李飞 (中国江苏省南京市江宁区东山街道润麒路99号, Jiangsu 3, 211103, CN)
YE, Shuang (No.99 Runqi Road, Dongshan Avenue Jiangnin, Nanjing Jiangsu 3, 211103, CN)
叶霜 (中国江苏省南京市江宁区东山街道润麒路99号, Jiangsu 3, 211103, CN)
CHEN, Xiaoxiang (No.99 Runqi Road, Dongshan Avenue Jiangnin, Nanjing Jiangsu 3, 211103, CN)
陈晓翔 (中国江苏省南京市江宁区东山街道润麒路99号, Jiangsu 3, 211103, CN)
南京明生医药技术有限公司 (中国江苏省南京市江宁区东山街道润麒路99号, Jiangsu 3, 211103, CN)
LI, Fei (No.99 Runqi Road, Dongshan Avenue Jiangnin, Nanjing Jiangsu 3, 211103, CN)
李飞 (中国江苏省南京市江宁区东山街道润麒路99号, Jiangsu 3, 211103, CN)
YE, Shuang (No.99 Runqi Road, Dongshan Avenue Jiangnin, Nanjing Jiangsu 3, 211103, CN)
叶霜 (中国江苏省南京市江宁区东山街道润麒路99号, Jiangsu 3, 211103, CN)
CHEN, Xiaoxiang (No.99 Runqi Road, Dongshan Avenue Jiangnin, Nanjing Jiangsu 3, 211103, CN)
| 权利要求书 1、 2-对辛基苯乙 -2-氨基丙二醇衍生物， 结构如式 （1 ) 所示： ( 1 ) 其中， 、 R2、 R3独立的选自 H或酰基； R4选自亚甲基、 羰基、 R5为反式 4-甲基环己基。 2、根据权利要求 1所述的 2-对辛基苯乙基 -2-氨基丙二醇衍生物，其特征在于所述 、 R2、 R3可独立的选自 H或 C1~C4的酰基。 3、根据权利要求 2所述的 2-对辛基苯乙基 -2-氨基丙二醇衍生物，其特征在于所述 、 R2、 R3可独立的选自 H或乙酰基。 4、 根据权利要求 1~3中任一项所述的 2-对辛基苯乙基 -2-氨基丙二醇衍生物， 其特征在于 所述的 2-对辛基苯乙基 -2-氨基丙二醇衍生物为： 结构式如 （A-1 ) 所示的 2- (反式 4-甲 基环己基） 甲酰基苯乙基 -2-氨基丙二醇， 结构式如（A-2)所示的 2- (反式 4-甲基环己基） 甲酰基苯乙基 -2-乙酰氨基丙二醇二乙酸酯、 结构式如 （A-3 )所示的 2- (反式 4-甲基环己 基） 甲基苯乙基 -2-氨基丙二醇、 结构式如 （A-4) 所示的 2- (反式 4-甲基环己基） 羟甲基 苯乙基 -2-氨基丙二醇或结构式如 （A-5 )所示的 2- (反式 4-甲基环己基）羟肟基苯乙基 -2- 氨基丙二醇， (A-5) 5、权利要求 1所述的 2-对辛基苯乙基 -2-氨基丙二醇衍生物在制备治疗肺损伤和 /或肺纤维 化的药物中的应用。 6、 权利要求 1所述的 2-对辛基苯乙基 -2-氨基丙二醇衍生物在制备免疫抑制剂药物中的应 用。 |
2-对辛基苯乙基 -2-氨基丙二醇衍生物及其应用 技术领域
本发明属于药物化学领域，具体涉及 2-对辛基苯乙基 -2-氨基丙二醇衍生物及其应用。
背景技术
