Login| Sign Up| Help| Contact|

Patent Searching and Data


Title:
23-HYDROXY-BETULINIC ACID DERIVATIVES, PREPARATION METHODS AND USES THEREOF
Document Type and Number:
WIPO Patent Application WO/2011/060634
Kind Code:
A1
Abstract:
23-hydroxy-betulinic acid derivatives, including 3-oxo-23-hydroxy-betulinic acid, 3-oxo-23-hydroxy-dihydrobetulinic acid and 23-hydroxy-dihydrobetulinic acid, their preparation methods and medical uses as antitumor and anti-HIV agents are disclosed.

More Like This:
Inventors:
ZHANG, Nan (Room 602, Building 3No. 33 Jinxianghe Road,Xuanwu District, Nanjing, Jiangsu 8, 210008, CN)
张南 (中国江苏省南京市玄武区进香河路33号3幢602, Jiangsu 8, 210008, CN)
Application Number:
CN2010/072740
Publication Date:
May 26, 2011
Filing Date:
May 13, 2010
Export Citation:
Click for automatic bibliography generation   Help
Assignee:
ZHANG, Nan (Room 602, Building 3No. 33 Jinxianghe Road,Xuanwu District, Nanjing, Jiangsu 8, 210008, CN)
张南 (中国江苏省南京市玄武区进香河路33号3幢602, Jiangsu 8, 210008, CN)
ZHONG, Rong (Room 602, Building 3No. 33 Jinxianghe Road,Xuanwu District, Nanjing, Jiangsu 8, 210008, CN)
International Classes:
C07J53/00; A61K31/56; A61P31/18; A61P35/00
Domestic Patent References:
2008-11-20
Foreign References:
CN101428071A2009-05-13
CN1491651A2004-04-28
CN101704872A2010-05-12
Attorney, Agent or Firm:
SUZHOU CREATOR PATENT & TRADEMARK AGENCY LTD. (No. 93 Ganjiang West Road, Suzhou, Jiangsu 2, 215002, CN)
Download PDF:
Claims:
权利要求:

1、一种 23-羟基白桦酸衍生物,该衍生物的化学名称为 3-羧基 -23- ¾基白桦酸, 化学式为

2、 制备权利要求 1所述的 23-羟基白桦酸衍生物的方法, 包括以 下步骤:

( 1 )将 23-羟基白桦酸溶解于吡啶中, 搅拌均匀, 缓慢滴加醋酸酑, 搅拌进行反应, 然后缓慢滴加氯化铵饱和溶液, 直至无气泡产生, 乙 酸乙酯萃取后合并有机层, 饱和氯化钠水溶液洗有机层, 再用无水硫 酸钠干燥, 旋干有机溶剂乙酸乙酯后上柱分离, 除回收部分原料外, 分别得到化合物 3, 23-二乙酰基 -23-羟基白桦酸, 23-二乙酰基 -23- 羟基白桦酸和 3-二乙酰基 -23-羟基白桦酸;

( 2 ) 将 23-二乙酰基 -23-羟基白桦酸 溶解分散于二氯甲烷中, 于 冰浴下加入氧化剂 二环己基碳二亚胺后, 于室温搅拌进行反应, 旋 干溶剂二氯甲烷后用乙酸乙酯溶解后用粗硅胶进行柱分离,得到化合 物 3-羧基 -23-二乙酰基 -23-羟基白桦酸;

( 3 ) 取 3-羧基 -23-二乙酰基 -23-羟基白桦酸 分散溶解于甲醇中, 加入碳酸钾的饱和溶液后, 于室温搅拌进行反应, 乙酸乙酯萃取后合 并有机层, 饱和氯化钠水溶液洗有机层, 再用无水硫酸钠干燥, 旋干 有机溶剂乙酸乙酯后上柱分离, 得化合物 3-羧基 -23-羟基白桦酸。

3、一种 23-羟基白桦酸衍生物,该衍生物的化学名称为 3-羧基 -23- 羟基二氢白桦酸, 化学式为

4、 制备权利要求 3所述的 23-羟基白桦酸衍生物的方法, 包括: 取 3-羧基 -23-羟基白桦酸 分散溶解于甲醇中, 加入还原剂钯碳后 密封反应体系, 抽真空, 充入氢气, 并于氢气流中室温搅拌进行反应, 在结束反应后滤除钯碳, 然后旋干溶剂, 得到产物 3-羧基 -23-羟基二 氢白桦酸。

5、一种 23-羟基白桦酸衍生物, 该衍生物的化学名称为 23-羟基二 氢白桦酸, 化学式为

6、 制备权利要求 5所述的 23-羟基白桦酸衍生物的方法, 包括: 取化合物 23-羟基白桦酸分散溶解于甲醇中,加入还原剂钯碳后密 封反应体系, 抽真空, 充入氢气, 并于氢气流中室温搅拌进行反应, 在结束反应后,滤除钯碳,然后旋干溶剂得到产物 23-羟基二氢白桦酸。

