ATEMWEGSERKRANKUNGEN

Die vorliegende Anmeldung betrifft neue 2,5-disubstituierte Cyclopentancarbonsäure-Derivate, Verfahren zu ihrer Herstellung, ihre Verwendung allein oder in Kombinationen zur Behandlung und/oder Prävention von Krankheiten sowie ihre Verwendung zur Herstellung von Arzneimitteln zur Behandlung und/oder Prävention von Krankheiten, insbesondere zur Behandlung und/oder Prävention von Erkrankungen der Atemwege, der Lunge und des Herz-Kreislauf-Systems.

Die humane Makrophagen-Elastase (HME, EC 3.4.24.65) gehört zur Familie der Matrix-Metallo- Peptidasen (MMPs) und wird auch humane Matrix-Metallo-Peptidase 12 (hMMP-12) genannt. Das Protein wird vermehrt u.a. von Makrophagen nach Kontakt mit "reizenden" Stoffen oder Partikeln gebildet, aktiviert und freigesetzt. Solche Stoffe und Partikel können beispielsweise als Fremdstoffe in Schwebeteilchen enthalten sein, wie sie u.a. in Zigarettenrauch oder Industriestäuben vorkommen. Im weiteren Sinne werden auch körpereigene und körperfremde Zellbestandteile und Zelltrümmer zu diesen Reizpartikeln gezählt, wie sie in zum Teil hoher Konzentration bei entzündlichen Prozessen vorliegen können. Das hochaktive Enzym ist in der Lage, eine Vielzahl von Bindegewebs-Proteinen abzubauen, z.B. vornehmlich das Protein Elastin (daher der Name), sowie weitere Proteine und Proteoglykane wie Kollagen, Fibronektin, Laminin, Chondroitinsulfat, Hepa- ransulfat und andere mehr. Durch diese proteolytische Aktivität des Enzyms werden Makrophagen in die Lage versetzt, die basale Membran zu penetrieren. Elastin zum Beispiel kommt in hohen Konzentrationen in allen Gewebetypen vor, die eine hohe Elastizität zeigen, z.B. in der Lunge und in Arterien. Bei einer Vielzahl von pathologischen Prozessen, wie Gewebeverletzungen, spielt die HME eine wichtige Rolle beim Gewebeabbau und -umbau (engl, tissue remodeling). Darüber hinaus ist die HME ein wichtiger Modulator bei entzündlichen Prozessen. Es ist ein Schlüsselmolekül bei der Rekrutierung von Entzündungszellen, indem es zum Beispiel den zentralen Entzündungsmediator Tumor-Nekrosefaktor-alpha (TNF-α) freisetzt und in den durch transformieren- den Wachstumsfaktor -beta (TGF-ß) vermittelten Signalweg eingreift [Hydrolysis of a Broad Spectrum of Extracellular Matrix Proteins by Human Macrophage Elastase, Gronski et al., J. Biol. Chem. 272, 12189-12194 (1997)] . MMP-12 spielt auch eine Rolle in der körpereigenen Abwehr (engl, host defense), insbesondere bei der Regulation der antiviralen Immunität, vermutlich durch einen Eingriff in den Interferon-alpha (IFN-a)-vermittelten Signalweg [A new transcriptional roleor matrix metalloproteinase-12 in antiviral immunity, Marchant et al., Nature Med. 20, 493-502 (2014)] .

Es wird daher angenommen, dass die HME bei vielen Erkrankungen, Verletzungen und pathologischen Veränderungen eine wichtige Rolle spielt, deren Entstehung und/oder Progression mit einem infektiösen oder nicht-infektiösen entzündlichen Geschehen und/oder einem proliferativen und hypertrophen Gewebe- und Gefäßumbau in Zusammenhang steht. Dies können insbesondere Erkrankungen und/oder Schädigungen der Lunge, der Niere oder des Herz-Kreislauf-Systems sein, oder es kann sich hierbei um Krebs-Erkrankungen oder um andere entzündliche Erkrankungen handeln [Macrophage metalloelasta.se (MMP-12) as a target for inflammatory respiratory dis- eases, Lagente et al., Expert Opin. Ther. Targets 13, 287-295 (2009); Macrophage Metalloelastase as a major Factor for Glomerular Injury in Anti-Glomerular Basement Membrane Nephritis, Kaneko et al., J. Immunol. 170, 3377-3385 (2003); A Selective Matrix Metalloelastase-12 Inhibitor Retards Atherosclerotic Plaque Development in Apolipoprotein E Knock-out Mice, Johnson et al., Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 31, 528-535 (2011); Impaired Coronary Collateral Growth in the Metabolie Syndrome Is in Part Mediated by Matrix Metalloelastase 12-dependent Production of Endo statin and Angiostatin, Dodd et al., Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 33, 1339- 1349 (2013); Matrix metalloproteinase pharmacogenomics in non-small-cell lung Carcinoma, Chetty et al., Pharmacogenomics 12, 535-546 (2011)] .

In diesem Kontext zu nennende Erkrankungen und Schädigungen der Lunge sind insbesondere die chronisch-obstruktive Lungenerkrankung (engl, chronic obstructive pulmonary disease, COPD), das Lungenemphysem (lung emphysema), interstitielle Lungenerkrankungen (interstitial lung diseases, ILD) wie z.B. die Lungenfibrose (ideopathic pulmonary fibrosis, IPF) und die Lungen- sarkoidose (pulmonary sareoidosis), die akute Lungenschädigung (acute lung injury, ALI), das akute Atemwegssyndrom (acute respiratory distress Syndrome, ARDS), zystische Fibrose (cystic fibrosis, CF; auch Mukoviszidose genannt), Asthma sowie infektiös, insbesondere viral bedingte Atemwegserkrankungen. Als andere fibrotische Erkrankungen seien hier beispielhaft die Leber - fibrose und die systemische Sklerose erwähnt. Erkrankungen und Schädigungen des Herz-Kreislauf-Systems, in denen die HME involviert ist, sind zum Beispiel Gewebe- und Gefäßveränderungen bei einer Arteriosklerose, hier insbesondere die karotide Arteriosklerose, die infektive Endo- karditis, hier insbesondere die virale Myokarditis, die Kardiomyopathie, die Herzinsuffizienz, der kardiogene Schock, das akute Koronarsyndrom (acute coronary Syndrome, ACS), Aneurysmen, Reperfusionsschäden nach einem Myokardinfarkt (acute myocardial infaret, AMI), ischämische Schädigungen der Niere oder der Retina sowie deren chronische Verläufe, wie zum Beispiel die chronische Nierenerkrankung (chronic kidney disease, CKD) und das Alport-Syndrom. Genannt seien hier auch das metabolische Syndrom und Adipositas. Erkrankungen in Zusammenhang mit einer Sepsis sind beispielsweise eine systemische entzündliche Reaktion (systemic inflammatory response Syndrome, SIRS), die schwere Sepsis, der septische Schock und das multiple Organversagen (multi-organ failure, MOF; multi-organ dysfunetion, MODS) sowie die intravaskuläre Gerinnung (disseminated intravascular coagulation, DIC). Beispiele für einen Gewebeab- und -umbau bei Krebsprozessen sind das Einwandern von Krebszellen in das gesunde Gewebe (Metastasenbildung) und die Neuausbildung von versorgenden Blutgefäßen (Neo-Angiogenese). Andere entzündliche Krankheiten, bei denen die HME eine Rolle spielt, sind rheumatoide Erkrankungen, zum Beispiel die rheumatoide Arthritis, sowie chronische Darmentzündungen (inflammatory bowel disease, IBD; Morbus Crohn, engl. Crohn 's disease, CD; Colitis ulcerosa, engl, ulcerative Colitis, UC). Im Allgemeinen geht man davon aus, dass Elastase-vermittelten pathologischen Prozessen ein verschobenes Gleichgewicht zwischen der freien Elastase (HME) und dem körpereigenen Elastase- Inhibitorprotein (tissue Inhibitor of metalloproteinase, ΤΓΜΡ) zugrunde liegt. In verschiedenen pathologischen, insbesondere entzündlichen Prozessen ist die Konzentration an freier Elastase (HME) erhöht, so dass lokal die Balance zwischen Protease und Anti-Protease zu Gunsten der Pro- tease verschoben ist. Ein ähnliches (Un-)Gleichgewicht besteht zwischen der Elastase der neutro- philen Zellen (human neutrophil elastase, HNE, ein Mitglied der Serinprotease-Familie) und der körpereigenen Anti-Protease AAT (alpha- 1 anti-Trypsin, ein Mitglied der Serinprotease-Inhibi- toren, SERPINs). Beide Gleichgewichte sind miteinander gekoppelt, da HME den Inhibitor der HNE spaltet und inaktiviert und umgekehrt HNE den HME-Inhibitor spaltet und inaktiviert, wo- durch sich die jeweiligen Protease/ Anti-Protease-Ungleichgewichte zusätzlich verschieben können. Außerdem herrschen im Umfeld von lokalen Entzündungen stark oxidierende Bedingungen (engl. oxidative burst), wodurch das Protease/ Anti-Protease-Ungleichgewicht weiter verstärkt wird [Pathogenic triad in COPD: oxidative stress, protease-antiprotease imbalance, and inflammation, Fischer et al., Int. J. COPD 6, 413-421 (2011)]. Es sind derzeit mehr als 20 MMPs bekannt, die historisch grob in verschiedene Klassen hinsichtlich ihrer prominentesten Substrate eingeteilt werden, z.B. Gelatinasen (MMP-2, MMP-9), Kollagenasen (MMP-1, MMP-8, MMP-13), Stromelysine (MMP-3, MMP-10, MMP-11) und Matri- lysine (MMP-7, MMP-26). HME (MMP-12) ist bisher einziger Vertreter der Metallo-Elastase. Darüber hinaus werden weitere MMPs zur Gruppe der sogenannten MT-MMPs (membrane-type MMPs) zusammengefügt, da diese eine charakteristische Domäne besitzen, die das Protein in der Membran verankert (MMP-14, MMP-15, MMP-16, MMP-17, MMP-24, MMP-25). Allen MMPs ist eine konservierte Zink-bindende Region im aktiven Zentrum des Enzyms gemeinsam, die für die kataly tische Aktivität wichtig ist und die auch in anderen Metallo-Proteinen zu finden ist (z.B. a disintegrin and metalloproteinase, ADAM). Das komplexierte Zink wird durch eine Sulfhydryl- Gruppe in der N-terminalen Pro-Peptid-Domäne des Proteins maskiert, was zu einer enzymatisch inaktiven Pro-Form des Enzyms führt. Erst durch eine Abspaltung dieser Pro-Peptid-Domäne wird das Zink im aktiven Zentrum des Enzyms von dieser Koordinierung befreit und das Enzym dadurch aktiviert (sog. Aktivierung durch cysteine switch) [Matrix metalloproteinase Inhibitors as therapy for inflammatory and vascular diseases, Hu et al., Nature Rev. Drug Discov. 6, 480-498 (2007)]. Die meisten bekannten synthetischen MMP-Inhibitoren verfügen über eine Zink-komplexierende funktionelle Gruppe, sehr häufig zum Beispiel ein Hydroxamat, ein Carboxylat oder ein Thiol [Recent Developments in the Design of Specific Matrix Metalloproteina.se Inhibitors aided by Structural and Computational Studies, B.G. Rao, Curr. Pharm. Des. 11, 295-322 (2005)]. Die Gerüststruktur (scaffold) dieser Inhibitoren ähnelt häufig noch Peptiden, man spricht dann von sogenannten Peptidomimetika (in der Regel mit einer schlechten oralen Bioverfügbarkeit), oder sie weist keine Ähnlichkeit zu Peptiden auf, man spricht dann allgemeiner von kleinen Molekülen (small molecules, SMOLs). Die physikochemischen und pharmakokinetischen Eigenschaften dieser Inhibitoren haben, ganz allgemein gesagt, einen großen Einfluss darauf, welche Zielmoleküle (targets) und welche unerwünschten Moleküle (anti-targets, off-targets) in welchem Gewebe und in welchem Zeitraum in welchem Ausmaß "getroffen" werden.

Es ist hierbei eine große Herausforderung, die spezifische Rolle einer bestimmten MMP in einem Krankheitsgeschehen zu bestimmen. Erschwert wird dies insbesondere durch den Umstand, dass es eine Vielzahl von MMPs und weiterer ähnlicher Moleküle (z.B. ADAMs) gibt, verbunden mit einer Vielzahl an jeweils möglichen physiologischen Substraten und damit unter Umständen auch einhergehenden inhibitorischen oder aktivatorischen Effekten in vielfältigen Signaltransduktions- wegen. Zahlreiche in vitro- und präklinische in vz ^' vo-Experimente haben viel zu einem besseren Verständnis der MMPs in verschiedenen Krankheitsmodellen beigetragen (z.B. transgene Tiere, knock-out-Tiere sowie genetische Daten aus Humanstudien). Die Validierung eines Targets hin- sichtlich einer möglichen medikamentösen Therapie kann letztendlich nur in klinischen Testreihen am Menschen bzw. Patienten erfolgen. Die erste Generation von MMP-Inhibitoren wurde hierbei in Krebsstudien klinisch untersucht. Zu dieser Zeit waren erst wenige Vertreter der MMP-Protein- familie bekannt. Keiner der untersuchten Inhibitoren konnte klinisch überzeugen, da bei wirksamen Dosierungen die aufgetretenen Nebenwirkungen nicht tolerierbar waren. Wie sich im Zuge der Kenntnis weiterer MMPs herausstellte, handelte es sich bei den Vertretern der ersten Inhibitor- Generation um nicht-selektive Inhibitoren, d.h. eine Vielzahl verschiedener MMPs wurde gleichermaßen inhibiert (pan-MMP-Inhibitoren, pan-MMPIs). Vermutlich wurde die erwünschte Wirkung an einem oder mehreren MMP-Targets überdeckt von einer unerwünschten Wirkung an einem oder mehreren MMP-anti-Targets oder durch eine unerwünschte Wirkung an einem sonstigen Ziel- ort (off-target) [Validating matrix metallo proteinases as drug targets and anti-targets for Cancer therapy, Overall & Kleifeld, Nature Rev. Cancer 6, 227-239 (2006)].

Neuere MMP-Inhibitoren, die sich durch eine erhöhte Selektivität auszeichnen, sind nun ebenfalls klinisch getestet worden, darunter auch explizit als MMP-12-Inhibitoren bezeichnete Verbindungen, bislang allerdings ebenso ohne durchschlagenden klinischen Erfolg. Bei einem genaueren Hinsehen haben sich auch hier die zuvor als selektiv beschriebenen Inhibitoren als nicht ganz so selektiv herausgestellt.

So wird für die klinische Testverbindung "MMP408" als ΜΜΡ-12-Inhibitor eine gewisse bis deutliche Selektivität in vitro gegenüber MMP-13, MMP-3, MMP-14, MMP-9, Agg-1, MMP-1, Agg-2, MMP-7 und TACE beschrieben [A Selective Matrix Metalloprotease 12 Inhibitor for Potential Treatment of Chronic Obstructive Pulmonary Disease (COPD): Discovery of (S)-2-(8-(Methoxy- carbonylamino)dibenzo[b,d]furan-3-sulfonamido)-3-methylbutan oic acid (MMP408), Li et al., J. Med. Chem. 52, 1799-1802 (2009)] . In vitro -Wirkdaten zu MMP-2 und MMP-8 deuten auf eine weniger vorteilhafte Selektivität gegenüber diesen beiden MMP-Vertretern hin [Matrix metallo- proteinase-12 is a therapeutic targetfor asthma in children and young adults, Mukhopadhyay et al., J. Allergy Clin. Immunol. 126, 70-76 (2010)] .

Ähnlich verhält es sich mit der klinischen Testsubstanz AZD1236 zur Behandlung von COPD, die als dualer MMP-9/12-Inhibitor beschrieben wird [Effects of an oral MMP-9 and -12 Inhibitor, AZD1236, on biomarkers in moderate/ 'severe COPD: A randomised controlled trial, Dahl et al., Pulm. Pharmacol. Therap. 25, 169-177 (2012)] . Die Entwicklung dieser Verbindung ist im Jahr 2012 eingestellt worden; auch hier wird eine merkliche Inhibition von MMP-2 und MMP-13 angeführt [http://www.wipo.int/research/en/details.jsp?id=2301].

Bei der Bewertung der MMP-Selektivität ist zudem eine vorsichtige Einschätzung der Aussagekraft von Tiermodellen angezeigt. Die Testverbindung MMP408 beispielsweise zeigt eine wesent- lieh verringerte Affinität zum orthologen MMP-12-Target der Maus: IC ₅₀ 2 nM (humanes MMP- 12), IC50 160 nM (murines MMP-12), IC50 320 nm (MMP-12 der Ratte) [siehe oben Li et al., 2009; Mukhopadhyay et al., 2010]. Angaben zur Wirkstärke gegenüber anderen MMPs der Maus sind nicht publiziert. Ähnlich scheint es sich bei der Testsubstanz AZD1236 darzustellen [siehe die unter http://www.wipo. int/research/en/details.jsp?id=2301 angegebenen Informationen zur Kreuz- reaktivität bei verschiedenen Tierspezies] .

Neben dem Selektivitätsprofil über Speziesgrenzen hinweg ist auch die Wirkstärke am Target MMP-12 selbst sehr wichtig. Bei einem vergleichsweise ähnlichen pharmakokinetischen Profil wird eine hochpotente Verbindung zu einer geringeren therapeutischen Dosis führen als eine weniger potente Verbindung, und im Allgemeinen sollte eine geringere Dosis mit einer vermin- derten Wahrscheinlichkeit von Nebenwirkungen einhergehen. Dies gilt insbesondere unter Einbeziehung der sogenannten "freien Fraktion" (fraction unbound, f _u ) einer Verbindung, die mit dem gewünschten Target bzw. unerwünschten anti- und off-Targets wechselwirken kann (die "freie Fraktion" ist definiert als die verfügbare Menge einer Verbindung, die nicht an Bestandteile des Blutplasmas gebunden ist; hierbei handelt es sich hauptsächlich um Bluteiweiß-Bestandteile wie z.B. Albumin). Neben der MMP-Selektivität ist also auch die Spezifität von herausragender Bedeutung.

Neue die Makrophagen-Elastase inhibierende Wirkstoffe sollten demnach eine hohe Selektivität und Spezifität aufweisen, um in der Lage zu sein, gezielt die HME zu inhibieren. Hierzu ist auch eine gute metabolische Stabilität der Substanzen notwendig (geringe Clearance). Außerdem sollten diese Verbindungen stabil sein unter oxidativen Bedingungen, um im Krankheitsgeschehen nicht an inhibitorischer Potenz zu verlieren.