2-对辛基苯乙基 -2-氨基丙二醇 （简称 FTY720 ) (2-amino-2-(2-[4-octyl-phenyl]ethyl) -1,3-propanediol hydrochloride) 是一个新型免疫抑制齐 U， 为子囊菌亚门 （ascomycete) 赤 僵菌（Isaria sinclarii)发酵菌丝体天然提取物的化学合成的 似物， 其化学结构类似于神 经鞘氨醇（sphingosine)和神经酰胺（ceramide) , 从结构上区别于 FK506 (普乐可复） ， 环孢霉素 A, 以及雷帕霉素等真菌多肽。 FTY720可以明显延长动物异体皮肤、 心脏、 肝 脏、 肾脏的移植存活时间， 并且毒副作用相对少见。 该药显示对多发性硬化疗效显著， 预 期近期可通过 FDA批准以该适应症上市。 FTY720治疗其他自身免疫性疾病动物模型有 效的报道多见， 如自身免疫性糖尿病小鼠模型， 实验性自身免疫性色素膜 -视网膜炎， 自 身免疫性甲状腺炎大鼠，实验性变应性脑脊髓 膜炎，佐剂性关节炎模型大鼠，以及 MRL/lpr 狼疮动物模型。但 FTY720也有许多问题有待解决， 特别是对神经系统具有较大的毒副作 用。 发明内容
本发明的目的是提供一类活性更高的 2-对辛基苯乙基 -2-氨基丙二醇 （FTY720 )衍生 物： 2- (反式 4-甲基环己基） 甲酰基苯乙基 -2-氨基丙二醇及其类似物。
本发明的另一目的是提供涉及该 2-对辛基苯乙基 -2-氨基丙二醇衍生物的应用。
本发明的技术方案如下：
2-对辛基苯乙基 -2-氨基丙二醇衍生物， 结构如式 （1 ) 所示：
( 1 )
N一 OH 其中， Ri R 2 、 R 3 独立的选自 H或酰基； R 4 选自亚甲基、 羰基、
R 5 为反式 4-甲基环己基。
其中所述 Ri、 R 2 、 R 3 优选独立的选自 H或 C1~C4的酰基， 进一步优选独立的选自 H 或乙酰基。
所述的 2-对辛基苯乙基 -2-氨基丙二醇衍生物优选如下化合物： 结构式如（A-1 )所示 的 2- (反式 4-甲基环己基） 甲酰基苯乙基 -2-氨基丙二醇， 结构式如 （A-2)所示的 2- (反 式 4-甲基环己基） 甲酰基苯乙基 -2-乙酰氨基丙二醇二乙酸酯、 结构式如 （A-3) 所示的 2- (反式 4-甲基环己基） 甲基苯乙基 -2-氨基丙二醇、 结构式如 （A-4)所示的 2- (反式 4- 甲基环己基）羟甲基苯乙基 -2-氨基丙二醇或结构式如（A-5)所示的 2- (反式 4-甲基环己 基） 羟肟基苯乙基 -2-氨基丙二醇，
(A-5)
本发明化合物的设计思想：
1. 2-对辛基苯乙基 -2-氨基丙二醇 （FTY720) 的一个显著特点是其结构由 1个亲水部 分 (氨基醇)和 1个亲脂部分 (碳链)所组成， 而两性分子是这类化合物产生毒性和特殊理化 性质的主要原因， 因此， 在新化合物设计中保留这两部分是必需的。
2. 2-氨基 2-取代 -1,3-丙二醇不同化合物的作用功效主要依赖于 链烷烃中苯环的位 置； 季碳和苯环之间的最佳碳链长度是两个碳原子 ， 苯环上取代位置以对位为宜， 因此， 保留苯环是必需的， 且以对位为取代。
3. 烷基链的长短变化仅对毒性有影响， 当季碳和苯环之间的最佳碳链长度是两个碳 原子， 烷基链长度为 8个碳原子时， 活性最明显。
基于以上构效关系的分析，我们着手对苯环对 位的取代基进行改造，根据生物电子等 排原理， 我们将 FTY720中苯环 4位上的直碳链换为同碳原子数的取代环链， 之后， 再在 该碳链的苄位上增加羟基， 羰基， 肟基， 得到本发明新的化合物。
本发明化合物制备路线如下:
本发明所述的 2-对辛基苯乙基 -2-氨基丙二醇衍生物具有免疫抑制和预防和 /或治疗肺 纤维化的作用，可在制备治疗肺损伤的药物中 的应用。可以经口服或静脉注射两个途径给 药， 两种用途给药剂量均在.0.2〜10mg/kg体重。 本发明的化合物加上适量的常规药用辅料， 如淀粉， 甲基或羧甲基纤维素， 水， 聚乙 烯吡洛烷酮和 pvpp等， 按照常规的制剂工艺制成片剂或注射剂。
本品 10〜500g
辅料 适量
制成 1000片或支
本发明的有益效果： 本发明基于对 FTY720 的构效分析， 成功合成了包括 2- (反式 4-甲基环己基） 甲酰基苯乙基 -2-氨基丙二醇在内的一系列 2-对辛基苯乙基 -2-氨基丙二醇 衍生物。本发明化合物能够抑制肺纤维化相关 基因如 VEGF、 a -SMA、 IL_1 β、 I型胶原的 表达， 改善 H.E染色的肺部纤维化病理、 减少 Mason纤维染色、 减少 TGF- β和 a -SMA 的生成，对博来霉素诱导的炎症性肺损伤、坏 死性胰腺炎引起的急性肺损伤均可起到保护 作用， 疗效显著优于 FTY720, 而且本发明化合物 A-1较之 FTY720能显著延长 BLM诱导 的肺纤维化模型小鼠的生存时间。本发明可同 时作用于静息淋巴和已激活的淋巴，对器官 移植的排斥反应不仅有良好的预防效果， 同时还有治疗作用。在不同器官移植时， 本发明 化合物较之 FTY720具有更优越的免疫抑制作用。因此， 本发明可用于制备治疗肺损伤和 /或肺纤维化的药物和 /或免疫抑制剂类药物， 为治疗肺损伤、 肺纤维化和器官移植产生的 排斥反应提供了一种更加有效、 更加安全的可选药物。