7、 权利要求 1、 3、 5中任一项所述的 23-羟基白桦酸衍生物或其 各种形式形成的盐在制备抗肿瘤药物中的应用。

8、 权利要求 1、 3、 5中任一项所述的 23-羟基白桦酸衍生物或其 各种形式形成的盐在制备抗艾滋病药物中的应用。

9、 药物组合物, 其中含有权利要求 1、 3、 5中任一项所述的 23- 羟基白桦酸衍生物或其各种形式形成的盐作为有效成分,并含有常规 药用载体和 /或赋形剂。

10、 根据权利要求 9所述的药物组合物, 该药物组合物制成口服 制剂或注射剂, 其中所述药用载体和 /或赋形剂包括谷物油, 羧甲基 纤维素钠。

Description:
23-羟基白桦酸衍生物、 其制备方法及应用 技术领域

本发明涉及具有抗肿瘤和抗艾滋病作用的 23-羟基白桦酸衍生 物、 其制备方法及应用。 背景技术

白桦酸, 又名桦木酸, 是五环三萜类化合物, 英文名称为 Betiilinic acid , 化学名为 3 p-hydroxy-lup-20(29)-ene-28-oic

acid , 分子式为 C 3 。H 48 0 3 , 分子量为 456.71。 白桦酸有几种生物来源, 如从蒲桃树叶、 白桦树皮乙醇萃取物进行重结晶提取; 也可以用白桦 脂醇为原料通过化学合成得到。 可用作调香剂。 白桦酸是一种无色结 晶, 熔点 316〜318 °C, 旋光度 [a】 D +8°, 能溶于乙醚、 乙醇、 丙酮、 氯 仿、 吡啶。 白桦酸的性质和作用可参见下面三篇文献: 周映霞, 王振 国, 马莉, 阎浩林, 白桦酯酸及其衍生物的研究概况, 中国药学杂志, 2005年 06期; 徐萍, 周金培, 徐进宜, 吴晓明, 白桦酸类化合物抗 肿瘤活性的研究进展, 中国药师, 2006年 02期; 李丹, 周金培, 吴 晓明, 白桦酸及其衍生物的研究进展, 药学进展, 2004年 03期, 白 桦酸具有抗肿瘤、 抗艾滋病病毒、 抗炎和体外抗疟病作用等多种生物 活性, 并对肿瘤细胞具有一定的选择性细胞毒性及其 较好的治疗指数, 甚至达到 500mg/kg时, 也没有明显的毒性反应。 九十年代中期经研究 发现白桦脂酸可以选择性地杀死人类黑色素瘤 细胞而不杀伤健康细 胞; 另外近期的研究表明白桦酸对脑瘤、 神经外胚层瘤、 白血病等恶 性肿瘤细胞也有抑制作用。 白桦酸抗肿瘤作用机制认为是降低肿瘤细 胞线粒体膜电位, 引起细胞内线粒体通透性改变, 最后导致细胞凋亡, 另外与其上调肿瘤细胞膜 p53蛋白的表达, 改变肿瘤细胞膜 Ca 2+ 、 Mg 2+ -ATP酶活性有关, 具体参见两篇文献, 叶银英, 何道伟, 叶文才, 张庆文, 赵守训 . 23-羟基桦木酸体外和体内抗黑色素瘤作用的研 究 [J】 中国肿瘤临床与康复, 2000年 01期; 程燕, 叶文才, 石俊敏, 姚新 生,栗原博. 23-羟基白桦酸诱导 LoVo细胞凋亡与线粒体膜电位的变化 [J] . 中国药理学通报, 2007年 03期 。

传统中药白头翁, 具清热解毒、 活血化瘀功效, 中医临床主要用 于结肠癌、 直肠癌等肠道肿瘤及子宫颈癌、 脑垂体瘤、 甲状腺瘤、 肺 癌的治疗, 具体参见文献 Ye w c, Zhang Q W, Hsiao W L , et al . New lupane glycosides from pulsatila chinensis [J] . P / anta Medwa , 2002, 68: 183-6。 23-羟基白桦酸是从白头翁中发现的三萜皂苷元 , 其含量高 达 2.5 %, 参见文献叶银英, 何道伟, 叶文才, 等. 23—羟基桦木酸体 外和体内抗黑色素肿瘤作用的研究 [J】. 中国肿瘤临床与康复, 2000 7(1): 5 一 7。 近年来的研究表明 23-羟基白桦酸在体内、 外均能够选 择性抑制小鼠黑色素瘤 B16细胞的增殖, 其作用机制主要是通过诱导 B16细胞凋亡, 参见两篇文献 Ye Y Y, He D W, Ye W C , et al . The study of 23-hydroxybetulinic

Acid against melanoma in vivo and in vitro [J] . Chin J Clin

Oncol

Rehab. 2000, 7(1): 5—7 ; Wu W K , Ho J C, Cheung F W , et Apoptotic activity of betulinic acid derivatives on murine melanoma B16 cell line [J] . Eur J Pharmacol. 2004 , 498(1—3) : 71— 8。