Die chronisch-obstruktive Lungenerkrankung (COPD) ist eine langsam fortschreitende Lungenerkrankung, die durch eine Behinderung der Atemströmung charakterisiert ist, welche durch ein Lungenemphysem und/oder eine chronische Bronchitis hervorgerufen wird. Die ersten Symptome der Erkrankung zeigen sich in der Regel ab dem vierten bis fünften Lebensjahrzehnt. In den darauf folgenden Lebensjahren verschlimmert sich häufig die Kurzatmigkeit und es manifestiert sich Husten, verbunden mit einem ausgiebigen und stellenweise eitrigen Auswurf und einer Stenose- Atmung bis hin zu einer Atemnot (Dyspnoe). COPD ist in erster Linie eine Krankheit von Rauchern: Rauchen ist verantwortlich für 90% aller COPD-Fälle und 80-90% aller COPD-Todes- fälle. COPD ist ein großes medizinisches Problem und stellt weltweit die sechsthäufigste Todesursache dar. Von den über 45-jährigen Menschen sind ca. 4-6% betroffen.

Obwohl die Behinderung der Atemströmung nur partiell und zeitlich befristet sein kann, ist COPD nicht heilbar. Behandlungsziel ist folglich eine Verbesserung der Lebensqualität, die Linderung der Symptome, die Verhinderung akuter Verschlechterungen und die Verlangsamung der fortschreitenden Beeinträchtigung der Lungenfunktion. Bestehende Pharmakotherapien, die sich seit den letzten zwei bis drei Jahrzehnten kaum geändert haben, sind das Verwenden von Broncho- dilatoren, um blockierte Atemwege zu öffnen, und in bestimmten Situationen Kortikosteroide, um die Entzündung der Lunge einzudämmen [Chronic Obstructive Pulmonary Disease, PJ. Barnes, N. Engl. J. Med. 343, 269-280 (2000)] . Die chronische Entzündung der Lunge, hervorgerufen durch Zigarettenrauch oder andere Reizstoffe, ist die treibende Kraft der Krankheitsentwicklung. Der zugrunde liegende Mechanismus beinhaltet Immunzellen, die im Zuge der inflammatorischen Reaktion der Lunge verschiedene Chemokine ausschütten. Hierdurch werden neutrophile Zellen und im weiteren Verlauf alveolare Makrophagen zum Lungenbindegewebe und Lumen gelockt. Neutrophile Zellen sezernieren einen Protease-Cocktail, der hauptsächlich HNE und Proteinase 3 enthält. Aktivierte Makrophagen setzen die HME frei. Hierdurch wird lokal die Protease/ Antipro- tease-Balance zu Gunsten der Proteasen verschoben, was u.a. zu einer unkontrollierten Elastase- Aktivität und in Folge hiervon zu einem überschießenden Abbau des Elastins der Alveolaren führt. Dieser Gewebeabbau verursacht einen Kollaps der Bronchien. Dies geht einher mit einer vermin- derten Elastizität der Lunge, was zu einer Behinderung der Atemströmung und beeinträchtigter Atmung führt. Darüber hinaus kann eine häufige und andauernde Entzündung der Lunge zu einem Remodeling der Bronchien und in der Folge zu einer Ausbildung von Läsionen führen. Solche Läsionen tragen zum Auftreten des chronischen Hustens bei, der eine chronische Bronchitis kenn- zeichnet.

Aus Untersuchungen mit humanen Sputum-Proben ist bekannt, dass die Menge an HME-Protein mit dem Rauch- bzw. COPD-Status einhergeht: Die nachweisbaren HME-Mengen sind bei Nichtrauchern am niedrigsten, bei ehemaligen Rauchern und Rauchern etwas erhöht, sowie bei COPD- Patienten deutlich erhöht [Elevated MMP-12 protein levels in induced Sputum from patients with COPD, Demedts et al., Thorax 61, 196-201 (2006)] . Ähnliche Daten wurden mit humanen Sputumproben und der bronchial-alveolaren Waschflüssigkeit (bronchial alveolar washing fluid, BALF) erhoben. Hier konnte HME auf aktivierten Makrophagen nachgewiesen und quantifiziert werden: HME-Menge COPD-Patient / Raucher > COPD-Patient / ehemaliger Raucher > ehemaliger Raucher > Nichtraucher [Patterns of airway inflammation and MMP-12 expression in smokers and ex-smokers with COPD, Babusyte et al., Respir. Res. 8, 81-90 (2007)] .

Eine der COPD in gewisser Weise ähnliche entzündliche Lungenerkrankung ist die interstitielle Lungenerkrankung (ILD), insbesondere hier die Ausprägung als idiopathische Lungenfibrose (idiopathic pulmonary fibrosis, IPF) und Sarkoidose [Commonalities between the pro-fibrotic mechanisms in COPD and IPF, L.A. Murray, Pulm. Pharmacol. Therap. 25, 276-280 (2012); The pathogenesis of COPD and IPF: distinct horns of the same devil?, Chilosi et al., Respir. Res. 13:3 (2012)] . Auch hier ist die Homöostase der extrazellulären Matrix gestört. Daten aus Genom- weiten Assoziationsstudien lassen eine besondere Rolle der HME im Krankheitsgeschehen solcher fibro- tischen Erkrankungen vermuten [Gene Expression Profiling Identifies MMP-12 and ADAMDEC1 as Potential Pathogenic Mediators of Pulmonary Sarcoidosis, Crouser et al., Am. J. Respir. Crit. Care Med. 179, 929-938 (2009); Association of a Functional Polymorphism in the Matrix Metallo- proteinase-12 Promoter Region with Systemic Sclerosis in an Italian Population, Manetti et al., J. Rheumatol. 37, 1852-1857 (2010); Increased serum levels and tissue expression of matrix metallo- proteinase-12 in patients with systemic sclerosis: correlation with severity of skin and pulmonary fibrosis and vascular damage, Manetti et al., Ann. Rheum. Dis. 7J_, 1064-1070 (2012)]. Darüber hinaus gibt es weitere präklinische Evidenz für eine massgebliche Rolle der HME in ischämisch-entzündlichen Krankheitsprozessen [Macrophage Metalloelastase (MMP-12) Defici- ency Mitigates Retinal Inflammation and Pathological Angiogenesis in Ischemic Retinopathy, Li et al., PLoS ONE 7 (12), e52699 (2012)] . Eine deutlich höhere MMP-12-Expression ist auch bei ischämischen Nierenverletzungen bekannt, ebenso die Beteiligung von MMP-12 bei weiteren ent- zündlichen Nierenerkrankungen [JNK signalling in human and experimental renal ischaemia/ reperfusion injury, Kanellis et al., Nephrol. Dial. Transplant. 25, 2898-2908 (2010); Macrophage Metalloelastase as a Major Factor for Glomerular Injury in Anti-Glomerular Basement Membrane Nephritis, Kaneko et al., J. Immun. 170, 3377-3385 (2003); Role for Macrophage Metallo- elastase in Glomerular Basement Membrane Damage Associated with Alport Syndrome, Rao et al., Am. J. Pathol. 169, 32-46 (2006); Differential regulation ofmetzincins in experimental chronic renal allograft rejection: Potential markers and novel therapeutic targets, Berthier et al., Kidney Int. 69, 358-368 (2006); Macrophage Infiltration and renal damage are independent of Matrix Metalloproteinase 12 (MMP-12) in the obstructed kidney, Abraham et al., Nephrology 17, 322-329 (2012)] .

Aufgabe der vorliegenden Erfindung war somit die Identifizierung und Bereitstellung neuer Substanzen, welche als potente, selektive und spezifische Inhibitoren der humanen Makrophagen- Elastase (HME / MMP-12) agieren und als solche zur Behandlung und/oder Prävention insbesondere von Erkrankungen der Atemwege, der Lunge und des Herz-Kreislauf-Systems geeignet sind. Aus den Patentanmeldungen WO 96/15096-A1, WO 97/43237-A1, WO 97/43238-A1, WO 97/ 43239-A1, WO 97/43240-A1, WO 97/43245-A1 und WO 97/43247-A1 sind 4-Aryl- und 4-Biaryl- substituierte 4-Oxobutansäure-Derivate mit inhibitorischer Aktivität gegenüber MMP-2, MMP-3, MMP-9 und, in geringerem Ausmaß, MMP-1 bekannt; aufgrund dieses Wirkprofils wurden die Verbindungen als insbesondere für die Behandlung von Osteoarthritis, rheumatoider Arthritis und Tumorerkrankungen geeignet betrachtet. In WO 98/09940-A1 und WO 99/18079-A1 wurden weitere Biarylbutansäure-Derivate als Inhibitoren von MMP-2, MMP-3 und/oder MMP-13 offenbart, die zur Behandlung verschiedenartiger Erkrankungen geeignet sind. In WO 00/40539- AI wird die Verwendung von 4-Biaryl-4-oxobutansäuren zur Behandlung von Lungen- und Atemwegserkrankungen beansprucht, basierend auf einer unterschiedlich ausgeprägten Inhibition von MMP-2, MMP-3, MMP-8, MMP-9, MMP-12 und MMP-13 durch diese Verbindungen. Ferner werden in WO 2012/014114-A1 3-Hydroxypropionsäure-Derivate und in WO 2012/038942- AI Oxy- oder Sulfonylessigsäure -Derivate als duale MMP-9/12-Inhibitoren beschrieben.

Vor dem Hintergrund der oben beschriebenen Aufgabe zeigte es sich allerdings, dass diese MMP- Inhibitoren aus dem Stand der Technik oftmals Nachteile aufweisen, wie insbesondere eine unzu- reichende inhibitorische Potenz gegenüber MMP-12, eine ungenügende Selektivität für MMP-12 im Vergleich zu anderen MMPs und/oder eine eingeschränkte metabolische Stabilität.

Weitere Arylalkancarbonsäure-Derivate werden in WO 2004/092146-A2, WO 2004/099168-A2, WO 2004/099170- A2, WO 2004/099171-A2, WO 2006/050097-A1 und WO 2006/055625- A2 als Inhibitoren der Protein-Tyrosin-Phosphatase 1B (PTP-1B) zur Behandlung von Diabetes, Krebserkrankungen und neurodegenerativen Erkrankungen beschrieben.

Es wurde nun überraschenderweise gefunden, dass bestimmte 2,5-disubstituierte Cyclopentan- carbonsäure-Derivate ein signifikant verbessertes Profil bezüglich ihrer Wirkstärke und Selektivi- tät gegenüber der humanen Makrophagen-Elastase (HME / hMMP-12) im Vergleich zu den aus dem Stand der Technik bekannten Verbindungen besitzen. Darüber hinaus zeigen die erfindungsgemäßen Verbindungen eine gute Löslichkeit in wässrigen Systemen und eine geringe unspezifische Bindung an Blutplasma-Bestandteile wie Albumin. Die erfindungsgemäßen Verbindungen weisen zudem eine niedrige in vziro-Clearance und eine gute metabolische Stabilität auf. Dieses Eigenschaftsprofil insgesamt lässt für die erfindungsgemäßen Verbindungen eine niedrige Dosier - barkeit und - als Folge der gezielteren Wirkungsweise - ein vermindertes Risiko des Auftretens von unerwünschten Nebenwirkungen in der Therapie erwarten.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen zeichnen sich außerdem durch eine signifikante inhibitorische Aktivität und Selektivität gegenüber den orthologen MMP-12-Peptidasen der Nagetiere aus, wie MMP-12 der Maus (auch als murine Makrophagen-Elastase, MME, bezeichnet) und MMP-12 der Ratte. Dies ermöglicht eine umfassendere präklinische Evaluierung der Substanzen in verschiedenen etablierten Tiermodellen der oben beschriebenen Erkrankungen.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind Verbindungen der allgemeinen Formel (I)

in welcher

A für -O- oder -S- steht, n für die Zahl 1 oder 2 steht und

R ¹ für Wasserstoff, Methyl, Fluormethyl, Difluormethyl oder Trifluormethyl steht, sowie ihre Salze, Solvate und Solvate der Salze. Erfindungsgemäße Verbindungen sind die Verbindungen der Formel (I) und deren Salze, Solvate und Solvate der Salze, die von Formel (I) umfassten Verbindungen der nachfolgend genannten Formeln und deren Salze, Solvate und Solvate der Salze sowie die von Formel (I) umfassten, nachfolgend als Ausführungsbeispiele genannten Verbindungen und deren Salze, Solvate und Solvate der Salze, soweit es sich bei den von Formel (I) umfassten, nachfolgend genannten Verbindungen nicht bereits um Salze, Solvate und Solvate der Salze handelt.

Als Salze sind im Rahmen der vorliegenden Erfindung physiologisch unbedenkliche Salze der erfindungsgemäßen Verbindungen bevorzugt. Umfasst sind auch Salze, die für pharmazeutische Anwendungen selbst nicht geeignet sind, jedoch beispielsweise für die Isolierung, Reinigung oder Lagerung der erfindungsgemäßen Verbindungen verwendet werden können.

Physiologisch unbedenkliche Salze der erfindungsgemäßen Verbindungen umfassen insbesondere die von üblichen Basen abgeleiteten Salze, wie beispielhaft und vorzugsweise Alkalimetallsalze (z.B. Natrium- und Kaliumsalze), Erdalkalisalze (z.B. Calcium- und Magnesiumsalze), Zinksalze sowie Ammoniumsalze abgeleitet von Ammoniak oder organischen Aminen mit 1 bis 16 C- Atomen, wie beispielhaft und vorzugsweise Ethylamin, Diethylamin, Triethylamin, /V,/V-Diisopro- pylethylamin, Monoethanolamin, Diethanolamin, Triethanolamin, Tromethamin, Dimethylamino- ethanol, Diethylaminoethanol, Cholin, Procain, Dicyclohexylamin, Dibenzylamin, /V-Mefhylmor- pholin, /V-Mefhylpiperidin, Arginin, Lysin und 1,2-Ethylendiamin.

Als Solvate werden im Rahmen der Erfindung solche Formen der erfindungsgemäßen Verbindun- gen bezeichnet, welche in festem oder flüssigem Zustand durch Koordination mit Lösungsmittelmolekülen einen Komplex bilden. Hydrate sind eine spezielle Form der Solvate, bei denen die Koordination mit Wasser erfolgt. Als Solvate sind im Rahmen der vorliegenden Erfindung Hydrate bevorzugt.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen können in Abhängigkeit von ihrer Struktur in unterschied- liehen stereoisomeren Formen existieren, d.h. in Gestalt von Konfigurationsisomeren oder gegebenenfalls auch als Konformationsisomere (Enantiomere und/oder Diastereomere, einschließlich solcher bei Atropisomeren). Die vorliegende Erfindung umfasst deshalb die Enantiomere und Diastereomere und ihre jeweiligen Mischungen. Aus solchen Mischungen von Enantiomeren und/ oder Diastereomeren lassen sich die stereoisomer einheitlichen Bestandteile in bekannter Weise isolieren; vorzugsweise werden hierfür chromatographische Verfahren verwendet, insbesondere die HPLC-Chromatographie an achiraler bzw. chiraler Phase.

Der Begriff "enantiomerenrein" wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung dahingehend verstanden, dass die betreffende Verbindung hinsichtlich der Absolutkonfiguration der chiralen Zentren in einem Enantiomerenüberschuss von mehr als 95%, bevorzugt von mehr als 98% vorliegt. Der Enantiomerenüberschuss (engl, enantiomeric excess, ee-Wert) wird hierbei durch Auswertung des Chromatogramms einer HPLC- Analyse an chiraler Phase nach der folgenden Formel berechnet:

Enantiomer 1 (Flächenprozent) — Enantiomer 2 (Flächenprozent)

ee = x 100%

Enantiomer 1 (Flächenprozent) + Enantiomer 2 (Flächenprozent) Sofern die erfindungsgemäßen Verbindungen in tautomeren Formen vorkommen können, umfasst die vorliegende Erfindung sämtliche tautomere Formen.

Die vorliegende Erfindung umfasst auch alle geeigneten isotopischen Varianten der erfindungsgemäßen Verbindungen. Unter einer isotopischen Variante einer erfindungsgemäßen Verbindung wird hierbei eine Verbindung verstanden, in welcher mindestens ein Atom innerhalb der erfin- dungsgemäßen Verbindung gegen ein anderes Atom der gleichen Ordnungszahl, jedoch mit einer anderen Atommasse als der gewöhnlich oder überwiegend in der Natur vorkommenden Atommasse ausgetauscht ist. Beispiele für Isotope, die in eine erfindungsgemäße Verbindung inkorporiert werden können, sind solche von Wasserstoff, Kohlenstoff, Stickstoff, Sauerstoff, Phosphor, Schwefel, Fluor, Chlor, Brom und Iod, wie Ή (Deuterium), Ή (Tritium), ¹³ C, ¹⁴ C, ¹⁵ N, ¹⁷ 0, ¹⁸ 0, ³² P, ³³ P, ³³ S, ³⁴ S, ³⁵ S, ³⁶ S, ¹⁸ F, ³⁶ C1, ⁸² Br, ¹²³ I, ¹²⁴ I, ¹²⁹ I und ¹³¹ I. Bestimmte isotopische Varianten einer erfindungsgemäßen Verbindung, wie insbesondere solche, bei denen ein oder mehrere radioaktive Isotope inkorporiert sind, können von Nutzen sein beispielsweise für die Untersuchung des Wirkmechanismus oder der Wirkstoff -Verteilung im Körper; aufgrund der vergleichsweise leichten Herstell- und Detektierbarkeit sind hierfür insbesondere mit ³ H- oder ¹⁴ C -Isotopen markierte Verbindungen geeignet. Darüber hinaus kann der Einbau von Isotopen, wie beispielsweise von Deuterium, zu bestimmten therapeutischen Vorteilen als Folge einer größeren metabolischen Stabilität der Verbindung führen, wie beispielsweise zu einer Verlängerung der Halbwertszeit im Körper oder zu einer Reduktion der erforderlichen Wirkdosis; solche Modifikationen der erfindungsgemäßen Verbindungen können daher gegebenenfalls auch eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung darstellen. Isotopische Varianten der erfindungsgemäßen Verbindungen können nach allgemein gebräuchlichen, dem Fachmann bekannten Verfahren hergestellt werden, so beispielsweise nach den weiter unten beschriebenen Methoden und den bei den Ausführungsbeispielen wiedergegebenen Vorschriften, indem hierbei entsprechende isotopische Modifikationen der jeweiligen Reagentien und/oder Ausgangsverbindungen eingesetzt werden. Außerdem umfasst die vorliegende Erfindung auch Prodrugs der erfindungsgemäßen Verbindungen. Der Begriff "Prodrugs" bezeichnet hierbei Verbindungen, welche selbst biologisch aktiv oder inaktiv sein können, jedoch während ihrer Verweilzeit im Körper auf beispielsweise metabolischem oder hydrolytischem Wege zu erfindungsgemäßen Verbindungen umgesetzt werden. Insbesondere umfasst die vorliegende Erfindung als Prodrugs hydrolysierbare Ester-Derivate der erfindungsgemäßen Carbonsäuren der Formel (I). Hierunter werden Ester verstanden, die in physiologischen Medien, unter den Bedingungen der im weiteren beschriebenen biologischen Tests und insbesondere in vivo auf enzymatischem oder chemischem Wege zu den freien Carbonsäuren, als den biologisch hauptsächlich aktiven Verbindungen, hydrolysiert werden können. Als solche Ester werden (Ci-C -Alkylester, in welchen die Alkylgruppe geradkettig oder verzweigt sein kann, bevorzugt. Besonders bevorzugt sind Methyl-, Ethyl- oder ieri.-Butylester.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung gilt, dass für alle Reste, die mehrfach auftreten, deren Bedeutung unabhängig voneinander ist. Wenn Reste in den erfindungsgemäßen Verbindungen sub- stituiert sind, können die Reste, soweit nicht anders spezifiziert, ein- oder mehrfach substituiert sein. Eine Substitution mit einem oder mit zwei gleichen oder verschiedenen Substituenten ist bevorzugt. Besonders bevorzugt ist die Substitution mit einem Substituenten.