附图说明
图 1 小鼠生存曲线图。
图 2 小鼠肺部纤维化 HE染色结果。
A为正常组（未经博来霉素造模的健康小鼠） 部纤维化 HE染色图； B为博来霉素造模小 鼠第 7日肺部纤维化 HE染色图； C为博来霉素造模小鼠第 28日肺部纤维化 HE染色图； D 为博来霉素造模小鼠经 FTY720治疗第 28 日肺部纤维化 HE染色图； E为博来霉素造模小 鼠经本发明化合物治疗第 28日肺部纤维化 HE染色图。
图 3 小鼠肺部纤维化 Mas son染色结果。
A为正常组（未经博来霉素造模的健康小鼠） 部纤维化 Masson染色图； B为博来霉素造 模小鼠第 7日肺部纤维化 Masson染色图; C为博来霉素造模小鼠第 28日肺部纤维化 Masson 染色图； D为博来霉素造模小鼠经 FTY720治疗第 28日肺部纤维化 Masson染色图； E为博 来霉素造模小鼠经本发明化合物治疗第 28日肺部纤维化 Masson染色图。
图 4 小鼠肺部纤维化 TGF- β免疫组化染色结果。
A为正常组 （未经博来霉素造模的健康小鼠） 肺部纤维化 TGF- β免疫组化染色图； B为博 来霉素造模小鼠第 7 日肺部纤维化 TGF- β免疫组化染色图； C为博来霉素造模小鼠第 28 日肺部纤维化 TGF- β免疫组化染色图； D为博来霉素造模小鼠经 FTY720治疗第 28日肺部 纤维化 TGF- β免疫组化染色图； E为博来霉素造模小鼠经本发明化合物治疗第 28 日肺部 纤维化 TGF- ø免疫组化染色图。
图 5 小鼠肺部纤维化 α -SMA免疫组化染色结果。
A为正常组（未经博来霉素造模的健康小鼠） 部纤维化 a -SMA免疫组化染色图； Β为博 来霉素造模小鼠第 7日肺部纤维化 α -SMA免疫组化染色图； C为博来霉素造模小鼠第 28 日肺部纤维化 α -SMA免疫组化染色图； D为博来霉素造模小鼠经 FTY720治疗第 28 日肺 部纤维化 α -SMA免疫组化染色图； E为博来霉素造模小鼠经本发明化合物治疗第 28日肺 部纤维化 α -SMA免疫组化染色图。
图 6 FTY720, 本发明化合物对纤维化相关的基因表达的影响 。
A 为 FTY720、本发明化合物为对 t -SMA基因表达的影响； B为 FTY720、本发明化合物对 VEGF基因表达的影响； C 为 FTY720、 本发明化合物对 I型胶原基因表达的影响； D 为 FTY720、 本发明化合物对 IL-1 β基因表达的影响。
具体实施方式
实施例 1
2-苯乙醇甲磺酸酯（B-1 ) 的制备
将 2-苯乙醇 （100.0g， 0.82 mol)、 三乙胺 (102.0g， 1.0 mol)和二氯甲烷 (500mL)投入 反应瓶中， 在 5 °C左右 （0~10°C ) 滴加甲磺酰氯 (119.0 g， 1.14mol)， 滴毕 0~10°C反应 3 h; 将反应混合物倒入水中， 分出有机相， 有机相用水洗至中性， 用无水硫酸镁干燥， 浓 縮， 得 B-1 (155.8 g, 95.0%)
2-苯基碘乙烷（B-2) 的制备
将正丁酮 (500 mLl)， 碘化钠 (157.0g, 2.85mol)和 B-1 ( 125.0g, 0.38mol)， 加入反应瓶 中， 室温反应 5 h， 回收正丁酮， 将浓縮物缓慢倒入冰水混合物中， 弃去水层， 固体溶于 二氯甲烷中， 水洗， 有机相用无水硫酸镁干燥， 浓縮， 得 B-2(83.8g, 95.0% )， GC-MS(m /z):232(M + ), 51， 77, 105， 127。