综上, 白桦酸和 23-羟基白桦酸具有抗肿瘤作用, 因此可用作抗肿 瘤的治疗药。 目前, 抗肿瘤药物应用于人体时, 不同个体的药效作用 是有很大差异的, 抗肿瘤药物的分子作用机理现在也没有完全研 究透 彻, 因此不同个体只能从不同的抗肿瘤药物中选择 对自己药效作用大, 副作用小的药物, 则对开发更多的抗肿瘤药物或者具有抗肿瘤活 性的 化合物是很有需求的。 基于白桦酸和 23-羟基白桦酸具有的抗肿瘤作 用,人们会期待从白桦酸或 23-羟基白桦酸的衍生物中发现其他具有生 物活性的化合物, 这些化合物可以应用于抗肿瘤的治疗药, 或者具有 其他作用, 如抗艾滋病。 为达到上述目的, 发明人对白桦酸或 23-羟基 白桦酸的很多衍生物进行了研究,结果发现了 三种 23-羟基白桦酸衍生 物是具有抗肿瘤和抗艾滋病活性的, 从而完成了本发明。 发明内容

本发明的第一个目的是提供具有抗肿瘤和抗艾 滋病作用的新化 合物, 该新化合物是属于 23-羟基白桦酸的衍生物; 本发明的第二 个目的是提供新化合物的制备方法; 本发明的第三个目的是说明新 化合物的应用。

本发明提供了三种新的 23-羟基白桦酸衍生物,化学名称为 3-羧基 -23-羟基白桦酸、 3-羧基 -23-羟基二氢白桦酸、 23-羟基二氢白桦酸, 化 学式依次为

3-羧基 -23-羟基白桦酸, 英文名称为 3-carbonyl-23-hydroxy betulinic acid, 其分子式为 C 3 。H 46 0 4 , 分子量为 470.68, 其制备方法 如下:

( 1 ) 将 500mg 23-羟基白桦酸溶解于 1ml吡啶中, 于零下 5度下 搅拌均匀, 缓慢滴加醋酸酑 0.15ml, 而后反应于零下 5度搅拌反应约 24小时后处理反应。 于该温度下缓慢滴加氯化铵饱和溶液, 直至无气 泡产生, 乙酸乙酯萃取三次后合并有机层, 饱和氯化钠水溶液洗有机 层两次, 再用无水硫酸钠干燥, 旋干有机溶剂乙酸乙酯后上柱分离, 除回收部分原料外, 分别得到化合物 3, 23-二乙酰基 -23-羟基白桦酸 (定义为 zhangiiaii-1 ), 23-二乙酰基 -23-羟基白桦酸 (定义为 zhangnan-2 ) 和 3-二乙酰基 -23-羟基白桦酸 (定义为 zhangnan-6 ), 化 合物 zhangnaii-l、zhaiigiiaii-2、 zhangnan-6分另 [J占总产物的 30% , 60% 和 10% , 该反应 骤的总收率为 65% , 反应式如下:

( 2 )将 lOOmg 化合物 zhangnan-2 溶解分散于 30ml二氯甲烷中, 于冰浴下加入氧化剂 二环己基碳二亚胺 58mg后, 于室温搅拌反应 4 小时后处理, 旋干溶剂二氯甲烷后用乙酸乙酯溶解后用粗硅 胶进行柱 分离, 得到化合物 3-羧基 -23-二乙酰基 -23-羟基白桦酸 (定义为 zh ;

( 3 ) 取 50mg 化合物 zhangnan-4 分散溶解于 30ml甲醇中, 加入

5ml碳酸钾的饱和溶液后, 于室温搅拌反应 2小时后处理反应, 乙酸 乙酯萃取三次后合并有机层, 饱和氯化钠水溶液洗有机层两次, 再用 无水硫酸钠干燥, 旋干有机溶剂乙酸乙酯后上柱分离, 得化合物 3- 羧基 -23-羟基白桦酸 (定义为 zhangnaii-5 ) 40mg , 该反应步骤的收 率为 90% , 反应式如下:

化合物 zhangnan-5

H-NMR(400 MHz, CDC13 ) 6: 0.963, 0.969, 0.992, 1.015, 1.690(各 3H, s, 5XCH3), 2.99(1H, m, H-19), 4.71(1H, d, J=1.6 Hz, 29-H), 4. 61(1H, d, J=1.6 Hz, 29-H)。

C-NMR(400 MHz, CDC13) δ: 213.95, 182.21, 150.31, 109.79, 56.36, 53.30, 49.20, 48.17, 46.93, 44.58, 42.56, 40.38, 40.34, 38.41, 37.43, 37.04, 36.79, 33.08, 32.13, 30.56, 29.60, 25.46, 22.18, 21.51, 19.34, 15.89, 14.52, 13.54。

MS(ESI): m/ z 440 [M-20

3-羧基 -23-羟基二氢白桦酸, 英文名称为 3-carbonyl-23-hydroxy Dihydrobetulinic acid, 其分子式为 C 3 。H 48 0 4 , 分子量为 472.7, 其 制备方法如下:

取 30mg 化合物 zhangnan-5 分散溶解于 30ml 甲醇中, 加入约 10mg还原剂钯碳后密封反应体系, 抽真空, 充入氢气, 并于氢气流中 室温搅拌反应 10 小时后结束反应, 滤除钯碳后旋干溶剂, 得到产物 3-羧基 -23-羟基二氢白桦酸 (定义为 zhangnan-7) 25mg, 该反应的收 率

化合物 zhangnan-7

H-NMR(400 MHz, CDC13 ) δ: 0.755(3H, d, 3=1.2 Hz), 0.963(3H, d, 3=1.2 Hz), 0.894, 0.936, 1.048, 1.301(各 3H, s, 4XCH3), 2.243(4H, m)。

C-NMR(400 MHz, CDC13) δ: 212.69, 177.79, 56.29, 52.98, 48.52, 47.65, 44.19, 44.12, 42.71,37.87, 37.33, 37.22, 36.78, 33.16, 32.12, 29.82, 29.59, 27.02, 23.45, 22.93, 22.19, 21.59, 16.12, 14.99, 14.58, 13.63, 12.04。

MS(ESI): ml z 442 [M-20H] 。

23- 羟 基 二 氢 白 桦 酸 , 英 文 名 称 为 23-hydroxy Dihydrobetulinicacid, 其分子式为 C 3 。H 4 。0 4 , 分子量为 474.72, 其 制备方法如下:

取 30mg化合物 23-羟基白桦酸分散溶解于 30ml 甲醇中, 加入约 10mg还原剂钯碳后密封反应体系, 抽真空, 充入氢气, 并于氢气流中 室温搅拌反应 10 小时后结束反应, 滤除钯碳后, 旋干溶剂得到产物 23-羟基二氢白桦酸(定义为 zhangnan-8)20mg,该反应的收率为 70%, 反应式如下:

化合物 zhangnan-8

H-NMR(400 MHz, CDC13 ) δ: 0.727(3Η, d, J=6.4 Hz , CH3), 0.816(3H, d, J=6.8 Hz , CH3), 0.790, 0.853, 0.910, 1.289 (各 3H, s, 4XCH3), 2.243(4H, m)。

C-NMR(400 MHz, CD30D) δ: 70.58, 64.82, 56.33, 50.39, 48.98, 47.09,

44.37, 42.68, 42.49, 39.38, 38.76, 37.64, 36.90, 34.26, 29.96, 27.37 27.18, 23.62, 23.23, 21.17, 17.99, 16.81, 16.66, 15.22, 14.78, 12.89。

MS(ESI): m/ z 444 [M-20H] 。

三种新的 23-羟基白桦酸衍生物, 3-羧基 -23-羟基白桦酸、 3-羧基 -23- 羟基二氢白桦酸、 23-羟基二氢白桦酸, 其制备方法可参考文献 Hashimoto F, Kashiwada Y, Cosentino LM, Chen CH, Garrett PE, Lee KH., Anti-AIDS agents-XXVII. Synthesis and anti-HIV activity of betulinic acid and dihydrobetulinic acid derivatives. Bioorg Med Chem. 1997 Dec;5(12):2133-43。 该三种新化合物能广泛抑制多种类型 的人肿瘤细胞系生长, 并进一步诱导肿瘤细胞凋亡。 在人肿瘤异种移 植模型研究中, 3-羧基 -23-羟基白桦酸被证明是一种有效的抗肿瘤剂 能强烈抑制人黑色素瘤、 白血病、 恶性神经胶质瘤、 前列腺癌、 肺癌 和结肠癌细胞在体内生长。 3-羧基 -23-羟基白桦酸具有被开发成为新的 广谱抗肿瘤药物的巨大潜能。 本发明还发现 3-羧基 -23-羟基白桦酸、 3-羧基 -23-羟基二氢白桦酸和 23-羟基二氢白桦酸还具有抗 HIV病毒作 用, 特别是 3-羧基 -23-羟基二氢白桦酸抗 HIV病毒作用最强并且强过 临床上使用的抗艾滋病药物阳性对照组。 因此说, 3-羧基 -23-羟基二氢 白桦酸具有被开发成为新的抗艾滋病药物的巨 大潜能。

附图说明

附图 1为化合物 zhangnaii-5或对照组治疗皮下接种的人前列腺 癌 (LnCAP ) 肿瘤细胞的肿瘤体积一移植后天数曲线图;

附图 2 为化合物 zhangnaii-5 或对照组治疗皮下接种的人肺癌 ( NCI-H23 ) 肿瘤细胞的肿瘤体积一移植后天数曲线图;

附图 3为化合物 zhangnaii-5或对照组治疗皮下接种的人结肠癌 ( HCT-116 ) 肿瘤细胞的肿瘤体积一移植后天数曲线图;

附图 4为化合物 zhangnaii-5或对照组治疗皮下接种的人黑色素 瘤 (G-361 ) 肿瘤细胞的肿瘤体积一移植后天数曲线图;