Bevorzugt im Rahmen der vorliegenden Erfindung sind Verbindungen der Formel (I), in welcher

A für -O- steht, n für die Zahl 1 oder 2 steht und

R ¹ für Wasserstoff, Methyl oder Trifluormethyl steht, sowie ihre Salze, Solvate und Solvate der Salze.

Besonders bevorzugt im Rahmen der vorliegenden Erfindung sind Verbindungen der Formel (I), in welcher

A für -O- steht, n für die Zahl 2 steht und

R ¹ für Wasserstoff, Methyl oder Trifluormethyl steht, sowie ihre Salze, Solvate und Solvate der Salze.

Von besonderer Bedeutung im Rahmen der vorliegenden Erfindung sind Verbindungen der Formeln (I-A) und (I-B)

worin A, n und R ¹ die oben definierten Bedeutungen haben und die an den zentralen Cyclopentan- Ring gebundenen Gruppen eine relative irans-Anordnung zueinander aufweisen, sowie Gemische dieser Verbindungen, wobei A, n bzw. R ¹ in einem solchen Gemisch von (I-A) und (I-B) jeweils identisch sind, und die Salze, Solvate und Solvate der Salze dieser Verbindungen und ihrer Gemische. Bevorzugt im Rahmen der vorliegenden Erfindung sind die Verbindungen der Formel (I-A)

worin A, n und R ¹ die oben definierten Bedeutungen haben, in enantiomerenreiner Form mit einer, wie bezeichnet, (lS,2R,5S)-Konfiguration am zentralen Cyclopentan-Ring sowie die Salze, Solvate und Solvate der Salze dieser Verbindungen.

Die in den jeweiligen Kombinationen bzw. bevorzugten Kombinationen von Resten im einzelnen angegebenen Reste-Definitionen werden unabhängig von den jeweiligen angegebenen Kombinationen der Reste beliebig auch durch Reste-Definitionen anderer Kombinationen ersetzt.

Ganz besonders bevorzugt sind Kombinationen von zwei oder mehreren der oben genannten Vorzugsbereiche. Weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen, dadurch gekennzeichnet, dass man eine Verbindung der Formel (II)

in welcher A und R ¹ die oben angegebenen Bedeutungen haben,

Gegenwart einer Base mit einer Verbindung der Formel (ΠΙ) in welcher n die oben angegebene Bedeutung hat und

X für eine Abgangsgruppe wie beispielsweise Chlor, Brom, lod, Mesylat, Triflat oder Tosylat steht, zu einer Verbindung der Formel (IV)

in welcher n, A und R ¹ die oben angegebenen Bedeutungen haben, alkyliert und anschließend die 2-(Trimethylsilyl)ethyl-Estergruppe mit Hilfe einer Säure oder eines Fluorid-Reagenzes zur Carbonsäure der Formel (I)

in welcher n, A und R ¹ die oben angegebenen Bedeutungen haben, abspaltet und gegebenenfalls die so erhaltenen Verbindungen der Formel (I) in ihre Enantiomere und/oder Diastereomere trennt und/oder mit den entsprechenden (i) Lösungsmitteln und/oder (ii) Basen in ihre Solvate, Salze und/oder Solvate der Salze überführt.

Als Base für die Alkylierungsreaktion (II) + (ΠΙ)— (IV) sind insbesondere geeignet Alkalicarbo- nate wie Lithium-, Natrium-, Kalium- oder Cäsiumcarbonat, Alkali-Alkoholate wie Natrium- oder Kaliummethanolat, Natrium- oder Kaliumethanolat oder Natrium- oder Kalium-ieri.-butylat, Alkalihydride wie Natrium- oder Kaliumhydrid, Amid-Basen wie Lithiumdiisopropylamid oder Lithium-, Natrium- oder Kalium-bis(trimethylsilyl)amid, oder übliche metallorganische Basen wie Phenyllithium oder n-, sec- oder ieri.-Butyllithium. Bevorzugt wird Kaliumcarbonat oder Kalium- ieri.-butylat eingesetzt. Als inertes Lösungsmittel für diese Reaktion eignen sich beispielsweise Ether wie Diethylether, Diisopropylether, Methyl-ieri.-butylether, Tetrahydrofuran, 1,4-Dioxan, 1,2-Dimethoxyethan oder Bis(2-methoxyethyl)ether, Kohlenwasserstoffe wie Benzol, Toluol, Xylol, Pentan, Hexan oder Cyclohexan, oder dipolar-aprotische Lösungsmittel wie Acetonitril, Butyronitril, N,N-Dimethyl- formamid (DMF), Ν,Ν-Dimefhylacetamid (DMA), Ν,Ν'-Dimefhylpropylenharnstoff (DMPU), /V-Methylpyrrolidinon (NMP) oder Dimethylsulfoxid (DMSO). Auch Gemische solcher Lösungsmittel können eingesetzt werden. Bevorzugt wird Acetonitril oder -Dimefhylformamid (DMF) verwendet.

Die Umsetzung (II) + (ΠΙ)— (IV) wird im Allgemeinen, je nach Reaktivität der beteiligten Komponenten, in einem Temperaturbereich von 0°C bis +120°C durchgeführt. Die Abspaltung der 2-(Trimethylsilyl)ethyl-Estergruppierung im Verfahrensschritt (IV)— (I) erfolgt nach üblichen Methoden mit Hilfe einer starken Säure, wie insbesondere Trifluoressigsäure, in einem inerten Lösungsmittel wie Dichlormethan oder mit Hilfe eines Fluorids, wie insbesondere Tetrabutylammoniumfluorid (TBAF), in einem etherischen Lösungsmittel wie Tetrahydrofuran. Die Esterspaltung wird in der Regel in einem Temperaturbereich von -20°C bis +30°C durchgeführt.

Die Verbindungen der Formel (Π) können im Fall, dass A für -O- steht, dadurch hergestellt werden, dass man eine Verbindung der Formel (V)

in welcher

PG für eine temporäre Schutzgruppe wie beispielsweise Benzyl steht, in Gegenwart eines Alkyl- oder Arylphosphans und eines Azodicarboxylats mit einem Triazin- 4(3//)-on-Derivat der Formel (VI)

in welcher R ¹ die oben angegebene Bedeutung hat, zu einer Verbindung der Formel (VII)

(VII), in welcher PG und R ¹ die oben angegebenen Bedeutungen haben, umsetzt und anschließend die Schutzgruppe PG unter Erhalt der Verbindung der Formel (II-A)

in welcher R ¹ die oben angegebene Bedeutung hat, abspaltet.

Die Umsetzung (V) + (VI)— (VII) wird unter den üblichen Bedingungen einer "Mitsunobu-Reak- tion" in Gegenwart eines Phosphins und eines Azodicarboxylats durchgeführt [siehe z.B. D. L. Hughes, Org. Reactions 42, 335 (1992); D. L. Hughes, Org. Prep. Proced. Int. 28 (2), 127 (1996)] . Als Phosphin-Komponente eignet sich beispielsweise Triphenylphosphin, Tri-n-butylphosphin, l,2-Bis(diphenylphosphino)ethan (DPPE), Diphenyl(2-pyridyl)phosphin, (4-Dimethylamino- phenyl)diphenylphosphin oder Tris(4-dimethylaminophenyl)phosphin. Als Azodicarboxylat kann beispielsweise Diethylazodicarboxylat (DEAD), Diisopropylazodicarboxylat (DIAD), Oi-tert.- butylazodicarboxylat, /V,/V,/VW-Tetramethylazodicarboxamid (TMAD), l,l'-(Azodicarbonyl)di- piperidin (ADDP) oder 4,7-Dimethyl-3,5,7-hexahydro-l,2,4,7-tetrazocin-3,8-dion (DHTD) eingesetzt werden. Bevorzugt wird hier Tri-n-butylphosphin in Verbindung mit Diethylazodicarboxylat (DEAD) verwendet.

Inerte Lösungsmittel für diese Reaktion sind beispielsweise Ether wie Diethylether, Diisopropyl- ether, Methyl- tert. -b ty lether, Tetrahydrofuran, 1,4-Dioxan, 1,2-Dimethoxyethan oder Bis(2-meth- oxyethyl)ether, Kohlenwasserstoffe wie Benzol, Toluol, Xylol, Pentan, Hexan oder Cyclohexan, oder polar-aprotische Lösungsmittel wie Acetonitril, Butyronitril, Dimethylsulfoxid (DMSO), N,N-Dimethylformamid (DMF), N,N-Dimefhylacetamid (DMA), N,N'-Dimefhylpropylenharnstoff (DMPU) oder /V-Methylpyrrolidinon (NMP). Auch können Gemische solcher Lösungsmittel verwendet werden. Bevorzugt wird Tetrahydrofuran, Toluol oder ein Gemisch dieser beiden eingesetzt. Die Umsetzung (V) + (VI)— > (VII) erfolgt in der Regel in einem Temperaturbereich von -20°C bis +60°C, bevorzugt bei 0°C bis +40°C. Gegebenenfalls kann die Verwendung einer Mikrowellenapparatur bei dieser Reaktion von Vorteil sein.

Die Abspaltung von Benzyl als temporärer Schutzgruppe PG im Verfahrensschritt (VII)— (II-A) erfolgt auf übliche Weise durch Hydrierung mit gasförmigem Wasserstoff oder, im Sinne einer Transfer-Hydrierung, mit Hilfe eines Wasserstoff-Donators wie Ammoniumformiat, Cyclohexen oder Cyclohexadien, jeweils in Gegenwart eines geeigneten Hydrierkatalysators wie insbesondere Palladium auf Aktivkohle. Die Reaktion wird vorzugsweise in einem alkoholischen Lösungsmittel wie Methanol oder Ethanol, in Ethylacetat oder Tetrahydrofuran oder in einem Gemisch solcher Lösungsmittel, gegebenenfalls unter Zusatz von Wasser, in einem Temperaturbereich von +20°C bis +80°C durchgeführt [zu möglichen alternativen Schutzgruppen sowie zur Einführung und Entfernung solcher Schutzgruppen siehe auch: T.W. Greene und P.G.M. Wuts, Protective Croups in Organic Synthesis, Wiley, New York, 1999].

Verbindungen der Formel (Π), worin A für -S- steht, können hergestellt werden, indem man die oben beschriebene Verbindung der Formel (Π-Α) in das korrespondierende Trifluormethansulfonat der Formel (VIII)

in welcher R ¹ die oben angegebene Bedeutung hat, überführt und dieses dann in Gegenwart eines geeigneten Palladium-Katalysators mit einem Tri- alkylsilanthiol, beispielsweise Triisopropylsilanthiol, zur Verbindung der Formel (Π-Β) in welcher R ¹ die oben angegebene Bedeutung hat, umsetzt.

Die Herstellung des Trifluormethansulfonats (VIII) ausgehend vom Phenol (II-A) erfolgt auf üb- liehe Weise durch Umsetzung mit Trifluormethansulfonsäureanhydrid in Gegenwart einer Amin- Base wie beispielsweise /V-Diisopropylethylamin oder Pyridin. Als inertes Lösungsmittel werden im Allgemeinen chlorierte Kohlenwasserstoffe wie Dichlormethan oder Chloroform verwendet, und die Reaktion wird in der Regel in einem Temperaturbereich von -20°C bis +25 °C durchgeführt. Die weitere Überführung des Trifluormethansulfonats (VIII) in das Thiophenol (Π-Β) erfolgt durch Palladium-katalysierte Umsetzung mit einem Trialkylsilanthiol wie beispielsweise Triisopropyl- silanthiol. Als Katalysator geeignet sind zum Beispiel Palladium(II)acetat, Palladium(II)chlorid, Bis(triphenylphosphin)palladium(II)chlorid, Bis(acetonitril)palladium(II)chlorid, Tetrakis(tri- phenylphosphin)palladium(O), Bis(dibenzylidenaceton)palladium(0), Tris(dibenzylidenaceton)- dipalladium(O) oder [l,l'-Bis(diphenylphosphino)ferrocen]palladium(II)chlorid, jeweils in Kombination mit einem Phosphin-Liganden wie beispielsweise 2-Dicyclohexylphosphino-2',4',6'-triiso- propylbiphenyl (X-Phos), 2-Dicyclohexylphosphino-2',6'-dimethoxybiphenyl (S-Phos), 1,2,3,4,5- Pentaphenyl- 1 '-(di-tert. -butylphosphino)ferrocen (Q-Phos), 4,5-Bis(diphenylphosphino)-9,9-di- methylxanthen (Xantphos), 2,2'-Bis(diphenylphosphino)-l,l'-binaphthyl (BINAP), 2-Dicyclo- hexylphosphino-2'-(A',/V-dimethylamino)biphenyl oder 2-Di-ieri.-butylphosphino-2'-(/V,/V-dimethyl- amino)biphenyl.

Die Reaktion wird in der Regel in Gegenwart einer Base durchgeführt. Als solche eignen sich Alkalicarbonate wie Natrium-, Kalium- oder Cäsiumcarbonat, Alkaliphosphate wie Natrium- oder Kaliumphosphat, Alkalifluoride wie Kalium- oder Cäsiumfluorid, Alkali-ieri.-butylate wie Natrium- oder Kalium-ieri.-butylat, tertiäre Amin-Basen wie Triethylamin, -Mefhylmorpholin, /V-Methylpiperidin, -Diisopropylefhylamin, Pyridin oder 4-A ⁱ ,/V-Dimethylaminopyridin, oder Amid-Basen wie Lithium-, Natrium- oder Kalium-bis(trimethylsilyl)amid. Die Umsetzung erfolgt in einem inerten Lösungsmittel wie beispielsweise Toluol, Xylol, 1,2-Dimethoxyethan, Tetra- hydrofuran, 1,4-Dioxan, Acetonitril, Dimethylsulfoxid (DMSO), N,N-Dimethylformamid (DMF) oder /V,/V-Dimethylacetamid (DMA) oder Mischungen hiervon in einem Temperaturbereich von +50°C bis +150°C, wobei die Verwendung einer Mikrowellenapparatur von Vorteil sein kann.

Bevorzugt wird für die Transformation (VIII)— (II-B) ein Katalysator/Ligand/Base-System bestehend aus Tris(dibenzylidenaceton)dipalladium(0), 4,5-Bis(diphenylphosphino)-9,9-dimethyl- xanthen (Xantphos) und -Diisopropylefhylamin eingesetzt sowie 1,4-Dioxan als Lösungsmittel verwendet. Das bei dieser Umsetzung zunächst entstehende Trialkylsilylsulfid wird unter den hier verwendeten Bedingungen einer wässrigen Reaktionsaufarbeitung und chromatographischen Produktreinigung wieder gespalten, so dass direkt das freie Thiophenol (Π-Β) erhalten wird [vgl. auch M. Kreis und S. Brase, Adv. Synth. Catal. 347 (2-3), 313-319 (2005); M. S. Chambers et al, Int. Pat. Appl. WO 2006/059149-A1, Seite 9; C.-K. Pei und M. Shi, Tetrahedron: Asymmetry 22 (11), 1239-1248 (2011)].

Die zuvor beschriebenen einzelnen Verfahrensschritte können bei normalem, bei erhöhtem oder bei erniedrigtem Druck durchgeführt werden (z.B. im Bereich von 0.5 bis 5 bar); im Allgemeinen arbeitet man jeweils bei Normaldruck.

Die Verbindungen der Formel (V) ihrerseits können in Anlehnung an publizierte Syntheseverfah- ren auf verschiedenen Wegen ausgehend von Verbindungen der Formel (IX) oder (X)

(IX) (X),

in welchen PG die oben angegebene Bedeutung hat und Hai für ein Halogenatom steht, erhalten werden [siehe z.B. die in WO 96/15096-A1, Seite 26-44, beschriebenen allgemeinen prä- parativen Methoden, insbesondere die Methoden A, G, H und K] .

Verbindungen der Formel (V) im Besonderen, welche eine relative trans -Anordnung der an den zentralen Cyclopentan-Ring gebundenen Gruppen aufweisen, d.h. Verbindungen der Formeln

(V-A) und (V-B)

(V-A) (V-B), in welchen PG die oben angegebene Bedeutung hat, können in Analogie zu publizierten Syntheseverfahren beispielsweise dadurch hergestellt werden, dass man e o-2-(Trimefhylsilyl)efhyl 2-oxobicyclo[2.2.1]heptan-7-carboxylat der Formel (XI)

mit einer Phenyl-Grignard- Verbindung der Formel (XII)

in welcher PG und Hai die oben angegebenen Bedeutungen haben, zum Addukt der Formel (XIII)

in welcher PG die oben angegebene Bedeutung hat, umsetzt, nachfolgend die tertiäre Hydroxygruppe über das korrespondierende Mesylat zum Olefin der Formel (XIV)

in welcher PG die oben angegebene Bedeutung hat, eliminiert, dieses dann mit -Methylmorpholin- -oxid zusammen mit Osmiumtetroxid als Katalysator zum 1,2-Diol der Formel (XV)

pQ (XV), in welcher PG die oben angegebene Bedeutung hat, oxidiert, anschließend dieses bicyclische Diol mit Hilfe von Bleitetraacetat oder Natriumperiodat zum 2-Formyl-5-Keto-Cyclopentancarbonsäureester der Formel (XVI)

in welcher PG die oben angegebene Bedeutung hat, spaltet und schließlich mit Natriumborhydrid zur Hydroxymethyl- Verbindung der Formel (V-A) in welcher PG die oben angegebene Bedeutung hat, reduziert [vgl. WO 96/15096-A1, präparative Methode K (Seite 42-44)] .

