dem Fortschreiten der

Erkrankung. Bei einen pH-Wert von 5,5 kommt es zu einem Selbstverdau des Knorpels. Dieser kann in Explantkulturen (beispielsweise von Maus, Rind oder Mensch) fast vollständig durch Pepstatin oder Ritonavir gehemmt werden. Dies legt eine wesentliche Rolle, wenn nicht sogar eine

Schlüsselrolle von Cathepsin D bei der Arthrose nahe, da Pepstatin

Aspartylproteasen mit einer Ausnahme - BACE1 - hemmt und nur diese beiden Aspartylproteasen im Knorpelgewebe bisher identifiziert wurden. So beschreiben auch Bo G. P. et al. (Clin. Rheumatol. 2009, 28(2): 191-9) die wichtige Rolle von Cathepsin D bei pathologischen Veränderungen in Gelenken.

Der bekannteste Aspartylproteaseinhibitor ist Pepstatin, ein Peptid das ursprünglich aus einer Streptomyces-Kultur isoliert wurde. Pepstatin ist wirksam gegenüber Pepsin, Cathepsin und Renin. Viele

Aspartylproteaseinhibitoren wurden deshalb dem Vorbild der Struktur des Pepstatins nachempfunden (U.S. Pat. No. 4,746,648; Umezawa, H, et al., J Antibiot (Tokyo) 23: 259-62, 1970; Morishima, H., et al., J. Antibiot. (Tokyo) 23: 263-5, 1970; Lin, Ty and Williams, H R., J. Biol. Chem. 254: 11875-83, 1979; Jupp, R A, et al., Biochem. J. 265: 871-8, 1990; Agarwal, N S and Rieh, D H, J. Med. Chem. 29: 2519-24, 1986; Baldwin, E T, et al., Proc. Natl. Acad. Sei., USA 90: 6796-800, 1993; Francis, S E et al., EMBO J 13: 306- 17, 1994).

Aspartylproteasen bzw. Cathepsin D werden häufig als Zielproteine für Wirkstoffe zur Behandlung von neurodegenerativen Erkrankungen, kognitiven Störungen, Demenz, Alzheimer, Krebs, Malaria, HIV-Infektion und Erkrankungen des Herzkreislauf- und Gefäßsystems beschrieben und Inhibitoren von Aspartylproteasen oder Cathepsin D werden zur Behandlung dieser Erkrankungen offenbart, wie beispielsweise in der WO 2009013293, EP 1987834, EP 1872780, EP 1867329, EP 1745778, EP 1745777, EP 1745776, WO 1999002153, WO 1999055687, US 6150416, WO

2003106405, WO 2005087751 , WO 2005087215, WO 2005016876, US 2006281729, WO 2008119772, WO 2006074950, WO 2007077004, WO 2005049585, US 6251928 und US 6150416.

Cyclische Guanidine werden in der WO 2006017836, WO 2006024932 und WO 2006017844 als Beta-Sekretase-Inhibitoren (BACE-Inhibitoren) zur Behandlung von Alzheimer, kognitiven Störungen, Senilität und Demenz offenbart. Auch die WO 2009045314, WO 2008103351 , WO 2008063558, WO 2005111031 , WO 2005058311 , US 20080200445, US 20070287692, US 20060281730, US 20060281729 und US 20060111370 offenbaren ähnliche Verbindungen.

Die bekannten Cathepsin D Inhibitoren und die beiden Modellverbindungen Pepstatin und Ritonavir hemmen zwar wirksam die Cathepsin D Aktivität, jedoch weisen sie eine recht geringe Selektivität gegenüber anderen

Aspartylproteasen auf. Die Rolle des Renin-Angiotensin Systems (RAS) bei der Regulation des Blutdrucks und des Flüssigkeits- und Elektrolythaushalts (Oparil, S. et al., N. Engl. J. Med. 1974; 291 : 381-401/446-57) und die Wirksamkeit von Renin- und Pepsininhibitoren bei Erkrankungen des

Herzkreislauf- und Gefäßsystems ist hinreichend bekannt und so ist insbesondere bei oraler bzw. systemischer Applikation dieser wenig selektiven Cathepsin D Inhibitoren mit zahlreichen Nebenwirkungen zu rechnen und auch bei lokaler Applikation ist durch die Diffusion der

Verbindungen mit systemischen Komplikationen zu rechnen. Daneben weisen gerade die peptidischen Verbindungen eine geringe Stabilität auf und sie kommen deshalb nicht für eine orale oder systemische Gabe in Frage.

Der Erfindung lag die Aufgabe zugrunde, neue Verbindungen mit wertvollen Eigenschaften aufzufinden, insbesondere solche, die zur Herstellung von Arzneimitteln verwendet werden können.

Aufgabe der vorliegende Erfindung war es insbesondere, neue Wirkstoffe und besonders bevorzugt neue Cathepsin D Inhibitoren zu finden, die zur Vorbeugung und Behandlung von Arthrose eingesetzt werden können und insbesondere eine hohe Selektivität für Cathepsin D gegenüber Renin und Pepsin aufweisen. Daneben sollten neue Cathepsin D Inhibitoren gefunden werden, die wenigstens bei lokaler bzw. intraartikulärer Applikation

ausreichend stabil sind.

Zusammenfassung der Erfindung

Überraschenderweise wurde gefunden, dass die erfindungsgemäßen cyclischen Guanidine hochwirksam Cathepsin D hemmen und dabei eine hohe Selektivität für Cathepsin D gegenüber Renin und Pepsin aufweisen und damit bei deren Anwendung zur Behandlung von Arthrose mit geringen Nebenwirkungen zu rechnen ist. Daneben weisen die erfindungsgemäßen Verbindungen eine ausreichend gute Stabilität in Synovialflüssigkeit auf, so dass sie sich zur intraartikulären Applikation und damit zur Behandlung von Arthrose eignen. Ebenfalls überraschenderweise hatte sich gezeigt, dass die erfindungsgemäßen cyclischen Guanidine eine entzündungsbedingte thermische Hyperalgesie dosisabhängig reduzieren können.

Die Erfindung betrifft cyclische Guanidine der allgemeinen Formel I,

worin

I ¹ , 1 ² , I ³ unabhängig voneinander CR ¹ oder CT bedeuten,

X H oder NH ₂ bedeutet,

Y eine cyclische Alkylaryl-Gruppe bedeutet, dadurch

gekennzeichnet, dass an ein unsubstituiertes oder ein ein- oder zweifach durch =S, =NR, =O, R, T, OR, NRR', SOR, S0 ₂ R, SO ₂ NRR\ CN, COOR, CONRR', NRCOR', NRCONR'R" und/oder NRSO ₂ R' substituiertes cyclisches Alkyl mit 5 oder 6 C-Atomen, worin eine oder zwei CH ₂ -Gruppen unabhängig voneinander durch O, S, SO, SO ₂ , NR, -OCO-, -NRCONR'-,

-NRCO-, -NRSO ₂ R'-, -COO-, -CONR-, und/oder auch 1-11 H-Atome durch F und/oder Cl ersetzt sein können, 1 oder 2 aromatische Ringe Ar kondensiert sind,

Ar ein unsubstituiertes oder ein-, zwei- drei- oder vierfach durch

R substituiertes Phenyl oder Naphthyl bedeutet oder ein ein- oder zweikerniger aromatischen Heterocyclus mit 1 bis 4 N-, O- und/oder S-Atomen, der unsubstituierte oder ein-, zwei- oder dreifach durch R, =S, =NR' und/oder =O substituiert ist, CH ₂ , CR ¹ R ² oder C=O bedeutet,

ein unsubstituiertes oder ein-, zwei- drei- oder vierfach durch R ¹ substituiertes Phenyl oder Naphthyl bedeutet oder ein ein- oder zweikernigen gesättigten, ungesättigten oder

aromatischen Heterocyclus mit 1 bis 4 N-, O- und/oder S- Atomen, der ein-, zwei- oder dreifach durch R, =S, =NR' und/oder =O substituiert sein kann,

unabhängig voneinander H, OR, Hai, C(Hal) ₃ , NRR', SOR, SO ₂ R, SO ₂ NRR', CN, COOR, CONRR', NRCOR',

NR'CONR'R", NRSO ₂ R', ein unsubstituiertes oder ein-, zwei- oder dreifach durch =S, =NR, =O, Hai, C(Hal) ₃ , OR, NRR', SO ₂ R, SO ₂ NRR', CN, CONRR', NRCOR' und/oder NRCONRR' substituiertes lineares oder verzweigtes Alkyl mit 1-10 C- Atomen, worin eine, zwei oder drei CH ₂ -Gruppen unabhängig voneinander durch O, S, SO, SO ₂ , NR, -OCO-, -NRCONR'-, -NRCO-, -NRSO ₂ R'- -COO-, -CONR-, -NRCO-, -C=C- Gruppen und/oder durch -CH=CH-Gruppen und/oder auch 1- 20 H-Atome durch F und/oder Cl ersetzt sein können, oder ein unsubstituiertes oder ein ein-, zwei- oder dreifach durch =S, =NR, =O, Hai, OR, NRR', SO ₂ R, SO ₂ NRR', CN, CONRR', NRCOR', und/oder NRCONRR' substituiertes cyclisches Alkyl mit 3-7 C-Atomen bedeuten, worin eine, zwei oder drei CH ₂ - Gruppen unabhängig voneinander durch O, S, SO, SO ₂ , NR, - OCO-, -NRCONR'-, -NRCO-, -NRSO ₂ R'-, -COO-, - CONR-, -NRCO- und/oder durch -CH=CH-Gruppen und/oder auch 1-11 H-Atome durch F und/oder Cl ersetzt sein können, unabhängig voneinander H, T, OH, Hai, C(Hal) ₃ , NH ₂ , SOAlkyl, SO ₂ Alkyl, SO2NH ₂ , CN, COOH, CONH ₂ , NHCOAlkyl,

NHCONH _2> NHSO ₂ Alkyl und/oder NHCOAlkyl, ein

unsubstituiertes oder ein ein-, zwei- oder dreifach durch =S, =NR, =O, Hai, C(Hal) ₃ , OH, NH ₂ , SO ₂ CH ₃ , SO ₂ NH ₂ , CN, CONH ₂ , NHCOCH ₃ , und/oder NHCONH ₂ substituiertes lineares oder verzweigtes Alkyl mit 1- 0 C-Atomen, worin eine, zwei oder drei CH ₂ -Gruppen unabhängig voneinander durch O, S, SO, SO ₂ , NH, NCH _3> -OCO-, -NHCONH-, -NHCO- - NHSO ₂ Alkyl-, -COO-, -CONH-, -NCH ₃ CO-, -CONCH ₃ -, - ΟΞΟ-Θαιρρβη und/oder durch -CH=CH-Gruppen und/oder auch 1-20 H-Atome durch F und/oder Cl ersetzt sein können, oder ein unsubstituiertes oder ein ein-, zwei- oder dreifach durch =S, =NR, =O, C(Hal) ₃ , OH, NH _2l SO ₂ CH ₃ , SO ₂ NH ₂ , CN, CONH ₂ , NHCOCH ₃ , und/oder NHCONH ₂ substituiertes cyclisches Alkyl mit 3-7 C-Atomen bedeuten, worin eine, zwei oder drei CH ₂ -Gruppen unabhängig voneinander durch O, S, SO, SO ₂ , NH, NCH ₃₎ -OCO-, -NHCONH-, -NHCO-, - NHSO ₂ Alkyl-, -COO-, -CONH-, -NCH ₃ CO-, -CONCH ₃ - und/oder durch -CH=CH-Gruppen und/oder auch 1-11 H- Atome durch F und/oder Cl ersetzt sein können oder R und R' oder R und R" oder R' und R", wenn beide an ein N gebunden sind, unter Einbeziehung des N einen Cyclus mit 3-7 C-Atomen bilden können, worin eine, zwei oder drei CH ₂ -Gruppen unabhängig voneinander durch O, S, SO, SO ₂ , NH, NAlkyl, NAryl, -CHT-, -CH(CH ₂ T)-, -OCO-, -NHCONH-, -NHCO-,

-NHSO ₂ -, -COO-, -CONAlkyl- und/oder durch -CH=CH- Gruppen und/oder auch 1-11 H-Atome durch F und/oder Cl ersetzt sein können, dadurch gekennzeichnet, dass an diesen Cyclus 1 oder 2 aromatische Ringe Ar kondensiert sein können und

Hai unabhängig voneinander F, Cl, Br oder I bedeutet,

sowie deren physiologisch unbedenklichen Salze, Derivate, Solvate,

Prodrugs und Stereoisomere, einschließlich deren Mischungen in allen Verhältnissen.

Ein bevorzugter Gegenstand der Erfindung sind alle vorgenannten

Verbindungen der Formel I, worin Y ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus den

unsubstituierten oder ein ein- oder zweifach durch =S, =NR, =O, R, R , T, OR, NRR', SOR, SO ₂ R, SO ₂ NRR', CN, COOR, CONRR', NRCOR', NRCONR'R" und/oder NRSO ₂ R' substituierten nachstehenden Resten:

Q CH ₂ oder C=O bedeutet und

R ¹ unabhängig voneinander H, CF ₃ , OR, Hai, CN, CONRR',

ein unsubstituiertes oder ein ein-, zwei- oder dreifach durch =O, Hai, C(Hal) ₃ , OR, NRR', SO ₂ R, SO ₂ NRR', CN, CONRR', NRCOR' und/oder NRCONRR' substituiertes lineares oder verzweigtes Alkyl mit 1-10 C-Atomen oder substituiertes cyclisches Alkyl mit 3-7 C-Atomen bedeutet, worin eine, zwei oder drei CH ₂ -Gruppen unabhängig voneinander durch O, - CH=CH-Gruppen und/oder auch 1-11 H-Atome durch F und/oder Cl ersetzt sein können,

und I ¹ , I ² , I ³ , X, Ar, T, R, R', R" und Hai die oben angegebenen Bedeutungen aufweisen, sowie deren physiologisch unbedenklichen Salze, Derivate, Solvate, Prodrugs und Stereoisomere, einschließlich deren Mischungen in allen Verhältnissen.

Ein besonders bevorzugter Gegenstand der Erfindung sind alle

vorgenannten Verbindungen der Formel I, worin

1 ¹ CH bedeutet,

1 ² CR ¹ oder CT bedeutet,

1 ³ CH oder CCI bedeutet,

X H bedeutet, ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus den

unsubstituierten oder ein ein- oder zweifach durch =S, =NR, =O, R, R , T, OR, NRR', SOR, S0 ₂ R, SO ₂ NRR', CN, COOR, CONRR', NRCOR', NRCONR'R" und/oder NRSO ₂ R' substituierten nachstehenden Resten:

Q CH ₂ bedeutet,

unabhängig voneinander H, CF ₃ , OR, Hai, CN, CONRR', ein unsubstituiertes oder ein ein-, zwei- oder dreifach durch =O, Hai, C(Hal) ₃ , OR, NRR', SO ₂ R, SO ₂ NRR' ₍ CN, CONRR', NRCOR' und/oder NRCONRR' substituiertes lineares oder verzweigtes Alkyl mit 1-10 C-Atomen oder substituiertes cyclisches Alkyl mit 3-7 C-Atomen bedeutet, worin eine, zwei oder drei CH ₂ -Gruppen unabhängig voneinander durch O, - CH=CH-Gruppen und/oder auch 1-11 H-Atome durch F und/oder Cl ersetzt sein können,

und Ar, T, R, R', R" und Hai die oben angegebenen Bedeutungen aufweisen, sowie deren physiologisch unbedenklichen Salze, Derivate, Solvate, Prodrugs und Stereoisomere, einschließlich deren Mischungen in allen Verhältnissen.

Ein besonders bevorzugter Gegenstand der Erfindung sind alle

vorgenannten Verbindungen der Formel I, worin

1 ¹ CH bedeutet,

1 ² CR ¹ oder CT bedeutet,

1 ³ CH oder CCI bedeutet,

X H bedeutet, Y ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus den

unsubstituierten oder ein ein- oder zweifach durch Methoxyl substituierten nachstehenden Resten:

Q CH ₂ bedeutet,

R ¹ unabhängig voneinander H, CF ₃ , OR, Hai, CN, CONRR',

ein unsubstituiertes oder ein ein-, zwei- oder dreifach durch =O, Hai, C(Hal) ₃ , OR, NRR', SO ₂ R, SO ₂ NRR', CN, CONRR',

NRCOR' und/oder NRCONRR' substituiertes lineares oder verzweigtes Alkyl mit 1-10 C-Atomen oder substituiertes cyclisches Alkyl mit 3-7 C-Atomen bedeutet, worin eine, zwei oder drei CH ₂ -Gruppen unabhängig voneinander durch O, - CH=CH-Gruppen und/oder auch 1-11 H-Atome durch F und/oder Cl ersetzt sein können,

und Ar, T, R, R', R" und Hai die oben angegebenen Bedeutungen

aufweisen, sowie deren physiologisch unbedenklichen Salze, Derivate, Solvate, Prodrugs und Stereoisomere, einschließlich deren Mischungen in allen Verhältnissen.

Ein besonders bevorzugter Gegenstand der Erfindung sind alle

vorgenannten Verbindungen der Formel I, worin

R und R' oder R und R" oder R' und R", wenn beide an ein N gebunden sind, unter Einbeziehung des N einen Cyclus mit 3-7 C-Atomen bilden, worin eine, zwei oder drei CH ₂ -Gruppen unabhängig voneinander durch O, S, SO, SO ₂ , NH, NAlkyl, NAryl, -CHT-, -CH(CH ₂ T)-, -OCO-, -NHCONH-, - NHCO-, -NHSO ₂ -, -COO-, -CONAlkyl- und/oder durch -CH=CH- Gruppen und/oder auch 1- 1 H-Atome durch F und/oder Cl ersetzt sein können, dadurch gekennzeichnet, dass an diesen Cyclus 1 oder 2

aromatische Ringe Ar kondensiert sein können und I ¹ , I ² , I ³ , X, Y, Q, Ar, T, R , R ² und Hai die oben angegebenen Bedeutungen aufweisen, sowie deren physiologisch unbedenklichen Salze, Derivate, Solvate, Prodrugs und Stereoisomere, einschließlich deren Mischungen in allen Verhältnissen.

Ein ganz besonders bevorzugter Gegenstand der Erfindung sind alle vorgenannten Verbindungen der Formel I, worin

1 ¹ CH bedeutet,

1 ² CR ¹ oder CT bedeutet und R ¹ oder T ausgewählt ist aus der

Gru e bestehend

CH oder CCI bedeutet,

H bedeutet,

ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem unsubstituierten oder ein ein- oder zweifach durch Methoxyl substituierten nachstehenden Rest:

Q CH ₂ bedeutet,

sowie deren physiologisch unbedenklichen Salze, Derivate, Solvate,

Prodrugs und Stereoisomere, einschließlich deren Mischungen in allen Verhältnissen. Ein ganz besonders bevorzugter Gegenstand der Erfindung sind alle vorgenannten Verbindungen der Formel I, worin Y chiral ist

Ein weiterer ganz besonders bevorzugter Gegenstand der Erfindung sind alle vorgenannten Verbindungen der Formel I, worin der aus R und R' oder R und R" oder R" und R" gebildete Cyclus chiral ist.

Alle vorgenannten bevorzugten, besonders bevorzugten und ganz besonders bevorzugten Bedeutungen der vorstehenden Reste der

Verbindungen der Formel I sind so zu verstehen, dass diese bevorzugten, besonders bevorzugten und ganz besonders bevorzugten Bedeutungen oder Ausfühungsformen in jeder möglichen Kombination zu Verbindungen der Formel I miteinander kombiniert werden können und solche

bevorzugten, besonders bevorzugten und ganz besonders bevorzugten Verbindungen der Formel I hierdurch ebenfalls explizit offenbart sind.