附图 5为化合物 zhangnaii-5或对照组治疗皮下接种的人恶性神 经胶质瘤 (U-251 ) 肿瘤细胞的肿瘤体积一移植后天数曲线图 。 具体实施方式

下面结合附图来进一步阐述本发明。

本发明涉及三种新的 23-羟基白桦酸衍生物, 化合物 Z h a n g n an -5、 zhangnan-7和 zhangnan-8, 它们的化学名称、 化学式、 表征化学结 构的各种参数以及制备方法已在发明内容部分 公开,这里通过实验来 说明三种新化合物的生物活性。

( 1 ) 化合物 zhangnan-5 ^ zhangnan-7^ 和 zhangnan-8广泛抑制 人体肿瘤细胞株, 但对正常细胞株没有作用: (可参考文献 Carmichael J, DeGraff WG, Gazadar AF, Minna JD, Mitchell JB; Evaluation of a tetrazolium-based semiautomated colormeteric assay: assessment of c he mo sensitivity testing. Cancer Research, 1987, 47: 943-946。)

我们使用人肿瘤细胞系进行细胞毒性分析。 在含有不同化合物 zhangnan-5 ^ zhangnan-7^ 和 zhangnan-8 的正常培养基中培养 31 种人肿瘤细胞株, 人肿瘤细胞系购自 ATCC和 NCI, 用含 10 % FBS 的 DMEM培养液, 在含 5%C02 的 370C孵箱中培养。 用胰蛋白酶 消化汇合的细胞, 经培养液洗涤后计数。 向 96孔培养板的每孔中加 入 3000〜6000个细胞, 孵育 16小时或 24小时。 然后向孔内加入不 同浓度的化合物 zhangnan-5 ^ zhangnan-7 ^ 和 zhangnan-8 o 继续培 养 72小时后, 对药物处理组细胞和对照组细胞进行 MTT试验, 测 定细胞存活情况。 结果如表 1所示, 表 1显示化合物 Z h an gn an -5、 zhangnan-7, 和 zhangnan-8广泛抑制人体肿瘤细胞株, 大多数人体 肿瘤细胞尤其对化合物 zhangnaii-5敏感。 有些肿瘤细胞对这种化合 物的 EC50低于 Ο.ΐ μ m。 但是, 正常人乳腺上皮细胞 (MCF— 10a ) 和正常小鼠成纤维细胞(MEF)对化合物 zhangnan-5、 zhangnan-7,和 zhangnan-8 不敏感, 即便化合物的浓度高达 30 μ m, 这些细胞仍然 生长良好。 表 1 化合物 zhangnan-5 zhangnan-7 和 zhangnan-8

体外抑制人肿瘤细胞生长 细胞类型 zhangnan-5 zhangnan-7 zhangnan-8 人肿瘤细胞株 EC50 ( uM ) EC50 ( uM ) EC50 ( uM )

LnCAP 前列腺 0.69 15.6 7.8

D145 前列腺 0.85 14.8 8.4

PC3 前列腺 0.91 16.2 8.9

HCT-116 结肠 0.09 15.1 7.8

Widr 结肠 0.28 14.8 8.1

HT29 结肠 0.47 13.9 8.9

LoVo 结肠 0.15 15.2 9.6

CCL-225 结肠 0.23 16.1 8.6

CCL-247 结肠 0.52 15.6 8.2

NCI-H23 肺 0.32 12.8 6.7

A549 肺 0.54 13.1 6.9

MDA-MB-231 乳腺 0.47 17.5 7.2

MDA-MB-435 乳腺 0.55 19.3 7.9

AU-565 乳腺 0.59 18.2 6.8

BT-549 乳腺 0.67 17. 4 7.4

MCF-7 乳腺 0.58 16.9 7.8

Caki-1 肾 0.98 20.1 9.2

ACHN 肾 1.2 18.3 8.9

786-0 肾 3.1 16.8 8.1

SN12C 肾 1.3 17.5 7.6

SKOV3 卵巢 1.5 16.9 6.9

IGROV1 卵巢 2.1 17.4 7.2

Mid PaCa-2 胰腺 0.93 18.9 9.4

U-251 恶性胶质瘤 0.089 17.8 5.6

SK-MEL-5 皮肤(黑色 0.093 18.5 4.9

G-361 皮肤(黑色 0.087 19. 3 5.3

正常乳腺上 >30

MCF-lOa >30 >30

皮细胞

SGC-7901 胃 0.89 18.5 8.9

EC 109 食管 0.78 17.9 9.5

CNE-2Z 鼻咽 1.3 19.2 10.2

Raji 淋巴瘤 0.098 20.5 6.9

Jurkat 白血病 T细 0.14 21.3 7.1

正常小鼠成

MEF >30 >30 >30

纤维细胞

化合物 zhangnan-5 ^ zhangnan-7^ 和 zhangnan-8或其各种形式 形成的盐可作为抗肿瘤药物的原料药,该形成 的盐是由衍生物与碱反 应生成的, 碱可采用各种形式的碱, 可以是无机碱如氢氧化钠、 氢氧 化钾等, 也可以是有机碱如碱金属醇盐等, 化合物 Z h an g nan -5、 zhangnan-7,和 zhangnan-8或其各种形式形成的盐可与药用载体 / 或赋形剂制成口服制剂或注射剂制的抗肿瘤药 物, 药用载体和 /或赋 形剂包括谷物油, 羧甲基纤维素钠等。