Bei der zuvor beschriebenen Synthesesequenz (XI) + (XII) -> (ΧΙΠ) -> (XIV) -> (XV) -> (XVI) — (V-A) wurde zur vereinfachten Darstellung der relativen Konfiguration der chiralen Zentren jeweils nur die Strukturformel eines Enantiomers wiedergegeben, auch wenn die betreffenden Verbindungen in racemischer Form eingesetzt bzw. erhalten wurden; tatsächliches Endprodukt eines solcherart in racemischer Form durchgeführten Herstellverfahrens ist das racemische Gemisch der Verbindungen (V-A) und (V-B). Die l,2,3-Triazin-4(3//)-on-Derivate der Formel (VI) sind auf einfache Weise durch Behandlung von oriÄo-Aminobenzamiden der Formel (XVII)

in welcher R ¹ die oben angegebene Bedeutung hat, mit Natriumnitrit in wässriger Salzsäure zugänglich [siehe z.B. D. Fernandez-Forner et ah , Tetra- hedron 47 (42), 8917-8930 (1991)] .

Die Auftrennung von Stereoisomeren (Enantio- und/oder Diastereomeren) der erfindungsgemäßen Verbindungen der Formel (I) läßt sich nach üblichen, dem Fachmann geläufigen Methoden erreichen. Vorzugsweise werden hierfür chromatographische Verfahren an achiralen bzw. chiralen Trennphasen angewandt. Alternativ kann auch eine Trennung über diastereomere Salze der Car- bonsäuren der Formel (I) mit chiralen Amin-Basen erfolgen. Eine Trennung der erfindungsgemäßen Verbindungen in die entsprechenden Enantiomere und/ oder Diastereomere kann gegebenenfalls, je nach Zweckmäßigkeit, auch bereits auf der Stufe der Intermediate (Π), (IV), (V), (VII), (II-A), (Π-Β) oder (V-A)/(V-B) erfolgen, welche dann in separierter Form gemäß der zuvor beschriebenen Reaktionssequenz weiter umgesetzt werden. Für eine solche Auftrennung der Stereoisomere von Intermediaten werden gleichfalls bevorzugt chromatographische Verfahren an achiralen bzw. chiralen Trennphasen angewandt.

Die Verbindungen der Formeln (ΙΠ), (IX), (X), (XI), (ΧΠ) und (XVII) sind entweder kommerziell erhältlich oder als solche in der Literatur beschrieben, oder sie können, ausgehend von anderen kommerziell erhältlichen Verbindungen, nach dem Fachmann geläufigen, literaturbekannten Me- thoden hergestellt werden. Zahlreiche detaillierte Vorschriften und weitere Literaturangaben befinden sich auch im Experimentellen Teil im Abschnitt zur Herstellung der Ausgangsverbindungen und Intermediate.

Die Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen kann durch die folgenden Reaktionsschemata beispielhaft veranschaulicht werden:

Schema 1

(als racemisches Gemisch) Schema 2

Die erfindungsgemäßen Verbindungen besitzen wertvolle pharmakologische Eigenschaften und können zur Vorbeugung und Behandlung von Erkrankungen bei Menschen und Tieren verwendet werden. Die erfindungsgemäßen Verbindungen stellen potente, nicht-reaktive und selektive Inhibitoren der humanen Makrophagen-Elastase (HME / hMMP-12) dar, die ein signifikant verbessertes Profil bezüglich der Wirkstärke und Selektivität im Vergleich zu den aus dem Stand der Technik bekannten Verbindungen besitzen. Darüber hinaus zeigen die erfindungsgemäßen Verbindungen eine gute Löslichkeit in wässrigen Systemen und eine geringe unspezifische Bindung an Blutplasma- Bestandteile wie Albumin. Die erfindungsgemäßen Verbindungen weisen zudem eine niedrige in vziro-Clearance und eine gute metabolische Stabilität auf. Dieses Eigenschaftsprofil insgesamt lässt für die erfindungsgemäßen Verbindungen eine niedrige Dosierbarkeit und - als Folge der gezielteren Wirkungsweise - ein vermindertes Risiko des Auftretens von unerwünschten Neben- Wirkungen in der Therapie erwarten.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen eignen sich daher in besonderem Maße zur Behandlung und/oder Prävention von Erkrankungen und pathologischen Prozessen, insbesondere solcher, bei denen im Zuge eines infektiösen oder nicht-infektiösen Entzündungsgeschehens und/oder eines Gewebe- oder Gefäßumbaus die Makrophagen-Elastase (HME / hMMP-12) involviert ist. Dazu zählen im Sinne der vorliegenden Erfindung insbesondere Erkrankungen der Atemwege und der Lunge, wie die chronisch-obstruktive Lungenerkrankung (COPD), Asthma und die Gruppe der interstitiellen Lungenerkrankungen (ILD), sowie Erkrankungen des Herz-Kreislauf-Systems, wie die Arteriosklerose und Aneurysmen.

Zu den Ausprägungen der chronisch-obstruktiven Lungenerkrankung (COPD) gehören insbeson- dere das Lungenemphysem, z.B. das durch Zigarettenrauch induzierte Lungenemphysem, die chronische Bronchitis (CB), die pulmonale Hypertension in der COPD (PH-COPD), Bronchiektasie (BE) und Kombinationen hiervon, insbesondere in akut exazerbierenden Stadien der Erkrankung (AE-COPD).

Zu den Ausprägungen von Asthma gehören asthmatische Erkrankungen unterschiedlicher Schwe- regrade mit intermittierendem oder persistierendem Verlauf, wie refraktäres Asthma, bronchiales Asthma, allergisches Asthma, intrinsisches Asthma, extrinsisches Asthma und durch Medikamente oder Staub induziertes Asthma.

Zu der Gruppe der interstitiellen Lungenerkrankungen (ILD) gehören die idiopathische pulmonale Fibrose (IPF), die Lungensarkoidose und die akute interstitielle Pneumonie, nicht-spezifische interstitielle Pneumonien, lymphoide interstitielle Pneumonien, respiratorische Bronchiolitis mit interstitieller Lungenerkrankung, kryptogene organisierende Pneumonien, desquamative interstitielle Pneumonien und nicht-klassifizierbare idiopathische interstitielle Pneumonien, ferner granulo- matöse interstitielle Lungenerkrankungen, interstitielle Lungenerkrankungen bekannter Ursache und andere interstitielle Lungenerkrankungen unbekannter Ursache.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen können auch zur Behandlung und/oder Prävention von weiteren Erkrankungen der Atemwege und der Lunge verwendet werden, wie z.B. der pulmonalen arteriellen Hypertonie (PAH) und anderer Formen der pulmonalen Hypertonie (PH), des Bronchiolitis obliterans-Syndroms (BOS), des akuten Atemwegssyndroms (ARDS), der akuten Lungenschädigung (ALI), der alpha- 1-Antitrypsin-Defizienz (AATD) und der zystischen Fibrose (CF), von verschiedenen Formen der Bronchitis (chronische Bronchitis, infektiöse Bronchitis, eosinophile Bronchitis), von Bronchiektasie, Pneumonie, Farmerlunge und verwandten Krankheiten, infektiös und nicht-infektiös bedingten Husten- und Erkältungskrankheiten (chronischer entzündlicher Husten, iatrogener Husten), Nasenschleimhautentzündungen (einschließlich medikamentöse Rhinitis, vasomotorische Rhinitis und jahreszeitabhängige, allergische Rhinitis, z.B. Heuschnupfen) und von Polypen.

Zu der Gruppe der Erkrankungen des Herz-Kreislauf-Systems gehören im Sinne der vorliegenden Erfindung insbesondere die Arteriosklerose und deren Folgeerkrankungen, wie z.B. Schlaganfall bei einer Arteriosklerose der Halsarterien (karotide Arteriosklerose), Herzinfarkt bei einer Arteriosklerose der Herzkranzgefäße, periphere arterielle Verschlusskrankheit (pAVK) in Folge einer Arteriosklerose der Beinarterien, sowie Aneurysmen, insbesondere Aneurysmen der Aorta, z.B. in Folge von Arteriosklerose, Bluthochdruck, Verletzungen und Entzündungen, Infektionen (z.B. bei rheumatischem Fieber, Syphilis, Lyme-Borreliose), angeborenen Bindegewebsschwächen (z.B. beim Marfan-Syndrom und Ehlers-Danlos-Syndrom) oder als Folge einer Volumenbelastung der Aorta bei angeborenen Herzfehlern mit Rechts-Links-Shunt oder einer Shunt-abhängigen Perfusion der Lungen, sowie Aneurysmen an Herzkranzgefäßen im Zuge einer Erkrankung am Kawa- saki-Syndrom und in Hirnarealen bei Patienten mit einer angeborenen Fehlbildung der Aorten- klappe.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen können darüber hinaus zur Behandlung und/oder Prävention weiterer kardiovaskulärer Erkrankungen eingesetzt werden, wie beispielsweise Bluthochdruck (Hypertonie), Herzinsuffizienz, koronare Herzerkrankung, stabile und instabile Angina pectoris, renale Hypertonie, periphere und kardiale Gefäßerkrankungen, Arrhythmien, Rhythmusstörungen der Vorhöfe und der Kammern sowie Überleitungsstörungen wie beispielsweise atrio-ventrikuläre Blockaden des Grades I-III, supraventrikuläre Tachyarrhythmie, Vorhofflimmern, Vorhofflattern, Kammerflimmern, Kammerflattern, ventrikuläre Tachyarrhythmie, Torsade de pointes-Tachykar- die, Extrasystolen des Vorhofs und des Ventrikels, AV-junktionale Extrasystolen, Sick-Sinus- Syndrom, Synkopen, AV-Knoten-Reentry-Tachykardie, Wolff-Parkinson-White-Syndrom, akutes Koronarsyndrom (ACS), autoimmune Herzerkrankungen (Perikarditis, Endokarditis, Valvolitis, Aortitis, Kardiomyopathien), Boxerkardiomyopathie, Schock wie kardiogener Schock, septischer Schock und anaphylaktischer Schock, ferner zur Behandlung und/oder Prävention von thrombo- embolischen Erkrankungen und Ischämien, wie myokardiale Ischämie, Herzhypertrophie, transito- rische und ischämische Attacken, Präeklampsie, entzündliche kardiovaskuläre Erkrankungen, Spasmen der Koronararterien und peripherer Arterien, Ödembildung wie beispielsweise pulmonales Ödem, Hirnödem, renales Ödem oder Herzinsuffizienz-bedingtes Ödem, periphere Durchblutungsstörungen, Reperfusionsschäden, arterielle und venöse Thrombosen, Mikroalbuminurie, Herzmuskelschwäche, endotheliale Dysfunktion, mikro- und makrovaskuläre Schädigungen (Vas- kulitis), sowie zur Verhinderung von Restenosen beispielsweise nach Thrombolyse-Therapien, percutan-transluminalen Angioplastien (PTA), percutan-transluminalen Koronarangioplastien (PTCA), Herztransplantationen und Bypass-Operationen.

Im Sinne der vorliegenden Erfindung umfasst der Begriff Herzinsuffizienz sowohl akute als auch chronische Erscheinungsformen der Herzinsuffizienz wie auch spezifische oder verwandte Krank- heitsformen hiervon, wie akute dekompensierte Herzinsuffizienz, Rechtsherzinsuffizienz, Linksherzinsuffizienz, Globalinsuffizienz, ischämische Kardiomyopathie, dilatative Kardiomyopathie, hypertrophe Kardiomyopathie, idiopathische Kardiomyopathie, angeborene Herzfehler, Herzklappenfehler, Herzinsuffizienz bei Herzklappenfehlern, Mitralklappenstenose, Mitralklappen- insuffizienz, Aortenklappenstenose, Aortenklappeninsuffizienz, Trikuspidalstenose, Trikuspidal- Insuffizienz, Pulmonalklappenstenose, Pulmonalklappeninsuffizienz, kombinierte Herzklappenfehler, Herzmuskelentzündung (Myokarditis), chronische Myokarditis, akute Myokarditis, virale Myokarditis, diabetische Herzinsuffizienz, alkoholtoxische Kardiomyopathie, kardiale Speichererkrankungen sowie diastolische und systolische Herzinsuffizienz.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen eignen sich außerdem zur Behandlung und/oder Prävention von Nierenerkrankungen, insbesondere von Niereninsuffizienz und Nierenversagen. Im Sinne der vorliegenden Erfindung umfassen die Begriffe Niereninsuffizienz und Nierenversagen sowohl akute als auch chronische Erscheinungsformen hiervon wie auch diesen zugrundeliegende oder verwandte Nierenerkrankungen, wie renale Hypoperfusion, intradialytische Hypotonie, obstruktive Uropathie, Glomerulopathien, Glomerulonephritis, akute Glomerulonephritis, Glomerulosklerose, tubulointerstitielle Erkrankungen, nephropathische Erkrankungen wie primäre und angeborene Nierenerkrankung, Nierenentzündung, immunologische Nierenerkrankungen wie Nierentransplantat-Abstoßung und das Alport-Syndrom, Immunkomplex-induzierte Nierenerkrankungen, durch toxische Substanzen induzierte Nephropathie, Kontrastmittel-induzierte Nephropathie, diabetische und nicht-diabetische Nephropathie, Pyelonephritis, Nierenzysten, Nephrosklerose, hypertensive Nephrosklerose und nephrotisches Syndrom, welche diagnostisch beispielsweise durch abnorm verminderte Kreatinin- und/oder Wasser-Ausscheidung, abnorm erhöhte Blutkonzentrationen von Harnstoff, Stickstoff, Kalium und/oder Kreatinin, veränderte Aktivität von Nierenenzymen wie z.B. Glutamylsynthetase, veränderte Urinosmolarität oder Urinmenge, erhöhte Mikroalbuminurie, Makroalbuminurie, Läsionen an Glomerula und Arteriolen, tubuläre Dilatation, Hyperphosphat- ämie und/oder die Notwendigkeit zur Dialyse charakterisiert werden können. Die vorliegende Erfindung umfasst auch die Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindungen zur Behandlung und/oder Prävention von Folgeerscheinungen einer Niereninsuffizienz, wie beispielsweise Hypertonie, Lungenödem, Herzinsuffizienz, Urämie, Anämie, Elektrolytstörungen (z.B. Hyperkalämie, Hyponaträmie) und Störungen im Knochen- und Kohlenhydrat-Metabolismus. Darüber hinaus sind die erfindungsgemäßen Verbindungen zur Behandlung und/oder Prävention von Erkrankungen des Urogenitalsystems geeignet, wie beispielsweise benignes Prostata-Syndrom (BPS), benigne Prostatahyperplasie (BPH), benigne Prostatavergrößerung (BPE), Blasenentleerungsstörungen (BOO), untere Harnwegssyndrome (LUTS), neurogene überaktive Blase (OAB), Inkontinenz wie beispielsweise Misch-, Drang-, Stress- oder Überlauf-Inkontinenz (MUI, UUI, SUI, OUI), Beckenschmerzen sowie erektile Dysfunktion und weibliche sexuelle Dysfunktion.