2-乙酰氨基 2-(2-苯基乙基)丙二酸二乙酯 (B-3)的制备
将无水乙醇 (800mL)投入反应瓶中， 分批缓慢加入金属钠 (20.0g， 0.87mol)， 待金属钠 全部反应后， 在 60°C~65°C温度下， 加入乙酰氨基丙二酸二乙酯 (172.0g， 0.8mol), 反应 1 h， 加入 B-2(65.0g, 0.28 mol)， 反应 7 h， 回收乙醇， 浓縮物溶于二氯甲烷中， 水洗至中 性， 有机相用无水硫酸镁干燥， 浓縮， 结晶， 得 B-3(62.9 g, 70.0 %) , 熔点 112.4 °C~11 2.8 °C， GC-MS(m/z):276(M-45), 91， 143， 171， 217， 276。
2-乙酰氨基 2-(2-苯基乙基 )-1,3-丙二醇 (B-4)的制备
将四氢呋喃 (400mL)， 硼氢化锂 (12.0g， 0.56mol)投入反应瓶中， 回流反应 1 h， 降至 室温， 加入 B-3 (44.9g， 0.14 mol)， 回流反应 6 h， 缓慢滴加饱和氯化铵溶液， 滴毕， 分出有机相， 水洗至中性， 无水硫酸镁干燥， 浓縮， 得 B-4(24.9 g, 75.0 %)。 GC-MS(m/ z):219(M+)， 73， 91， 115， 129， 146， 188。
2-乙酰氨基 2-(2-苯基乙基) - 1 ,3-丙二醇二乙酸酯 (B-5)的制备
依次将吡啶 (300mL)， 醋酐 (250.0g， 2.45mol) 和 B-4(33.2g, 0.14mol)投入反应瓶中， 4 5°C下反应 10 h， 将反应物倒入水中， 弃去水相， 溶于二氯甲烷中， 水洗至中性， 干燥， 浓縮， 结晶， 得 B-5(22.5 g, 50.0 %) , 熔点 106.5 °C~108.3 °C。 GC-MS(m/z):321(M + ), 9 7， 129， 146， 157， 164， 188， 206， 248， 261。
2-乙酰氨基 2-[2-(4-对甲基环己基甲酰基苯基)乙基 ]-1,3-丙二醇二乙酸酯 (A-2)的制备
0 °C~5°C， 依次将对甲基环己基甲酰氯 （340.0 g, 2.12 mol)， 三氯化铝 (555.4 g, 4. 16 mol)和二氯甲烷 (250 mL)投入反应瓶中， 搅拌反应 0.5 h后， 缓慢滴加 B-5 ( 166.9 g， 0.52 mol) 的溶液，滴加完毕， 室温反应 8h， 将反应混合物慢慢倒入 5 %的盐酸冰水溶液 中， 分出有机层， 用饱和氯化钠溶液洗至中性， 无水硫酸镁干燥， 浓縮， 结晶， 得 A-2(6 9.4 g， 30.0%)
A-2:
白色结晶： mp: 108.5~110.5°C。 IR(KBr， υ , cm -丄)：
3310.47, 2945.03， 1749.63, 1558.33， 1246.10, 1223.65， 1040.31。
1HNMR(400MHz,DMSO-J 6 )( δ ,ppm):
7.88(d,J=8.0Hz,2H,ArH), 7.71(s,lH,NH), 7.32(d,J=8.0Hz,2H, ArH), 4.28(d,J=10.8Hz,2H,0- CH 2 )， 4.18(d,J=10.8Hz,2H,0-CH 2 ), 3.36(s,lH,羰基 α位- CH), 2.59(t,J=8.4Hz,2H,苄基 a位- CH 2 )， 2.03 1.99(m，9H，CH3X 3)， 1.792-1.716(m,2H,CH 2 ), 1.65(s，H，CH)， 1.40~1.30(m,8H, 环己基 -CH 2 )， 0.91(d,J=6.8Hz,3H,CH 3 )。
1 3 CNMR(400MHz,DMSO-J 6 )( δ ,ppm):
202.99， 170.30, 147.75, 133.90， 128.86， 128.51， 125.99， 63.41， 44.33， 42.42， 34.09， 32.61， 31.98， 29.26， 26.87， 23.52， 22.74， 20.84。
MS(FAB M/Z):444 (M + -l).