Ganz besonders bevorzugt sind auch die nachfolgenden Verbindungen der Formel I ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:

a) 3

b) 7

c) 5

d) 3

e) 1-

2

f) 3

g) 7- h) 3

i) 7- j) 7- k) 3-lndan-1-yl-7-trifluoromethyl-3,4-dihydro-quinazolin-2-ylam in

I) 7-Chloro-3-(5-methoxy-indan-2-yl)-3,4-dihydro-quinazolin-2-y lamin m) 3-(9H-Fluoren-9-yl)-7-trifluoromethyl-3,4-dihydro-quinazolin -2-ylamin n) 3-(5-Methoxy-indan-2-yl)-7-trifluoromethyl-3,4-dihydro-quina zolin-2- ylamin

o) 7-Ethyl-3-(5-methoxy-indan-2-yl)-3,4-dihydro-quinazolin-2-yl amin p) 3-((S)-5-Methoxy-indan-2-yl)-7-trifluoromethyl-3,4-dihydro-q uinazolin-2- ylamin

q) 3-((R)-5-Methoxy-indan-2-yl)-7-trifluoromethyl-3,4-dihydro-q uinazolin ylamin

r) 3-(1 ,2,3,4-Tetrahydro-naphthalen-2-yl)-7-trifluoromethyl-3,4-dih ydro- quinazolin-2-ylamin

s) (2-Amino-3-indan-2-yl-3,4-dihydro-quinazolin-7-yl)-(2,3-dihy dro-indol-1- yl)-methanon

t) (2-Amino-3-indan-2-yl-3,4-dihydro-quinazolin-7-yl)-(5-methox y-1 ,3- dihydro-isoindol-2-yl)-methanon

u) 2-Amino-3-indan-2-yl-3,4-dihydro-quinazoline-7- carbonsäurediethylamid

v) (2-Amino-3-indan-2-yl-3,4-dihydro-quinazolin-7-yl)-morpholin -4-yl- methanon

w) 2-Amino-3-indan-2-yl-7-trifluoromethyl-3H-quinazolin-4-on

x) 2-Hydrazino-3-indan-2-yl-7-trifluoromethyl-3H-quinazolin-4-o n y) (2-Amino-3-indan-2-yl-3,4-dihydro-quinazolin-7-yl)-(2-benzyl -pyrrolidin- 1-yl)-methanon

z) (2-Amino-3-indan-2-yl-3,4-dihydro-quinazolin-7-yl)-(2,3-dihy dro- benzo[1 ,4]oxazin-4-yl)-methanon

aa) 3-((1 R,2S)-1 -Methoxy-indan-2-yl)-7-trifluoromethyl-3,4-dihydro-1 H- quinazolin-2-ylidenamin

sowie deren physiologisch unbedenklichen Salze, Derivate, Solvate, Prodrugs und Stereoisomere, einschließlich deren Mischungen in allen Verhältnissen. Erfindungsgemäß sind ausdrücklich alle denkbaren Tautomere der

Verbindungen der Formel I wie beispielsweise:

Hai bedeutet Fluor, Chlor, Brom oder lod, insbesondere Fluor oder Chlor.

-(C=O)- oder =O bedeutet Carbonylsauerstoff und steht für bzw. an ein Kohlenstoffatom mit einer Doppelbindung gebundes Sauerstoffatom.

Alkyl oder A ist eine gesättigte, unverzweigte (lineare) oder verzweigte Kohlenwasserstoffkette und hat 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 oder 10 C-Atome. Alkyl bedeutet vorzugsweise Methyl, weiterhin Ethyl, Propyl, Isopropyl, Butyl, Isobutyl, sek.-Butyl oder tert.-Butyl, ferner auch Pentyl, 1-, 2- oder 3- Methylbutyl, 1 ,1- , 1 ,2- oder 2,2-Dimethylpropyl, 1-Ethylpropyl, Hexyl, 1- , 2- , 3- oder 4-Methylpentyl, 1 ,1- , 1 ,2- , 1 ,3- , 2,2- , 2,3- oder 3,3-Dimethylbutyl, 1- oder 2-Ethylbutyl, -Ethyl-l-methylpropyl, 1-Ethyl-2-methylpropyl, 1 ,1 ,2- oder 1,2,2-Trimethylpropyl, lineares oder verzweigtes Heptyl, Octyl, Nonyl oder Decyl bedeutet, weiter bevorzugt z.B. Trifluormethyl.

Cyclisches Alkyl oder Cycloalkyl ist eine gesättigte cyclische

Kohlenwasserstoffkette und hat 3-10, vorzugsweise 3-7 C-Atome und bedeutet vorzugsweise Cyclopropyl, Cyclobutyl, Cyclopentyl, Cyclohexyl oder Cycloheptyl. Cycloalkyl bedeutet auch ein teilweise ungestättiges cyclisches Akyl, wie beispielsweise Cyclohexenyl oder Cyclohexinyl. Aryl, Ar oder aromatischer Ring bedeutet eine aromatische bzw. vollständig ungsättigte cyclische Kohlenwasserstoffkette z.B. unsubstituiertes Phenyl, Naphthyl oder Biphenyl, weiterhin vorzugsweise z.B. durch A, Fluor, Chlor, Brom, lod, Hydroxy, Methoxy, Ethoxy, Propoxy, Butoxy, Pentyloxy,

Hexyloxy, Nitro, Cyan, Formyl, Acetyl, Propionyl, Trifluormethyl, Amino, Methylamino, Ethylamino, Dimethylamino, Diethylamino, Benzyloxy,

Sulfonamido, Methylsulfonamido, Ethylsulfonamido, Propylsulfonamido, Butylsulfonamido, Dimethylsulfonamido, Phenylsulfonamido, Carboxy, Methoxycarbonyl, Ethoxycarbonyl, Aminocarbonyl mono-, di- oder trisub- stituiertes Phenyl, Naphthyl oder Biphenyl.

Ein- oder zweikerniger gesättigter, ungesättigter oder aromatischer

Heterocyclus bedeutet vorzugsweise unsubstituiertes oder ein-, zwei- oder dreifach substituiertes 2- oder 3-Furyl, 2- oder 3-Thienyl, 1-, 2- oder 3- Pyrrolyl, 1-, 2, 4- oder 5-lmidazolyl, 1-, 3-, 4- oder 5-Pyrazolyl, 2-, 4- oder 5- Oxazolyl, 3-, 4- oder 5-lsoxazolyl, 2-, 4- oder 5-Thiazolyl, 3-, 4- oder 5- Isothiazolyl, 2-, 3- oder 4-Pyridyl, 2-, 4-, 5- oder 6-Pyrimidinyl, weiterhin bevorzugt 1 ,2,3-Triazol-1-, -4- oder -5-yl, 1 ,2,4-TriazoM-, -3- oder 5-yl, 1- oder 5-Tetrazolyl, 1 ,2,3-Oxadiazol-4- oder -5-yl, 1 ,2,4-Oxadiazol-3- oder -5- yl, 1 ,3,4-Thiadiazol-2- oder -5-yl, 1 ,2,4-Thiadiazol-3- oder -5-yl, 1 ,2,3-

Thiadiazol-4- oder -5-yl, 3- oder 4-Pyridazinyl, Pyrazinyl, 1-, 2-, 3-, 4-, 5-, 6- oder 7-lndolyl, 4- oder 5-lsoindolyl, 1-, 2-, 4- oder 5-Benzimidazolyl, 1-, 3-, 4- , 5-, 6- oder 7-Benzopyrazolyl, 2-, 4-, 5-, 6- oder 7-Benzoxazolyl, 3-, 4-, 5-, 6- oder 7- Benzisoxazolyl, 2-, 4-, 5-, 6- oder 7-Benzothiazolyl, 2-, 4-, 5-, 6- oder 7-Benzisothiazolyl, 4-, 5-, 6- oder 7-Benz-2,1 ,3-oxadiazolyl, 2-, 3-, 4-, 5-, 6-, 7- oder 8-Chinolyl, 1-, 3-, 4-, 5-, 6-, 7- oder 8-lsochinolyl, 3-, 4-, 5-, 6-, 7- oder 8-Cinnolinyl, 2-, 4-, 5-, 6-, 7- oder 8-Chinazolinyl, 5- oder 6-Chinoxalin- yl, 2-, 3-, 5-, 6-, 7- oder 8-2H-Benzo[1 ,4]oxazinyl, weiter bevorzugt 1 ,3- Benzodioxol-5-yl, 1 ,4-Benzodioxan-6-yl, 2,1 ,3-Benzothiadiazol-4- oder -5-yl oder 2, 1 ,3-Benzoxadiazol-5-yl. Die heterocyclischen Reste können auch teilweise oder vollständig hydriert sein und bedeuten z.B. auch 2,3-Dihydro-2-, -3-, -4- oder -5-furyl, 2,5- Dihydro-2-, -3-, -4- oder 5-furyl, Tetrahydro-2- oder -3-furyl, 1 ,3-Dioxolan-4- yl, Tetrahydro-2- oder -3-thienyl, 2,3-Dihydro-1-, -2-, -3-, -4- oder -5-pyrrolyl, 2,5-Dihydro-1-, -2-, -3-, -4- oder -5-pyrrolyl, 1-, 2- oder 3-Pyrrolidinyl,

Tetrahydro-1-, -2- oder -4-imidazolyl, 2,3-Dihydro-1-, -2-, -3-, -4- oder -5- pyrazolyl, Tetrahydro-1-, -3- oder -4-pyrazolyl, 1 ,4-Dihydro-1-, -2-, -3- oder - 4-pyridyl, 1 ,2,3,4-Tetrahydro-1-, -2-, -3-, -4-, -5- oder -6-pyridyl, 1-, 2-, 3- oder 4-Piperidinyl, 2-, 3- oder 4-Morpholinyl, Tetrahydro-2-, -3- oder -4- pyranyl, 1 ,4-Dioxanyl, ,3-Dioxan-2-, -4- oder -5-yl, Hexahydro-1-, -3- oder - 4-pyridazinyl, Hexahydro-1-, -2-, -4- oder -5-pyrimidinyl, 1-, 2- oder 3- Piperazinyl, 1 ,2,3,4-Tetrahydro-1-, -2-, -3-, -4-, -5-, -6-, -7- oder -8-chinolyl, I ^.S^-Tetrahydro-l-^-.-S-, -4-, -5-, -6-, -7- oder -8-isochinolyl, 2-, 3-, 5-, 6-, 7- oder 8- 3,4-Dihydro-2H-benzo[1 ,4]oxazinyl, weiter bevorzugt 2,3- Methylendioxyphenyl, 3,4-Methylendioxyphenyl, 2,3-Ethylendioxyphenyl, 3,4-Ethylendioxyphenyl, 3,4-(Difluormethylendioxy)phenyl, 2,3-Dihydro- benzofuran-5- oder 6-yl, 2,3-(2-Oxo-methylendioxy)-phenyl oder auch 3,4- Dihydro-2H-1 ,5-benzodioxepin-6- oder -7-yl, ferner bevorzugt 2,3-Dihydro- benzofuranyl oder 2,3-Dihydro-2-oxo-furanyl.

Heterocyclus bedeutet ferner z.B. 2-Oxo-piperidin-1-yl, 2-Oxo-pyrrolidin-1-yl, 2-Oxo-l - -pyridin-1-yl, 3-Oxo-morpholin-4-yl, 4-Oxo-1/- -pyridin-1-yl, 2,6- Dioxo-piperidin1-yl, 2-Oxo-piperazin-1-yl, 2,6-Dioxo-piperazin-1-yl, 2,5- Dioxo-pyrrolidin-1-yl, 2-Oxo-1 ,3-oxazolidin-3-yl, 3-Oxo-2/-/-pyridazin-2-yl, 2- Caprolactam-1-yl (= 2-Oxo-azepan-1-yl), 2-Hydroxy-6-oxo-piperazin-1-yl, 2- Methoxy-6-oxo-piperazin-1 -yl oder 2-Aza-bicyclo[2.2.2]-octan-3-on-2-yl.

Heteroycycloalkyl bedeutet dabei ein vollständig hydrierter bzw. gesättigter Heterocyclus, Heterocycloalkenyl (eine oder mehrere Doppelbindungen) oder Heterocycloalkinyl (eine oder mehrere Dreifachbindungen) bedeutet ein teilweise oder unvollständig hydrierter bzw. ungsättigter Heterocyclus, Heteroaryl bedeutet ein aromatischer bzw. vollständig ungesättigter Heterocyclus.

Eine cyclische Alkylaryl-Gruppe bedeutet im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung, dass an ein unsubstituiertes oder ein ein- oder zweifach substituiertes cyclisches Alkyl, worin eine oder zwei CH ₂ -Gruppen und/oder auch 1-11 H-Atome ersetzt sein können, und ein oder zwei aromatische Ringe Ar kondensiert sind, wie beispielsweise in den

OA bedeutet Alkoxyl und ist vorzugsweise Methoxyl, ferner auch Ethoxyl, n-Propoxyl, Isopropoxyl, n-Butoxyl, Isobutoxyl, sek.-Butoxyl oder tert.-Butoxyl.

Ferner bedeutet nachstehend:

Boc ter.-Butoxycarbonyl

CBZ Benzyloxycarbonyl

DNP 2,4-Dinitrophenyl

FMOC 9-Fluorenylmethoxycarbonyl

imi-DNP 2,4-Dinitrophenyl in 1-Stellung des Imidazolrings

OMe Methylester

POA Phenoxyacetyl

DCCI Dicyclohexylcarbodiimid

HOBt 1-Hydroxybenzotriazol Erfindungsgemäß sind auch alle physiologisch unbedenklichen Salze, Derivate, Solvate und Stereoisomere dieser Verbindungen, einschließlich deren Mischungen in allen Verhältnissen. Verbindungen der allgemeinen Formel I können ein oder mehrere

Chiralitätszentren enthalten, sodass in der vorliegenden Erfindung auch sämtliche Stereoisomere, Enentiomere, Diastereomere usw. der

Verbindungen der allgemeinen Formel I beansprucht werden. Gegenstand der Erfindung sind auch die optisch aktiven Formen

(Stereoisomeren), die Enantiomeren, die Racemate, die Diastereomeren sowie Hydrate und Solvate dieser Verbindungen.

Erfindungsgemäße Verbindungen der Formel I können aufgrund ihrer Molekülstruktur chiral sein und können dementsprechend in verschiedenen enantiomeren Formen auftreten. Sie können daher in racemischer oder in optisch aktiver Form vorliegen. Da sich die pharmazeutische Wirksamkeit der Racemate bzw. der Stereoisomere der erfindungsgemäßen

Verbindungen unterscheiden kann, kann es wünschenswert sein, die

Enantiomere zu verwenden. In diesem Fällen kann das Endprodukt oder aber bereits die Zwischenprodukte in enantiomere Verbindungen, durch dem Fachmann bekannte chemische oder physikalische Maßnahmen,

aufgetrennt oder bereits als solche bei der Synthese eingesetzt werden. Unter pharmazeutisch oder physiologisch unbedenklichen Derivaten versteht man z.B. Salze der erfindungsgemäßen Verbindungen, als auch sogenannte Prodrug-Verbindungen. Unter Prodrug-Verbindungen versteht man mit z.B. Alkyl- oder Acylgruppen (siehe auch nachstehende Amino- und

Hydroxyschutzgruppen), Zuckern oder Oligopeptiden abgewandelte

Verbindungen der Formel I, die im Organismus rasch zu den wirksamen erfindungsgemäßen Verbindungen gespalten oder freigesetzt werden.

Hierzu gehören auch bioabbaubare Polymerderivate der erfindungsgemäßen Verbindungen, wie dies z.B. in Int. J. Pharm. 115

(1995), 61-67 beschrieben ist.

Als Säureadditionssalze kommen anorganische oder organische Salze aller physiologisch oder pharmakologisch unbedenklichen Säuren in Frage, beispielsweise Halogenide, insbesondere Hydrochloride oder Hydrobromide, Lactate, Sulfate, Citrate, Tartrate, Maleate, Fumarate, Oxalate, Acetate, Phosphate, Methylsulfonate oder p-Toluolsulfonate. Ganz besonders bevorzugt sind die Hydrochloride, die Trifluoracetate oder die bis-Trifluoracetate der erfindungsgemäßen Verbindungen.

Unter Solvaten der Verbindungen der Formel I werden Anlagerungen von inerten Lösungsmittelmolekülen an die Verbindungen der Formel I

verstanden, die sich aufgrund ihrer gegenseitigen Anziehungskraft

ausbilden. Solvate sind beispielsweise Hydrate, wie Monohydrate oder Dihydrate oder Alkoholate, d.h. Additiönsverbindungen mit Alkoholen wie beispielsweise mit Methanol oder Ethanol. Es ist weiterhin vorgesehen, dass eine Verbindung der Formel I

isotopen-markierte Formen davon umfasst. Eine isotopenmarkierte Form einer Verbindung der Formel I ist mit dieser Verbindung bis auf die

Tatsache, dass eines oder mehrere Atome der Verbindung durch ein Atom bzw. Atome mit einer Atommasse oder Massenzahl ersetzt wurden, die sich von der Atommasse oder Massenzahl des Atoms, das üblicherweise natürlich vorkommt, unterscheidet, identisch. Zu den Isotopen, die leicht im Handel erhältlich sind und in eine Verbindung der Formel I nach gut bekannten Verfahren eingebaut werden können, zählen zum Beispiel Isotope von Wasserstoff, Kohlenstoff, Stickstoff, Sauerstoff, Phosphor, Fluor und Chlor, z.B. ² H, ³ H, ¹³ C, ¹⁴ C, ⁵ N, ⁸ O, ⁷ O, ³¹ P, ³² P, ³⁵ S, ¹⁸ F bzw. ³⁶ CI. Eine Verbindung der Formel I, eines ihrer Prodrugs oder jeweils ein pharmazeutisch unbedenkliches Salz davon, die eines oder mehrere der oben genannten Isotope und/oder andere Isotope von anderen Atomen enthält, ist als Bestandteil der vorliegenden Erfindung vorgesehen. Eine isotopenmarkierte Verbindung der Formel I lässt sich auf vielerlei nützliche Art verwenden. Zum Beispiel eignet sich eine isotopenmarkierte Verbindung der Formel I, in die z.B. ein Radioisotop wie ³ H oder ⁴ C eingebaut worden ist, für Assays zur Verteilung des Arzneistoffs und/oder Substratgewebes. Diese Radioisotope, d.h. Tritium ( ³ H) und Kohlenstoff-14 ( ¹⁴ C), sind aufgrund ihrer einfachen Herstellung und ausgezeichneten Nachweisbarkeit besonders bevorzugt. Der Einbau schwererer Isotope, z.B. Deuterium ( ² H), in eine Verbindung der Formel I weist therapeutische Vorteile aufgrund der höheren Stabilität dieser isotopenmarkierten Verbindung im Metabolismus auf. Höhere Stabilität in Metabolismus bedeutet unmittelbar eine erhöhte Halbwertszeit in vivo oder niedrigere Dosierungen, was unter den meisten Umständen eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung darstellen würde. Eine isotopenmarkierte Verbindung der Formel I lässt sich üblicherweise durch Durchführung der in den Syntheseschemata und der damit in Zusammenhang stehenden Beschreibung, im Beispielteil und im Herstellungsteil im vorliegenden Text offenbarten Vorgehensweisen herstellen, wobei ein nicht isotopenmarkierter Reaktionspartner durch einen leicht verfügbaren isotopenmarkierten Reaktionspartner ersetzt wird.

Zur Manipulation des oxidativen Metabolismus der Verbindung über den primären kinetischen Isotopeneffekt kann auch Deuterium ( ² H) in eine Verbindung der Formel I eingebaut werden. Beim primären kinetischen Isotopeneffekt handelt es sich um eine Veränderung der Geschwindigkeit einer chemischen Reaktion aufgrund des Austausches isotopischer Kerne, was wiederum durch die Änderung der für die Bildung kovalenter Bindungen im Anschluß an diesen isotopischen Austausch erforderlichen

Grundzustandsenergien verursacht wird. Der Austausch eines schwereren Isotops führt üblicherweise zu einer Erniedrigung der Grundzustandsenergie für eine chemische Bindung und verursacht so eine Verringerung der Geschwindigkeit bei einem geschwindigkeitslimitierenden Bindungsbruch. Findet der Bindungsbruch an bzw. in der Nähe einer Sattelpunktregion entlang der Koordinate einer Reaktion mit mehreren Produkten statt, so können sich die Produktverteilungsverhältnisse stark ändern. Zur

Erläuterung: Wird Deuterium an ein Kohlenstoffatom in einer

nichtaustauschbaren Position gebunden, so sind

Geschwindigkeitsunterschiede von k _M /ko = 2-7 typisch. Wird dieser

Geschwindigkeitsunterschied erfolgreich auf eine oxidationsanfällige

Verbindung der Formel I angewandt, so kann sich dadurch das Profil dieser Verbindung in vivo drastisch ändern und zu verbesserten

pharmakokinetischen Eigenschaften führen.