Zudem besitzen die erfindungsgemäßen Verbindungen anti-inflammatorische Wirkung und können daher als entzündungshemmende Mittel zur Behandlung und/oder Prävention von Sepsis (SIRS), multiplem Organversagen (MODS, MOF), entzündlichen Erkrankungen der Niere, chronischen Darmentzündungen (IBD, Morbus Crohn, Colitis ulcerosa), Pankreatitis, Peritonitis, Cystitis, Ure- thritis, Prostatitis, Epidimytitis, Oophoritis, Salpingitis, Vulvovaginitis, rheumatoiden Erkrankungen, entzündlichen Erkrankungen des Zentralnervensystems, multipler Sklerose, entzündlichen Hauterkrankungen und entzündlichen Augenerkrankungen eingesetzt werden.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind ferner zur Behandlung und/oder Prävention von fibro- tischen Erkrankungen der inneren Organe, wie beispielsweise der Lunge, des Herzens, der Niere, des Knochenmarks und insbesondere der Leber, sowie von dermatologischen Fibrosen und fibro- tischen Erkrankungen des Auges geeignet. Im Sinne der vorliegenden Erfindung umfasst der Begriff fibrotische Erkrankungen insbesondere solche Erkrankungen wie Leberfibrose, Leberzirrhose, Lungenfibrose, Endomyokardfibrose, Nephropathie, Glomerulonephritis, interstitielle Nieren- fibrose, fibrotische Schäden in Folge von Diabetes, Knochenmarksfibrose, Peritonealfibrose und ähnliche fibrotische Erkrankungen, Sklerodermie, Morphaea, Keloide, hypertrophe Narbenbildung, Naevi, diabetische Retinopathie, proliferative Vitroretinopathie und Erkrankungen des Bindegewebes (z.B. Sarkoidose). Die erfindungsgemäßen Verbindungen können ebenso verwendet werden zur Förderung der Wundheilung, zur Bekämpfung postoperativer Narbenbildung, z.B. nach Glaukom-Operationen, und zu kosmetischen Zwecken bei alternder oder verhornender Haut. Auch können die erfindungsgemäßen Verbindungen zur Behandlung und/oder Prävention von Anämien verwendet werden, wie hämolytischen Anämien, insbesondere Hämoglobinopathien wie Sichelzellanämie und Thalassämien, megaloblastären Anämien, Eisenmangel-Anämien, Anämien durch akuten Blutverlust, Verdrängungsanämien und aplastischen Anämien. Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind zudem zur Behandlung von Krebserkrankungen geeignet, wie beispielsweise von Hautkrebs, Hirntumoren, Brustkrebs, Knochenmarktumoren, Leukämien, Liposarcomen, Karzinomen des Magen-Darm- Traktes, der Leber, Bauchspeicheldrüse, Lunge, Niere, Harnleiter, Prostata und des Genitaltraktes sowie von bösartigen Tumoren des lymphoproliferativen Systems, wie z.B. Hodgkin's und Non-Hodgkin's Lymphom. Darüber hinaus können die erfindungsgemäßen Verbindungen eingesetzt werden zur Behandlung und/oder Prävention von Lipidstoffwechselstörungen und Dyslipidämien (Hypolipoproteinämie, Hypertriglyceridämie, Hyperlipidämie, kombinierte Hyperlipidämien, Hypercholesterolämie, Abetalipoproteinämie, Sitosterolämie), Xanthomatose, Tangier-Krankheit, Fettsucht (Adipositas), Fettleibigkeit (Obesitas), metabolischen Erkrankungen (Metabolisches Syndrom, Hyperglykämie, Insulin-abhängiger Diabetes, nicht-Insulin-abhängiger Diabetes, Gestationsdiabetes, Hyperinsulin- ämie, Insulinresistenz, Glukose-Intoleranz und diabetische Spätfolgen wie Retinopathie, Nephropathie und Neuropathie), von Erkrankungen des Gastrointestinaltrakts und des Abdomen (Glos- sitis, Gingivitis, Periodontitis, Oesophagitis, eosinophile Gastroenteritis, Mastocytose, Morbus Crohn, Colitis, Proctitis, Pruritis ani, Diarrhöe, Zöliakie, Hepatitis, Leberfibrose, Leberzirrhose, Pankreatitis und Cholecystitis), von Erkrankungen des Zentralen Nervensystems und von neuro- degenerativen Störungen (Schlaganfall, Alzheimer'sche Krankheit, Parkinson'sche Krankheit, Demenz, Epilepsie, Depressionen, Multiple Sklerose), Immunerkrankungen, Schilddrüsenerkrankungen (Hyperthyreose), Hauterkrankungen (Psoriasis, Akne, Ekzeme, Neurodermitis, vielfältige Formen der Dermatitis wie z.B. Dermatitis abacribus, Dermatitis actinica, Dermatitis allergica, Dermatitis ammoniacalis, Dermatitis artefacta, Dermatitis autogenica, Dermatitis atrophicans, Dermatitis calorica, Dermatitis combustionis, Dermatitis congelationis, Dermatitis cosmetica, Dermatitis escharotica, Dermatitis exfoliativa, Dermatitis gangraenose, Dermatitis haemostatica, Dermatitis herpetiformis, Dermatitis lichenoides, Dermatitis linearis, Dermatitis maligna, Dermatitis medimencatosa, Dermatitis palmaris et plantaris, Dermatitis parasitaria, Dermatitis photoallergica, Dermatitis phototoxica, Dermatitis pustularis, Dermatitis seborrhoica, Dermatitis solaris, Dermatitis toxica, Dermatitis ulcerosa, Dermatitis veneata, infektiöse Dermatitis, pyogene Dermatitis und Rosazea-artige Dermatitis, sowie Keratitis, Bullosis, Vasculitis, Cellulitis, Panniculitis, Lupus erythematodes, Erythema, Lymphome, Hautkrebs, Sweet-Syndrom, Weber-Christian-Syndrom, Narbenbildung, Warzenbildung, Frostbeulen), von entzündlichen Augenerkrankungen (Saccoidosis, Blepharitis, Conjunctivitis, Iritis, Uveitis, Chorioiditis, Ophthalmitis), viralen Erkrankungen (durch Influenza-, Adeno- und Coronaviren, wie z.B. HPV, HCMV, HIV, SARS), von Erkrankungen des Skelettknochens und der Gelenke sowie der Skelettmuskel (vielfältige Formen der Arthritis wie z.B. Arthritis alcaptonurica, Arthritis ankylosans, Arthritis dysenterica, Arthritis exsudativa, Arthritis fungosa, Arthritis gonorrhoica, Arthritis mutilans, Arthritis psoriatica, Arthritis purulenta, Arthritis rheumatica, Arthritis serosa, Arthritis syphilitica, Arthritis tuberculosa, Arthritis urica, Arthritis villonodularis pigmentosa, atypische Arthritis, hämophile Arthritis, juvenile chronische Arthritis, rheumatoide Arthritis und metastatische Arthritis, des weiteren das Still-Syndrom, Felty- Syndrom, Sjörgen-Syndrom, Clutton-Syndrom, Poncet-Syndrom, Pott-Syndrom und Reiter-Syn- drom, vielfältige Formen der Arthropathien wie z.B. Arthropathie deformans, Arthropathie neuro- pathica, Arthropathie ovaripriva, Arthropathie psoriatica und Arthropathie tabica, systemische Sklerosen, vielfältige Formen der entzündlichen Myopathien wie z.B. Myopathie epidemica, Myopathie fibrosa, Myopathie myoglobinurica, Myopathie ossificans, Myopathie ossificans neurotica, Myopathie ossificans progressiva multiplex, Myopathie purulenta, Myopathie rheumatica, Myopathie trichinosa, Myopathie tropica und Myopathie typhosa, sowie das Günther-Syndrom und das Münchmeyer-Syndrom), von entzündlichen Arterienveränderungen (vielfältige Formen der Arteri- tis wie z.B. Endarteritis, Mesarteritis, Periarteritis, Panarteritis, Arteritis rheumatica, Arteritis deformans, Arteritis temporalis, Arteritis cranialis, Arteritis gigantocellularis und Arteritis granulomatosa, sowie das Horton-Syndrom, Churg-Strauss-Syndrom und die Takayasu-Arteritis), des Mückle -Well-Syndroms, der Kikuchi-Krankheit, von Polychondritis, Sklerodermia sowie von wei- teren Erkrankungen mit einer entzündlichen oder immunologischen Komponente, wie beispielsweise Katarakt, Kachexie, Osteoporose, Gicht, Inkontinenz, Lepra, Sezary-Syndrom und paraneoplastisches Syndrom, bei Abstossungsreaktionen nach Organtransplantationen und zur Wundheilung und Angiogenese insbesondere bei chronischen Wunden.

Aufgrund ihres Eigenschaftsprofils eignen sich die erfindungsgemäßen Verbindungen insbeson- dere zur Behandlung und/oder Prävention von Erkrankungen der Atemwege und der Lunge, vor allem der chronisch-obstruktiven Lungenerkrankung (COPD), hier insbesondere des Lungenemphysems, der chronischen Bronchitis (CB), der pulmonalen Hypertension in der COPD (PH- COPD) und von Bronchiektasie (BE) sowie von Kombinationen dieser Krankheitsformen insbesondere in akut exazerbierenden Stadien der COPD-Erkrankung (AE-COPD), des weiteren von Asthma und von interstitiellen Lungenerkrankungen, hier insbesondere der idiopathischen Lungenfibrose (IPF) und der Lungensarkoidose, von Erkrankungen des Herz-Kreislauf-Systems, insbesondere von Arteriosklerose, speziell der karotiden Arteriosklerose, sowie viraler Myokarditis, Kardiomyopathie und Aneurysmen, einschließlich deren Folgeerkrankungen wie Schlaganfall, Myokardinfarkt und periphere arterielle Verschlusskrankheit (pAVK), sowie von chronischen Nieren- erkrankungen und dem Alport-Syndrom. Die zuvor genannten, gut charakterisierten Krankheiten des Menschen können mit vergleichbarer Ätiologie auch in anderen Säugetieren vorkommen und dort ebenfalls mit den Verbindungen der vorliegenden Erfindung behandelt werden.

Im Sinne der vorliegenden Erfindung umfasst der Begriff "Behandlung" oder "behandeln" ein Hemmen, Verzögern, Aufhalten, Lindern, Abschwächen, Einschränken, Verringern, Unterdrücken, Zurückdrängen oder Heilen einer Krankheit, eines Leidens, einer Erkrankung, einer Verletzung oder einer gesundheitlichen Störung, der Entfaltung, des Verlaufs oder des Fortschreitens solcher Zustände und/oder der Symptome solcher Zustände. Der Begriff "Therapie" wird hierbei als synonym mit dem Begriff "Behandlung" verstanden. Die Begriffe "Prävention", "Prophylaxe" oder "Vorbeugung" werden im Rahmen der vorliegenden Erfindung synonym verwendet und bezeichnen das Vermeiden oder Vermindern des Risikos, eine Krankheit, ein Leiden, eine Erkrankung, eine Verletzung oder eine gesundheitliche Störung, eine Entfaltung oder ein Fortschreiten solcher Zustände und/oder die Symptome solcher Zustände zu bekommen, zu erfahren, zu erleiden oder zu haben. Die Behandlung oder die Prävention einer Krankheit, eines Leidens, einer Erkrankung, einer Verletzung oder einer gesundheitlichen Störung können teilweise oder vollständig erfolgen.

Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindungen zur Behandlung und/oder Prävention von Erkrankungen, insbesondere der zuvor genannten Erkrankungen. Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindungen zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung und/oder Prävention von Erkrankungen, insbesondere der zuvor genannten Erkrankungen.

Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Arzneimittel, enthaltend mindestens eine der erfindungsgemäßen Verbindungen, zur Behandlung und/oder Prävention von Erkrankungen, insbesondere der zuvor genannten Erkrankungen.

Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindungen in einem Verfahren zur Behandlung und/oder Prävention von Erkrankungen, insbesondere der zuvor genannten Erkrankungen.

Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Behandlung und/oder Prä- vention von Erkrankungen, insbesondere der zuvor genannten Erkrankungen, unter Verwendung einer wirksamen Menge von mindestens einer der erfindungsgemäßen Verbindungen. Die erfindungsgemäßen Verbindungen können allein oder bei Bedarf in Kombination mit einer oder mehreren anderen pharmakologisch wirksamen Substanzen eingesetzt werden, solange diese Kombination nicht zu unerwünschten und inakzeptablen Nebenwirkungen führt. Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind daher Arzneimittel, enthaltend mindestens eine der erfin- dungsgemäßen Verbindungen und einen oder mehrere weitere Wirkstoffe, insbesondere zur Behandlung und/oder Prävention der zuvor genannten Erkrankungen. Als hierfür geeignete Kombinationswirkstoffe seien beispielhaft und vorzugsweise genannt:

• anti-obstruktiv / bronchodilatorisch wirkende Mittel, wie sie z.B. zur Therapie der chronischobstruktiven Lungenerkrankung (COPD) oder eines Asthma bronchiale eingesetzt werden, bei- spielhaft und vorzugsweise aus der Gruppe der inhalativ oder systemisch angewendeten beta- adrenergen Rezeptor-Agonisten (beta-Mimetika), der inhalativ angewendeten anti-muscariner- gen Substanzen und der PDE 4-Inhibitoren;

• organische Nitrate und NO-Donatoren, wie beispielsweise Natriumnitroprussid, Nitroglycerin, Isosorbidmononitrat, Isosorbiddinitrat, Molsidomin oder SIN-1, sowie inhalatives NO; · Verbindungen, die den Abbau von cyclischem Guanosinmonophosphat (cGMP) und/oder cyclischem Adenosinmonophosphat (cAMP) inhibieren, wie beispielsweise Inhibitoren der Phosphodiesterasen (PDE) 1, 2, 3, 4 und/oder 5, insbesondere PDE 4-Inhibitoren wie Roflumi- last und PDE 5-Inhibitoren wie Sildenafil, Vardenafil, Tadalafil, Udenafil, Dasantafil, Avanafil, Mirodenafil oder Lodenafil; · NO- und Häm-unabhängige Aktivatoren der löslichen Guanylatcyclase (sGC), wie insbesondere die in WO 01/19355, WO 01/19776, WO 01/19778, WO 01/19780, WO 02/070462 und WO 02/070510 beschriebenen Verbindungen;

• NO-unabhängige, jedoch Häm-abhängige Stimulatoren der löslichen Guanylatcyclase (sGC), wie insbesondere Riociguat sowie die in WO 00/06568, WO 00/06569, WO 02/42301, WO 03/095451, WO 2011/147809, WO 2012/004258, WO 2012/028647 und WO 2012/059549 beschriebenen Verbindungen;

• Verbindungen, die die humane neutrophile Elastase (HNE) inhibieren, wie insbesondere Sivele- stat, DX-890 (Reltran) sowie die in WO 2004/020410, WO 2004/020412, WO 2004/024700, WO 2004/024701, WO 2005/080372, WO 2005/082863, WO 2005/082864, WO 2009/080199, WO 2009/135599, WO 2010/078953 und WO 2010/115548 beschriebenen Verbindungen;

• Prostacyclin-Analoga und IP-Rezeptor-Agonisten, wie beispielhaft und vorzugsweise Iloprost, Beraprost, Treprostinil, Epoprostenol oder NS-304; Endothelin-Rezeptor-Antagonisten, wie beispielhaft und vorzugsweise Bosentan, Darusentan, Ambrisentan oder Sitaxsentan; entzündungshemmende, immunmodulierende, immunsuppressive und/oder zytotoxische Mittel, beispielhaft und vorzugsweise aus der Gruppe der systemisch oder inhalativ angewendeten Corticosteroide sowie Acetylcystein, Montelukast, Azathioprin, Cyclophosphamid, Hydroxy- carbamid, Azithromycin, IFN-γ, Pirfenidon oder Etanercept; antifibrotisch wirkende Mittel, wie beispielhaft und vorzugsweise Lysophosphatidsäure -Rezeptor 1 (LPA-l)-Antagonisten, Lysyloxidase (LOX) -Inhibitoren, Lysyloxidase-like-2-Inhibitoren, Vasoaktives intestinales Peptid (VIP), VIP-Analoga, a _v ß6-Integrin-Antagonisten, Cholchicin, IFN-ß, D-Penicillamin, Inhibitoren des WNT-Signalwegs oder CCR2 -Antagonisten; den Fettstoffwechsel verändernde Wirkstoffe, beispielhaft und vorzugsweise aus der Gruppe der Thyroidrezeptor-Agonisten, Cholesterinsynthese-Inhibitoren wie beispielhaft und vorzugsweise HMG-CoA-Reduktase- oder Squalensynthese -Inhibitoren, der ACAT-Inhibitoren, CETP- Inhibitoren, MTP-Inhibitoren, PPAR-alpha-, PPAR-gamma- und/oder PPAR-delta-Agonisten, Cholesterin-Absorptionshemmer, Lipase-Inhibitoren, polymeren Gallensäureadsorber, Gallensäure -Reabsorptionshemmer und Lipoprotein(a)-Antagonisten; den Blutdruck senkende Wirkstoffe, beispielhaft und vorzugsweise aus der Gruppe der Calcium-Antagonisten, Angiotensin AII-Antagonisten, ACE-Hemmer, Vasopeptidase-Inhibitoren, Endothelin-Antagonisten, Renin-Inhibitoren, alpha-Rezeptoren-Blocker, beta-Rezeptoren- Blocker, Mineralocorticoid-Rezeptor- Antagonisten sowie der Diuretika; die Signaltransduktionskaskade inhibierende Verbindungen, beispielhaft und vorzugsweise aus der Gruppe der Kinase-Inhibitoren, insbesondere aus der Gruppe der Tyrosinkinase- und/oder Serin/Threoninkinase-Inhibitoren, wie beispielhaft und vorzugsweise Nintedanib, Dasatinib, Nilotinib, Bosutinib, Regorafenib, Sorafenib, Sunitinib, Cediranib, Axitinib, Telatinib, Imati- nib, Brivanib, Pazopanib, Vatalanib, Gefitinib, Erlotinib, Lapatinib, Canertinib, Lestaurtinib, Pelitinib, Semaxanib oder Tandutinib;

Verbindungen, die die Bindung von Serotonin an dessen Rezeptor blockieren, beispielhaft und vorzugsweise Antagonisten des 5 -HT2B -Rezeptors wie PRX -08066; Antagonisten von Wachstumsfaktoren, Zytokinen und Chemokinen, beispielhaft und vorzugs- weise Antagonisten von TGF-ß, CTGF, IL-1, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-13 und Integrinen; • die Rho-Kinase inhibierende Verbindungen, wie beispielhaft und vorzugsweise Fasudil, Y-27632, SLx-2119, BF-66851, BF-66852, BF-66853, KI-23095 oder BA-1049;

• Verbindungen, die die lösliche Epoxidhydrolase (sEH) inhibieren, wie beispielsweise N,N'-Oi- cyclohexylharnstoff, 12-(3-Adamantan-l-yl-ureido)-dodecansäure oder l-Adamantan-l-yl-3-{5- [2-(2-ethoxyethoxy)ethoxy]pentyl } -harnstoff ;

• den Energiestoffwechsel des Herzens beeinflussende Verbindungen, wie beispielhaft und vorzugsweise Etomoxir, Dichloracetat, Ranolazin oder Trimetazidin;

• antithrombotisch wirkende Mittel, beispielhaft und vorzugsweise aus der Gruppe der Thrombozytenaggregationshemmer, der Antikoagulantien und der profibrinolytischen Substanzen;

• Chemotherapeutika, wie sie z.B. zur Therapie von Neubildungen (Neoplasien) der Lunge oder anderer Organe eingesetzt werden; und/oder

• Antibiotika, insbesondere aus der Gruppe der Fluorchinoloncarbonsäuren, wie beispielhaft und vorzugsweise Ciprofloxacin oder Moxifloxacin.

Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden die erfindungsgemäßen Verbindungen in Kombination mit einem beta-adrenergen Rezeptor-Agonisten, wie beispielhaft und vorzugsweise Albuterol, Isoproterenol, Metaproterenol, Terbutalin, Fenoterol, Formoterol, Repro- terol, Salbutamol oder Salmeterol, verabreicht.

Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden die erfindungsgemäßen Verbindungen in Kombination mit einer anti-muscarinergen Substanz, wie beispielhaft und vorzugsweise Ipratropiumbromid, Tiotropiumbromid oder Oxitropiumbromid, verabreicht.

Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden die erfindungsgemäßen Verbindungen in Kombination mit einem Corticosteroid, wie beispielhaft und vorzugsweise Prednison, Prednisolon, Methylprednisolon, Triamcinolon, Dexamethason, Beclomethason, Betamethason, Flunisolid, Budesonid oder Fluticason, verabreicht.

Unter antithrombotisch wirkenden Mittel werden vorzugsweise Verbindungen aus der Gruppe der Thrombozytenaggregationshemmer, der Antikoagulantien und der profibrinolytischen Substanzen verstanden.

Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden die erfindungsgemäßen Verbindungen in Kombination mit einem Thrombozytenaggregationshemmer, wie beispielhaft und vorzugsweise Aspirin, Clopidogrel, Ticlopidin oder Dipyridamol, verabreicht. Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden die erfindungsgemäßen Verbindungen in Kombination mit einem Thrombin-Inhibitor, wie beispielhaft und vorzugsweise Ximela- gatran, Melagatran, Dabigatran, Bivalirudin oder Clexane, verabreicht.

Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden die erfindungsgemäßen Verbin- düngen in Kombination mit einem GPIIb/nia-Antagonisten, wie beispielhaft und vorzugsweise Tirofiban oder Abciximab, verabreicht.

Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden die erfindungsgemäßen Verbindungen in Kombination mit einem Faktor Xa-Inhibitor, wie beispielhaft und vorzugsweise Riva- roxaban, Apixaban, Fidexaban, Razaxaban, Fondaparinux, Idraparinux, DU-176b, PMD-3112, YM-150, KFA-1982, EMD-503982, MCM-17, MLN-1021, DX 9065a, DPC 906, JTV 803, SSR- 126512 oder SSR-128428, verabreicht.

Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden die erfindungsgemäßen Verbindungen in Kombination mit Heparin oder einem low molecular weight (LMW)-Heparin-Derivat verabreicht. Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden die erfindungsgemäßen Verbindungen in Kombination mit einem Vitamin K-Antagonisten, wie beispielhaft und vorzugsweise Coumarin, verabreicht.