(2) 化合物 zhangnan-5、 zhangnan-7^ 和 zhangnan-8对 C8166 和 PBMC细胞的毒性:

取对数生长期的 C8166 (人 T淋巴细胞系) 和 PBM (用淋巴细 胞分离液自正常人外周血分离, 贴壁的单个核细胞从 PBMC中分离) 细胞, 离心(1 000 r,min-l, 10 min)后将细胞重悬, 浓度分别调至 4 X105 / ml和 2X106 / ml。 在 96孔细胞培养板上将被检样品 2倍 倍比稀释, 共设 6个梯度, 每个梯度设 3个重复孔, 另设阳性对照组 及细胞对照组。分别加细胞悬液后,置 370C、 5%C02培养箱中孵育。 第 7天用 MTT法测定样品对细胞的毒性。 按下列公式计算被检样品 对细胞生长的抑制率, 并计算 IC50 (50 %inhibition concentration) 值。 细胞生长抑制率(% ) = (1- 实验孔 OD值 I对照孔(OD值) X100%

23-轻基白桦酸、 化合物 zhangnan-5^ zhangnan-7^ 和 zhangnan-8 对 C8166细胞的 IC50值分另 [J为 15.1±3.57uM、 2.3±0.47uM、 25 ±5.2uM和 10.3±2.9uM, 而阳性对照 AZT在 3.437mM时对 50% C8166 细胞产生毒性。 23-羟基白桦酸、 化合物 zhangnan-5、 zhangnaii-7、和 zhangnaii-8对正常人 PBMC的 IC50值分另 [J为 14.9 ±3.46 uM、 2.4±0.38uM、 25.8±4.9uM和 11.6±3.5uM。 阳性对 照药物 SCH— C (治疗艾滋病的抗逆转录病毒药物, 是 CCR 的拮 抗剂, 只能阻止 R 型病毒与细胞结合, 对 X 型病毒无效。 分子量 (MW)为 557。 将 184. 1 m 的 SCH_C溶解到 3. 3 ml DMSO中, 得到 lOOummol 的贮存液, 于 4°C或一 20°C保存。 )对 PBMC 的 IC50为 82. 667ummol。

( 3 ) 化合物 zhangnan-5 ^ zhangnan-7^ 和 zhangnan-8对病毒 HIV-1IIIB诱导 C8166细胞形成合胞体的抑制作用:(可参考文 姜 海鸥;汪旭, 李汝润, 陈大刚, 贲昆龙. 复方三黄散胶囊体外抗艾滋 病病毒的实验研究, [J】. 山东中医杂志,2005.8(1):21-26. )

在 96孔平底培养板上, 将待测物用培养基进行 2倍稀释, 共 8 个稀释度, 每孔 lOOul设 2个重复孔, 同时设置阳性对照组、 细胞对 照组和病毒对照组。 每孔加 4 X 105 / ml的 C8166细胞 8 0 ul , 然后 每孔加入 20ul 病毒 HIV-1IIIB 上清, 每孔的终末体积为 200 ul, 置 37 °C , 5%C02 培养箱内培养。 感染后第 3 天观察化合物 zhangnan-5 ^ zhangnan-7^ 和 zhangnan-8对合胞体形成的影响。 在 倒置显微镜下, 计数病毒 HIV-1IIIB诱导 C8166细胞形成的合胞体 数。 EC50 为抑制合胞体形成达 50%时的化合物 zhangnan-5、 zhangnan-7, 和 zhangnan-8的浓度。 以下列公式计算样品对合胞体 形成的抑制率: 合胞体形成的抑制率(%) = (1 - 实验孔合胞体数 I对照孔合胞体数)

X 100% 阳性对照 AZT显示出有效的抑制 HIV— 1诱导 C8166细胞形成 合胞体, 其 EC50为 1.39uM, 治疗指数 TI值为 2473。 23-羟基白 桦酸、 化合物 zhangnan-5 ^ zhangnan-7^ 和 zhangnan-8的 EC50 值分另 (J为 1.2 ± 0.23uM、 0.5 ± 0.07uM 、 0.0019 ± 0.0002uM、和 1.1 ± 0.09uM ; 其治疗指数分别为 13、 4.6、 13158、 9.4。 化合物 zhangnan-5 ^ zhangnan-7^ 和 zhangnan-8对 HIV-1IIIB诱导合胞 体形成的抑制作用随其浓度的增加而增强, 与阳性对照药物 AZT 相比, zhangnaii-7 治疗指数(TI)最高, 对合胞体的形成显示出明 显的抑制作用。