Bei der Entdeckung und Entwicklung von Therapeutika versucht der Fachmann, pharmakokinetische Parameter zu optimieren und gleichzeitig wünschenswerte In-vitro-Eigenschaften beizubehalten. Man kann vernünftig annehmen, daß viele Verbindungen mit schlechten pharmakokinetischen Profilen gegenüber dem oxidativen Metabolismus anfällig sind. Aus derzeitig verfügbaren I -vitro-Assays mit Lebermikrosomen erhält man wertvolle Informationen über den Verlauf dieses oxidativen Metabolismus, aufgrund dessen wiederum deuterierte Verbindungen der Formel I mit einer verbesserten Stabilität durch Resistenz gegenüber einem derartigen oxidativen Metabolismus rational gestaltet werden können. So gelangt man zu wesentlichen Verbesserungen der pharmakokinetischen Profile der Verbindungen der Formel I, die sich quantitativ als erhöhte ln-vivo-

Halbwertszeit (T/2), Konzentration bei maximaler therapeutischer Wirkung (Cmax), Fläche unter der Dosis-Wirkungskurve (AUC) sowie F und als verringerte Clearance, Dosis und Materialkosten ausdrücken lassen. Zur Veranschaulichung des Obigen soll folgendes dienen: eine Verbindung der Formel I mit mehrfachen potentiellen Angriffsstellen für den oxidativen Metabolismus, z.B. Wasserstoffatome an einem Benzylrest und Wasserstoffatome, die an ein Stickstoffatom gebunden sind, wird als Reihe von Analogen hergestellt, in denen verschiedene Kombinationen von

Wasserstoffatomen durch Deuteriumatome ersetzt werden, so daß einige, die meisten oder alle dieser Wasserstoffatome durch Deuteriumatome ersetzt sind. Durch Bestimmungen der Halbwertszeit gelangt man zu einer günstigen und genauen Bestimmung, wie sehr sich die Verbesserung der Widerstandsfähigkeit gegenüber oxidativen Metabolismen verbessert hat. Auf diese Weise wird bestimmt, dass aufgrund eines derartigen Austausches von Wasserstoff gegen Deuterium die Halbwertszeit der

Ausgangsverbindung um bis zu 100% verlängert werden kann.

Der Austausch von Wasserstoff gegen Deuterium in einer Verbindung der Formel I lässt sich auch dazu verwenden, um zu einer günstigen Änderung des Stoffwechselproduktspektrums der Ausgangsverbindung zwecks

Verringerung oder Ausschluss von unerwünschten toxischen

Stoffwechselprodukten zu gelangen. Entsteht zum Beispiel ein toxisches Stoffwechselprodukt aufgrund der Spaltung einer oxidativen Kohlenstoff- Wasserstoff (C-H)-Bindung kann vernünftigerweise angenommen werden, dass das deuterierte Analog die Produktion des unerwünschten

Stoffwechselprodukts wesentlich verringert oder ausschließt, sogar dann, wenn es sich bei der jeweiligen Oxidation nicht um einen

geschwindigkeitsbestimmenden Schritt handelt. Weitere Informationen zum Stand der Technik in bezug auf den Austausch von Wasserstoff gegen Deuterium finden sich z.B. bei Hanzlik et al., J. Org. Chem. 55, 3992-3997, 1990, Reider et al., J. Org. Chem. 52, 3326-3334, 987, Foster, Adv. Drug Res. 14, 1-40, 1985, Gillette et al., Biochemistry 33(10), 2927-2937, 1994, und Jarman et al., Carcinogenesis 16(4), 683-688, 1993.

Gegenstand der Erfindung sind auch Mischungen der erfindungsgemäßen Verbindungen der Formel I, z.B. Gemische zweier Diastereomere z.B. im Verhältnis 1 :1 , 1 :2, 1 :3, 1 :4, 1 :5, 1 :10, 1 :100 oder 1 :1000. Besonders bevorzugt handelt es sich um Mischungen zweier stereoisomerer Verbindungen. Bevorzugt sind jedoch auch Mischungen zweier oder mehrerer Verbindungen der Formel I.

Gegenstand der Erfindung ist außerdem ein Verfahren zur Herstellung der

Verbindungen der Formel I, worin

X H bedeutet,

Q CH ₂ bedeutet und

und I ¹ , 1 ² , 1 ³ , Y, Ar, T, R ¹ , R ² , R, R', R" und Hai die oben angegebenen Bedeutungen aufweisen, dadurch gekennzeichnet, dass man eine

Verbindung der Formel II durch reduktive Aminierung zu einer Verbindung der Formel III umsetzt, eine Verbindung der Formel III durch Hydrierung in Gegenwart eines Katalysators zu einer Verbindung der Formel IV umsetzt, eine Verbindung der Formel IV mit Bromcyan zu einer Verbindung der Formel V als Hydrobromid umsetzt und eine Verbindung der Formel V durch Behandlung mit einer Base zu einer Verbindung der Formel I umsetzt.

Gegenstand der Erfindung ist außerdem ein Verfahren zur Herstellung der Verbindungen der Formel I, worin

X H oder NH ₂ bedeutet,

Q C=0 bedeutet und

und I ¹ , I ² , I ³ , Y, Ar, T, R ¹ , R ² , R, R', R" und Hai die oben angegebenen Bedeutungen aufweisen, dadurch gekennzeichnet, dass man eine

Verbindung der Formel VI durch Reaktion mit Thiophosgen oder ähnlichen Reagenzien zu einer Verbindung der Formel VII umsetzt, eine Verbindung der Formel VII unter basischen Bedingungen mit einem geeigneten Amin und gegebenenfalls unter Zugabe von basischen Reagenzien zu einer Verbindung der Formel VIII umsetzt und eine Verbindung der Formel VIII mit Hydrazin zu einer Verbindung der Formel la bzw. einer Verbindung der Formel I umsetzt, worin

X NH ₂ bedeutet,

Q C=O bedeutet und

und I ¹ , I ² , I ³ , Y, Ar, T, R ¹ , R ² , R, R', R" und Hai die oben angegebenen

Bedeutungen aufweisen, oder eine Verbindung der Formel VIII mit

Ammoniak oder Hydroxylamin und gegebenenfalls unter Verwendung von tert-Butylhydroperoxid zu einer Verbindung der Formel Ib bzw. einer

Verbindung der Formel I umsetzt, worin

X H bedeutet,

Q C=0 bedeutet und

und I ¹ , I ² , I ³ , Y, Ar, T, R ¹ , R ² , R, R', R" und Hai die oben angegebenen Bedeutungen aufweisen.

Gegenstand der Erfindung ist außerdem ein Verfahren zur Herstellung der

Verbindungen der Formel I, dadurch gekennzeichnet, dass man

a) die Base einer Verbindung der Formel I durch Behandlung mit einer

Säure in eines ihrer Salze überführt, oder

b) eine Säure einer Verbindung der Formel I durch Behandlung mit einer

Base in eines ihrer Salze überführt.

Es ist auch möglich die Reaktionen jeweils stufenweise durchzuführen und die Reihenfolge der Bausteinverknüpfungen unter Anpassung des

Schutzgruppenkonzepts zu verändern.

Die Ausgangsstoffe oder Ausgangsverbindungen sind in der Regel bekannt. Sind sie neu, so können sie nach an sich bekannten Methoden hergestellt werden.

Die Ausgangsstoffe können, falls erwünscht, auch in situ gebildet werden, so dass man sie aus dem Reaktionsgemisch nicht isoliert, sondern sofort weiter zu den Verbindungen der Formel I umsetzt. Vorzugsweise werden die Verbindungen der Formel I erhalten, indem man sie aus ihren funktionellen Derivaten durch Solvolyse, insbesondere durch Hydrolyse oder durch Hydrogenolyse freisetzt. Bevorzugte Ausgangsstoffe für die Solvolyse bzw. Hydrogenolyse sind solche, die an der Stelle einer oder mehrerer freier Amino-, Carboxyl- und/oder Hydroxygruppen

entsprechend geschützte Amino-, Carboxyl- und/oder Hydroxygruppen enthalten, vorzugsweise solche, die an der Stelle eines H-Atoms, das mit einem N-Atom verbunden ist, eine Aminoschutzgruppe tragen. Ferner sind Ausgangsstoffe bevorzugt, die an der Stelle des H-Atoms einer

Hydroxygruppe eine Hydroxyschutzgruppe tragen. Außerdem sind

Ausgangsstoffe bevorzugt, die an der Stelle einer freien Carboxylgruppe eine geschützte Carboxygruppe tragen. Es können auch mehrere, gleiche oder verschiedene geschützte Amino-, Carboxyl- und/oder Hydroxygruppen im Molekül des Ausgangsstoffs vorhanden sein. Falls die vorhandenen Schutzgruppen voneinander verschieden sind, können sie in vielen Fällen selektiv abgespalten werden. Der Ausdruck„Aminoschutzgruppe" ist allgemein bekannt und bezieht sich auf Gruppen, die geeignet sind, eine Aminogruppe vor chemischen

Umsetzungen zu schützen (zu blockieren), die aber leicht entfernbar sind, nachdem die gewünschte chemische Reaktion an anderen Stellen de

Moleküls durchgeführt worden ist. Typisch für solche Gruppen sind insbesondere unsubstituierte oder substituierte Acylgruppen, ferner unsubstituierte oder substituierte Aryl- (z.B. 2,4-Dinitophenyl) oder

Aralkylgruppen (z.B. Benzyl, 4-Nitrobenzyl, Triphenylmethyl). Da die

Aminoschutzgruppen nach der gewünschten Reaktion oder Reaktionsfolge entfernt werden, ist ihre Art und Größe im Übrigen nicht kritisch, bevorzugt sind jedoch solche mit 1-20, insbesondere 1-8 C-Atomen. Der Ausdruck „Acylgruppe" ist im Zusammenhang mit dem vorliegenden Verfahren in weitestem Sinne aufzufassen. Er umschließt von aliphatischen,

araliphatischen, aromatischen oder heterozyklischen Carbonsäuren oder Sulfonsäuren abgeleitete Acylgruppen sowie insbesondere Alkoxycarbonyl-, Aryloxycarbonyl- und vor allem Aralkoxycarbonylgruppen. Beispiele für derartige Acylgruppen sind Alkanoyl wie Acteyl, Propionyl, Buturyl,

Aralkanoyl wie Phenylacetyl, Aroyl wie Benzoyl oder Toluyl, Aryoxyaklkanoyl wie Phenoxyacetyl, Alkyoxycarbonyyl wie Methoxycarbonyl, Ethoxycarbonyl, 2,2,2-Trichlorethoxycarbonyl, BOC, 2-Jodethoxycaronyl, Aralkyloxycarbonyl wie CBZ, 4-Methoxybenzyloxycarbonyl oder FMOC. Bevorzugte

Acylgruppen sind CBZ, FMOC, Benzyl und Acetyl.

Der Ausdruck„Säureschutzgruppe" oder„Carboxylschutzgruppe" ist ebenfalls allgemein bekannt und bezieht sich auf Gruppen, die geeignet sind, eine -COOH-gruppe vor chemischen Umsetzungen zu schützen, die aber leicht entfernbar sind, nachdem die gewünschte chemische Reaktion an anderen Stellen des Moleküls durchgeführt worden sind. Typisch ist die Verwendung von Estern anstelle der freien Säuren z.B. von substutierten und unsubstituierten Alkylestern (wie Methyl, Ethyl, tert-Butyl und deren substituierte Derivate), von substutierten und unsubstituierten Benzylestern oder Silylestem. Die Art und Größe der Säureschutzgruppen ist nicht kritisch, bevorzugt sind jedoch solche mit 1-20, insbesondere 1-10 C- Atomen.

Der Ausdruck„Hydroxyschutzgruppe" ist ebenfalls allgemein bekannt und bezieht sich auf Gruppen, die geeignet sind, eine Hydroxygruppe vor chemischen Umsetzungen zu schützen, die aber leicht entfernbar sind, nachdem die gewünschte chemische Reaktion an anderen Stellen des Moleküls durchgeführt worden sind. Typisch für solche Gruppen sind die oben genannten unsubstituierten oder substituierten Aryl-, Aralkyl- odder Acylgruppen, ferner auch Alkylgruppen. Die ihre Art und Größe der

Hydroxyschutzgruppen ist nicht kritisch, bevorzugt sind jedoch solche mit 1- 20, insbesondere 1-10 C-Atomen. Beispiele für Hyrdoxyschutzgruppen sind u.a. Benzyl, p-Nitrobenzoyl, p-Toluolsulfonyl und Acetyl, wobei Benzyl und Acetyl bevorzugt sind. Weitere typische Beispiele für Amino-, Säure-, und Hydroxyschutzgruppen finden sich beispielsweise in„Greene's Protective Groups in Organic

Synthesis", vierte Auflage, Wiley-Interscience, 2007.

Die als Ausgangstoffe zu verwendenden funktionellen Derivate der

Verbindungen der Formel I können nach bekannten Methoden der

Aminosäure- und Peptidsynthese hergestellt werden, wie sie z.B. in den genannten Standardwerken und Patentanmeldungen beschrieben sind.

Die Freisetzung der Verbindungen der Formel I aus ihren funktionellen Derivaten gelingt, je nach verwendeter Schutzgruppe, z.B. mithilfe starker

Säuren, zweckmäßig mit Trifluoressigsäure oder Perchlorsäure, jedoch auch mit anderen starken anorganischen Säuren wie Salz- oder Schwefelsäure, starken organischen Säuren wie Trichloressigsäure oder Sulfonsäuren wie Benzoyl- oder p-Toluol-Sulfonsäure. Die Anwesenheit eines zusätzlichen inerten Lösungsmittels und/oder eines Katalysators ist möglich, jedoch nicht immer erforderlich.

In Abhängigkeit des jeweiligen Synthesewegs kann man die Ausgangsstoffe, gegebenenfalls in Anwesenheit eines inerten Lösungsmittels reagieren lassen. Als inerte Lösungsmittel eignen sich z.B. Heptan, Hexan, Petrolether, DMSO, Benzol, Toluol, Xylol, Trichlorethylen-, 1 ,2- Dichlorethantetra- chlorkohlenstoff, Chloroform oder Dichlormethan; Alkohole wie Methanol, Ethanol, Isopropanol, n-Propanol, n-Butanol oder tert.-Butanol; Ether wie Diethylether, Diisopropylether (bevorzugt für die Substitution am

Indolstickstoff), Tetrahydrofuran (THF) oder Dioxan; Glykolether wie

Ethylenglykolmonomethyl- oder monoethylether (Methylglykol oder

Ethylglykol), Ethylenglykoldimethy-Iether (Diglyme); Ketone wie Aceton oder Butanon; Amide wie Acetamid, Dimethylacetamid, N-Methylpyrrolidon (NMP) oder Dimethylformamid (DMF); Nitrile wie Acetonitril; Ester wie Ethylacetat, Carbonsäuren oder Säureanhydride, wie z. B. wie Essigsäure oder

Acetanhydrid, Nitroverbindungen wie Nitromethan oder Nitrobenzol, gegebenenfalls auch Gemische der genannten Lösungsmittel untereinander oder Gemische mit Wasser. Die Menge des Lösungsmittels ist nicht kritisch, vorzugsweise können 10 g bis 500 g Lösungsmittel je g der umzusetzenden Verbindung der Formel I zugesetzt werden.

Vorteilhaft kann die Zugabe eines säurebindenden Mittels sein, z.B. ein Alkalimetall oder Erdalkalimetallhydroxid, -carbonat oder -bicarbonat oder andere Alkalimetall- oder Erdalkalimetallsalze schwacher Säuren,

vorzugsweise ein Kalium-, Natrium- oder Calciumsalz, oder die Zugabe einer organischen Base, wie beispielsweise an Triethylamin, Dimethylamin, Pyridin oder Chinolin, oder ein Überschuss der Aminkomponente.

Die erhaltenen erfindungsgemäßen Verbindungen können von der

entsprechenden Lösung, in der sie hergestellt werden, getrennt werden (z.B. durch Zentrifugation und Waschen) und können nach der Trennung in einer anderen Zusammensetzung gelagert werden, oder sie können direkt in der Herstellungslösung verbleiben. Die erhaltenen erfindungsgemäßen

Verbindungen können auch zur jeweiligen Verwendung in gewünschte Lösungsmittel aufgenommen werden.

Die Dauer der Umsetzung hängt von den gewählten Reaktionsbedingungen ab. In der Regel beträgt die Reaktionsdauer 0.5 Stunden bis 10 Tage, vorzugsweise 1 bis 24 Stunden. Bei Verwendung einer Mikrowelle kann die Reaktionszeit auf werte von 1 bis 60 Minuten reduziert werden.

Die Verbindungen der Formel I und auch die Ausgangsstoffe zu ihrer

Herstellung werden im übrigen nach bekannten Methoden hergestellt, wie sie in der Literatur beschrieben sind (z. B. in Standardwerken wie Houben- Weyl, Methoden der organischen Chemie, Georg-Thieme-Verlag, Stuttgart) so z.B. unter Reaktionsbedingungen, die für die genannten Umsetzungen bekannt und geeignet sind. Dabei kann man auch von an sich bekannten, hier nicht näher beschriebenen Varianten Gebrauch machen. Durch übliche Aufarbeitungsschritte wie z. B. Wasserzugabe zum

Reaktionsgemisch und Extraktion können die Verbindungen nach

Entfernung des Lösungsmittels erhalten werden. Es kann vorteilhaft sein, zur weiteren Reinigung des Produktes eine Destillation oder Kristallisation anzuschließen oder eine chromatographische Reinigung durchzuführen.

Eine Säure der Formel I kann mit einer Base in das dazugehörige

Additionssalz überführt werden, beispielsweise durch Umsetzung äquivalenter Mengen der Säure und der Base in einem inerten

Lösungsmittel wie Ethanol und einschließendes Eindampfen. Für diese Umsetzung kommen insbesondere Basen in Frage, die physiologisch unbedenkliche Salze liefern. So kann die Säure der Formel I mit einer Base (z.B. Natrium- oder Kaliumhydroxid oder -carbonat) in das entsprechende Metall-, insbesondere Alkali- oder Erdalkalimetall- oder in das

entsprechende Ammoniumsalz umgewandelt werden. Für diese Umsetzung kommen auch organische Basen in Frage, die physiologisch unbedenkliche Salze liefern, wie z.B. Ethanolamin.

Andererseits kann eine Base der Formel I mit einer Säure in das zugehörige Säureadditionssalz überführt werden, beispielsweise durch Umsetzung äquivalenter Mengen der Base und der Säure in einem inerten

Lösungsmittel wie Ethanol und anschließendes Eindampfen. Für diese Umsetzung kommen insbesondere Säuren in Frage, die physiologisch unbedenkliche Salze liefern. So können anorganische Säuren verwendet werden, z.B. Schwefelsäure, Salpetersäure, Halogenwasserstoffsäuren wie Chlorwasserstoffsäure oder Bromwasserstoffsäure, Phosphorsäuren wir Orthophosphorsäure, Sulfaminsäure, ferner organische Säuren,

insbesondere aliphatische, alicyclische, araliphatische, aromatische oder heterocyclische, ein- oder mehrbasige Carbon-, Sulfon- oder

Schwefelsäuren, z.B. Ameisensäure, Essigsäure, Propionsäure,

Pivalinsäure, Diethylessigsäure, Malonsäure, Bernsteinsäure, Pimelinsäure, Fumarsäure, Maleinsäure, Milchsäure, Weinsäure, Äpfelsäure,

Citronensäure, Gluconsäure, Ascorbinsäure, Nicotinsäure, Isonicotinsäure, Methan- oder Ethansulfonsäure, Ethandisulfonsäure, 2-Hydroxysulfonsäure, Benzolsulfonsäure, p-Toluolsulfonsäure, Naphthalin-mom- und

disulfonsäuren oder Laurylschwefelsäure. Salze mit physiologisch nicht unbedenklichen Säuren, z.B. Pikrate, können zur Isolierung und/oder Aufreinigung der Verbindungen der Formel I verwendet werden. Es wurde gefunden, dass die Verbindungen der Formel I gut verträglich sind und wertvolle pharmakologische Eigenschaften besitzen, da sie

Aspartylproteasen und insbesondere Cathepsin D selektiv inhibieren. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist deshalb die Verwendung von erfindungsgemäßen Verbindungen zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Krankheiten, die durch Cathepsin D und/oder durch Cathepsin D-vermittelte Signaltransduktion verursacht, vermittelt und/oder propagiert werden.

Gegenstand der Erfindung ist somit insbesondere auch ein Arzneimittel enthaltend wenigstens eine erfindungsgemäße Verbindung und/oder eines ihrer physiologisch unbedenklichen Salze, Derivate, Solvate, Prodrugs und Stereoisomere, einschließlich deren Mischungen in allen Verhältnissen zur Verwendung bei der Behandlung und/oder Prophylaxe von physiologischen und/oder pathophysiologischen Zuständen.

Besonders bevorzugt sind insbesondere physiologische und/oder

pathophysiologische Zustände, die mit Cathepsin D in Zusammenhang stehen.

Unter physiologischen und/oder pathophysiologischen Zuständen werden physiologische und/oder pathophysiologische Zustände verstanden, die medizinisch relevant sind, wie beispielsweise Krankheiten bzw.