Unter den Blutdruck senkenden Mitteln werden vorzugsweise Verbindungen aus der Gruppe der Calcium-Antagonisten, Angiotensin AII-Antagonisten, ACE-Hemmer, Endothelin-Antagonisten, Renin-Inhibitoren, alpha-Rezeptoren-Blocker, beta-Rezeptoren-Blocker, Mineralocorticoid-Rezep- tor-Antagonisten sowie der Diuretika verstanden.

Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden die erfindungsgemäßen Verbindungen in Kombination mit einem Calcium- Antagonisten, wie beispielhaft und vorzugsweise Nifedipin, Amlodipin, Verapamil oder Diltiazem, verabreicht. Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden die erfindungsgemäßen Verbindungen in Kombination mit einem alpha- 1 -Rezeptoren-Blocker, wie beispielhaft und vorzugsweise Prazosin, verabreicht.

Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden die erfindungsgemäßen Verbindungen in Kombination mit einem beta-Rezeptoren-Blocker, wie beispielhaft und vorzugsweise Propranolol, Atenolol, Timolol, Pindolol, Alprenolol, Oxprenolol, Penbutolol, Bupranolol, Meti- pranolol, Nadolol, Mepindolol, Carazalol, Sotalol, Metoprolol, Betaxolol, Celiprolol, Bisoprolol, Carteolol, Esmolol, Labetalol, Carvedilol, Adaprolol, Landiolol, Nebivolol, Epanolol oder Bucin- dolol, verabreicht.

Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden die erfindungsgemäßen Verbindungen in Kombination mit einem Angiotensin AII-Antagonisten, wie beispielhaft und vorzugs- weise Losartan, Candesartan, Valsartan, Telmisartan oder Embursatan, verabreicht.

Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden die erfindungsgemäßen Verbindungen in Kombination mit einem ACE-Hemmer, wie beispielhaft und vorzugsweise Enalapril, Captopril, Lisinopril, Ramipril, Delapril, Fosinopril, Quinopril, Perindopril oder Trandopril, verabreicht. Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden die erfindungsgemäßen Verbindungen in Kombination mit einem Endothelin-Antagonisten, wie beispielhaft und vorzugsweise Bosentan, Darusentan, Ambrisentan oder Sitaxsentan, verabreicht.

Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden die erfindungsgemäßen Verbindungen in Kombination mit einem Renin-Inhibitor, wie beispielhaft und vorzugsweise Aliskiren, SPP-600 oder SPP-800, verabreicht.

Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden die erfindungsgemäßen Verbindungen in Kombination mit einem Mineralocorticoid-Rezeptor-Antagonisten, wie beispielhaft und vorzugsweise Spironolacton, Eplerenon oder Finerenon, verabreicht.

Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden die erfindungsgemäßen Verbin- düngen in Kombination mit einem Diuretikum, wie beispielhaft und vorzugsweise Furosemid, Bumetanid, Torsemid, Bendroflumethiazid, Chlorthiazid, Hydrochlorthiazid, Hydroflumethiazid, Methyclothiazid, Polythiazid, Trichlormethiazid, Chlorthalidon, Indapamid, Metolazon, Quineth- azon, Acetazolamid, Dichlorphenamid, Methazolamid, Glycerin, Isosorbid, Mannitol, Amilorid oder Triamteren, verabreicht. Unter den Fettstoffwechsel verändernden Mitteln werden vorzugsweise Verbindungen aus der Gruppe der CETP-Inhibitoren, Thyroidrezeptor-Agonisten, Cholesterinsynthese-Inhibitoren wie HMG-CoA-Reduktase- oder Squalensynthese-Inhibitoren, der ACAT-Inhibitoren, MTP-Inhibi- toren, PPAR-alpha-, PPAR-gamma- und/oder PPAR-delta-Agonisten, Cholesterin-Absorptions- hemmer, polymeren Gallensäureadsorber, Gallensäure-Reabsorptionshemmer, Lipase -Inhibitoren sowie der Lipoprotein(a) -Antagonisten verstanden. Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden die erfindungsgemäßen Verbindungen in Kombination mit einem CETP-Inhibitor, wie beispielhaft und vorzugsweise Torcetrapib (CP-529 414), JJT-705 oder CETP-vaccine (Avant), verabreicht.

Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden die erfindungsgemäßen Verbin- düngen in Kombination mit einem Thyroidrezeptor-Agonisten, wie beispielhaft und vorzugsweise D-Thyroxin, 3,5,3'-Triiodothyronin (T3), CGS 23425 oder Axitirome (CGS 26214), verabreicht.

Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden die erfindungsgemäßen Verbindungen in Kombination mit einem HMG-CoA-Reduktase-Inhibitor aus der Klasse der Statine, wie beispielhaft und vorzugsweise Lovastatin, Simvastatin, Pravastatin, Fluvastatin, Atorvastatin, Rosuvastatin oder Pitavastatin, verabreicht.

Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden die erfindungsgemäßen Verbindungen in Kombination mit einem Squalensynthese-Inhibitor, wie beispielhaft und vorzugsweise BMS-188494 oder TAK-475, verabreicht.

Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden die erfindungsgemäßen Verbin- düngen in Kombination mit einem ACAT-Inhibitor, wie beispielhaft und vorzugsweise Avasimibe, Melinamide, Pactimibe, Eflucimibe oder SMP-797, verabreicht.

Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden die erfindungsgemäßen Verbindungen in Kombination mit einem MTP-Inhibitor, wie beispielhaft und vorzugsweise Implitapide, BMS-201038, R-103757 oder JTT-130, verabreicht. Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden die erfindungsgemäßen Verbindungen in Kombination mit einem PPAR-gamma-Agonisten, wie beispielhaft und vorzugsweise Pioglitazone oder Rosiglitazone, verabreicht.

Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden die erfindungsgemäßen Verbindungen in Kombination mit einem PPAR-delta-Agonisten, wie beispielhaft und vorzugsweise GW 501516 oder BAY 68-5042, verabreicht.

Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden die erfindungsgemäßen Verbindungen in Kombination mit einem Cholesterin- Absorptionshemmer, wie beispielhaft und vorzugsweise Ezetimibe, Tiqueside oder Pamaqueside, verabreicht.

Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden die erfindungsgemäßen Verbin- düngen in Kombination mit einem Lipase-Inhibitor, wie beispielhaft und vorzugsweise Orlistat, verabreicht. Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden die erfindungsgemäßen Verbindungen in Kombination mit einem polymeren Gallensäureadsorber, wie beispielhaft und vorzugsweise Cholestyramin, Colestipol, Colesolvam, CholestaGel oder Colestimid, verabreicht.

Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden die erfindungsgemäßen Verbin- düngen in Kombination mit einem Gallensäure -Reabsorptionshemmer, wie beispielhaft und vorzugsweise ASBT (= IBAT)-Inhibitoren wie z.B. AZD-7806, S-8921, AK-105, BARI- 1741, SC-435 oder SC-635, verabreicht.

Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden die erfindungsgemäßen Verbindungen in Kombination mit einem Lipoprotein(a)-Antagonisten, wie beispielhaft und vorzugs- weise Gemcabene calcium (CI-1027) oder Nicotinsäure, verabreicht.

Besonders bevorzugt sind Kombinationen der erfindungsgemäßen Verbindungen mit einem oder mehreren weiteren Wirkstoffen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Corticosteroiden, beta- adrenergen Rezeptor- Agonisten, anti-muscarinergen Substanzen, PDE 4-Inhibitoren, PDE 5-Inhibi- toren, sGC-Aktivatoren, sGC-Stimulatoren, HNE-Inhibitoren, Prostacyclin-Analoga, Endothelin- Antagonisten, Statinen, antifibrotisch wirkenden Mitteln, entzündungshemmend wirkenden Mitteln, immunmodulierend wirkenden Mitteln, immunsuppressiv wirkenden Mitteln und zytotoxisch wirkenden Mitteln.

Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind Arzneimittel, die mindestens eine erfindungsgemäße Verbindung, üblicherweise zusammen mit einem oder mehreren inerten, nicht- toxischen, pharmazeutisch geeigneten Hilfsstoffen enthalten, sowie deren Verwendung zu den zuvor genannten Zwecken.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen können systemisch und/oder lokal wirken. Zu diesem Zweck können sie auf geeignete Weise appliziert werden, wie z.B. oral, parenteral, pulmonal, nasal, sublingual, lingual, buccal, rectal, dermal, transdermal, conjunctival, otisch oder als Implan- tat oder Stent.

Für diese Applikationswege können die erfindungsgemäßen Verbindungen in geeigneten Applikationsformen verabreicht werden.

Für die orale Applikation eignen sich nach dem Stand der Technik funktionierende, die erfindungsgemäßen Verbindungen schnell und/oder modifiziert abgebende Applikationsformen, die die erfindungsgemäßen Verbindungen in kristalliner und/oder amorphisierter und/oder gelöster Form enthalten, wie z.B. Tabletten (nicht-überzogene oder überzogene Tabletten, beispielsweise mit magensaftresistenten oder sich verzögert auflösenden oder unlöslichen Überzügen, die die Frei- setzung der erfindungsgemäßen Verbindung kontrollieren), in der Mundhöhle schnell zerfallende Tabletten oder Filme/Oblaten, Filme/Lyophilisate, Kapseln (beispielsweise Hart- oder Weichgelatinekapseln), Dragees, Granulate, Pellets, Pulver, Emulsionen, Suspensionen, Aerosole oder Lösungen. Die parenterale Applikation kann unter Umgehung eines Resorptionsschrittes geschehen (z.B. intravenös, intraarteriell, intrakardial, intraspinal oder intralumbal) oder unter Einschaltung einer Resorption (z.B. inhalativ, intramuskulär, subcutan, intracutan, percutan oder intraperitoneal). Für die parenterale Applikation eignen sich als Applikationsformen u.a. Injektions- und Infusionszubereitungen in Form von Lösungen, Suspensionen, Emulsionen, Lyophilisaten oder sterilen Pul- vern.

Für die sonstigen Applikationswege eignen sich z.B. Inhalationsarzneiformen (u.a. Pulverinhalatoren, Nebulizer, Dosieraerosole), Nasentropfen, -lösungen oder -sprays, lingual, sublingual oder buccal zu applizierende Tabletten, Filme/Oblaten oder Kapseln, Suppositorien, Ohren- oder Augenpräparationen, Vaginalkapseln, wäßrige Suspensionen (Lotionen, Schüttelmixturen), lipo- phile Suspensionen, Salben, Cremes, transdermale therapeutische Systeme (z.B. Pflaster), Milch, Pasten, Schäume, Streupuder, Implantate oder Stents.

Bevorzugt sind die orale, die intrapulmonale (inhalative) und die intravenöse Applikation.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen können in die angeführten Applikationsformen überführt werden. Dies kann in an sich bekannter Weise durch Mischen mit inerten, nichttoxischen, pharma- zeutisch geeigneten Hilfsstoffen geschehen. Zu diesen Hilfsstoffen zählen u.a. Trägerstoffe (beispielsweise mikrokristalline Cellulose, Lactose, Mannitol), Lösungsmittel (z.B. flüssige Poly- ethylenglycole), Emulgatoren und Dispergier- oder Netzmittel (beispielsweise Natriumdodecyl- sulfat, Polyoxysorbitanoleat), Bindemittel (beispielsweise Polyvinylpyrrolidon), synthetische und natürliche Polymere (beispielsweise Albumin), Stabilisatoren (z.B. Antioxidantien wie beispiels- weise Ascorbinsäure), Farbstoffe (z.B. anorganische Pigmente wie beispielsweise Eisenoxide) und Geschmacks- und/oder Geruchskorrigentien.

Im Allgemeinen hat es sich als vorteilhaft erwiesen, bei parenteraler Applikation Mengen von etwa 0.001 bis 1 mg kg, vorzugsweise etwa 0.01 bis 0.5 mg kg Körpergewicht zur Erzielung wirksamer Ergebnisse zu verabreichen. Bei oraler Applikation beträgt die Dosierung etwa 0.01 bis 100 mg kg, vorzugsweise etwa 0.01 bis 20 mg/kg und ganz besonders bevorzugt 0.1 bis 10 mg/kg Körpergewicht. Bei intrapulmonaler Applikation beträgt die Menge im Allgemeinen etwa 0.1 bis 50 mg je Inhalation. Trotzdem kann es gegebenenfalls erforderlich sein, von den genannten Mengen abzuweichen, und zwar in Abhängigkeit von Körpergewicht, Applikationsweg, individuellem Verhalten gegenüber dem Wirkstoff, Art der Zubereitung und Zeitpunkt bzw. Intervall, zu welchem die Applikation erfolgt. So kann es in einigen Fällen ausreichend sein, mit weniger als der vorgenannten Mindestmenge auszukommen, während in anderen Fällen die genannte obere Grenze überschritten werden muss. Im Falle der Applikation größerer Mengen kann es empfehlenswert sein, diese in mehreren Einzelgaben über den Tag zu verteilen.

Die nachfolgenden Ausführungsbeispiele erläutern die Erfindung. Die Erfindung ist nicht auf die Beispiele beschränkt.

Beispiele

Abkürzungen und Akronyme: abs. absolut

Ac Acetyl

aq. wässrig, wässrige Lösung

br. breit (bei NMR-Signal)

Bsp. Beispiel

Bu Butyl

c Konzentration

ca. circa, ungefähr

cat. katalytisch

CI chemische Ionisation (bei MS)

d Dublett (bei NMR)

d Tag(e)

(dba) ₃ Pd ₂ Tris(dibenzylidenaceton)dipalladium(0)

DC Dünnschichtchromatographie

DCI direkte chemische Ionisation (bei MS)

dd Dublett von Dublett (bei NMR)

DEAD Diethylazodicarboxylat

DMF N, -Dimefhylf ormamid

DMSO Dimethylsulfoxid

dt Dublett von Triplett (bei NMR)

d. Th. der Theorie (bei chemischer Ausbeute) ee Enantiomerenüberschuss

EI Elektronenstoß-Ionisation (bei MS)

ent enantiomerenrein, Enantiomer

eq. Äquivalent(e)

ESI Elektrospray-Ionisation (bei MS)

Et Ethyl

h Stunde(n)

HPLC Hochdruck-, Hochleistungsflüssigchromatographie

iPr Isopropyl

konz konzentriert (bei Lösung)

LC Flüssigchromatographie

LC/MS Flüssigchromatographie-gekoppelte Massenspektrometrie

Lit. Literatur(stelle)

m Multiplett (bei NMR)

Me Methyl

min Minute(n)

MPLC Mitteldruckflüssigchromatographie (über Kieselgel; auch "flash-

Chromatographie" genannt)

Ms Methansulfonyl (Mesyl)

MS Massenspektrometrie

NMO N-Methylmorpholin-N-oxid

NMR Kernresonanzspektrometrie

Pd/C Palladium auf Aktivkohle

Pr Propyl

q (oder quart) Quartett (bei NMR)

qd Quartett von Dublett (bei NMR)

quant. quantitativ (bei chemischer Ausbeute)

quint Quintett (bei NMR)

rac racemisch, Racemat

Rf Retentionsindex (bei DC)

RP reverse phase (Umkehrphase, bei HPLC)

RT Raumtemperatur

R _t Retentionszeit (bei HPLC, LC/MS)

s Singulett (bei NMR)

sept Septett (bei NMR)

SFC superkritische Flüssigchromatographie t Triplett (bei NMR)

tBu teri.-Butyl

td Triplett von Dublett (bei NMR)

TFA Trifluoressigsäure

THF Tetrahydrofuran

UV Ultraviolett-Spektrometrie

v/v Volumen zu Volumen- Verhältnis (einer Lösung)

Xantphos 4,5-Bis(diphenylphosphino)-9,9-dimethylxanthen

zus. zusammen

HPLC- und LC/MS-Methoden:

Methode 1 (LC/MS):

Instrument: Waters ACQUITY SQD UPLC System; Säule: Waters Acquity UPLC HSS T3 1.8 μ, 50 x 1 mm; Eluent A: 1 1 Wasser + 0.25 ml 99%-ige Ameisensäure, Eluent B: 1 1 Acetonitril + 0.25 ml 99%-ige Ameisensäure; Gradient: 0.0 min 90% A -> 1.2 min 5% A -> 2.0 min 5% A; Ofen: 50°C; Fluss: 0.40 ml/min; UV-Detektion: 208-400 nm.

Methode 2 (LC/MS):

Instrument: Micromass Quattro Premier mit Waters UPLC Acquity; Säule: Thermo Hypersil GOLD 1.9 μ, 50 x 1 mm; Eluent A: 1 1 Wasser + 0.5 ml 50%-ige Ameisensäure, Eluent B: 1 1 Acetonitril + 0.5 ml 50%-ige Ameisensäure; Gradient: 0.0 min 97% A— > 0.5 min 97% A— > 3.2 min 5% A -> 4.0 min 5% A; Ofen: 50°C; Fluss: 0.3 ml/min; UV-Detektion: 210 nm.

Methode 3 (LC/MS):

Instrument MS: Waters Micromass QM; Instrument HPLC: Agilent 1100 Serie; Säule: Agilent ZORBAX Extend-C18 3.5 μ, 3.0 x 50 mm; Eluent A: 1 1 Wasser + 0.01 mol Ammoniumcarbonat, Eluent B: 1 1 Acetonitril; Gradient: 0.0 min 98% A -> 0.2 min 98% A -> 3.0 min 5% A -> 4.5 min 5% A; Ofen: 40°C; Fluss: 1.75 ml/min; UV-Detektion: 210 nm.

Methode 4 (präparative HPLC):

Säule: Reprosil C18, 10 μιη, 250 x 30 mm; Eluent: Acetonitril/Wasser mit 0.1% TFA; Gradient: 0-5.00 min 10:90, Probeninjektion bei 3.00 min; 5.00-23.00 min bis 95:5; 23.00-30.00 min 95:5; 30.00-30.50 min bis 10:90; 30.50-31.20 min 10:90. Methode 5 (präparative HPLC):

Säule: Reprosil C18, 10 μιη, 250 x 30 mm; Eluent: AcetonitrilAVasser mit 0.1% TFA; Gradient: 0-5.00 min 10:90, Probeninjektion bei 3.00 min; 5.00-20.00 min bis 95:5; 20.00-30.00 min 95:5; 30.00-30.50 min bis 10:90; 30.50-31.20 min 10:90. Methode 6 (präparative HPLC):

Säule: Reprosil C18, 10 μιη, 125 x 30 mm; Eluent: AcetonitrilA asser mit 0.1% TFA; Gradient: 0-6.00 min 35:65, Probeninjektion bei 3.00 min; 6.00-27.00 min bis 80:20; 27.00-30.00 min 95:5; 30.00-33.00 min bis 35:65.