( 4 )定量酶联免疫吸附法(EIISA ) 检测化合物对病毒 HIV-lAda-M p24表达的抑制作用: (可参考文献 姜海鸥;汪旭, 李汝润, 陈大刚, 贲昆龙. 复方三黄散胶囊体外抗艾滋病病毒的实验研究 , [J】. 山东中 医杂志,2005.8(1):21-26. ) 在 96孔培养板上, 用多头加样器对样品进行 3倍倍比稀释, 设 6个稀释度, 每个稀释度设三个重复孔, 每孔 100ul。 同时设阳性对 照组 SCH— C (治疗艾滋病的抗逆转录病毒药物,是 CCR 的拮抗剂, 只能阻止 R 型病毒与细胞结合, 对 X 型病毒无效。 分子量 (MW)为 557。将 184. 1 m 的 SCH— C溶解到 3 . 3 ml DMSO中,得到 lOOummol 的贮存液,于 4 °C或一 20 °C保存。;)、病毒对照组和细胞 +病毒对照组。 在 96 孔平底培养板上每孔分别加入含有 1000〜5000 pg / well P24 抗原的病毒贮存液 25 ul, 充分混匀, 加入单个核细胞 PBMC悬液 75 ul (3 X 105 细胞数 /孔), 置 37°C, 5%C02培养箱中培养到第 3天 时每孔补加 100 ul培养基, 第 7天时收集细胞培养上清供 p24抗原 测定, 按 p24试剂盒说明用 EILSA法检测各样品细胞培养孔上清的 病毒 HIV-l p24抗原浓度, 以下列公式计算样品对病毒的抑制率: 样品对病毒 p24抗原的抑制率(%) = (1 - 实验孔 OD值 /细胞加病 毒对照孔 OD值) X 100% , 以 Reed and Mueneh法计算出被测样 品的 EC50 , 并进一步计算出治疗指数(TI) (TI = IC50 I EC50)。

当以试剂盒测定 HIVp24抗原的含量时, 发现加入的病毒量 (V)为 896. 3 pg / ml , 而病毒增值对照(病毒加细胞, V+ C) 的病毒 p24 含量为 1 452. 9 pg / ml o 阳性对照 SCH_C、 23-羟基白桦酸、 化 合物 zhangnan-5、 zhangnan-7 ^ 和 zhangnan-8在所测定的范围内 都达到了 50%以上的抑制率,阳性对照 SCH— C抑制 HIV-lAda-M p24抗原表达, 其 EC50为 0.032 ummol , 治疗指数为 2583。 23- 羟基白桦酸、化合物 zhangnan-5、zhangnan-7、和 zhangnan-8 EC50 值分另 (J为 1.9 ± 0.39uM、 0.7 ± 0.19uM 、 0.0026 ± 0.0005uM、和 1.6 ± 0.23uM, 其治疗指数分别为 7.8、 3.4、 9923和 7.3。 23-羟基白 桦酸、 化合物 zhangnan-5、 zhangnan-7^ 和 zhangnan-8都具有对 HIV-lAda-M的抑制作用,其中化合物 zhangnan-7对 HIV-lAda-M 的抑制活性最强, 并且明显强于阳性对照化合物 SCH_ C, 而且 对 HIV-lAda-M的抑制作用与其浓度存在着明显的量 关系。

化合物 zhangnan-5 ^ zhangnan-7^ 和 zhangnan-8或其各种形式 形成的盐可作为抗艾滋病药物的原料药,该形 成的盐是由衍生物与碱 反应生成的, 碱可采用各种形式的碱, 可以是无机碱如氢氧化钠、 氢 氧化钾等, 也可以是有机碱如碱金属醇盐等, 化合物 Z h an gn an -5、 zhangnan-7,和 zhangnan-8或其各种形式形成的盐可与药用载体 / 或赋形剂制成口服制剂或注射剂制的抗艾滋病 药物, 药用载体和 /或 赋形剂包括谷物油, 羧甲基纤维素钠等。

( 5 )化合物 zhangnaii-5在小鼠体内的药代动力学研究: (可参考文 献 Singh SS, Shah H, Gupta S, Jain M, Sharma K, Thakkar P, Shah R. Liquid chromatography— electrospray ionisation mass spectrometry method for the determination of escitalopram in human plasma and its application in bioequivalence study. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 2004 Nov 25;811(2):209-15. )

取 4只 8 周龄 BlebC 小鼠 (2 只雄性和 2 只雌性), 单次剂量 100mg/kg给予化合物 zhangnan-5。 分别于口饲给药后 0.5、 1、 3、 6、 12、 24、 48、 72 小时, 经眼静脉取血并制得血浆, 以测定给予化合 物 zhangnan-5的血浆浓度。 表 2. 化合物 zhangnan-5在小鼠体内的药代动力学参 数