Erkrankungen und medizinische Störungen, Beschwerden, Symptome oder Komplikationen und dergleichen, insbesondere Krankheiten.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Arzneimittel enthaltend wenigstens eine erfindungsgemäße Verbindung und/oder eines ihrer physiologisch unbedenklichen Salze, Derivate, Solvate, Prodrugs und

Stereoisomere, einschließlich deren Mischungen in allen Verhältnissen zur Verwendung bei der Behandlung und/oder Prophylaxe von physiologischen und/oder pathophysiologischen Zuständen, ausgewählt aus der Gruppe bestehend Arthrose, traumatische Knorpelverletzungen und Arthritis, insbesondere rheumatoide Arthritis. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Arzneimittel enthaltend wenigstens eine erfindungsgemäße Verbindung und/oder eines ihrer physiologisch unbedenklichen Salze, Derivate, Solvate, Podrugs und

Stereoisomere, einschließlich deren Mischungen in allen Verhältnissen zur Verwendung bei der Behandlung und/oder Prophylaxe von physiologischen und/oder pathophysiologischen Zuständen, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Alzheimer Krankheit, Chorea Huntington, Mucolipidose, Krebs, insbesondere Brustkrebs, Kontaktdermatitis, Spät-Typ der

Überempfindlichkeitsreaktion, Entzündungen, Endometriose, Vernarbung, gutartige Prostatahyperplasie, Osteosarkom, Rachitis, Hauterkrankungen wie beispielsweise Psoriasis, immunologische Krankheiten, Autoimmunkrankheiten und Immunschwächekrankheiten.

In diesem Zusammenhang sind Hirnkrebs, Lungenkrebs, Plattenepithelkrebs, Blasenkrebs, Magenkrebs, Pankreaskrebs, Leberkrebs, Nierenkrebs, Kolorektalkrebs, Brustkrebs, Kopfkrebs, Halskrebs, Ösophaguskrebs, gynäkologischer Krebs, Schilddrüsenkrebs, Lymphome, chronische

Leukämie und akute Leukämie als krebsartige Erkrankungen anzusehen, die alle gewöhnlich zur Gruppe der hyperproliferativen Erkrankungen gezählt werden.

Schmerz ist eine komplexe Sinneswahrnehmung, die als akutes Geschehen den Charakter eines Warn- und Leitsignals aufweist, als chronischer

Schmerz diesen aber verloren hat und in diesem Fall (als Chronisches Schmerzsyndrom) heute als eigenständiges Krankheitsbild gesehen und behandelt werden soll. Als Hyperalgesie wird in der Medizin eine

übermäßige Schmerzempfindlichkeit und Reaktion auf einen üblicherweise schmerzhaften Reiz hin bezeichnet. Reize, die Schmerzen auslösen können, sind beispielsweise Druck, Wärme, Kälte oder Entzündungen. Die

Hyperalgesie ist eine Form der Hyperästhesie, dem Oberbegriff für eine übermäßige Empfindlichkeit auf einen Reiz hin. Als Allodynie wird in der Medizin eine Schmerzempfindung bezeichnet, die durch Reize ausgelöst wird, welche üblicherweise keinen Schmerz verursachen.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist somit ein Arzneimittel enthaltend wenigstens eine erfindungsgemäße Verbindung und/oder eines ihrer physiologisch unbedenklichen Salze, Derivate, Solvate, Prodrugs und Stereoisomere, einschließlich deren Mischungen in allen Verhältnissen zur Verwendung bei der Behandlung und/oder Prophylaxe von physiologischen und/oder pathophysiologischen Zuständen, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Schmerz, Allodynie und Hyperalgesie. Somit ist ein besonders bevorzugter Gegenstand der Erfindung ein

Arzneimittel enthaltend wenigstens eine erfindungsgemäße Verbindung und/oder eines ihrer physiologisch unbedenklichen Salze, Derivate, Solvate, Prodrugs und Stereoisomere, einschließlich deren Mischungen in allen Verhältnissen zur Verwendung bei der Behandlung und/oder Prophylaxe von physiologischen und/oder pathophysiologischen Zuständen, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Arthrose, traumatische Knorpelverletzungen, Arthritis, Schmerz, Allodynie und Hyperalgesie.

Es ist beabsichtigt, dass mit obenstehend offenbarten Arzneimitteln eine entsprechende Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindungen zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung und/oder Prophylaxe von vorstehenden physiologischen und/oder pathophysiologischen Zuständen umfasst ist. Es ist außerdem beabsichtigt, dass mit obenstehend offenbarten

Arzneimitteln ein entsprechendes Verfahren zur Behandlung und/oder Prophylaxe von vorstehenden physiologischen und/oder pathophysiologischen Zuständen, bei dem man wenigstens eine

erfindungsgemäße Verbindung an einen Patienten verabreicht, der eine solche Behandlung benötigt, umfasst ist. Die erfindungsgemäßen Verbindungen zeigen bevorzugt eine vorteilhafte biologische Aktivität, die in Enzym-Assays und Tierversuchen, wie in den Beispielen beschrieben, leicht nachweisbar ist. In derartigen auf Enzymen basierenden Assays zeigen und bewirken die erfindungsgemäßen

Antikörper bevorzugt einen inhibierenden Effekt, der gewöhnlich durch IC ₅ o-Werte in einem geeigneten Bereich, bevorzugt im mikromolaren Bereich und bevorzugter im nanomolaren Bereich dokumentiert wird.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen können an Menschen oder Tiere, insbesondere Säugetiere, wie Affen, Hunde, Katzen, Ratten oder Mäuse verabreicht werden und bei der therapeutischen Behandlung des

menschlichen oder des tierischen Körpers sowie bei der Bekämpfung der oben aufgeführten Krankheiten verwendet werden. Sie können weiterhin als Diagnostika oder als Reagenzien Verwendung finden. Weiterhin können erfindungsgemäße Verbindungen zur Isolierung und zur Untersuchung der Aktivität oder Expression von Cathepsin D verwendet werden. Außerdem eignen sie sich insbesondere zur Verwendung in diagnostischen Verfahren zu Erkrankungen im Zusammenhang mit gestörter Cathepsin D-Aktivität. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist deshalb die Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindungen zur Isolierung und zur Untersuchung der Aktivität oder Expression von Cathepsin D bzw. als Binder und Inhibitoren von Cathepsin D.

Für diagnostische Zwecke können die erfindungsgemäßen Verbindungen beispielsweise radioaktiv markiert werden. Beispiele für radioaktive

Markierungen sind ³ H, ¹ C, ²³ 1 und ¹²⁵ l. Ein bevorzugtes Markierungsverfahren ist die lodogen-Methode (Fraker et al., 1978). Darüber hinaus können die erfindungsgemäßen Verbindungen durch Enzyme, Fluorophore und Chemophore markiert werden. Beispiele für Enzyme sind alkalische Phosphatase, ß-Galaktosidase und Glucoseoxidase, ein Beispiel für eine Fluorophor ist Fluorescin, ein Beispiel für ein Chemophor ist Lumtnol und Automatisierte Detektionssysteme beispielsweise für fluoreszente

Färbungen werden beispielweise in US 4,125,828 und US 4,207,554 beschrieben.

Die Verbindungen der Formel I können zur Herstellung pharmazeutischer Zubereitungen verwendet werden, insbesondere auf nicht-chemischem Wege. Hierbei werden sie zusammen mit mindestens einem festen, flüssigen und/oder halbflüssigen Träger- oder Hilfsstoff und gegebenenfalls in Kombination mit einem oder mehreren weiteren Wirkstoff(en) in eine geeignete Dosierungsform gebracht.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind deshalb pharmazeutische Zubereitungen, enthaltend wenigstens eine Verbindung der Formel I und/oder ihre physiologisch unbedenklichen Salze, Derivate, Solvate, Prodrugs und Stereoisomere, einschließlich deren Mischungen in allen Verhältnissen. Gegenstand der Erfindung sind insbesondere auch solche pharmazeutische Zubereitungen, die weitere Träger- und/oder Hilfsstoffe enthalten, sowie auch solche pharmazeutische Zubereitungen, die wenigstens einen weiteren Arzneimittelwirkstoff enthalten. Gegenstand der Erfindung ist insbesondere auch ein Verfahren zur

Herstellung einer pharmazeutischen Zubereitung, dadurch gekennzeichnet, dass man eine Verbindung der Formel I und/oder eines ihrer physiologisch unbedenklichen Salze, Derivate, Solvate, und Stereoisomere, einschließlich deren Mischungen in allen Verhältnissen zusammen mit einem festen, flüssigen oder halbflüssigen Träger- oder Hilfsstoff und gegebenenfalls mit einem weiteren Arzneimittelwirkstoff in eine geeignete Dosierungsform bringt. Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zubereitungen können als Arzneimittel in der Human- oder Veterinärmedizin verwendet werden. Der Patient oder Wirt kann jeglicher Säugerspezies angehören, z. B. einer Primatenspezies, besonders Menschen; Nagetieren, einschließlich Mäusen, Ratten und Hamstern; Kaninchen; Pferden, Rindern, Hunden, Katzen usw. Tiermodelle sind für experimentelle Untersuchungen von Interesse, wobei sie ein Modell zur Behandlung einer Krankheit des Menschen zur Verfügung stellen.

Als Trägersubstanzen kommen organische oder anorganische Stoffe in Frage, die sich für die enterale (z.B. orale), parenterale oder topische Applikation eignen und mit den neuen Verbindungen nicht reagieren, beispielsweise Wasser, pflanzliche Öle (wie Sonnenblumenöl oder

Lebertran), Benzylalkohole, Polyethylenglykole, Gelatine, Kohlehydrate wie Laktose oder Stärke, Magnesiumstearat, Talk, Lanolin oder Vaseline.

Welche Hilfsstoffe für die gewünschte Arzneimittelformulierung geeignet sind, ist dem Fachmann auf Grund seines Fachwissens geläufig. Neben Lösungsmitteln z.B. Wasser, physiologische Kochsalzlösung oder Alkohole wie z.B. Ethanol, Propanol oder Glycerin, Zuckerlösungen wie Glucose oder Mannitlösungen oder eine Mischung der genannten Lösungsmittel,

Gelbildnern, Tablettenhilfsstoffen und anderen Wirkstoffträgern können beispielsweise Gleitmittel, Stabilisatoren und/oder Netzmittel, Emulatoren, Salze zur Beeinflussung des osmotischen Druckes, Antioxidantien,

Dispergiermittel, Entschäumer, Puffersubstanzen, Geschmacks- und/oder Aromastoffe bzw. Geschmackskorrigentien, Konservierungsmittel,

Lösungsvermittler oder Farbstoffe verwendet werden. Falls erwünscht, können erfindungsgemäße Zubereitungen oder Medikamente einen oder mehrere weitere Wirkstoffe enthalten, beispielsweise ein oder mehrere Vitamine. Falls erwünscht, können erfindungsgemäße Zubereitungen oder

Medikamente einen oder mehrere weitere Wirkstoffe und/oder einen oder mehrere Wirkverstärker (Adjuvantien) enthalten. Die Begriffe„pharmazeutische Formulierung" und„pharmazeutische

Zubereitung" werden im Rahmen der vorliegenden Erfindung als Synonyme verwendet.

Wie hier verwendet bezieht sich„pharmazeutisch verträglich" auf Arznei- mittel, Präzipitationsreagezien, Trägerstoffe, Hilfsstoffe, Stabilisatoren, Lösungsmittel und sonstige Agenzien, die die Verabreichung der daraus erhaltenen pharmazeutischen Zubereitungen ohne unerwünschte

physiologische Nebenwirkungen, wie beispielsweise Übelkeit, Schwindel, Verdauungsprobleme o.ä. an ein Säugetier ermöglichen .

Bei pharmazeutischen Zubereitungen zur parenteralen Verabreichung besteht die Forderung nach Isotonie, Euhydrie sowie nach Verträglichkeit und Sicherheit der Formulierung (geringe Toxizität), der eingesetzten Hilfsstoffe und des Primärpackmittels. Überraschenderweise haben die erfindungsgemäßen Verbindungen vorzugsweise den Vorteil, dass eine direkte Verwendung möglich ist und vor Verwendung der

erfindungsgemäßen Verbindungen in pharmazeutischen Formulierungen keine weiteren Reinigungsschritte zum Entfernen toxikologisch bedenklicher Agenzien, wie beispielsweise hohe Konzentrationen organischer

Lösungsmittel oder anderer toxikologisch bedenklicher Hilfsstoffe, erforderlich sind.

Ein besonders bevorzugter Gegenstand der Erfindung sind auch pharmazeutische Zubereitungen enthaltend wenigstens eine erfindungsgemäße Verbindung in präzipitierter nicht-kristalliner, präzipitierter kristalliner oder in gelöster oder suspendierter Form, sowie gegebenenfalls Träger- und/oder Hilfsstoffe und/oder weitere pharmazeutische Wirkstoffe. Vorzugsweise ermöglichen es die erfindungsgemäßen Verbindungen, hochkonzentrierte Formulierungen herzustellen, ohne dass es zu

ungünstigen unerwünschten Aggregationen der erfindungsgemäßen

Verbindungen kommt. So lassen sich mithilfe erfindungsgemäßer

Verbindungen mit wässrigen Lösungsmitteln oder in wässrigen Medien applikationsfertige Lösungen mit hohem Wirkstoffanteil herstellen.

Die Verbindungen und/oder deren physiologisch unbedenklichen Salze und Solvate können auch lyophilisiert und die erhaltenden Lyophilisate beispielsweise zur Herstellung von Injektionspräparaten verwendet werden.

Wässrige Zubereitungen können hergestellt werden, indem man

erfindungsgemäße Verbindungen in einer wässrigen Lösung löst oder suspendiert und gegebenenfalls Hilfsstoffe zufügt. Zweckmäßigerweise wird hierzu einer Lösung oder Suspension mit einer definierten Konzentration an erfindungsgemäßen Verbindungen mit definierten Volumina an

Stammlösungen, die die genannten weiteren Hilfsstoffe in definierter Konzentration enthalten, versetzt und ggf. mit Wasser auf die vorberechnete Konzentration verdünnt. Alternativ können die Hilfsstoffe in fester Form zugesetzt werden. Die erhaltene wässrige Lösung oder Suspension kann anschließend mit den jeweils erforderlichen Mengen an Stammlösungen und/oder Wasser versetzt werden. Zweckmäßigerweise können

erfindungsgemäße Verbindungen auch direkt in einer alle weiteren

Hilfsstoffe enthaltenden Lösung gelöst oder suspendiert werden.

Vorteilhaft können die erfindungsgemäße Verbindungen enthaltenden Lösungen oder Suspensionen mit einem pH-Wert von 4 bis 10, bevorzugt mit einem pH-Wert von 5 bis 9, und einer Osmolalität von 250 bis 350 mOsmol/kg hergestellt werden. Die pharmazeutische Zubereitung kann somit weitgehend schmerzfrei intravenös, intraarteriell, intraartikulär, subkutan oder perkutan direkt verabreicht werden. Daneben können der Zubereitung auch Infusionslösungen, wie z.B. Glukoselösung, isotonische Kochsalzlösung oder Ringerlösung, die auch weitere Wirkstoffe enthalten können, zugesetzt werden, so dass auch größere Wirkstoffmengen appliziert werden können.

Erfindungsgemäße pharmazeutische Zubereitungen können auch

Mischungen mehrerer erfindungsgemäßer Verbindungen enthalten.

Die erfindungsgemäßen Zubereitungen sind physiologisch gut verträglich, leicht herstellbar, exakt dosierbar und vorzugsweise über die Dauer der Lagerung sowie des Transports und bei mehrfachen Einfrier- und

Auftauvorgängen hinsichtlich Gehalt, Zersetzungsprodukten und Aggregaten stabil. Sie können bei Kühlschranktemperatur (2-8°C) und bei

Raumtemperatur (23-27°C) und 60 % relativer Luftfeuchtigkeit (r.F.) vorzugsweise über einen Zeitraum von mindestens drei Monaten bis zu zwei Jahren stabil gelagert werden.

Beispielsweise können die erfindungsgemäßen Verbindungen durch

Trocknung stabil gelagert und bei Bedarf durch Lösung oder Suspension in eine gebrauchsfertige pharmazeutische Zubereitung überführt werden.

Mögliche Methoden zur Trocknung sind zum Beispiel, ohne auf diese

Beispiele beschränkt zu sein, Stickstoffgastrocknung, Vakuumofen- Trocknung, Lyophilization, Waschen mit organischem Lösungsmittel und anschließende Lufttrocknung, Flüssigbett-Trocknung,

Wirbelschichttrocknung, Sprühtrocknung, Walzentrocknung,

Lagentrocknung; Lufttrocknung bei Raumtemperatur und weitere Methoden.

Der Ausdruck "wirksame Menge" bedeutet die Menge eines Arzneimittels oder eines pharmazeutischen Wirkstoffes, die eine biologische oder medizinische Antwort in einem Gewebe, System, Tier oder Menschen hervorruft, die z.B. von einem Forscher oder Mediziner gesucht oder angestrebt wird. Darüber hinaus bedeutet der Ausdruck "therapeutisch wirksame Menge" eine Menge, die, verglichen zu einem entsprechenden Subjekt, das diese Menge nicht erhalten hat, folgendes zur Folge hat: verbesserte Heilbehand- lung, Heilung, Prävention oder Beseitigung einer Krankheit, eines

Krankheitsbildes, eines Krankheitszustandes, eines Leidens, einer Störung oder Verhinderung von Nebenwirkungen oder auch die Verminderung des Fortschreitens einer Krankheit, eines Leidens oder einer Störung. Die Bezeichnung "therapeutisch wirksame Menge" umfasst auch die Mengen, die wirkungsvoll sind, die normale physiologische Funktion zu erhöhen.

Bei Verwendung von erfindungsgemäßen Zubereitungen oder

Medikamenten werden die erfindungsgemäßen Verbindungen und/oder dessen physiologisch unbedenklichen Salze und Solvate in der Regel analog zu bekannten, käuflich erhältlichen Zubereitungen oder Präparaten verwendet, vorzugsweise in Dosierungen zwischen 0,1 und 500 mg, insbesondere 5 und 300 mg pro Anwendungseinheit. Die tägliche Dosierung liegt vorzugsweise zwischen 0,001 und 250 mg/kg, insbesondere 0,01 und 100 mg/kg Köpergewicht. Die Zubereitung kann ein- oder mehrmals pro Tag verabreicht werden, z.B. zwei-, drei- oder viermal am Tag. Jedoch hängt die individuelle Dosierung für einen Patienten von einer großen Zahl

individueller Faktoren ab, wie beispielsweise von der Wirksamkeit der jeweils verwendeten Verbindung, vom Alter, Körpergewicht, allgemeinen

Gesundheitszustand, Geschlecht, Ernährung, vom Verabreichungszeitpunkt und -weg, von der Ausscheidungsrate, von der Kombination mit anderen Arzneimitteln und von der Schwere und Dauer der jeweiligen Erkrankung.

Ein Maß für die Aufnahme eines Arzneimittelwirkstoffs in einen Organismus ist seine Bioverfügbarkeit. Wird der Arzneimittelwirkstoff in Form einer Injektionslösung dem Organismus intravenös zugeführt, so liegt seine absolute Bioverfügbarkeit, d.h. der Anteil des Pharmakons, der unverändert im systemischen Blut, d.h. in den großen Kreislauf gelangt, bei 100%. Bei oraler Gabe eines therapeutischen Wirkstoffs liegt der Wirkstoff in der Regel als Feststoff in der Formulierung vor und muss sich daher zuerst auflösen, damit er die Eintrittsbarrieren, beispielsweise den

Gastrointestinaltrakt, die Mundschleimhaut, nasale Membranen oder die Haut, insbesondere das Stratum corneum, überwinden kann bzw. vom Körper resorbiert werden kann. Daten zur Pharmakokinetik, d.h. zur

Bioverfügbarkeit können analog zu der Methode von J. Shaffer et al., J. Pharm. Sciences, 88 (1999), 313-318 erhalten werden. Weiterhin lassen sich solche Arzneimittel mit einem der im

pharmazeutischen Fachgebiet allgemein bekannten Verfahren herstellen.

Arzneimittel lassen sich zur Verabreichung über einen beliebigen geeigneten Weg, beispielsweise auf oralem (einschließlich buccalem bzw.

sublingualem), rektalem, pumonalen, nasalem, topischem (einschließlich buccalem, sublingualem oder transdermalem), vaginalem oder parenteralem (einschließlich subkutanem, intramuskulärem, intravenösem, intradermalem und insbesondere intraartikulärem) Wege, anpassen. Solche Arzneimittel können mit allen im pharmazeutischen Fachgebiet bekannten Verfahren hergestellt werden, indem beispielsweise der Wirkstoff mit dem bzw. den Trägerstoff(en) oder Hilfsstoffen) zusammengebracht wird.

Zur Verabreichung der erfindungsgemäßen Arzneimittel eignet sich vorzugsweise die parenterale Applikation. Im Falle der parenteralen

Applikation ist die intraartikuläre Applikation besonders bevorzugt.