2-氨基 2-[2-(4-对甲基环己基甲酰基苯基)乙基] -1,3-丙二醇 (A-l)的制备
将氢氧化锂 (17.0g, 0.4mol)和甲醇 (200mL)投入反应瓶中， 加入 A-2(20.0g， 0.046mol), 回流 h， 减压蒸除甲醇， 结晶， 得 A-l g,
A-l:
白色结晶， mp: 133.5~135.5°C。
IR(KBr， υ ,cm l ):
3349.82， 3290.12, 2945.03， 1670.18, 1019.89。
1HNMR(400MHz,DMSO-J 6 )( δ ,ppm):
7.86(d,J=8.0Hz,2H, ArH), 7.32(d,J=8.0Hz,2H, ArH), 4.49(s，2H，NH 2 )， 3.25(t，4H，0-CH 2 )， 2.69~2.65(m,2H,苄基 CH 2 ), 1.798~1.714(m,2H, CH 2 )， 1.54-1.49, 1.37-1.31, 1.14~1.11(9H, 环己基)， 0.91(d,J=6.4Hz,3H,-CH
1 3 CNMR(400MHz,DMSO-J 6 )( δ ,ppm):
202.99， 149.42， 133.60， 128.77, 128.42， 65.56， 55.66， 44.33， 36.59， 34.11, 31.99， 29.30， 29.26， 22.73。
MS(FAB M/Z):320 (M++l)。 本发明化合物对肺纤维化模型的治疗效应 2. 1博来霉素致小鼠肺纤维化模型的建立
8-12周龄 C57B1/6小鼠， SPF级层流架无菌饮食喂养， 经气管软骨环间隙向心端注射 0. 05-0. 075 units ( 2-3 units/kg 体重） 博来霉素（以下简称 BLM, 购自 Gensia Sicor Pharmaceuticals)， 注射时体位直立， 注射后旋转体位以保证博来霉素在肺内均匀分 布。 2. 2生存曲线测定
将 BLM造模成功的小鼠分为三组， A-1组和 FTY720组分别从第二天开始给予本发明 化合物 2- (反式 4-甲基环己基） 甲酰基苯乙基 -2-氨基丙二醇 （A-1 ) lmg/kg 和 FTY720 0. 5mg/kg, 每天尾静脉注射一次。 未处理组不给药。
给药后小鼠生存曲线见图 1， 由图 1可看出本发明化合物 A-1能显著延长 BLM造模的 肺纤维化小鼠的生存时间，在 28d时的生存率可达 90%, 而 FTY720则只有 33%左右，未处理 组完全死亡。 这说明本发明化合物 A-1较之 FTY720能显著延长 BLM诱导的肺纤维化模型 小鼠的生存时间。
2. 3对肺部纤维化的病理改变
将 BLM造模成功的小鼠分为三组， A-1组和 FTY720组分别从第二天开始给予本发明 化合物 2- (反式 4-甲基环己基） 甲酰基苯乙基 -2-氨基丙二醇 （A-1 ) lmg/kg 和 FTY720 0. 5mg/kg, 每天尾静脉注射一次。未处理组不给药。另设 立未经博来霉素造模的健康小鼠 作为正常组。
各组小鼠右下肺组织常规固定后， 经固定后， 常规石蜡包埋， 制成病理切片。
2. 3. 1. HE染色