( 6 ) 给药后化合物 zhangnaii-5对小鼠的急性毒性研究: (可 参考文献 Gol'dberg LE, Stepanova ES, Vertogradova TP, Shevniuk LA, Shepelevtseva G. Preclinical toxicological study of the new antibiotic eremomycin. Its acute toxicity for laboratory animals, Antibiot Med Biotekhnol. 1987, 32(12): 910-5. )

取两组 8周龄的 BlabC小鼠,每组 10只(5只雄性和 5只雌性), 分别以单次剂量 500mg/kg和多次剂量 200mg/kg ( QDX15 ) 给予化 合物 Z h an gn an -5 (用玉米油或载体配制),然后分别观察 1周和 4周。 每两天称体重。 试验结束后, 将受试小鼠处死, 进行病理分析。 结果 显示, 以单次剂量 500mg/Kg和多次剂量 200mg/kg ( QDX15 ) 给予 化合物 Z h a n gn an -5, 均未观察到毒性,所有受试小鼠生长良好,无 一死 亡。 因此给予化合物 zhangnan-5是具有很大开发前景的广谱抗肿瘤 新药, 化合物 zhangnaii-5可作为抗肿瘤药物的原料药, 优先作为抗 恶性实体瘤药物的原料药, 化合物 zhangnaii-5 也可与药用载体和 / 或赋形剂制成抗肿瘤药物。 所述药用载体和 /或赋形剂例如谷物油, 羧甲基纤维素钠等。 化合物 zhangnan-5 —般口服推荐剂量为每天 165mg/体表面积 m2,连续三周, 休息一周为一疗程。化合物 zhangnaii-5每天总剂量一 次于早餐后半小时口服,具体病例可由医师根 据病情调整。

( 7 ) 人肿瘤异种移植模型和裸小鼠肿瘤移植模型的 给药:

(可参考文献 Harrison SD Jr; Growth of human tumor cells in athymic mice; J Natl Cancer Inst. 1991 Oct 16 ;83(20): 1509. )

T细胞缺陷裸小鼠 (nu/nu ), 雄性, 6周龄, 购自 Charles River 实验室, 按照大学动物饲养和使用委员会指南饲养于无 病原体环境。 将 5 X 106个 LNCaP、 NCI-H23 , HCT-116、 G-361、 U-251细胞分别 悬浮于 0.2mlHBSS 或基质胶 ( 50 : 50,v/v ) 中, 皮下接种到小鼠的侧 腹部区域。 当肿瘤平均直径达 7〜8mm 时, 选出肿瘤大小为 100〜 200mm3 的小鼠, 分为给予玉米油配制的化合物 zhangnan-5 的处理 组和只给予空载体 (玉米油) 的对照组。 为保证化合物 zhangnan-5 处理组和对照组在处理开始时肿瘤体积分布大 致相等,将小鼠分成三 类: 肿瘤体积小 (长度 <4mm ), 肿瘤体积中等 (4〜8mm ), 肿瘤体 积大 (>8mm )。 对照组, 化合物 zhangnan-5处理组中来自相同类别 的小鼠数目大致相等。 在口服给药试验中,将化合物 zhangnan-5 (30mg/kg)溶解于玉米 油中。每日管饲给予单次剂量 200μ1药液(用玉米油配制, 含 0.75mg 化合物 zhangnan-5 ) , 每周 5次,持续 3周; 对照组按同样方法给予 安慰剂 (玉米油)。 小鼠单独饲养, 允许自由采食。 抗肿瘤效应评价: 每 3〜4天沿两个垂直方向对肿瘤进行测量。 肿瘤体积根据以下 公式计算:

V= (a2 X b)/2 其中 a是肿瘤宽度 (较小直径), b是长度 (较大直径)。 每个肿 瘤的相对肿瘤体积(RTV )定义为给定时间点的肿瘤体积与处理开始 时肿瘤体积的比值。每个处理组均计算平均值 。根据以下公式计算肿 瘤生长抑制值 (TGI ) , 判断抗肿瘤活性:

TGI(%)=T/C X 100 其中 T是处理组试验终点 (4周) RTV的平均值, C是对照组试 验终点 RTV的平均值。 采用美国国立癌症研究所的最小抗肿瘤活性 标准 (T/C 42% )。 在化合物 zhangnaii-5 有效抑制多种肿瘤细胞体外增殖的基础 上, 应用人肿瘤移植裸鼠 (皮下接种) 评价化合物 zhangnan-5的抗 肿瘤作用, 受试的肿瘤细胞包括人前列腺癌细胞 LnCAP , 人肺癌细 胞 NCI-H23,人结肠癌细胞 HCT-116, 人黑色素瘤细胞 G-361和人恶 性胶质瘤细胞 U-251。 结果如图 1一5所示, 化合物 zhangnaii-5强烈 抑制这三种肿瘤生长, 其 TGI值分别为 5%, 0% , 6.9% , 10.8% , 和 12.5%。 同时未发现化合物 zhangnan-5具有明显的副作用, 包括 体重的变化。 这些数据强烈提示, 化合物 zhangnan-5是开发新的抗 肿瘤药物的一个很好的候选化合物。