Ein bevorzugter Gegenstand der Erfindung ist so auch die Verwendung einer erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zubereitung zur intraartikulären Applikation bei der Behandlung und/oder Prophylaxe von physiologischen und/oder pathophysiologischen Zuständen, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Arthrose, traumatischen Knorpelverletzungen, Arthritis, Schmerz, Allodynie oder Hyperalgesie. Die intraartikuläre Applikation hat den Vorteil, dass die erfindungsgemäße Verbindung direkt in die Nähe des Gelenkknorpels in die Synovialflüssigkeit appliziert werden und von dort auch in das Knorpelgewebe

hineindiffundieren kann. Erfindungsgemäße pharmazeutische Zubereitungen können somit auch direkt in den Gelenkspalt injiziert werden und so direkt am bestimmungsgemäßen Wirkort ihre Wirkung entfalten. Die

erfindungsgemäßen Verbindungen eignen sich auch zur Herstellung von parenteral zu applizierenden Arzneimitteln mit kontrollierter, gleichmäßiger und/oder verzögerter Wirkstofffreisetzung (slow-release, sustained-release, controlled release). Somit eignen sie sich auch zur Herstellung von Depot- Formulierungen, die für den Patienten vorteilhaft sind, da eine Applikation nur in größeren Zeitintervallen notwendig ist. Zu den an die parenterale Verabreichung angepassten Arzneimitteln gehören wässrige und nichtwässrige sterile Injektionslösungen, die

Antioxidantien, Puffer, Bakteriostatika und Solute, durch die die

Formulierung isotonisch mit dem Blut oder der Synovialflüssigkeit des zu behandelnden Empfängers gemacht wird, enthalten; sowie wässrige und nichtwässrige sterile Suspensionen, die Suspensionsmittel und Verdicker enthalten können. Die Formulierungen können in Einzeldosis- oder

Mehrfachdosisbehältern, z.B. versiegelten Ampullen und Fläschchen, dargereicht und in gefriergetrocknetem (lyophilisiertem) Zustand gelagert werden, so dass nur die Zugabe der sterilen Trägerflüssigkeit, z.B. Wasser für Injektionszwecke, unmittelbar vor Gebrauch erforderlich ist.

Rezepturmäßig hergestellte Injektionslösungen und Suspensionen können aus sterilen Pulvern, Granulaten und Tabletten hergestellt werden.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen lassen sich auch in Form von

Liposomenzuführsystemen, wie z.B. kleinen unilamellaren Vesikeln, großen unilamellaren Vesikeln und multilamellaren Vesikeln, verabreichen. Liposomen können aus verschiedenen Phospholipiden, wie z.B. Cholesterin, Stearylamin oder Phosphatidylcholinen, gebildet werden.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen können auch mit löslichen Polymeren als zielgerichtete Arzneistoffträger gekoppelt werden. Solche Polymere können Polyvinylpyrrolidon, Pyran-Copolymer, Polyhydroxypropylmethacryl- amidphenol, Polyhydroxyethylaspartamidphenol oder Polyethylenoxid- polylysin, substituiert mit Palmitoylresten, umfassen. Weiterhin können die erfindungsgemäßen Verbindungen an eine Klasse von biologisch

abbaubaren Polymeren, die zur Erzielung einer kontrollierten Freisetzung eines Arzneistoffs geeignet sind, z.B. Polymilchsäure, Polyepsilon- Caprolacton, Polyhydroxybuttersäure, Polyorthoester, Polyacetale, Polydihy- droxypyrane, Polycyanoacrylate, Polymilchcoglykolsäure, Polymere wie Konjugate zwischen Dextran und Methacrylate, Polyphosphoester, verschiedene Polysaccharide und Polyamine sowie Poly-E-caprolacton,

Albumin, Chitosan, Collagen oder modifizierte Gelatine und quervernetzte oder amphipatische Blockcopolymere von Hydrogelen, gekoppelt sein.

Zur enteralen Applikation (oral oder rektal) dienen insbesondere Tabletten, Dragees, Kapseln, Sirupe, Säfte, Tropfen oder Suppositorien, für die topische Anwendung Salben, Creme, Pasten, Lotionen, Gele, Sprays, Schäume, Aerosole, Lösungen (z.B. Lösungen in Alkoholen wie Ethanol oder Isopropanol, Acetonitril, DMF, Dimethylacetamid, 1 ,2-Propandiol oder deren Gemischen untereinander und/oder mit Wasser) oder Puder.

Insbesondere für topische Anwendungen kommen auch liposomale

Zubereitungen in Betracht.

Bei Formulierung zu einer Salbe kann der Wirkstoff entweder mit einer paraffinischen oder einer mit Wasser mischbaren Cremebasis eingesetzt werden. Alternativ kann der Wirkstoff zu einer Creme mit einer Öl-in-Wasser- Cremebasis oder einer Wasser-in-ÖI-Basis formuliert werden. An die transdermale Verabreichung angepasste Arzneimittel können als eigenständige Pflaster für längeren, engen Kontakt mit der Epidermis des Empfängers dargereicht werden. So kann beispielsweise der Wirkstoff aus dem Pflaster mittels lontophorese zugeführt werden, wie in Pharmaceutical Research, 3(6), 318 (1986) allgemein beschrieben.

Es versteht sich, dass die erfindungsgemäßen Arzneimittel neben den obigen besonders erwähnten Bestandteilen andere im Fachgebiet übliche Mittel mit Bezug auf die jeweilige Art der pharmazeutischen Formulierung enthalten können.

Gegenstand der Erfindung ist auch ein Set (Kit) bestehend aus getrennten Packungen von

a) einer wirksamen Menge einer Verbindung der Formel I und/oder ihrer physiologisch unbedenklichen Salze, Derivate, Solvate, Prodrugs und

Stereoisomere, einschließlich deren Mischungen in allen Verhältnissen und

b) einer wirksamen Menge eines weiteren Arzneimittelwirkstoffs. Das Set enthält geeignete Behälter, wie Schachteln oder Kartons, individuelle Flaschen, Beutel oder Ampullen. Das Set kann z.B. separate Ampullen enthalten, in denen jeweils eine wirksame Menge einer

Verbindung der Formel I und/oder ihrer pharmazeutische unbedenklichen Salze, Derivate, Solvate, Prodrugs und Stereoisomere, einschließlich deren Mischungen in allen Verhältnissen, und eine wirksame Menge eines weiteren Arzneimittelwirkstoffs gelöst oder in lyophilisierter Form vorliegt.

Weiterhin können die erfindungsgemäße Arzneimittel verwendet werden, um bei gewissen bekannten Therapien additive oder synergistische Effekte bereitzustellen, und/oder können dazu verwendet werden, um die

Wirksamkeit gewisser existierender Therapien wiederherzustellen. Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zubereitungen können neben den erfindungsgemäßen Verbindungen noch weitere Arzneimittelwirkstoffe enthalten, z.B. zur Verwendung bei der Behandlung von Arthrose andere Cathepsin D-Inhibtioren, NSAIDS, Cox-2-lnhibitoren, Glucocorticoide, Hyaluronsäure, Azathioprin, Methotrexat, anti-CAM Antikörper, wie beispielweise anti-ICAM-1 Antikörper, FGF-18. Zur Behandlung der anderen genannten Erkrankungen können die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zubereitungen können neben den erfindungsgemäßen Verbindungen noch weitere Arzneimittelwirkstoffe, die dem Fachmann bei deren Behandlung bekannt sind, enthalten.

Die hier offenbarte Krebsbehandlung kann als Therapie mit einer

Verbindung der vorliegenden Erfindung erfolgen oder in Kombination mit einer Operation, Bestrahlung oder Chemoherapie. Eine solche

Chemotherapie kann die Verwendung von einem oder mehreren Wirkstoffen der nachfolgenden Kategorien von Anti-Tumorwirkstoffen einschließen:

(i) antiproliferative/antineoplastische/DNA-schädigende Wirkstoffe und Kobinationen davon wie sie in der medizinishen Onkologie verwendet werden, wie alkylierendene Wirkstoffe (z.B. Cis-Platin, Parboplatin,

Zyklophosphamid, Stickstoffsenf, Melphalan, Chlorambucil, Busulphan and Nitrosoureas); AntiMetaboliten (z.B. Antifolate wie Fluorpyrimidine wie 5-Fluoruracil und Tegafur, Raltitrexed, Methotrexate, Cytosinarabinosid, Hydroxyurea und Gemcitabine); Antitumor-Antibiotika (z.B. Anthracycline, wie Adriamycin, Bleomycin, Doxorubicin, Daunomycin, Epirubicin, Idarubicin, Mitomycin-C, Dactinomycin und Mithramycin); antimitotische Wirkstoffe (z.B. Vincaalkaloide wie Vincristin, Vinblastin, Vindesin und Vinorelbin, und

Taxoide wie Taxol und Taxotere); Topoisomerase-Inhibitoren (z.B.

Epipodophyllotoxine, wie Etoposid und Teniposid, Amsacrin, Topotecan, Irinotecan und Camptothecin) und zelldifferenzierende Wirkstoffe (z.B. all- trans-Retinolsäure, 13-cis- Retinolsäure und Fenretinid);

(ii) zytostatische Wirkstoffe, wie Antioöstrogene (z.B. Tamoxifen, Toremifen, Raloxifen, Droloxifen und lodoxyfen), Östrogenrezeptor- Regulatoren (z.B. Fulvestrant), Antiandrogene (z.B. Bicalutamid, Flutamid, Nilutamid und Cyproteronacetat), LHRH Antagonisten oder LHRH Agoniste (z.B. Goserelin, Leuprorelin und Buserelin), Progesterone (z.B.

Megestrolacetat), Aromatase-Inhibitoren (z.B. Anastrozol, Letrozol, Vorazol and Exemestan) und Inhibitoren von 5oc-Reductase, wie Finasteride;

(iii) Wirkstoffe, die die Krebsinvasion hemmen (z.B. Metalloproteinase- Inhibitoren, wie Marimastat, und Inhibitoren der Urokinase-Plasminogen- Aktivator-Rezeptor-Funktion);

(iv) Inhibitoren der Wachstumsfaktorfunktion, z.B.

Wachstumsfaktorantikörper, Wachstumsfaktorrezeptorantikörper, z.B. der anti-erbb2 Antikörper Trastuzumab [Herceptin™] und der Anti-erbbl

Antikörper Cetuximab [C225]), Farnesyltransferase-Inhibitoren,

Tyrosinekinase-Inhibitoren und Serin-/Threonin-Kinase-lnhibitoren, z.B.

Inhibitoren der epidermalen Wachstumsfaktor-Familie (z.B. EGFR Familie Tyrosine Kinase Inhibitoren wie N-(3-Chloro-4-fluorphenyl)-7-methoxy-6- (3- morpholinopropoxy) quinazolin-4-amin (gefitinib, AZD1839), N-(3-Ethynyl- phenyl)-6,7-bis (2-methoxyethoxy)quinazolin-4-amin (erlotinib, OSI-774) and 6-acrylamido-N-(3-chloro-4-fluorophenyl)-7-(3-morpholinoprop oxy)quinazolin- 4-amine (Cl 1033), z.B. Inhibitoren der Platelet-derived Wachstumsfaktor Familie und z.B. Inhibitoren der Hepatozyten-Wachstumsfaktor-Familie;

(v) Antiangiogene Wirkstoffe, wie solche, die die Wirkungen der

Wachstumsfaktoren des Vaskularendothels hemmen (z.B. der Anti- Vascularendothel-Zell-Wachstumsfaktor-Antikörper Bevacizumab

[Avastin™], Verbindungen, die in den internationalen Patentanmeldungen WO 97/22596, WO 97/30035, WO 97/32856 und WO 98/13354 veröffentlich wurden) und erbindunen, die über einen anderen Mechanismus wirksam sind (z.B. Linomid, Inhibitoren der Integrin avß3 Funktion und Angiostatin);

(vi) Gefäß-zerstörende Agenzien wie Combretastatin A4 und

Verbindungen, die in den internationalen Patentanmeldungen WO 99/02166, WO 00/40529, WO 00/41669, WO 01/92224, WO 02/04434 und

WO 02/08213 veröffentlicht wurden; (vii) Antisense-Therapien, z.B. solche die auf die obengenannten Ziele gerichtet sind, wie ISIS 2503, ein Anti-Ras Antisense;

(viii) Genetherapie-Ansätze, einschließlich z.B. Ansätze zum Ersatz abnormer, veränderter Gene wie abnormem p53 oder abnormem BRCA1 oder BRCA2, GDEPT-Ansätze (gene-directed enzyme pro-drug therapy) wie solche, die Cytosin-Deaminase, Thymidin-Kinase oder ein bakterielles Nitroreductase-Enzym verwenden, und Ansätze, die die Toleranz eines Patienten für Chemo- oder Bestrahlungstherapie erhöhen, wie Multi-Drug- Resistance-Therapie und

(ix) Immuntherapie-Ansätze, einschließlich z.B. ex-vivo and in-vivo Ansätze zur Erhöhung der Immunogenität von Tumorzellen eines Patienten wie Transfektion mit Cytokinen, wie Interleukin 2, Interleukin 4 oder

Granulozyten-Macrophagen-Kolonie-stimulierender-Faktor, Ansätze zur Verminderung der T-Zell-Anergie, Ansätze zur Verwendung transfektierter Immunzellen wie Cytokin-transfektierte dendritische Zellen, Ansätze zur Verwendung Cytokin-transfektierte Tumorzellen und Ansätze zur

Verwendung anti-idiotypischer Antikröper.

Die Arzneimittel aus Tabellel können vorzugsweise, jedoch nicht

ausschließlich mit den Verbindungen der Formel 1 kombiniert werden.

Tabelle 1

Alkylierende Cyclophosphamid Lomustin

Wirkstoffe Busulfan Procarbazin

Ifosfamid Altretamin Melphalan Estramustinphosphat Hexamethylmelamin Mechloroethamin

Thiotepa Streptozocin

chloroambucil Temozolomid

Dacarbazin Semustin

Carmustin

Platin-Wirkstoffe Cisplatin Carboplatin

Oxaliplatin ZD-0473 (AnorMED)

Spiroplatin Lobaplatin (Aetema)

Carboxyphthalatoplatinum Satraplatin (Johnson

Tetraplatin Matthey)

Ormiplatin BBR-3464 Iproplatin (Hoffrnann-La Roche)

SM-11355 (Sumitomo) AP-5280 (Access)

Antimetaboliten Azacytidin Tomudex

Gemcitabin Trimetrexat

Capecitabin Deoxycoformycin

5-Fluoruracil Fludarabine

Floxuridin Pentostatin

2-Chlordesoxyadenosin Raltitrexed

6-Mercaptopurin Hydroxyurea

6-Thioguanin Decitabin (SuperGen)

Cytarabin Clofarabin (Bioenvision)

2-Fluordesoxycytidin Irofulven (MGI Pharma)

Methotrexat DMDC (Hoffmann-La Roche)

Idatrexat Ethynylcytidin (Taiho )

Topoisomerase- Amsacrin Rubitecan (SuperGen)

Inhibitoren Epirubicin Exatecan mesylate (Daiichi)

Etoposid Quinamed (ChemGenex)

Teniposid oder Mitoxantron Gimatecan (Sigma- Tau)

Irinotecan (CPT-1 ) Diflomotecan (Beaufour-

7-ethyl-10- Ipsen) hydroxycamptothecin TAS-103 (Taiho)

Topotecan Elsamitrucin (Spectrum)

Dexrazoxanet (TopoTarget) J-107088 (Merck & Co)

Pixantron (Novuspharrna) BNP-1350 (BioNumerik)

Rebeccamycin Analog CKD-602 (Chong Kun Dang)

(Exelixis) KW-2170 (Kyowa Hakko)

BBR-3576 (Novuspharrna)

Antitumor- Dactinomycin (Actinomycin Amonafid

Antibiotika D) Azonafid

Doxorubicin (Adriamycin) Anthrapyrazol

Deoxyrubicin Oxantrazol

Valrubicin Losoxantron

Daunorubicin (Daunomycin) Bleomycinsulfat (Blenoxan)

Epirubicin Bleomycinsäure

Therarubicin Bleomycin A

Idarubicin Bleomycin B

Rubidazon Mitomycin C

Plicamycinp MEN-10755 (Menarini)

Porfiromycin GPX- 00 (Gern

Cyanomorpholinodoxorubicin Pharmaceuticals)

Mitoxantron (Novantron)

Antimitotische Paclitaxel SB 408075

Wirkstoffe Docetaxel (GlaxoSmithKline)

Colchicin E7010 (Abbott)

Vinblastin PG-TXL (Cell Therapeutics)

Vincristin IDN 5109 (Bayer)

Vinorelbin A 05972 (Abbott)

Vindesin A 204197 (Abbott)

Dolastatin 10 (NCI) LU 223651 (BASF) Rhizoxin (Fujisawa) D 24851 (ASTA Medica) Mivobulin (Warner-Lambert) ER-86526 (Eisai)

Cemadotin (BASF) Combretastatin A4 (BMS) RPR 109881 A (Aventis) Isohomohalichondrin-B TXD 258 (Aventis) (PharmaMar)

Epothilone B (Novartis) ZD 6126 (AstraZeneca) T 900607 (Tularik) PEG-Paclitaxel (Enzon) T 138067 (Tularik) AZ 0992 (Asahi)

Cryptophycin 52 (Eli Lilly) !DN-5109 (Indena)

Vinflunine (Fabre) AVLB (Prescient

Auristatin PE (Teikoku NeuroPharma)

Hormone) Azaepothilon B (BMS) BMS 247550 (BMS) BNP- 7787 (BioNumerik) BMS 184476 (BMS) CA-4-prodrug (OXiGENE) BMS 188797 (BMS) Dolastatin-10 (NrH)

Taxoprexin (Protarga) CA-4 (OXiGENE)

Aromatase- Aminoglutethimid Exemestan

Inhibitoren Letrozol Atamestan (BioMedicines)

Anastrazol YM-511 (Yamanouchi)

Formestan

Thymidylate- Pemetrexed (Eli Lilly) Nolatrexed (Eximias)

Synthase- ZD-9331 (BTG) CoFactor™ (BioKeys)

Inhibitoren

DNA-Antagonisten Trabectedin (PharmaMar) Mafosfamid (Baxter

Glufosfamid (Baxter International)

International) Apaziquon (Spectrum Albumin + 32P (Isotop Pharmaceuticals)

Lösungen) 06-Benzylguanin (Paligent) Thymectacin (NewBiotics)

Edotreotid (Novartis)

Farnesyl- Arglabin (NuOncology Labs) Tipifarnib (Johnson &

Transferase- Lonafarnib (Schering-Plough) Johnson)

Inhibitoren BAY-43-9006 (Bayer) Perillylalkohol (DOR

BioPharma)

Pumpen-Inhibitoren CBT-1 (CBA Pharma) Zosuquidar Trihydrochlorid

Tariquidar (Xenova) (Eli Lilly)

MS-209 (Schering AG) Biricodar dicitrate (Vertex)

Histonacetyl- Tacedinalin (Pfizer) Pivaloyloxymethylbutyrat Transferase- SAHA (Aton Pharma) (Titan)

Inhibitoren MS-275 (Schering AG) Depsipeptid (Fujisawa)

Metalloproteinase- Neovastat (Aeterna Labo- CMT -3 (CollaGenex)

Inhibitoren, ratories) BMS-275291 (Celltech)

Ribonucleosid- Marimastat (British Biotech) Tezacitabin (Aventis)

Reductase-Inhibi- Galliummaltolat (Titan) Didox (Molecules for Health) toren Triapin (Vion) TNF-alpha Virulizin (Lorus Therapeutics) Revimid (Celgene)

Agonisten/ CDC-394 (Celgene)

Antagonisten

Endothelin-A-Re- Atrasentan (Abbot) YM-598 (Yamanouchi) zeptor-Antagonisten ZD-4054 (AstraZeneca)

Retinolsäure-Re- Fenretinid (Johnson & Alitretinoin (Ligand) zeptor-Agonisten Johnson)

LGD-1550 (Ligand)

ImmunomodulaInterferon Dexosom-Therapie (Anosys) toren Oncophage (Antigenics) Pentrix (Australian Cancer

GMK (Progenics) Technology)

Adenocarcinoma Vakzin JSF-154 (Tragen)

(Biomira) Cancer Vakzin (Intercell) CTP-37 (AVI BioPharma) Norelin (Biostar)

JRX-2 (Immuno-Rx) BLP-25 (Biomira)

PEP-005 (Peplin Biotech) MGV (Progenics)

Synchrovax Vakzine (CTL !3-Alethin (Dovetail)

Immuno) CLL-Thera (Vasogen) Melanoma Vakzine (CTL

Immuno)

P21-RAS Vakzin (GemVax) hormonale und Östrogene Prednison

antihormonale Conjugierte Östrogene Methylprednisolon

Wirkstoffe Ethynylöstradiol Prednisolon

Chlortrianisen Aminoglutethimid

Idenestrol Leuprolid

Hydroxyprogesteron Goserelin Caproat Leuporelin

Medroxyprogesteron Bicalutamid

Testosteron Flutamid

Testosteronpropionat Octreotid

Fluoxymesteron Nilutamid Methyltestosteron Mitotan

Diethylstilbestrol P-04 (Novogen)