切片在二甲苯中脱蜡 5〜10分钟。移入二甲苯和纯酒精（1 : 1 )混合液中 5分钟左右 (如经二次二甲苯脱蜡， 此步可略）。 入 100%、 95 %、 85 %、 70%酒精， 各级为 2〜5分 钟。最后经蒸馏水转入染液。 苏木精染液染色 5〜15分钟。水洗玻片上多余染液， 0. 5〜1 %盐酸酒精 （70%酒精配制） 分色片刻。 镜检控制， 直至细胞核及核内染色质清晰为止， 约数 10秒钟。流水冲洗 15〜30分钟， 或者在碳酸锂饱和液中短时间碱化或蓝化， 即细胞 核呈蓝色， 蒸馏水短洗。 0. 1〜0. 5 %伊红染液染色 1〜5分钟， 若着色困难， 可在每 100 毫升染液中加入 1〜2滴冰醋酸， 使易着色且不易脱色。 依次经 70%、 85 %、 95 %、 100 %酒精脱水，各级为 2〜3分钟，在 95 %以下浓度的酒精中伊红易脱色，应适当縮短 间。 二甲苯透明 （二次）， 共约 10分钟。 封片： 擦去切片周围多余二甲苯， 切勿干涸， 迅速滴 加适量中性树胶， 再加盖玻片封固。 光镜下观察， 结果见图 2
2. 3. 2 Masson染色
切片脱蜡至水， 1%高锰酸钾氧化切片 5min， 水洗， 草酸漂白 lmin。 再水洗， 蒸馏水 洗， 天青石蓝染 5min水洗， 摔去余液不用水洗， 滴染 Mayer氏苏木素 3_5min， 流水冲洗 5-10mino丽春红苦味酸饱和液染 5min， 1%醋酸水溶液洗， 1%磷钼酸分化切片约 5min， 蒸 馏水洗， 1%淡绿或者甲苯胺蓝滴染 30s， 1%醋酸水溶液洗切片， 95%酒精分化， 无水酒精 脱水， 二甲苯透明， 中性树胶封固。 光镜下观察， 结果见图 3
2. 3. 3 TGF- β , α -SMA免疫组化染色
切片脱蜡和水化后， 用 PBS (pH7. 4)冲洗三次， 每次 3min。 如果有必要， 每张切片加 1滴过氧化氢液室温下孵育 10分钟，以阻断内源性过氧化物酶的活性。 PBS冲洗 3x3min。 除去 PBS液， 每张切片加 1滴或 50 μ 1的抗 a -SMA抗体、 或抗 TGF- β抗体（DAK0公司）， 室温下孵育 90分钟。 PBS冲洗 3x5min。 除去 PBS液， 每张切片 1： 10000的兔抗大鼠-辣 根过氧化物酶（DAK0公司） 50 μ 1， 室温下孵育 40分钟。 PBS冲洗 3x3min。 除去 PBS液， 每张切片加 1滴或 50 μ 1新鲜配制的 DAB或 AEC溶液，显微镜下观察 3_5分钟。 自来水冲 洗， 苏木素复染， 用 0. 1%HC1分化， 自来水冲洗， PBS返蓝， 中性树胶封固， 封片。 光镜 下观察， 结果见图 5 。
病理结果显示 FTY720和本发明化合物 A-1均能有效地改善 H. E染色的肺部纤维化病 理、 减少 Mason纤维染色、 减少 TGF- β和 a -SMA的生成， 且本发明化合物 A-1效果较之 FTY720更为显著， 提示本发明化合物 A-1对治疗 BLM诱导的肺纤维化模型有效。
2. 4 对肺纤维化相关的基因表达的影响
使用 Syber green dye I法检测小鼠 VEGFA、 a -SMA、 I型胶原和 IL_1 β的 mRNA水 平， 结果见图 6。 试剂 PrimeScript RT reagent Kit Perfect Real time购自 （Takara ( code : DRR037A)o 仪器使用 ABI PRISM 7900HT。
引物序列： VEGF正向引物: SEQ ID NO. 1； VEGF反向引物 SEQ ID NO. 2o a - SMA 正 向引物： SEQ ID N0. 3; a -SMA 反向引物： SEQ ID N0. 4; IL-1 β正向引物： SEQ ID N0. 5; IL-Ι β反向引物： SEQ ID NO. 6； I型胶原正向引物： SEQ ID NO. 7； I型胶原反向引物： SEQ ID NO. 8。