Methode 7 (präparative HPLC):

Säule: Reprosil-Pur C18, 10 μιη; Eluent: Wasser/Methanol; Gradient: 70:30 -> 50:50 (bis 6 min) -> 20:80 (bis 22 min), bis 75 min 20:80.

Methode 8 (präparative HPLC):

Säule: Reprosil-Pur C18, 10 μιη; Eluent: Wasser/Methanol; Gradient: 70:30 -> 50:50 (bis 6 min) -> 20:80 (bis 20 min), bis 115 min 20:80. Methode 9 (präparative HPLC):

Säule: Reprosil-Pur C18, 10 μιη; Eluent: Wasser/Methanol; Gradient: 70:30 -> 50:50 (bis 6 min) -> 20:80 (bis 21 min), bis 75 min 20:80.

Methode 10 (präparative HPLC):

Säule: Reprosil-Pur C18, 10 μιη; Eluent: Wasser/Methanol; Gradient: 70:30 -> 50:50 (bis 6 min) -> 20:80 (bis 25 min), bis 75 min 20:80.

Methode 11 (präparative HPLC):

Säule: Reprosil-Pur C18, 10 μιη; Eluent: Wasser/Methanol; Gradient: 70:30 -> 50:50 (bis 6 min) -> 20:80 (bis 20 min), bis 75 min 20:80.

Weitere Angaben:

Die Prozentangaben in den folgenden Beispiel- und Testbeschreibungen sind, sofern nicht anders angegeben, Gewichtsprozente; Teile sind Gewichtsteile. Lösungsmittelverhältnisse, Verdünnungsverhältnisse und Konzentrationsangaben von flüssig/flüssig-Lösungen beziehen sich jeweils auf das Volumen. Reinheitsangaben beziehen sich in der Regel auf entsprechende Peak-Integrationen im LC/MS- Chromatogramm, können aber zusätzlich auch unter Zuhilfenahme des ^-NMR-Spektrums ermittelt worden sein. Wenn keine Reinheit angegeben ist, handelt es sich in der Regel um eine 100%-Reinheit laut automatischer Peak-Integration im LC/MS-Chromatogramm oder die Reinheit wurde nicht explizit ermittelt.

Angaben zu Ausbeuten in % d. Th. sind in der Regel reinheitskorrigiert, sofern eine Reinheit <100% angegeben ist. Bei lösungsmittelhaltigen oder verunreinigten Chargen kann die Ausbeute formal ">100%" betragen; in diesen Fällen ist die Ausbeute nicht lösungsmittel- bzw. reinheitskorrigiert. Die nachfolgenden Beschreibungen der Kopplungsmuster von ^-NMR-Signalen wurden teilweise direkt den Vorschlägen des ACD SpecManagers (ACD/Labs Release 12.00, Product version 12.5) entnommen und nicht notwendigerweise streng hinterfragt. Teilweise wurden die Vorschläge des SpecManagers manuell angepasst. Manuell angepasste bzw. zugewiesene Beschreibungen orientieren sich in der Regel an dem optischen Erscheinungsbild der betreffenden Signale und entsprechen nicht notwendigerweise einer strengen, physikalisch korrekten Interpretation. In der Regel bezieht sich die Angabe zur chemischen Verschiebung auf das Zentrum des betreffenden Signals. Bei breiten Multipletts erfolgt die Angabe eines Intervalls. Durch Lösungsmittel oder Wasser verdeckte Signale wurden entweder tentativ zugeordnet oder sind nicht aufgeführt.

Schmelzpunkte und Schmelzbereiche, soweit angegeben, sind nicht korrigiert. Für alle Reaktanden oder Reagenzien, deren Herstellung im Folgenden nicht explizit beschrieben ist, gilt, dass sie von allgemein zugänglichen Quellen kommerziell bezogen wurden. Für alle übrigen Reaktanden oder Reagenzien, deren Herstellung im Folgenden ebenfalls nicht beschrieben ist und die nicht kommerziell erhältlich waren oder von Quellen bezogen wurden, die nicht allgemein zugänglich sind, ist ein Verweis auf die veröffentlichte Literatur angegeben, in der ihre Her- Stellung beschrieben ist.

Bei den im Folgenden beschriebenen Intermediaten und Ausführungsbeispielen bedeutet eine im IUP AC -Namen des betreffenden Beispiels aufgeführte Bezeichnung " IRS,2RS,5SR" in Verbindung mit der Angabe "Racemat", dass es sich hierbei um ein racemisches Gemisch des IR,2R,5S- Enantiomeren (— jeweils 1. Buchstabe nach der Positionsziffer in " IRS,2RS,5SR") mit dem ent- sprechenden lS,2S,5R-Enantiomeren (— > jeweils 2. Buchstabe nach der Positionsziffer) handelt. Die Bezeichnung " IRS,2RS,5SR" in Verbindung mit den Angaben "Enantiomer 1" und "Enantio- mer 2" bedeutet, dass es sich hierbei um die beiden Enantiomere in separierter, isolierter Form handelt, wobei eine Zuordnung der Absolutkonfiguration (IR,2R,5S oder IS,2S,5R) zu diesen Enantiomeren nicht vorgenommen wurde. Ähnliche Bezeichnungen wie " IRS,2SR,5RS", die sich aus der veränderten Priorität und/oder Reihenfolge von Namensbestandteilen aufgrund der IUPAC -Nomenklatur-Regeln ergeben, sind nach dieser Anleitung auf analoge Weise zu interpretieren. Zur vereinfachten Darstellung der relativen stereochemischen Konfiguration chiraler Zentren wird im Folgenden bei den Strukturformeln racemischer Beispielverbindungen nur die Strukturformel eines der beteiligten Enantiomere wiedergegeben; wie aus der Angabe "Racemat" beim zugehörigen IUPAC -Namen ersichtlich, ist in diesen Fällen das zweite Enantiomer mit der jeweils entgegengesetzten Absolutkonfiguration immer mit eingeschlossen.

Ausgangsverbindungen und Intermediate:

Beispiel 1A

6-(Trifluormethyl)-l,2,3-benzotriazin-4(3//)-on

Zu einer Suspension von 24.4 g (119.51 mmol) 2-Amino-5-(trifluormethyl)benzamid in 174 ml eines 2: 1 -Gemisches von Wasser und konz. Salzsäure bei 0°C wurde eine Lösung von 9.08 g (131.47 mmol) Natriumnitrit in 74 ml Wasser langsam hinzugegeben, wobei die Innentemperatur unter 5°C gehalten wurde. Nach 30 min Rühren bei 0°C Badtemperatur wurden unter weiterer Eisbad-Kühlung langsam 74 ml (0.74 mol) 10 M Natronlauge hinzugegeben, wobei die Innentempera- tur auf ca. 20°C anstieg. Es bildete sich zunächst eine Lösung, aus welcher dann eine Suspension entstand, die zur besseren Rührbarkeit mit 100 ml Wasser verdünnt wurde. Nach 1.5 h Rühren bei RT wurde das Gemisch vorsichtig mit konz. Salzsäure sauer gestellt (pH = 2). Der gebildete Niederschlag wurde abfiltriert und dreimal mit Wasser nachgewaschen. Nach Trocknen an der Luft und danach im Vakuum wurden 24.74 g (96% d. Th.) der Titelverbindung erhalten. Ή-NMR (400 MHz, DMSO-de): δ [ppm] = 15.31 (br. s, 1H), 8.46 (s, 1H), 8.40 (d, 2H).

LC/MS (Methode 1, ESIpos): R _t = 0.78 min, m/z = 216 [M+H] Beispiel 2A

6-Mefhyl-l,2,3-benzotriazin-4(3//)-on

Zu einer Suspension von 32.0 g (213.08 mmol) 2-Amino-5-methylbenzamid in 300 ml eines 2: 1- Gemisches von Wasser und konz. Salzsäure bei 0°C wurde eine Lösung von 16.17 g (234.38 mmol) Natriumnitrit in 120 ml Wasser langsam hinzugegeben, wobei die Innentemperatur unter 5°C gehalten wurde. Nach 30 min Rühren bei 0°C Badtemperatur wurden unter weiterer Eisbad- Kühlung langsam 120 ml (1.2 mol) 10 M Natronlauge hinzugegeben, wobei die Innentemperatur auf ca. 20°C anstieg und vorhandener Feststoff in Lösung ging. Nach 1 h Rühren bei RT wurde das Gemisch vorsichtig mit konz. Salzsäure sauer gestellt (pH = 2). Der gebildete Niederschlag wurde abfiltriert und dreimal mit Wasser nachgewaschen. Nach Trocknen an der Luft und im Vakuum wurden 33.80 g (98% d. Th.) der Titelverbindung erhalten.

Ή-NMR (400 MHz, DMSO-d ₆ ): δ [ppm] = 14.85 (br. s, 1H), 8.08 (d, 1H), 8.02 (s, 1H), 7.90 (d, 1H). LC/MS (Methode 3, ESIpos): R _t = 1.40 min, m/z = 162 [M+H] ⁺ . Beispiel 3A

2-(Trimethylsilyl)ethyl (lR _l S ^, ,2R _l S ^, ,5.S ^, R)-2-[4-(benzyloxy)benzoyl]-5-[(4-oxo-l,2,3-benzotriaz in- 3(4 /)-yl)methyl]cyclopentancarboxylat (Racemat)

Schritt 1:

2-(Trimethylsilyl)ethyl 2- [4-(benzyloxy)phenyl] -2-hydroxybicyclo [2.2.1 ]heptan-7-carboxylat

Eine Lösung von 24.30 g (95.52 mmol) e o-2-(Trimemylsilyl)ethyl 2-oxobicyclo[2.2.1]heptan-7- carboxylat [WO 96/15096, Beispiel 360 / Stufe 1] in 60 ml THF wurde bei ca. -5°C Innentemperatur unter Argon langsam mit 114.62 ml (114.62 mmol) einer 1 M Lösung von 4-(Benzyloxy)- phenylmagnesiumbromid in THF versetzt, wobei die Innentemperatur auf maximal 0°C anstieg. Anschließend wurde das Kältebad entfernt und das Gemisch 1 h nachgerührt. Das Gemisch wurde dann mit 200 ml 5%-iger Zitronensäure-Lösung versetzt und zweimal mit Dichlormethan extra- hiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden über Magnesiumsulfat getrocknet und eingeengt. Der Rückstand wurde mittels Flash-Chromatographie an 1 kg Kieselgel gereinigt (Laufmittel Cyclohexan/Ethylacetat 9: 1). Es wurden 28.70 g (66% d. Th., Reinheit 97%) der Titelverbindung erhalten.

Ή-NMR (400 MHz, DMSO-d ₆ ): δ [ppm] = 7.49-7.27 (m, 7H), 6.95 (d, 2H), 5.09 (s, 2H), 5.05 (s IH), 4.10-4.00 (m, 2H), 2.44-2.37 (m, IH), 2.33-2.24 (m, IH), 2.23-2.11 (m, IH), 1.78-1.60 (m IH), 1.52-1.26 (m, 4H), 0.95-0.80 (m, 2H), 0.00 (s, 9H).

LC/MS (Methode 1, ESIpos): R _t = 3.15 min, m/z = 421 [M+H-H ₂ 0] ⁺ .

2-(Trimethylsilyl)ethyl 2-[4-(benzyloxy)phenyl]bicyclo[2.2.1]hept-2-en-7-carboxylat

Zu einer Lösung von 28.70 g (63.466 mmol) der Verbindung aus Beispiel 3A / Schritt 1 in 150 ml Dichlormethan unter Argon wurden bei ca. 0°C zunächst 26.50 ml (190.40 mmol) Triethylamin und dann langsam 9.82 ml (126.93 mmol) Methansulfonsäurechlorid gegeben, wobei die Innentemperatur 5°C nicht überschritt. Anschließend wurde 1.5 h bei 0°C nachgerührt. Danach wurde das Gemisch mit Dichlormethan verdünnt und mit Wasser extrahiert. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und eingeengt und der Rückstand mittels Flash-Chromatographie an 1 kg Kieselgel gereinigt (Laufmittel Cyclohexan/Ethylacetat 95:5). Es wurden 20.06 g (75% d. Th.) der Titelverbindung erhalten.

Ή-NMR (400 MHz, DMSO-de): δ [ppm] = 7.48-7.28 (m, 7H), 6.97 (d, 2H), 6.30 (d, 1H), 5.11 (s, 2H), 4.15-4.06 (m, 2H), 3.43 (br. s, 1H), 3.06 (br. s, 1H), 1.85-1.71 (m, 2H), 1.17-1.06 (m, 1H), 1.04-0.87 (m, 3H), 0.04 (s, 9H).

LC/MS (Methode 1, ESIpos): R _t = 1.61 min, m/z = 421 [M+H] ⁺ .

Schritt 3:

2-(Trimethylsilyl)ethyl 2-[4-(benzyloxy)phenyl]-2,3-dihydroxybicyclo[2.2.1]heptan-7- carboxylat

Zu einer entgasten Lösung von 25.37 g (60.314 mmol, nicht reinheitskorrigiert) der Verbindung aus Beispiel 3A / Schritt 2 in 150 ml THF unter Argon wurde bei 0°C eine entgaste Lösung von 15.90 g (135.71 mmol) /V-Methylmorpholin-/V-oxid (NMO) in 42 ml Wasser unter Argon gegeben. Zu diesem Gemisch wurden dann langsam unter Rühren 116 ml (9.05 mmol) einer 2.5%-igen Lösung von Osmiumtetroxid in tert. -Butanol gegeben. Anschließend wurde 1 h bei 0°C nachgerührt. Nach weiteren 16 h Rühren bei RT wurde das Gemisch mit 150 ml Ethylacetat verdünnt und zweimal mit jeweils 250 ml 10%-iger Zitronensäure-Lösung, zweimal mit jeweils 300 ml gesättigter Natriumhydrogencarbonat-Lösung und zweimal mit jeweils 300 ml gesättigter Natriumchlorid- Lösung extrahiert. Die organische Phase wurde anschließend über Natriumsulfat getrocknet und eingeengt. Es wurden 27.51 g (75% d. Th., Reinheit 75%) der Titelverbindung erhalten. LC/MS (Methode 1, ESIpos): R _t = 1.40 min, m/z = 437 [M+H-H ₂ 0] ⁺ . Schritt 4:

2-(Trimethylsilyl)ethyl (lRS,2RS,5SR)-2-[4-(benzyloxy)benzoyl]-5-formylcyclopentanca rboxylat

(Racemat)

Methode A:

Zu einer Lösung von 27.42 g (60.31 mmol, nicht reinheitskorrigiert) der Verbindung aus Beispiel 3A / Schritt 3 in 170 ml Methanol unter Argon wurden bei -15°C Badtemperatur langsam 30.96 g (66.34 mmol, Reinheit 95%) Bleitetraacetat gegeben. Das Gemisch wurde 1 h bei -15°C gerührt. Nach Erwärmen auf RT wurde das Gemisch über Celite filtriert und der Filtrationsrückstand dreimal mit jeweils 50 ml Methanol nachgewaschen. Das Filtrat wurde eingeengt und der Rückstand in 500 ml Dichlormethan und 500 ml Wasser aufgenommen, ohne dass sich eine Phasentrennung einstellte. Daraufhin wurde das Gemisch über Kieselgel filtriert und das Kieselgel mit Dichlormethan nachgewaschen. Nach Phasentrennung wurde die wässrige Phase noch einmal mit 150 ml Dichlor - methan extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden über Natriumsulfat getrocknet und eingeengt. Es wurden 27.1 g (86% d. Th., Reinheit 87%) der Titelverbindung erhalten.

Ή-NMR (400 MHz, DMSO-d ₆ ): δ [ppm] = 9.72 (d, 1H), 8.02 (d, 2H), 7.53-7.34 (m, 5H), 7.18 (d, 2H), 5.25 (s, 2H), 4.17 (q, 1H), 4.09 (dd, 2H), 3.74 (t, 1H), 3.23-3.14 (m, 1H), 2.24-2.13 (m, 1H), 2.08-1.88 (m, 2H), 1.61-1.49 (m, 1H), 0.87-0.79 (m, 2H), 0.00 (s, 9H). LC/MS (Methode 1, ESIpos): R _t = 1.45 min, m/z = 425 [M+H-28]

Methode B:

Zu einer Lösung von 69.0 g (131 mmol, ca. 80% Reinheit) der Verbindung aus Beispiel 3A / Schritt 2 in einem Gemisch aus Aceton/Wasser/THF (3: 1 : 1) wurden bei 0°C unter Argon zunächst 76.87 g (656 mmol) N-Mefhylmorpholin-N-oxid (NMO) und dann 2.09 g (8.20 mmol) einer 4%- igen Lösung von Osmiumtetroxid in Wasser gegeben. Das Gemisch wurde 3 Tage bei RT gerührt. Anschließend wurden 105.26 g (492 mmol) Natriumperiodat hinzugefügt und das Gemisch weiter über Nacht bei RT gerührt. Nach Versetzen mit Ethylacetat und 10%-iger wässriger Zitronensäure wurde die wässrige Phase abgetrennt und einmal mit Ethylacetat extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden einmal mit gesättigter Natriumhydrogencarbonat-Lösung gewaschen und dann mit Magnesiumsilikat (Fluorisil) verrührt. Nach Filtration wurde der Filterrückstand mit Ethylacetat nachgewaschen. Nach Einengen des Filtrats wurde der so erhaltene Rückstand mit den Rückständen aus zwei ähnlich durchgeführten Vorversuchen [eingesetzte Mengen der Verbindung aus Beispiel 3A / Schritt 2: 3.0 g (7.13 mmol) bzw. 3.2 g (7.61 mmol)] vereinigt und gemeinsam mittels Flash-Chromatographie gereinigt (Kieselgel, Laufmittel Petrolether/Ethylacetat 8:2). Es wurden auf diese Weise 53 g (58% d. Th. unter Berücksichtigung der Vorversuche, Reinheit 89%) der Titelverbindung erhalten.

Schritt 5:

2-(Trimethylsilyl)ethyl (lRS,2RS,5SR)-2-[4-(benzyloxy)benzoyl]-5-(hydroxymefhyl)cycl opentan- carboxylat (Racemat)

Zu einer Lösung von 27.0 g (59.65 mmol, nicht reinheitskorrigiert) der Verbindung aus Beispiel 3A / Schritt 4 in 135 ml Ethanol wurden bei RT langsam 677 mg (17.895 mmol) Natriumborhydrid gegeben und das Gemisch 30 min bei RT gerührt. Anschließend wurde das Gemisch mit jeweils 400 ml Ammoniumchlorid-Lösung und Wasser versetzt und zweimal mit jeweils 300 ml Ethylacetat extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden über Natriumsulfat getrocknet und eingeengt. Es wurden 21.90 g (70% d. Th., Reinheit 87%) der Titelverbindung erhalten. Ή-NMR (400 MHz, DMSO-d ₆ ): δ [ppm] = 7.95 (d, 2H), 7.48-7.31 (m, 5H), 7.12 (d, 2H), 5.20 (s, 2H), 4.64 (t, 1H), 4.07-3.98 (m, 3H), 3.53-3.45 (m, 1H), 3.40-3.34 (m, 1H), 2.94 (t, 1H), 2.34-2.23 (m, 1H), 2.12-2.01 (m, 1H), 1.90-1.78 (m, 1H), 1.67-1.47 (m, 2H), 0.82-0.75 (m, 2H), 0.00 (s, 9H).