Megestrol 2-Methoxyoestradiol (En- Tamoxifen treMed)

Toremofin Arzoxifen (Eli Lilly)

Dexamethason

Photodynamische Talaporfin (Light Sciences) Pd-Bacteriopheophorbid Wirkstoffe Theralux (Theratechnologies) (Yeda)

Motexafin-Gadolinium Lutetium-Texaphyrin

(Pharmacyclics) (Pharmacyclics)

Hypericin

Tyrosinekinase- Imatinib (Novartis) Kahalid F (PharmaMar) Inhibitoren Leflunomid (Sugen/Phar- CEP- 701 (Cephalon) macia) CEP-751 (Cephalon) ZDI839 (AstraZeneca) MLN518 (Millenium)

Erlotinib (Oncogene Science) PKC412 (Novartis)

Canertjnib (Pfizer) Phenoxodiol O

Squalamin (Genaera) Trastuzumab (Genentech) SU5416 (Pharmacia) C225 (ImClone)

SU6668 (Pharmacia) rhu-Mab (Genentech) ZD4190 (AstraZeneca) MDX-H210 (Medarex) ZD6474 (AstraZeneca) 2C4 (Genentech)

Vatalanib (Novartis) MDX-447 (Medarex) PK1166 (Novartis) ABX-EGF (Abgenix)

GW2016 (GlaxoSmithKline) IMC-1 C 1 (ImClone) EKB-509 (Wyeth)

EKB-569 (Wyeth)

Verschiedene SR-27897 (CCK-A Inhibitor, BCX-1777 (PNP Inhibitor, andere Wirkstoffe Sanofi-Syntheläbo) BioCryst)

Tocladesine (zyklisches AMP Ranpirnase (Ribonuclease

Agonist, Ribapharm) Stimulanz, Alfacell)

Alvocidib (CDK Inhibitor, Galarubicin (RNA Synthese

Aventis) Inhibitor, Dong-A)

CV-247 (COX-2 Inhibitor, Ivy Tirapazamine (reduzierendes

Medical) Agenz, SRI International)

P54 (COX-2 Inhibitor, N-Acetylcysteine

Phytopharm) (reduzierendes Agenz,

CapCell™ (CYP450 Zambon)

Stimulanz, Bavarian Nordic) R-Flurbiprofen (NF-kappaB

GCS-IOO (gal3 Antagonist, Inhibitor, Encore)

GlycoGenesys) 3CPA (NF-kappaB Inhibitor,

G17DT immunogen (Gastrin Active Biotech)

Inhibitor, Aphton) Seocalcitol (Aitamin D

Efaproxiral (Oxygenator, Rezeptor Agonist, Leo)

Allos Therapeutics) 131-1-TM-601 (DNA

PI-88 (Heparanase Inhibitor, Antagonist, TransMolecular)

Progen) Eflornithin (ODC Inhibitor,

Tesmilifen (Histamine An- ILEX Oncology)

tagonist, YM BioSciences) Minodronic acid

Histamine (Histamine H2 (Osteoclasten-Inhibitor,

Rezeptor Agonist, Maxim) Yamanouchi)

Tiazofurin (IMPDH Inhibitor, Indisulam (p53 Stimulanz,

Ribapharm) Eisai)

Cilengitide (Integrin An- Aplidin (PPT Inhibitor, tagonist, Merck KGaA) PharmaMar)

SR-31747 (IL-1 Antagonist, Rituximab (CD20 Antikörper,

Sanofi-Synthelabo) Genentech)

CCI-779 (mTOR Kinase Gemtuzumab (CD33

Inhibitor, Wyeth) Antikörper, Wyeth Ayerst)

Exisulind (PDE-V Inhibitor, PG2 (Hämatopoese-

Cell Pathways) Promoter, Pharmagenesis)

CP-461 (PDE-V Inhibitor, Cell Immunol™ (Triclosan

Pathways) Mundspülung, Endo)

AG-2037 (GART Inhibitor, Triacetyluridine (Uridine

Pfizer) Prodrug, Wellstat) WX-UK1 (Plasminogen SN-4071 (Sarcoma Agenz, Aktivator Inhibitor, Wilex) Signature BioScience) PBI-1402 (PMN Stimulanz, TransMID-107™

ProMetic LifeSciences) (Immunotoxin, KS Biomedix) Bortezomib (Proteasome- PCK-3145 (ApoptoseproInhibitor, Millennium) moter, Procyon)

SRL-172 (T-Zell Stimulanz, Doranidazole (ApoptoseproSR Pharma) moter, Pola)

TLK-286 (Glutathione-S- CHS-828 (zytotoxisches Transferase Inhibitor, Telik) Agenz, Leo)

PT-100 (Wachstumsfaktor- Trans-retininsäure ( agonist, Point Therapeutics) Differenziator, NIH)

Midostaurin (PKC Inhibitor, MX6 (Apoptosepromoter, Novartis) MAXIA)

Bryostatin-1 (PKC-Stimulanz, Apomine (apoptosis

GPC Biotech) Promoter, ILEX Oncology)

CDA-II (Apoptosepromoter, Urocidin (Apoptosepromoter,

Everlife) Bioniche)

SDX-101 (Apoptosepromoter, Ro-31-7453 (ApoptoseproSalmedix) moter, La Roche)

Ceflatonin (ApoptoseproBrostallicin (Apoptosepro- moter, ChemGenex) moter, Pharmacia)

Auch ohne weitere Ausführungsformen wird davon ausgegangen, dass ein Fachmann die obige Beschreibung im weitesten Umfang nutzen kann. Die bevorzugten Ausführungsformen sind deshalb lediglich als beschreibende, keineswegs aber als in irgendeiner Weise limitierende Offenbarung aufzufassen.

Die folgenden Beispiele sollen somit die Erfindung erläutern, ohne sie zu begrenzen. Sofern nichts anderes angegeben ist, bedeuten Prozentangaben Gewichtsprozent. Alle Temperaturen sind in Grad Celsius angegeben.

"Übliche Aufarbeitung": Man gibt, falls erforderlich, Wasser hinzu, stellt, falls erforderlich, je nach Konstitution des Endprodukts auf pH-Werte zwischen 2 und 10 ein, extrahiert mit Ethylacetat oder Dichlormethan, trennt ab, trocknet die organische Phase über Natriumsulfat, filtriert, dampft ein und reinigt durch Chromatographie an Kieselgel und /oder durch Kristallisation.

Rf-Werte an Kieselgel; Massenspektrometrie: El (Elektronenstoßionisation): M\ FAB (Fast Atom Bombardment): (M+H)\ THF (Tetrahydrofuran), NMP (N-Methlpyrrolidon), DMSO (Dimethlysulfoxid), EE (Ethylacetat), MeOH (Methanol), DC (Dünnschichtchromatographie) Die folgenden Substanzen wurden synthetisiert und charakterisiert. Die Herstellung und Charakterisierung der Substanzen ist jedoch auch auf anderen Wegen für den Fachmann durchführbar.

Beispiel 1: Beispielhafte Verbindungen der Formel I

Tabelle 2

Erfindungsgemäß sind nachfolgende Verbindungen

sowie deren physiologisch unbedenklichen Salze, Derivate, Solvate, Prodrugs und Stereoisomere, einschließlich deren Mischungen in allen Verhältnissen.

Stabil: Wiederauffinden 75% nach 4h.

Um möglichen Zweifeln vorzubeugen wird überall, wo zu einer

erfindungsgemäßen Verbindung die chemische Bezeichnung der

Verbindung und die Abbildung der chemischen Struktur der Verbindung fälschlicherweise nicht übereinstimmen, die erfindungsgemäße Verbindung eindeutig durch die Abbildung der chemischen Struktur definiert.

Die Retentionszeiten wurden bestimmt:

Chromolith Speed Rod RP 18e 50-4,6 mm LCMS.Polar.m, 2,4ml/min,

220nm, Puffer A 0,05% HCOOH/H ₂ O, Puffer B 0,04% HCOOH/ACN, 0,0- 2,8min 4%-100% Puffer B; 2,8-3,3min 100% Puffer B 3,3-3,4min 100%-4% Puffer B oder Chromolith Speed Rod RP 18e 50-4,6 mm LCMS;Polar.m, 2,4ml/min, 220nm, Puffer A 0,05% HCOOH/H2O, Puffer B 0,04%

HCOOH/ACN, 0,0-3,0min 5%-100% Puffer B; 3,0-3,5min 100% Puffer B

Tabelle 3

Beispiel 2: Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen Formel I bei denen X = H und Q = CH ₂ bedeutet

Die beanspruchten Verbindungen der Formel I, bei denen X = H und Q = CH ₂ bedeutet, sind z. B. nach dem Fachmann bekannten Methoden durch folgende Synthesesequenzen darstellbar. Die angegebenen Beispiele beschreiben die Synthese, schränken diese aber nicht auf die Beispiele ein. Synthesesequenz:

IV

Ausgehend von substituierten Ortho-Nitrobenzaldehyden wird durch reduktive Aminierung mit einem geeigneten Amin ein substituiertes Ortho- Nitrobenzylamin hergestellt, das durch Hydrierung in Gegenwart eines Katalysators, beispielsweise von Raney-Nickel, in das entsprechende

Anilinderivat überführt wird. Enthält der Rest R funktionelle Gruppen, die in Gegenwart eines Katalysators, beispielsweise von Raney-Nickel, und

Wasserstoff reaktiv sind, kommt es gegebenenfalls zur Reduktion diese Einheiten (z.B. wird Alkenyl in Alkyl überführt) und ist Teil des Verfahrens. Cyclisierung durch Umsetzung mit Bromcyan bei erhöhten Temperaturen von 10°C bis 80°C, bevorzugt RT bis 60°C, liefert die erfindungsgemäßen Guanidinderivate als Hydrobromide. Aus diesen erhält man durch

Behandlung mit Base die freien Guanidinderivate.

An diese Sequenz können sich weitere Schritte wie z.B. chirale Trennungen, Oxidationen, Reduktionen, Metall-katalysierte Reaktionen,

Schutzgruppenabspaltungen, Amidkupplungen etc. anschließen, ohne die Methode auf diese Reaktionen zu beschränken.

Die als Ausgangsmaterialien benötigten substituierten Ortho- Nitrobenzaldehyde sind entweder kommerziell erhältlich oder können durch entsprechende Methoden wie zum Beispiel Suzuki-Reaktionen, Hydrolysen, Hydrierungen, Amidkupplungen hergestellt werden.

A) Verfahren zur Herstellung der substituierten Ortho-Nitrobenzaldehyden mit Amidfunktionen:

Nach diesem Verfahren lassen sich beispielweise die folgenden (bisher unbekannten Verbindungen herstellen:

MS-FAB (M + H+ ) = 297,0 S-FAB (M + H+ ) = 327,0 MS-FAB (M + H+ ) = 151 ,1

Rf (Methode polar): 2,22 Min (MS-Spur). Rf (Methode polar): 2,12 Min (MS-Spur). Rf (Methode polar): 1 ,86 Min (MS-Spur).

MS-FAB (M + H+ ) = 265,0 MS-FAB (M + H+ ) = 313,0 MS-FAB (M + H+ ) = 339,1

Rf (Methode polar): 1 ,53 Min (MS-Spur). Rf (Methode polar): 2,16 Min (MS-Spur). Rf (Methode polar): 2,33 Min (MS-Spur).

B) Verfahren zur Herstellung der Ortho-Nitrobenzaldehyde mit Arylresten oder Alkenylresten durch Suzuki-Reaktion:

Ortho-Nitrobenzaldehyde mit Arylresten oder Alkenylresten lassen sich entsprechend der obigen Gleichung durch Suzuki-Reaktion mit geeigneten Boronsäuren herstellen. Anstelle der freien Boronsäuren lassen sich mit gleichem Erfolg die Boronsäureester einsetzen. Die Ausbeuten bei

Verwendung von SPhos als Ligand und Kaliumphosphat als Base liegen typischerweise zwischen 60 und 99%. Die Temperaturen der Reaktion liegen zwischen 10°C und 80°C, bevorzugt zwischen RT und 60°C, besonders bevorzugt zwischen 30°C und 50°C. Nach diesem Verfahren lassen sich beispielweise die folgenden (bisher unbekannten) Verbindungen herstellen:

MS-FAB (M + H ⁺ ) = 206,1 MS-FAB (M + H ⁺ ) = 254,1 MS-FAB (M + H*) = 220,1

Rf (Methode polar): 2,43 Min (MS-Spur). Rf (Methode polar): 2<61 Min (MS-Spur). Rf (Methode polar): 2,64 Min (MS-Spur).

MS-FAB (M + H*) = 218,1 MS-FAB (M + H*) = 222,1 MS-FAB (M + H*) = 192,1

Rf ( Rf (Methode polar): 2,30 Min (MS-Spur).

MS-FAB (M + H*) = 234,1 MS-FAB (M + H*) = 178,0 MS-FAB (M + H*) = -

Rf (Methode polar): 2,68 Min (MS-Spur). Rf (Methode polar): 2,11 Min (MS-Spur). Rf (Methode polar): -

Die so hergestellten Verbindungen werden zur Herstellung der

erfindungsgemäßen Verbindungen der Formel I, wie folgt weiter umgesetzt:

Durch reduktive Aminierung mit einem geeigneten Amin wird ein

substituiertes Ortho-Nitrobenzylamin hergestellt, das durch Hydrierung in Gegenwart eines Katalysators, beispielsweise von Raney-Nickel, in das entsprechende Anilinderivat überführt wird. Bei diesem Verfahren wird gleichzeitig auch die Doppelbindung der Alkenylgruppe reduziert.

Wie oben liefert die Cyclisierung durch Umsetzung mit Bromcyan bei erhöhten Temperaturen die erfindungsgemäßen Guanidinderivate als Hydrobromide, aus denen durch Behandlung mit Base die freien

Guanidinderivate freigesetzt werden.

Beispiel 3: Hersteilung der erfindungsgemäßen Verbindungen der Formel I bei denen X = H oder X - NH ₂ und Q = C=0 bedeutet

Die beanspruchten Verbindungen der Formel I, bei denen X = H (Formel Ib) oder X = NH2 (Formel la) ist und Q = C=0 bedeutet, sind z. B. nach dem Fachmann bekannten Methoden, wie z.B. in Bioorganic Medicinal

Chemistry (2007), 4009-4015 beschrieben, darstellbar. In Abwandlung dieser Methode lassen sich beanspruchten Verbindungen der Formel I, bei denen X - H (Formel Ib) oder X = NH ₂ (Formel la) ist und Q = C=O bedeutet durch folgende Synthesesequenzen herstellen. Die angegebenen Beispiele beschreiben die Synthese, schränken diese aber nicht auf die Beispiele ein.

Synthesesequenz:

Ausgehend von substituierten Ortho-Aminobenzoesäureestern werden durch Reaktion mit Thiophosgen oder ähnlichen Reagenzien die entsprechenden Isocyanate hergestellt. Unter basischen Bedingungen erfolgt bei

Temperaturen von 40°C bis 100°C, bevorzugt 60°C bis 90°C, besonders bevorzugt 75°C bis 85°C, ganz besonders bevorzugt bei 80°C, durch

Reaktion mit einem geeigneten Amin die Zyklisierung zu entsprechenden zyklischen Thioharnstoffderivaten. In manchen Fällen erweist sich die Zugabe von basischen Reagenzien wie z.B. Kalium-tert-butylat als günstig. Die Thioharnstoffderivate werden durch weitere Umsetzung mit Hydrazin bei höheren Temperaturen von 80°C bis 200°C, bevorzugt 100°C bis 150°C, besonders bevorzugt 110°C bis 130°C, z.B auch in der Mikrowelle in die erfindungsgemäßen Zielverbindungen (X = NH ₂ ) überführt.

Durch Umsetzung mit Ammoniak oder Hydroxylamin erhält man dagegen die erfindungsgemäßen Zielverbindungen (X = H). Hier erweist sich die

Durchführung der Reaktion in Gegenwart von tert-Butylhydroperoxid als günstig. An diese Sequenz können sich weitere Schritte wie z.B. Oxidationen, Reduktionen, Metall-katalysierte Reaktionen, Schutzgruppenabspaltungen, Amidkupplungen etc. anschließen, ohne die Methode auf diese Reaktionen zu beschränken.

Die als Ausgangsmaterialien benötigten substituierten Ortho- Aminobenzoesäureester sind entweder kommerziell erhältlich oder z.B. durch Veresterung aus den entsprechenden Ortho-Aminobenzoesäuren hergestellt werden.

Beispiet 4: Herstellung von A21 (2-Amino-3-indan-2-yl-3,4-dihydro- quinazolin-7-yl)-(2,3-dihydro-indol-1-yl)-methanon -(2.3-Dihvdro-indole-1-carbonyl)-2-nitro-benzaldehyd.

4-Formyl-3-nitro-benzoesäure (650,00 mg; 3,33 mmol; 100,00 mol%) wurde in N,N-Dimethylformamid (20,00 ml; 257,20 mmol; 7721 ,20 mol%) gelöst, und mit INDOLIN (0,37 ml; 3,33 mmol; 100,00 mol%) sowie Ethyl- diisopropyl-amine (578,04 μΙ; 3,33 mmol; 100,00 mol%) versetzt. Das Reaktionsgemisch wurde im Eisbad gekühlt, unter Rühren Hatu

C10H15N6O ^* F6P (1 ,39 g; 3,66 mmol; 110,00 mol%) zugegeben und über Nacht bei RT nachgerührt. Zur Aufarbeitung wurde das Reaktionsgemisch unter Rühren auf ges. Natriumhydrogencarbonatlösung gegossen, 30 min nachgerührt, die entstandenen Kristalle abgesaugt und mit Wasser nachgewaschen. Umkristallisation aus wenig EE ergab 430 mg 4-(2,3- Dihydro-indole-1-carbonyl)-2-nitro-benzaldehyd als beige Kristalle. (Ausbeute 42%, Gehalt >97%). MS-FAB (M + H ⁺ ) = 297,0 R _f (Methode polar): 2,22 Min (MS-Spur).

Analo zu diesem Schritt lassen sich die folgenden Verbindungen herstellen:

MS-FAB (M + H+ ) = 297,0 MS-FAB (M + H+ ) = 327,0 MS-FAB ( + H+ ) = 151,1

Rf (Methode polar): 2,22 Min (MS-Spur). Rf (Methode polar): 2,12 Min (MS-Spur). Rf (Methode polar): 1,86 Min (MS-Spur).

MS-FAB (M + H+ ) = 265,0 MS-FAB (M + H+ ) = 313,0 MS-FAB (M + H+ ) = 339, 1

Rf (Methode polar): 1,53 Min (MS-Spur). Rf (Methode polar): 2,16 Min (MS-Spur). Rf (Methode polar): 2,33 Min (MS-Spur).

Schritt 2: (2.3-Dihvdro-indol-1-yl)-r4-(indan-2-ylaminomethyl)-3-nitro- phenvn- methanon

4-(2,3-Dihydro-indole-1-carbonyl)-2-nitro-benzaldehyd (430,00 mg; 1 ,41 mmol; 100,00 mol%) wurde mit 2-Aminoindan (262,78 mg; 1 ,97 mmol;

140,00 mol%) in 1 ,2-Dichlorethan (10,00 ml; 126,31 mmol; 8963,18 mol%) gelöst, mit Eisessig (81 ,41 μΙ; 1 ,41 mmol; 100,00 mol%) und

Natriumtriacetoxyborohydrid, 95% (418,15 mg; 1 ,97 mmol; 140,00 mo!%) versetzt und über Nacht bei RT gerührt. Es wurde nochmals

Natriumtriacetoxyborohydrid, 95% (40,00 mg; 0,19 mmol; 13,39 mol%) zugegeben und 3 h bei RT gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde mit

Wasser/Dichlormethan versetzt, die wäßrige Phase 1 x mit Dichlormethan extrahiert, die org. Phase 1 x mit ges. NaCI-Lösung gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und eingeengt. Die Aufreinigung des

Rohproduktes durch Säulenchromatographie auf einer CombiflashRf-Anlage (120g RediSep Silica Säule, 60ml/min Heptan/Essigester 5-100% EE in 25min) ergab 330mg (2,3-Dihydro-indol-1-yl)-[4-(indan-2-ylaminomethyl)-3- nitro-phenyl]-methanon als beige Kristalle.

(Ausbeute 56,6%, Gehalt 100%). MS-FAB (M + H+ ) = 414,5 Rf (Methode polar): 1 ,80 Min (MS-Spur). Schritt 3: [3-Amino-4-(indan-2-ylaminomethyl)-phenyll-(2,3-dihvdro-indo l-1- -methanon

330mg (2,3-Dihydro-indol-1-yl)-[4-(indan-2-ylaminomethyl)-3-nitro- phenyl]- methanon wurden in Gegenwart von 300mg Sponge Nickel (wassernass) in 10ml THF bei Normaldruck und Raumtemperatur mit Wasserstoff über Nacht reduziert. Erfernung des Lösungsmittels ergab 267 mg [3-Amino-4-(indan-2- ylaminomethyl)-phenyl]-(2,3-dihydro-indol-1 -yl)-methanon als wachsartigen Feststoff.