50mg小鼠肺组织，按 Trizol法抽提 mRNA后，逆转录成为 cDNA。 SYBR Premix Ex Taq (2x) lOul , PCR 正向引物 0. 8 ul， PCR反向引物 0. 8ul ( 50mg/ml ) , ROX Reference dye 0. 4ul, RT 反应液 2ul, ddH20 6ul配至 20 ul反应体系。 反应过程： 95. 0°C变性 30秒， 95. 0°C 5秒 60. 0°C 34秒， 95. 0°C 15秒， 40个循环； 后 60. 0°C 1分， 95. 0°C 15秒。
结果显示： 与未经造模的正常组小鼠相比， 经 BLM处理以后小鼠的 a -SMA、 VEGFA、 IL-1 β、 I型胶原基因的 mRNA水平显著升高， 但 Fty720和本发明化合物 A-1均能显著 下调上述基因的 mRNA水平，而本发明化合物 A-1在下调上述基因的 mRNA水平方面的活性 较之 Fty720更强。 实施例 3 本发明化合物免疫抑制效果考察
实验方法：
将 WKAH大鼠的心脏移植到 ACI大鼠的颈部，形成心脏移植模型。 受试动物分为两组， 一组口投本发明化合物 A-1 , 称为实验组， 另一组口投 FTY720, 称为对照组。 两组均从移 植当日起连续 15日给药； 口投药物第一日即移植当日计为第 0日， 口投药物第二日即移 植后的第 1天依次计为第 1 日，以此类推， 口投药物第 15日计为第 14日。实验结果显示， 本发明化合物组随着用量的增加移植心脏在受 者中的生存日数得到相应的延长，尽管用量 很大也没有发现副作用。而对照组大鼠在实验 剂量范围内其生存日数不受剂量影响。且各 剂量的实验组大鼠的生存日数较之对照组大鼠 的生存日数显著延长，表明本发明化合物较 之 FTY720有更好的免疫抑制效果。
对大鼠做肝脏移植， 受试动物分为两组， 一组口投本发明化合物 A-1 , 称为实验组， 另一组口投 FTY720, 称为对照组。 两组均从移植次日开始连续 14 d给药。 结果显示， 本 发明化合物较之 FTY720能显著延长受者的生存日数，表明本发明 化合物较之 FTY720有更 好的免疫抑制效果。
对大鼠做小肠移植， 受试动物分为两组， 一组口投本发明化合物 A-1 , 称为实验组， 另一组口投 FTY720, 称为对照组。 两组均从移植当日起连续 15日给药； 口投药物第一日 即移植当日计为第 0日， 口投药物第二日即移植后的第 1天依次计为第 1 日， 以此类推， 口投药物第 15日计为第 14日。 结果显示， 本发明化合物较之 FTY720能显著延长受者的 生存日数， 表明本发明化合物较之 FTY720有更好的免疫抑制效果。
对 Beagle犬做肾脏移植， 受试动物分为两组， 一组口投本发明化合物 A_l， 称为实 验组， 另一组口投 FTY720, 称为对照组。 两组均从移植当日起每日给药， 直至两组动物 的生存日数出现显著不同。本发明化合物 A-1较之 FTY720能明显延长受试狗的生存日数， 表明本发明化合物对大动物也同样有抑制排斥 反应的效果。
表 1总结了本发明化合物 A-1与 FTY720的不同用量对不同动物的不同器官移植时 ， 所得到的免疫抑制的实验结果。
表 1
从上表看出，实验组本发明化合物在不同器官 移植时，免疫抑制的作用均优于对照组
FTY720。
本发明实施例部分所用动物均由江苏省实验动 物中心提供。
Next Patent: LIGHT MODULATOR PIXEL UNIT AND MANUFACTURING METHOD THEREOF