(Ausbeute 71 ,7%, Gehalt 82,2%). MS-FAB (M + H+ ) = 384,6 Rf (Methode polar): 1 ,74 Min (MS-Spur).

Schritt 4: [3-Amino-4-(indan-2-ylaminomethyl)-phenyl1-(2,3-dihvdro-indo l-1 - yl)-methanon

Fehler! Es ist nicht möglich, durch die Bearbeitung von Feldfunktionen Objekte zu erstellen.3-Amino-4-(indan-2-ylaminomethyl)-phenyl]-(2,3- dihydro-indol-1-yl)-methanon (267,00 mg; 0,70 mmol; 100,00 mol%) wurde in 1 ,4-Dioxan (max. 0,005% H2O) SeccoSolv® (6,00 ml; 70,14 mmol; 10074,56 mol%) gelöst, unter Rühren mit Bromcyan (81 ,12 mg; 0,77 mmol; 110,00 mol%) versetzt und 3 Stunden bei 80°C gerührt. Die Suspension wurde mit 1 ,4-Dioxan verdünnt und weitere 5 Stunden bei 120°C refluxiert. Es wurde nochmals Bromcyan (20,00 mg; 0,19 mmol; 27,12 mol%) zugegeben und 3 Stunden bei 120°C refluxiert.

Die beim Abkühlen ausgefallenen Kristalle wurden abgesaugt, mit 2 N NaOH behandelt und in EE aufgenommen. Die EE-Phase wurde 1 x mit ges. NaCI- Lösung gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet, filtriert, eingeengt. Nach Verreiben des Rückstandes mit etwas Acetonitril und Absaugen des

Lösungsmittels erhielt man 72 mg [3-Amino-4-(indan-2-ylaminomethyl)- phenyl]-(2,3-dihydro-indol-1-yl)-methanon als weiße Kristalle.

(Ausbeute 24,1%, Gehalt 95,2%). MS-FAB (M + H+ ) = 409,5 Rf (Methode polar): 1 ,91 Min (MS-Spur).

Nach dieser Methode lassen sich die Verbindungen A1 , A3, A4, A6, A8-A16, A20-23, A25, A26, A29-31 herstellen (Daten siehe Excel-Datenblatt)

Beispiel 5: Herstellung von A9 (7-Chloro-3-(5,6-dimethoxy-indan-2-yl)- 3,4-dihydro-quinazolin-2-ylamin Hydrobromid)

(2-Amino-4-chloro-benzyl)-(5,6-dimethoxy-indan-2-yl)-amine (580,00 mg; 1 ,74 mmol; 100,00 mol%) wurde in 10 ml 1 ,4-Dioxan gelöst, mit Bromcyan zur Synthese (203,04 mg; 1 ,92 mmol; 110,00 mol%) unter Rühren versetzt und 3 h refluxiert. Die beim Abkühlen ausgefallenen Kristalle wurden abgesaugt, mit Dioxan nachgewaschen und an der Lyophilisierungsanlage getrocknet (weiße Kristalle, Gehalt 100%). MS-FAB (M + H+ ) = 358,1 Rf (Methode polar): 1 ,73 Min (MS-Spur).

Nach dieser Methode wurden die Verbindungen A2, A9, A24 und A26 hergestellt.

Beispiel 6: Herstellung von A7 (3-lndan-2-yl-7-propyl-3,4-dihydro- quinazolin-2-ylamin)

Schritt 1 : 2-Nitro-4-propenyl-benzaldehvd durch Suzuki-Reaktion

In einen 100mL Zweihalskolben wurden 4-Chloro-2-nitrobenzaldehyde (3,200 g; 16,382 mmol; 100,00 mol%), trans-Propenylboronic acid (1 ,610 g; 18,556 mmol; 113,27 mol%) und Trikaliumphosphat Monohydrat (11 ,913 g; 49,147 mmol; 300,00 mol%) (gemörsert) in 15 ml Tetrahydrofuran und

150,000 μΙ Wasser suspendiert. Die Suspension wurde im Vakuum entgast, mit Argon inertisiert und im Argon-Gegenstrom mit Palladium(ll)-acetat (47% Pd) zur Synthese (18,390 mg; 0,082 mmol; 0,50 mol%) und 2- Dicyclohexylphosphino-2',6'-dimethoxybiphenyl (34,667 mg; 0,082 mmol; o,50 mol%) versetzt. Das Reaktionsgemisch wurde einige Stunden bei 40°C und Argon-Atmosphäre gerührt. Nach der Umsetzung wurde filtiert und das Filtrat zum Rückstand eingeengt. Chromatographische Reinigung des Rückstands über Kieselgel (Eluent Heptan/EE 11 :1) ergab 3,000g 2-Nitro-4- propenyl-benzaldehyd (Ausbeute 95,8%, Gehalt 100%). MS-FAB (M + H ⁺ ) = 192,0 R _f (Methode polar): 2,28 Min (MS-Spur).

Analog zu diesem Schritt lassen sich die folgenden Verbindungen herstellen:

Schritt 2: lndan-2-yl-r2-nitro-4-((E)-propenyl)-benzyl1-amin

In einen 100mL Einhalskolben wurden 2-Nitro-4-propenyl-benzaldehyd (1 ,000 g; 0,005 mol; 100,00 mol%) und 2-Aminoindan (0,949 ml; 0,007 mol; 140,00 mol%) in 12 ml 1 ,2-Dichlorethan gelöst und mit 0,302 ml Essigsäure (Eisessig) versetzt. Es wurde unter Rühren Natriumtriacetoxyborhydrid 95% (1 ,634 g; 0,007 mol; 140,00 mol%) hinzugegeben und das

Reaktionsgemisch über Nacht bei RT gerührt. Nach der Umsetzung wurde wässrige, gesättigte NaHCO ₃ -Lösung zugegeben und mit DCM verdünnt. Die organische Phase wurde abgetrennt, über Na ₂ SO ₄ getrocknet und das Lösungsmittel wird im Vakuum entfernt. Chromatographische Reinigung des Rückstands über Kieselgel (Eluent Heptan/EE 3:1) ergab 1 ,401g lndan-2-yl- [2-nitro-4-((E)-propenyl)-benzyl]-amin (Ausbeute 86,8%, Gehalt 100%). MS- FAB (M + H ⁺ ) = 309,1 Rf (Methode polar): 1 ,83 Min (MS-Spur).

Schritt 3: (2-Amino-4- ropyl-benzyl)-indan-2-yl-amin

Ein Lösung von 1 ,200g lndan-2-yl-[2-nitro-4-((E)-propenyl)-benzyl]-amin in 20 ml THF wurde in Gegenwart von 0,200g Sponge Nickel (wassernass) bei RT und Normaldruck über Nacht mit Wasserstoff hydriert. Die Lösung wurde abfiltriert und das Lösungsmittel entfernt. Man erhielt 1 ,001g (2-Amino-4- propyl-benzyl)-indan-2-yl-amin als farbloses Öl (Ausbeute: 90,7%, Gehalt 99,0%). MS-FAB (M + H ⁺ ) = 281 ,1 Rf (Methode polar): 1 ,82 Min (MS-Spur).

Schritt 4: Cvclisierunq zu 3-lndan-2-yl-7-propyl-3,4-dihydro-quinazolin-2- lamin

In einen 100mL Zweihalskolben wurde zu einer Lösung von 2-Amino-4- propyl-benzyl)-indan-2-yl-amin (1 ,000 g; 0,004 mol; 100,00 mol%) in 20 ml 1 ,4-Dioxan unter Rühren Bromcyan (0,227 ml; 0,004 mol; 120,00 mol%), gelöst in Dioxan, hinzugegeben und bei 80°C 4 Stunden gerührt. Nach der Umsetzung wurde das Reaktionsgemisch im Eisbad abgekühlt, der entstandene Niederschlag abgesaugt und in 2N-NaOH-Lösung suspendiert. Absaugen und Trocknet ergab 0,730g 3-lndan-2-yl-7-propyl-3,4-dihydro- quinazolin-2-ylamin als weißen Feststoff (Ausbeute 67,7%, Gehalt 100%). MS-FAB (M + H ⁺ ) = 306,2 Rf (Methode polar): 1 ,96 Min (MS-Spur).

Analog zu diesem Beispiel lassen sich die Verbindungen A5, A7 und A 7 herstellen.

Beispiel 7: Herstellung von A28 (2-Hydrazino-3-indan-2-yl-7- trifluoromethyl-3H-quinazolin-4-on)

Schritt 1 : 2-lsothiocyanato-4-trifluoromethyl-benzoesäuremethylester

Zu einer Mischung aus 2-Amino-4-trifluoromethyl-benzoesäuremethylester (2,212 g; 10,093 mmol; 100,00 mol%) in 20 ml Dichlormethan und 20 ml NaHCO ₃ -Lösung wurde unter Eiskühlung Thiophosgen (1 ,595 ml; 20,186 mmol; 200,00 mol%) hinzu getropft. Das Reaktionsgemisch wurde langsam auf 35°C erwärmt, 4-5 Stunden gerührt, 1 weiteres Äquivalent und ca. 10 ml NaHCO ₃ -Lösung zugegeben, über Nacht bei 35°C gerührt, nochmals 1 Äquivalent Thiophosgen und 10 ml NaHCO ₃ -LÖsung zugegeben und 2 Stunden weitergerührt. Die Phasen wurden getrennt und die wässrige Phase dreimal mit DCM extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden über Na ₂ SO ₄ getrocknet, das Lösungsmittel entfernt. Chromatographische Reinigung des Rückstands über Kieselgel (Eluent Heptan/EE 5:1) lieferte 2,40 g 2-lsothiocyanato-4-trifluoromethyl-benzoesäuremethylester als gelben Feststoff (Ausbeute 91 ,1 %, Gehalt 100%). MS-FAB (M-31) ⁺ = 230,0 Rf (Methode polar): 2,71 Min (MS-Spur). Schritt 2: S-lndan^-yl^-thioxo-T-trifluoromethyl^.S-dihydro-I H-quinazolin^- on

2- lsothiocyanato-4-trifluoromethyl-benzoesäuremethylester (2,397 g; 9,176 mmol; 100,00 mol%) wurde in Ν,Ν-Dimethylformamid zur Synthese (20,000 ml; 0,257 mol) gelöst, mit 2-Aminoindan (1 ,372 g; 10,094 mmol; 110,00 mol%) versetzt und bei 80°C über Nacht gerührt. Zugabe von Wasser führte zu einem Niederschlag, der abgesaugt wurde und nach dem Trocknen 3,30g

3- lndan-2-yl-2-thioxo-7-trifluoromethyl-2,3-dihydro-1 H-quinazolin-4-on als bräunlichen Feststoff ergab (Ausbeute 99,2%, Gehalt 100%). MS-FAB (M + H ⁺ ) = 363,0 Rf (Methode polar): 2,74 Min (MS-Spur). -Hydrazino-3-indan-2-yl-7-trifluoromethyl-3H-quinazolin-4-on

Eine Lösung von 3-lndan-2-yl-2-thioxo-7-trifluoromethyl-2,3-dihydro-1 H- quinazolin-4-one (350,000 mg; 0,966 mmol; 100,00 mol%) und Hydrazin (0,316 ml; 9,659 mmol; 1000,00 mol%) wurde 10 in tert-Butanol in der Mikrowelle bei 120°C, 45 min. gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde mit Wasser versetzt und entstandene abgesaugt, mit Wasser gewaschen und getrocknet. Chromatographische Reinigung (Reversed Phase, Eluent 5% - 65% ACN, 20 min) ergab nach Trocknung 43 mg 4 2-Hydrazino-3-indan-2- yl-7-trifluoromethyl-3H-quinazolin-4-on als weißes Pulver. (Ausbeute 12,0%, Gehalt 97%). MS-FAB (M+ H ⁺ ) = 361 ,1 Rf (Methode polar): 2,00 Min (MS- Spur).

Beispiel 8: Herstellung von 7-Bromo-3-indan-2-yl-2-thioxo-2,3-dihydro- 1 H-quinazolin-4-οη

Schritt 1 ; 4-Bromo-2-isothiocyanato-benzoesäuremethylester

2-Amino-4-bromobenzoesäuremethylester (5,000 g; 21 ,734 mmol; 100,00 mol%) wurde in 50 ml Dichlormethan gelöst und mit 50 ml NaHCO ₃ -Lösung versetzt. Bei 0°C wurde unter Rühren Thiophosgen (3,435 ml; 43,467 mmol; 200,00 mol%) zugegeben, 20 min. gerührt, dann langsam auf die RT erwärmt. Das Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei 35° C gerührt, danach 1 Äquivalent Thiophosgen zugegeben, bei 35°C 3 Stunden gerührt, nochmals 1 Äquivalent Thiophosgen und 10 ml NaHC03-Lösung zugegeben und erneut 4,5 Stunden weitergerührt. Nach Phasentrennung wurde die wässrige Phase noch dreimal mit DCM extrahiert, die vereinigten organische Phasen mit NaHCO ₃ gewaschen und über MgS04 getrocknet. Entfernung des Lösungsmittels und chromatographische Reinigung über Kieselgel (Eluent Heptan/EE 3:1) lieferte 3,6 g 4-Bromo-2-isothiocyanato- benzoesäuremethylester als weißes Pulver. (Ausbeute 61 ,5%, Gehalt 100%). MS-FAB (M -31 ) ⁺ = 241 ,8/239,8 Rf (Methode polar): 2,74 Min (MS- Spur).

Schritt 2: 7-Bromo-3-indan-2-yl-2-thioxo-2,3-dihydro-1 H-quinazolin-4-on

Eine Lösung von 4-Bromo-2-isothiocyanato-benzoesäuremethylester (2,00g; 7,35 mmol; 100,00 mol%) und 2-Aminoindan (0,99g; 7,35 mmol; 100,00 mol%) in 25ml DMF wurde bei 80°C über Nacht gerührt. Kalium-tert-butylat zur Synthese (0,42g; 3,68 mmol; 50,00 mol%) wurde in die

Reaktionsmischung gegeben und bei 80°C weitergerührt, bis die Reaktion vollständig war. Nach Abkühlen wurde auf Wasser gegossen und der entstandene Feststoff abgesaugt. Man erhielt nach Trocknen 2,68g

7-Bromo-3-indan-2-yl-2-thioxo-2,3-dihydro-1H-quinazolin-4-on (Ausbeute 97,7%, Gehalt 100%). MS-FAB (M -30) = 373,0/375,0 Rf (Methode polar): 2,69 Min (MS-Spur).

Diese Verbindung kann analog zu Beispiel 6 zu dem entsprechenden

Hydrazinderivat umgesetzt werden.

Beispiel 9: Herstellung von A27 (2-Amino-3-indan-2-yl-7-

Eine Lösung von 3-lndan-2-yl-2-thioxo-7-trifluoromethyl-2,3-dihydro-1 H- quinazolin-4-one (350,000 mg; 0,966 mmol; 100,00 mol%), Hydroxylamin (50%IGE LOESUNG IN WASSER, 3,000 ml; 50,863 mmol; 5266,05 mol%) und tert-Butylhydroperoxid (3,233 g; 25,112 mmol; 2600,00 mol%) in 5 ml 2- Propanol wurde bei RT über Nacht gerührt. Es wurde auf Wasser gegossen und der entstandene Feststoff abgesaugt. Chromatographische Reinigung über Kieselgel (Eluent Heptan/EE 3:2) lieferte 211mg 2-Amino-3-indan-2-yl- 7-trifluoromethyl-3H-quinazolin-4-on als gelben Feststoff (Ausbeute 61 ,4%, Gehalt 97%). MS-FAB (M + H ⁺ ) = 346,0 Rf (Methode polar): 2,25 Min (MS- Spur).

Beispiel 10: Herstellung von A18 (3-((S)-5-Methoxy-indan-2-yl)-7- trifluoromethyl-3,4-dihydro-quinazolin-2-ylamin) und A19 (3-((R)-5- Methoxy-indan-2-yl)-7-trifluoromethyl-3,4-dihydro-quinazolin -2-ylamin) durch chirale Trennung:

80 mg racemisches 3-(5-Methoxy-indan-2-yl)-7-trifluoromethyl-3,4-dihydro- quinazolin-2-ylamin wurden in 2 ml Methanol gelöst und an einer SFC- Anlage in die entsprechenden Enantiomeren getrennt (40 Läufe a 50μί).

Stationäre Phase: ChiraICel OD-H, Eluent CO2, Methanol DEA 0,5 (30%).

Man erhielt 31mg 3-((S)5-Methoxy-indan-2-yl)-7-tn ^' fluoromethyl-3,4-dihydro- quinazolin-2-ylamin und 31mg 3-((R)5-Methoxy-indan-2-yl)-7-trifluoromethyl-

3,4-dihydro-quinazolin-2-ylamin.

MS-FAB (M + H ⁺ ) = 362,1 Rf (Methode polar): 1 ,86 Min (MS-Spur).

A18 Rf (ChiraICel OD-H, Eluent CO2, Methanol DEA 0,5 (30%): 3,90 Min.

A19 Rf (ChiraICel OD-H, Eluent CO2, Methanol DEA 0,5 (30%): 7,09 Min.

Die absolute Konfiguration der Enantiomere ist nicht bekannt und wurde willkürlich zugeordnet.

Abkürzungen:

DCM = Dichlormethan DMA = Dimethylacetamid

DMF = Dimethylformamid

EE = Essigsäureethylester

h = Stunden

MTBE = Methyl-te/f-butylether

PE = Petrolether

RT = Raumtemperatur

SPhos= 2-Dicyclohexylphosphino-2',6'-dimethoxybiphenyl

TFA = Trifluoressigsäure

Beispiel 11: ln-vitro Fluoreszenz-Assay zur Identifizierung von

Cathepsin D Inhibitoren Zur Identifizierung von Modulatoren der Cathepsin D Aktivität wurde ein kontinuierlicher enzymatischer Test mit einem synthetischen Peptid, das eine fluoreszierende Gruppe (MCA=(7-methoxycoumarin-4-yl)acetyl) trägt, die durch Energietransfer von einer Dpn (2,4 dinitrophenyl)-Gruppe am selben Molekül gequencht ist, in 384-well-nb-Mikrotiterplatten von Greiner durchgeführt. Die Spaltung des peptidischen Substrats durch Cathepsin D bewirkt einen Anstieg in der Fluoreszenzintensität. Zur Bestimmung der Wirksamkeit von Substanzen wurde der zeitabhängige Anstieg in der Fluoreszenzintensität in Gegenwart der Substanz mit der zeitabhängigen Fluoreszenzzunahme in Abwesenheit von Substanzen verglichen. Als Referenzsubstanz diente Pepstatin A (Sigma-Aldrich). Als Substrat wurde MCA-GKPILFFRLK(Dnp)d-R-NH ₂ (Enzo Life Sciences, Lörrach) verwendet. Als Enzym wurde aus der humanen Leber isoliertes Cathepsin D (Sigma- Aldrich) in einer finalen Konzentration von 1.4 nM eingesetzt. Der Test wurde in 100 mM Natrium-Acetat-Puffer, 1.25 % (v/v) DMSO, 0.25 % (w/v) Chaps, pH 5.5 durchgeführt. Zu je 4 μΙ Cathepsin D-Lösung wurden je 2 μΙ Substanzlösung mit seriell verdünnter Substanzkonzentration zugegeben und 10 min bei Raumtemperatur inkubiert. Die Reaktion wurde gestartet durch Zugabe von 2 μΙ Substrat-Lösung (finale Konzentration 5 μΜ). Nach Durchführung einer Startpunkt-Fluoreszenzmessung (Anregungswellenlänge 340 nm/Emissionswellenlänge 450 nm) mit einem Envision Multilabel reader (Perkin Elmer) wurde die Reaktion 60 min bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurde die Menge des während der Reaktionszeit

abgespaltenen Peptidfragments durch Bestimmung der Zunahme der Fluoreszenzintensität bei 450 nm (Anregungswellenlänge 340 nm) gemessen. Die IC ₅ o-Werte der erfindungsgemäßen Verbindungen sind der Tabelle 2 aus Beispiel 1 zu entnehmen.

Beispiel 12: Knorpel-Explant-Assay

Um den Effekt von potentiellen Cathepsin D Inhibitoren auf Knorpelabbau zu untersuchen wird ein pH-induziertes Modell basierend auf bovinen

Explantaten verwendet. Dabei wird der pH-Wert des Mediums, in dem die Explantate kultiviert werden, dem pathophysiologischen pH-Wert eines arthrotischen Knies angepasst. Dieser pH-Wert liegt bei pH 5,5. In diesem ex vivo Modell werden anschließend potentielle Cathepsin D Inhibitoren auf ihre Wirkung hinsichtlich einer Arretierung des Knorpelabbauprozesses untersucht. Wird der Knorpel zerstört, werden Glycosaminoglycane (GAGs) in den Zellkulturüberstand abgegeben. Die Menge der freigesetzten GAGs lässt sich quantitativ mit Hilfe des DMMB (Dimethylmethylenblau- Hydrochlorid) bestimmen. Beim Nachweis sulfatierter GAGs mit

Dimethylmethylenblau-Hydrochlorid macht man sich die Abnahme der Absorption bei 633 nm zu Nutze. Da auch bei sehr niedrigen GAG- Konzentrationen gearbeitet werden kann, fällt auch nach langer Inkubation von DMMB mit GAG kein Farbstoff/GAG-Komplex aus, wie das bei anderen Messmethoden mitunter schon nach kurzer Zeit passiert. Zur Bestimmung der Konzentration wird eine Eichgerade mit Chondroitinsulfat mitgeführt. Anhand der GAG-Werte lässt sich ein IC ₅ o-Wert errechnen, d.h. eine

Konzentration bei der eine Substanz 50% ihrer Wirkung zeigt.

Lösungen:

Inkubationsmedium, pH 7,4:

DMEM ohne FBS, Zugabe von 1% Pen/Strep und 30 g/ml Ascorbinsäure, das Medium wird nicht gelagert. Inkubationsmedium, pH 5,5:

DMEM ohne FBS, der pH-Wert wird durch Zugabe von MES eingestellt und am pH-Meter kontrolliert, Zugabe von 1% Pen/Strep und 30 Mg/ml

Ascorbinsäure. Lösungen für die GAG-Messunq:

DMMB-Färbelösung (V = 500 ml):

8 mg DMMB (Dimethylmethylenblau) in 2,5 ml Ethanol lösen + 1 g

Natriumformiat + 1 ml Ameisensäure, mit bidest. Wasser ad 500 ml auffüllen

Inkubationsmedium: FBS (Medium ohne FBS) Chondroitinsulfat-Lösunqen (Standardkurve)

Ansatz von Standardlösungen mit folgenden Konzentrationen: 50Mg/ml; 25Mg/ml; 12,5pg/ml; 6,25pg/ml; 3,125Mg/ml; 1 ,56pg/ml; 0,78pg/ml sowie eine Leerkontrolle des Mediums. Der Ansatz der Standardlösung erfolgt in dem Medium, mit welchem auch der Versuch durchgeführt wurde.

1.) Durchführung: pH induzierter Knorpelabbau von bovinen Explantaten Die bovinen Explantate werden zunächst präpariert. Die Induktion des Knorpelabbaus wird in 96 -Multiwellplatten durchgeführt. Dabei wird ein Explantat pro well kultiviert. Es erfolgt die Zugabe von je 200 μΙ DMEM (Inkubationsmedium pH 5,5) ohne FBS + 30 pg/ml Ascorbinsäure. Also Negativkontrolle werden Explantate (n= 4) bei pH 7,4 (ohne FBS) inkubiert. Diese Kontrolle geht nicht in die Berechnung der Daten mit ein, sondern stellt sicher dass die pH-Wert Änderung den gewünschten Effekt auf die Freisetzung von GAG hat. An dieser Stelle erfolgt die Zugabe der zu testenden Substanzen. Es findet keine Vorinkubation der Explantate statt. Die Explantate werden mit den entsprechenden Substanzen 3 Tage im Brutschrank bei 37°C und 7,5% CO ₂ kultiviert. 2.) Inkubationsablauf

Um den Effekt von Cathepsin D Inhibitoren auf die Freisetzung von GAG (Glycosaminoglycan) zu untersuchen, werden die Substanzen in der gewünschten Konzentration eingesetzt und für 3 Tage kultiviert. Dabei werden die zu testenden Verbindungen in einem ersten Experiment in einer Konzentration von 1 μΜ und 1% DMSO getestet. Substanzen die einen

Effekt von >50% auf die Freisetzung von GAG haben (das entspricht <50% der Kontrolle im Assay Explorer), werden in einem nächsten Experiment bei 100 nM und 1% DMSO gestestet. Substanzen, die unter diesen

Bedingungen einen Effekt von >50% auf die Freisetzung von GAG haben (das entspricht <50% der Kontrolle im Assay Explorer), werden in einer Konzentrations-Wirkungs-Beziehung getestet. Dabei werden die

Verbindungen in den folgenden Konzentrationen untersucht: 30 μΜ, 10 μΜ, 3 μΜ, 1 μΜ, 0.3 μΜ, 0.1 μΜ, 0.03 μΜ, 0.01 μΜ. Als Positivkontrolle wird Pepstatin A mit einer Konzentration von 0,01 μΜ verwendet. Das Wirkungsfenster (assay window) ist definiert durch die Kontrolle (pH 5,5), definiert als 0% Effekt und die Kontrolle pH 5,5 + 0,01 μΜ Pepstatin A, definiert als 100% Effekt. Nach 3 Tagen Inkubation werden die Zellkulturüberstände gesammelt und bei -20°C gelagert oder direkt vermessen. Dabei wird photometrisch die Menge an freigesetztem GAG gemessen. Berichtet werden für Konzentrationen von 1 μΜ und 100 nM der Effekt ( 1 Wert) der jeweiligen Substanz in % bezogen auf die Positivkontrolle (pH 5,5 + 0,01 μΜ Pepstatin A) und die Negativkontrolle (pH 5,5). Der Wert stellt den Mittelwert aus 4 Replikaten da. Bei der Ermittlung einer Konzentrations- Wirkungs-Beziehung wird ein IC ₅ o-Wert an die Datenbank berichtet (Assay Explorer).

4. ) Messung

Die Zellkulturüberstände (200 μΙ) werden entweder direkt vermessen oder werden bei -20°C gelagert. Eine genaue Bestimmung der Konzentration (pg/ml GAG im Überstand) von GAG zu gewährleisten müssen sich die Messwerte im linearen Bereich der Standardkurve befinden. Um dies zu gewährleisten werden routinemäßig verschiedene Verdünnungen vorgelegt (1/5, 1/10, 1/20, 1/40). Die Verdünnungen werden mit Medium hergestellt und automatisiert (Hamilton) in einer 384-Multiwellplatte vorgelegt (15 μΙ). Ebenfalls automatisiert (oder mit Mehrkanalpipette) werden 60 μΙ DMMB- Lösung zugegeben. Es erfolgt eine schnelle Farbreaktion die anschließend bei 633 nm mit einem Platten-Reader (z.B. Envision) gemessen wird.

Je nach vorhandener Probenmenge wird mindestens eine

Doppelbestimmung durchgeführt.

Die Daten werden vom MTP-Reader als csv oder xls-Files zur Verfügung gestellt und basierend auf diesem Format (xls) als Rohdaten gespeichert bzw. zur Berechnung des prozentualen Effekts der jeweiligen Verbindung herangezogen.

5. ) Qualitätskontrollen

Als Kontrolle für die Induktion des pH-induzierten Knorpelabbaus werden 4 Explantate bei pH 7,4 inkubiert. Dies entspricht dem physiologischen pH- Wert des Knorpels und somit ist hier kein Effekt auf die Freisetzung von GAG zu erwarten. Diese GAG Werte (pg/ml Überstand) sind somit immer signifikant niedriger als die GAG-Werte einer Inkukation mit pH 5,5. Eine weitere Kontrolle, die sowohl der Überprüfung des Experimentes dient aber auch wichtig für die Definition des Wirkungsfensters ist, ist die

Pepstatin-Kontrolle (pH 5,5 + 0,01 μΜ Pepstatin A). Diese Substanz blockiert unspezifisch die Aktivität der meisten Proteasen und legt somit den maximal möglichen Effekt einer Verbindung fest.

6.) Ergebnisse

Alle gemessenen Verbindungen zeigten im GAG-Assay einen ICso-Wert von 10- ⁸ bis 10- ¹⁰ M.

(1) Klompmakers, A. & Hendriks, T. (1986) Anal. Biochem. 153, 80-84, Spektrophotometrischer Nachweis für sulfatierte Glycosaminoglycane.

(2) Graves, P.J. et al. (1997) Anal. Biochem. 245, 247-248

Polyvinylalkohol-stabilisierte Bindung von sulfatierten GAGs an

Dimethylmethylenblau.

Beispiel 13: Untersuchung anti-hyperalgetischer Wirkung im Tier

Zur Induktion einer Entzündungsreaktion wurde eine Carrageenan-Lösung (CAR, 1%, 50 μΙ) einseitig intraartikulär in ein Rattenkniegelenk injiziert. Die nichtinjizierte Seite wurde zu Kontrollzwecken herangezogen. Es wurden sechs Tiere pro Gruppe verwendet. Die Schwellung wurde mittels einer Mikrometerschraube bestimmt (medial-lateral am Kniegelenk) und die thermische Hyperalgesie mittels einer gerichteten Infrarotlichtquelle nach der Hargreaves-Methode (Hargreaves et al. 1988) an der Fußunterseite bestimmt. Da der Ort der Entzündung (Kniegelenk) von dem Ort der

Messung (Pfotenunterseite) abweicht, spricht man hier von sekundärer thermischer Hyperalgesie, deren Mechanismen für die Auffindung wirksamer Analgetika von Bedeutung ist.

Versuchsbeschreibung Thermische Hyperalgesie (Hargreaves Test): Das Versuchstier wird in einer Plastikkammer auf eine Quarzglasscheibe gesetzt. Vor der Testung wird dem Versuchstier zunächst etwa 5 - 15 Minuten Zeit gegeben, sich an die Umgebung zu gewöhnen. Sobald sich das

Versuchstier nach der Erkundungsphase nicht mehr so oft bewegt (Ende der Explorationsphase), wird die Infrarotlichtquelle, deren Fokus in der Ebene des Glasbodens liegt, direkt unterhalb der zu stimulierenden Hinterpfote positioniert. Ein Versuchsdurchlauf wird nun durch Knopfdruck gestartet: Infrarotlicht führt zur Erhöhung der Hauttemperatur der Hinterpfote. Der Versuchablauf wird entweder bei Anheben der Hinterpfote durch das

Versuchstier (als Ausdruck des Erreichens der Schmerzschwelle) oder bei Erreichen einer vorgegeben Höchsttemperatur durch automatisches

Ausschalten der Infrarotlichtquelle beendet. Solange das Versuchstier still sitzt, wird Licht, das von der Pfote reflektiert wird, registriert. Ein Wegziehen der Pfote unterbricht diese Reflektion, woraufhin die Infrarotlichtquelle abgeschaltet und die Zeit von An- bis Abschalten registriert wird. Das Gerät ist so geeicht, dass die Infrarotlichtquelle in 10s die Hauttemperatur auf ca. 45 Grad Celsius erhöht (Hargreaves et al. 1988). Zur Testung wird ein von der Firma Ugo Basile zu diesem Zweck produziertes Gerät benutzt.

CAR wurde von Sigma-Aldrich bezogen. Die Applikation der

erfimndungsgemäßen, spezifischen Cathepsin D-Inhibitoren wurde 30 Minuten vor der CAR intraartikulär vorgenommen. Als Positivkontrolle wurde Triamcinolone (TAC) 10 pg/Gelenk und als Negativkontrolle wurde das Lösungsmittel (Vehikel) verwendet. Die Hyperalgesie wird als Differenz der Wegziehzeiten zwischen der entzündeten und der nicht-entzündeten Pfote angegeben.

Ergebnis: TAC war in der Lage, die CAR-induzierte Schwellung zu

reduzieren, nicht aber die erfidungsgemäßen spezifischeb Cathepsin D- Inhibitoren. Im Gegensatz dazu konnte die erfindungsgemäßen spezifischen Cathepsin D-Inhibitoren das Ausmaß der thermischen Hyperalgesie dosisabhängig reduzieren. Beurteilung: Es konnte gezeigt werden, dass die Verbindungen der vorliegenden Erfindung eine anti-hyperalgetische Wirkung ausüben. Dies kann postuliert werden, da die Verbindungen keinen Einfluss auf die entzündliche Schwellung und damit auf den Auslöser der Hyperalgesie zeigten. Es kann damit angenommen werden, dass die Verbindungen beim Menschen eine Schmerz reduzierende Wirkung entfalten.

Beispiel 14: Stabilität der erfindungsgemäßen Verbindungen in boviner Synovialflüssigkeit

1. ) Gewinnung von boviner Synovialflüssigkeit

Bei der Präparation von bovinen Expiantaten (für die Diffusionskammer oder andere Assays) werden entweder Rinderhufe (metacarpale Gelenke) oder Rinderknie verwendet. Die Synovialflüssigkeit lässt sich aus beiden

Gelenken gewinnen. Dazu wird bei der Öffnung des Gelenkes die

Synovialflüssigkeit mit einer 10 ml Spritze und einer Kanüle vorsichtig aus dem Gelenk entfernt und in bereit gestellte 2 ml Eppendorfgefäße gefüllt. Die Eppendorfgefäße sind je nach Tier beschriftet (Rinderpass liegt vor). Dabei ist darauf zu achten, dass bei der Präparation der Gelenke kein Blut in den Gelenkspalt eindringt. Ist dies der Fall, verfärbt sich die Synovialflüssigkeit rötlich und muss somit verworfen werden. Die Synovialflüssigkeit ist grundsätzlich hochviskos und klar bis gelblich gefärbt. Die Entnahme zusammen mit einer makroskopischen Analyse der Synovialflüssigkeit wird dokumentiert.

2. ) Ansatz der Stabilitätsprüfung von Substanzen in SF

Um die Stabilität einzelner Verbindungen zu überprüfen wird ein Pool aus 4 verschiedenen bovinen Synovialflüssigkeiten gemischt. Dazu werden ca. 1 ml je SF verwendet. Das Gemisch wird direkt in einem 5 ml Glasgefäß angesetzt. Die SFs werden gründlich aber vorsichtig gemischt. Dabei sollten keine Luftblasen oder Schaum entstehen. Dazu wird ein Vortex-Gerät auf niedrigster Stufe verwendet. Die zu testenden Verbindungen werden in einer Anfangskonzentration (sofern nicht anders angefordert) von 1 μΜ getestet. Nach Zugabe der Substanz erfolgt eine erneute gründliche und vorsichte Durchmischung des Ansatzes. Zur optischen Kontrolle werden alle SF- Ansätze fotografiert und die Bilder im eLabBio-Ordner des entsprechenden Versuchs abgelegt. Abbildung 1 zeit exemplarisch eine solche

Fotodokumentation. Die Ansätze werden für 48 h bei 37°C und 7,5% CO ₂ im Brutschrank inkubiert. 3.) Probenentnahme

Die Probenentnahme erfolgt nach den vorher abgestimmten Zeiten (sofern nicht anders angefordert, siehe unten). Dabei werden pro Zeitpunkt 200 μΙ der SF aus dem Gemisch entnommen und direkt in ein 0,5 ml„Low-binding" Eppendorf Gefäß überführt.„Low-binding" Eppendorf Gefäße werden verwendet um eine Wechselwirkung der Substanzen mit dem Kunststoff der Gefäße zu minimieren. In dem Eppendorfgefäß wurde bereits 200 μΙ

Acetonitril vorgelegt, so dass danach eine 1 + 1 Mischung der SF entsteht. Dies erleichtert die folgende Analytik, es kann jedoch direkt nach Zugabe der SF zum Ausfallen vom Protein kommen. Dies ist im Protokoll zu vermerken. Direkt nach Zugabe der Substanz wird die 0 h Probe entnommen. Dies entspricht dem 100% Wert in der Stabilitätsberechnung. Idealerweise sollte sich hier die eingesetzte Konzentration wiederfinden. Die Proben können bei -20°C eingefroren werden.

0 h

6 h

24 h

48 h

Als Negativkontrolle wird SF ohne Substanz verwendet. Als Positivkontrolle wird SF mit 1 μΜ Substanz verwendet. Dies entspricht dem 0h Wert und somit 100% Stabilität. Die Lagerung der Proben erfolgt in„low-Binding" Eppendorf-Gefäßen bei - 20°C. Anschließend werden die Proben quantitativ vermessen. 4.) Datenverarbeitung

Die gemessenen Konzentrationen (ng/ml) werden in einer Graphik

(GraphPad Prism®) als zeitlicher Verlauf dargestellt. Dabei wird die prozentuale Stabilität der Substanz ermittelt. Als 100% Wert wird der Ausgangswert in SF zum Zeitpunkt 0 h verwendet. Die Daten werden unter der jeweiligen Versuchsnummer in eLabBio gespeichert und in die MSR Datenbank (als Prozent Stabilität nach den entsprechenden

Inkubationszeiten) berichtet.

5.) Ergebnisse

Alle gemessenen Verbindungen blieben stabil.

Beispiel 15: ln-vitro Fluoreszenz-Assay zur Identifizierung von Renin inhibitorischer Aktivität

Zur Identifizierung von Modulatoren der Renin Aktivität wurde ein

kontinuierlicher enzymatischer Test mit einem synthetischen Peptid, das eine fluor7szierende Gruppe Edans (=(5-(aminoethyl)aminonaphthalene sulfonate) trägt, die durch Energietransfer von einer Dabcyl (4'- dimethylaminoazo-benzene-4-carboxylate)-Gruppe am selben Molekül gequencht ist, in 384-well-Mikrotiterplatten von Greiner durchgeführt. Die Spaltung des peptidischen Substrats durch Renin bewirkt einen Anstieg in der Fluoreszenzintensität. Zur Bestimmung der Wirksamkeit von Substanzen wurde der zeitabhängige Anstieg in der Fluoreszenzintensität in Gegenwart der Substanz mit der zeitabhängigen Fluoreszenzzunahme in Abwesenheit von Substanzen verglichen. Als Referenzsubstanz diente Renin inhibitor 2 (Z-Arg-Arg-Pro-Phe-His-Sta-Ile-His N-Boc-Lys methyl ester Z) (Sigma- Aldrich). Als Substrat wurde Renin FRET Substrate I (DABCYL - g - Abu - lle - His - Pro - Phe - His - Leu - Val - lle - His - Thr - EDANS) (Anaspec, Fremont CA) verwendet. Als Enzym wurde rekombinantes humanes Renin (Proteos, Kalamazoo, MI) in einer finalen Konzentration von 10 nM

eingesetzt. Der Test wurde in 50 mM Mops-Puffer, 1.5 % (v/v) DMSO, 0.1 % (w/v) Igepal®, pH 7.2, 0.5 % (w/v) BSA durchgeführt. Zu je 4 μΙ Renin- Lösung wurden je 2 μΙ Substanzlösung mit seriell verdünnter

Substanzkonzentration zugegeben und 15 min bei Raumtemperatur inkubiert. Die Reaktion wurde gestartet durch Zugabe von 4 μΙ Substrat- Lösung (finale Konzentration 5 μΜ). Nach Durchführung einer Startpunkt- Fluoreszenzmessung (Anregungswellenlänge 340 nm/Emissionswellenlänge 495 nm) mit einem Envision Multilabel reader (Perkin Elmer) wurde die Reaktion 60 min bei 37°C inkubiert. Anschließend wurde die Menge des während der Reaktionzeit abgespaltenen Peptidfragments durch

Bestimmung der Zunahme der Fluoreszenzintensität bei 495 nm

(Anregungswellenlänge 340 nm) gemessen.

Ergebnis: Alle gemessenen Verbindungen haben eine IC ₅ o der

Reninselektiviät >30μΜ.

Beispiel 16: Injektionsgläser

Eine Lösung von 100 g einer Verbindung der Formel I und 5 g Dinatrium- hydrogenphosphat wird in 3 I zweifach destilliertem Wasser mit 2 n

Salzsäure auf pH 6,5 eingestellt, steril filtriert, in Injektionsgläser abgefüllt, unter sterilen Bedingungen lyophilisiert und steril verschlossen. Jedes Injektionsglas enthält 5 mg einer Verbindung der Formel I.

Beispiel 17: Lösung Man bereitet eine Lösung aus 1 g einer Verbindung der Formel I, 9,38 g NaH ₂ PO ₄ 2 H ₂ O, 28,48 g Na ₂ HP0 ₄ - 12 H ₂ O und 0,1 g Benzalkoniumchlorid in 940 ml zweifach destilliertem Wasser. Man stellt auf pH 6,8 ein, füllt auf 1 I auf und sterilisiert durch Bestrahlung. Diese Lösung kann in Form von Augentropfen verwendet werden.

Beispie! 18: Salbe Man mischt 500 mg einer Verbindung der Formel I mit 99,5 g Vaseline unter aseptischen Bedingungen.

Beispiel 19: Ampullen

Eine Lösung von 1 kg einer Verbindung der Formel I in 60 I zweifach destilliertem Wasser wird steril filtriert, in Ampullen abgefüllt, unter sterilen Bedingungen lyophilisiert und steril verschlossen. Jede Ampulle enthält 10 mg einer Verbindung der Formel I.