LC/MS (Methode 1, ESIpos): R _t = 1.34 min, m/z = 455 [M+H] ⁺ . Schritt 6:

2-(Trimethylsilyl)ethyl (lR _l S ^, ,2R _l S ^, ,5.S ^, R)-2-[4-(benzyloxy)benzoyl]-5-[(4-oxo-l,2,3-benzotriaz in- 3(4//)-yl)mefhyl]cyclopentancarboxylat (Racemat)

Zu einer Lösung von 500 mg (1.10 mmol, nicht reinheitskorrigiert) der Verbindung aus Beispiel 3A / Schritt 5 in 6 ml THF unter Argon wurden 243 mg (1.65 mmol) l,2,3-Benzotriazin-4(3 /)-on und 1.11 g (5.50 mmol) Tributylphosphan gegeben. Anschließend wurden 1.50 ml (3.30 mmol) einer 40% -igen Lösung von Diethylazodicarboxylat (DEAD) in Toluol bei 0°C hinzugetropft. Das Gemisch wurde ca. 1 h bei RT gerührt, dann mit Ethylacetat verdünnt und zweimal mit jeweils 5 ml Wasser und zweimal mit gesättigter Natriumchlorid-Lösung extrahiert. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und eingeengt. Der Rückstand wurde mittels präparativer HPLC (Methode 6) gereinigt. Es wurden 334 mg (52% d. Th.) der Titelverbindung erhalten.

Ή-NMR (400 MHz, DMSO-d ₆ ): δ [ppm] = 8.44 (dd, 1H), 8.38 (d, 1H), 8.27 (td, 1H), 8.15-8.08 (m, 3H), 7.65-7.48 (m, 5H), 7.29 (d, 2H), 5.37 (s, 2H), 4.74-4.62 (m, 2H), 4.26 (q, 1H), 3.40 (t, 1H), 3.13-3.01 (m, 1H), 2.36-2.25 (m, 1H), 2.21-2.10 (m, 1H), 1.96-1.84 (m, 1H), 1.77-1.65 (m, 1H), 0.53-0.46 (m, 2H), 0.17 (s, 9H).

LC/MS (Methode 1, ESIpos): R _t = 1.51 min, m/z = 584 [M+H] ⁺ . Beispiel 4A

2-(Trimethylsilyl)ethyl (lR _l S ^, ,2R _l S ^, ,5.S ^, R)-2-(4-hydroxybenzoyl)-5-[(4-oxo-l,2,3-benzotriazin-3 (4 /)- yl)methyl]cyclopentancarboxylat (Racemat)

Zu einer Lösung von 270 mg (0.46 mmol) der Verbindung aus Beispiel 3A in 12 ml Ethylacetat unter Argon wurden 25 mg (0.024 mmol) Palladium auf Aktivkohle (10% Pd) gegeben. Anschließend wurde 42 h unter Normaldruck hydriert. Das Gemisch wurde danach über Kieselgur filtriert, der Filter-Rückstand mit Ethylacetat nachgewaschen und das Filtrat eingeengt. Der so erhaltene Rückstand wurde in wenig Dichlormethan aufgenommen und mittels Säulenchromatographie ge- reinigt (25 g Kieselgel, Laufmittel Cyclohexan/Ethylacetat 7:3). Es wurden 165 mg (72% d. Th., Reinheit 100%) der Titelverbindung erhalten.

Ή-NMR (400 MHz, CDC1 ₃ ): δ [ppm] = 8.37 (d, 1H), 8.16 (d, 1H), 7.98-7.88 (m, 3H), 7.84-7.77 (m, 1H), 6.89 (d, 2H), 6.67 (br. s, 1H), 4.77-4.70 (m, 1H), 4.68-4.60 (m, 1H), 4.20-4.10 (m, 1H), 3.88-3.81 (m, 2H), 3.46 (t, 1H), 3.08-2.94 (m, 1H), 2.19-2.04 (m, 1H), 2.01-1.86 (m, 2H), 1.72- 1.64 (m, teilweise verdeckt, 1H), 0.63-0.55 (m, 2H), -0.09 (s, 9H).

LC/MS (Methode 1, ESIpos): R _t = 1.23 min, m/z = 494 [M+H] ⁺ .

Beispiel 5A

2-(Trimethylsilyl)ethyl (lR5,25R,5R5)-2-[(4-oxo-l,2,3-benzotriazin-3(4 /)-yl)methyl]-5-[4-(tetra- hydro-2/f-pyran-4-ylmefhoxy)benzoyl]cyclopentancarboxylat (Racemat)

Zu einer Lösung von 164 mg (0.33 mmol) der Verbindung aus Beispiel 4A in 3.7 ml Acetonitril unter Argon wurden 92 mg (0.66 mmol) Kaliumcarbonat und 71 mg (0.40 mmol) 4-(Brommefhyl)- tetrahydropyran gegeben und das Gemisch 20 h unter Rückfluss gerührt. Anschließend wurden weitere 36 mg (0.20 mmol) 4-(Brommethyl)tetrahydropyran hinzugefügt und das Gemisch erneut 7 h unter Rückfluss gerührt. Danach wurden nochmals 71 mg (0.40 mmol) 4-(Brommethyl)tetra- hydropyran sowie 46 mg (0.33 mmol) Kaliumcarbonat hinzugegeben und das Gemisch weitere 17 h unter Rückfluss gerührt. Nach Abkühlen auf RT wurde das Gemisch mit 30 ml Wasser und 30 ml Ethylacetat verdünnt, und nach Trennen der Phasen wurde die wässrige Phase einmal mit 30 ml Ethylacetat extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und eingeengt. Der Rückstand wurde mittels präparativer HPLC (Methode 4) gereinigt. Die vereinigten produkthaltigen Fraktionen wurden mit gesättigter wässriger Natrium- hydrogencarbonat-Lösung auf pH 7-8 gestellt, dann bis auf einen Rest an wässriger Phase eingeengt und diese zweimal mit Ethylacetat extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden über Natriumsulfat getrocknet, eingeengt und der Rückstand im Vakuum getrocknet. Es wurden 85 mg (42% d. Th., Reinheit 97%) der Titelverbindung erhalten.

Ή-NMR (400 MHz, CDCL): δ [ppm] = 8.37 (dd, 1H), 8.15 (d, 1H), 7.99-7.91 (m, 3H), 7.83-7.76 (m, 1H), 6.91 (d, 2H), 4.77-4.68 (m, 1H), 4.67-4.59 (m, 1H), 4.23-4.13 (m, 1H), 4.03 (dd, 2H), 3.89-3.80 (m, 4H), 3.50-3.39 (m, teilweise verdeckt, 3H), 3.09-2.93 (m, 1H), 2.19-2.03 (m, 2H), 2.01-1.86 (m, 2H), 1.76 (dd, 2H), 1.71-1.62 (m, teilweise verdeckt, 1H), 1.47 (qd, 2H), 0.65-0.53 (m, 2H), -0.09 (s, 9H).

LC/MS (Methode 1, ESIpos): R _t = 1.43 min, m/z = 592 [M+H] ⁺ .

Beispiel 6A

2-(Trimethylsilyl)ethyl (lR5,25R,5R5)-2-[(4-oxo-l,2,3-benzotriazin-3(4 /)-yl)methyl]-5-{4-[2- (tetrahydro-2i7-pyran-4-yl)ethoxy]benzoyl } cyclopentancarboxylat (Racemat)

Zu einer Lösung von 3.88 g (7.47 mmol, Reinheit 95%) der Verbindung aus Beispiel 4A in 41 ml DMF unter Argon wurden 1.01 g (8.96 mmol) Kalium-feri.-butylat gegeben. Nach 5 min Rühren bei RT wurden 1.73 g (8.96 mmol) 4-(2-Bromefhyl)tetrahydro-2i7-pyran hinzugegeben, und das Gemisch wurde 2 h bei 100°C Badtemperatur gerührt. Nach Abkühlen auf RT wurden dem Gemisch Wasser und Ethylacetat zugesetzt. Nach Trennen der Phasen wurde die wässrige Phase einmal mit Ethylacetat extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden einmal mit gesättigter Natriumchlorid-Lösung gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und eingeengt. Der Rückstand wurde mittels Säulenchromatographie gereinigt (300 g Kieselgel, Laufmittel Cyclo- hexan/Ethylacetat 7:3). Es wurden 2.91 g (64% d. Th., Reinheit 99%) der Titelverbindung erhalten.

Ή-NMR (400 MHz, DMSO-d ₆ ): δ [ppm] = 8.27 (d, 1H), 8.20 (d, 1H), 8.10 (t, 1H), 7.97-7.89 (m, 3H), 7.03 (d, 2H), 4.57-4.44 (m, 2H), 4.14-4.03 (m, 3H), 3.82 (dd, 2H), 3.63-3.46 (m, 2H), 3.31- 3.17 (m, teilweise verdeckt, 3H), 2.97-2.84 (m, 1H), 2.18-2.05 (m, 1H), 2.04-1.92 (m, 1H), 1.80- 1.48 (m, 6H), 1.29-1.13 (m, 3H), 0.37-0.26 (m, 2H), -0.17 (s, 9H).

LC/MS (Methode 1, ESIpos): R _t = 1.46 min, m/z = 606 [M+H] ⁺ .

Beispiel 7A

2-(Trimethylsilyl)ethyl (lR _l S ^, ,2R _l S ^, ,5.S ^, R)-2-[4-(benzyloxy)benzoyl]-5-{ [4-oxo-6-(trifluormethyl)- l,2,3-benzotriazin-3(4 /)-yl]methyl}cyclopentancarboxylat (Racemat)

Zu einer Lösung von 13.88 g (30.53 mmol, nicht reinheitskorrigiert) der Verbindung aus Beispiel 3A / Schritt 5 in 200 ml Toluol unter Argon wurden 7.88 g (36.64 mmol) der Verbindung aus Beispiel 1A und 9.88 g (48.85 mmol) Tributylphosphan gegeben. Anschließend wurden 13.90 ml (30.53 mmol) einer 40%-igen Lösung von Diethylazodicarboxylat in Toluol bei 0°C hinzugetropft. Das Gemisch wurde 1 Tag bei RT gerührt und dann eingeengt. Der Rückstand wurde mittels Flash-Chromatographie gereinigt (1 kg Kieselgel, Laufmittel Cyclohexan/Ethylacetat 9: 1). Es wurden 9.06 g (44% d. Th., Reinheit 98%) der Titelverbindung erhalten.

Ή-NMR (400 MHz, DMSO-d ₆ ): δ [ppm] = 8.52 (s, 1H), 8.47-8.43 (m, 2H), 7.95 (d, 2H), 7.48- 7.30 (m, 5H), 7.12 (d, 2H), 5.20 (s, 2H), 4.60-4.50 (m, 2H), 4.10 (q, 1H), 3.65-3.49 (m, 2H), 3.25 (t, 1H), 2.96-2.83 (m, 1H), 2.19-2.07 (m, 1H), 2.07-1.95 (m, 1H), 1.80-1.68 (m, 1H), 1.63-1.50 (m, 1H), 0.39-0.22 (m, 2H), -0.18 (s, 9H).

LC/MS (Methode 1, ESIpos): R _t = 1.57 min, m/z = 652 [M+H] ⁺ .

Beispiel 8A 2-(Trimethylsilyl)ethyl (lR _l S ^, ,2R _l S ^, ,5.S ^, R)-2-(4-hydroxybenzoyl)-5-{ [4-oxo-6-(trifluormethyl)-l,2,3- benzotriazin-3(4 /)-yl]methyl}cyclopentancarboxylat (Racemat)

Zu einer Lösung von 9.05 g (13.89 mmol) der Verbindung aus Beispiel 7A in einem Gemisch aus 100 ml Ethylacetat und 100 ml Ethanol unter Argon wurden 1.05 g (16.66 mmol) Ammonium- formiat und 369 mg (0.35 mmol) Palladium auf Aktivkohle (10% Pd) gegeben. Anschließend wur- de das Gemisch 1 h bei 75°C gerührt. Danach wurden weitere 105 mg (1.67 mmol) Ammonium- formiat hinzugegeben und das Gemisch nochmals 30 min bei 75°C gerührt. Nach Abkühlen auf RT wurde das Gemisch über Kieselgur filtriert, der Filter-Rückstand mit Ethylacetat und Ethanol nachgewaschen und das Filtrat eingeengt. Es wurden 7.86 g (100% d. Th.) der Titelverbindung erhalten. Ή-NMR (400 MHz, DMSO-de): δ [ppm] = 10.40 (br. s, 1H), 8.52 (s, 1H), 8.47-8.42 (m, 2H), 7.85 (d, 2H), 6.84 (d, 2H), 4.60-4.51 (m, 2H), 4.05 (q, 1H), 3.64-3.48 (m, 2H), 3.23 (t, 1H), 2.96-2.82 (m, 1H), 2.17-2.05 (m, 1H), 2.05-1.94 (m, 1H), 1.79-1.67 (m, 1H), 1.62-1.49 (m, 1H), 0.38-0.22 (m, 2H), -0.18 (s, 9H).

LC/MS (Methode 1, ESIpos): R _t = 1.31 min, m/z = 562 [M+H] ⁺ . Beispiel 9A

2-(Trimethylsilyl)ethyl (lRS,2SR^^

methyl } -5-[4-(tetrahydro-2 i-pyran-4-ylmethoxy)benzoyl]cyclopentancarboxylat (Racemat)

Zu einer Lösung von 1.07 g (1.90 mmol) der Verbindung aus Beispiel 8A in 20 ml DMF unter Argon wurden 256 mg (2.28 mmol) Kalium-ieri.-butylat gegeben. Nach 5 min Rühren bei RT wurden 408 mg (2.28 mmol) 4-(Brommethyl)tetrahydropyran hinzugegeben, und das Gemisch wurde 2 h bei 100°C Badtemperatur gerührt. Anschließend wurden weitere 136 mg (0.76 mmol) 4-(Brom- methyl)tetrahydropyran hinzugegeben und das Gemisch nochmals 2 h bei 100°C Badtemperatur gerührt. Nach Abkühlen auf RT wurde das Gemisch mit den Reaktionsgemischen aus zwei ähnlich durchgeführten Vorversuchen (Ansatzgröße jeweils 47 mg (0.08 mmol) der Verbindung aus Beispiel 8A) vereinigt. Nach Entfernen des DMF wurde diesem vereinten Gemisch 60 ml Wasser und 60 ml Ethylacetat zugesetzt. Nach Trennen der Phasen wurde die wässrige Phase einmal mit 30 ml Ethylacetat extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und eingeengt. Der Rückstand wurde in einem Gemisch aus Cyclohexan und Ethylacetat (9: 1) aufgenommen und mittels Säulenchromatographie gereinigt (120 g Kieselgel, Laufmittel Cyclohexan/Ethylacetat 9: 1). Es wurden 590 mg (47% d. Th., Reinheit 100%) der Titelverbindung erhalten.

Ή-NMR (400 MHz, CDC1 ₃ ): δ [ppm] = 8.66 (s, 1H), 8.28 (d, 1H), 8.14 (dd, 1H), 7.95 (d, 2H), 6.92 (d, 2H), 4.78-4.62 (m, 2H), 4.21-4.13 (m, 1H), 4.03 (dd, 2H), 3.89-3.81 (m, 4H), 3.50-3.40 (m, 3H), 3.07-2.93 (m, 1H), 2.19-2.03 (m, 2H), 2.03-1.87 (m, 2H), 1.76 (dd, 2H), 1.72-1.61 (m, 1H), 1.47 (qd, 2H), 0.63-0.53 (m, 2H), -0.09 (s, 9H). LC/MS (Methode 1, ESIpos): R _t = 1.51 min, m/z = 560 [M+H] ⁺ .

Beispiel 10A

2-(Trimethylsilyl)ethyl (lRS,2SR^^

methyl}-5-{4-[2-(tetrahydro-2ii-pyran-4-yl)ethoxy]benzoyl }cyclopentancarboxylat (Racemat)

Zu einer Lösung von 250 mg (0.45 mmol) der Verbindung aus Beispiel 8A in 4.5 ml DMF unter Argon wurden 60 mg (0.53 mmol) Kalium-feri.-butylat gegeben. Nach 5 min Rühren bei RT wurden 103 mg (0.53 mmol) 4-(2-Bromethyl)tetrahydro-2i7-pyran hinzugegeben, und das Gemisch wurde 1 h bei 100°C Badtemperatur gerührt. Nach Abkühlen auf RT wurden dem Gemisch 60 ml Wasser und 60 ml ieri.-Butyl-methylether zugesetzt. Nach Trennen der Phasen wurde die wässrige Phase einmal mit 30 ml ieri.-Butyl-methy lether und zweimal mit jeweils 50 ml Ethylacetat extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und eingeengt. Der Rückstand wurde in Dichlormethan aufgenommen und mittels Säulenchromatographie gereinigt (25 g Kieselgel, Laufmittel Cyclohexan/Ethylacetat 7:3). Es wurden 138 mg (46% d. Th., Reinheit 100%) der Titelverbindung erhalten.

Ή-NMR (400 MHz, DMSO-d ₆ ): δ [ppm] = 8.52 (s, 1H), 8.45 (s, 2H), 7.93 (d, 2H), 7.04 (d, 2H), 4.60-4.50 (m, 2H), 4.15-4.07 (m, 3H), 3.82 (dd, 2H), 3.64-3.47 (m, 2H), 3.31-3.18 (m, 3H), 2.97- 2.83 (m, 1H), 2.19-2.06 (m, 1H), 2.06-1.94 (m, 1H), 1.81-1.49 (m, 6H), 1.29-1.14 (m, 3H), 0.36- 0.22 (m, 2H), -0.18 (s, 9H).

LC/MS (Methode 1, ESIpos): R _t = 1.53 min, m/z = 674 [M+H] ⁺ .

Beispiel IIA

2-(Trimethylsilyl)ethyl (lRS,2SR^^

methyl}-5-(4-{ [(trifluormethyl)sulfonyl]oxy}benzoyl)cyclopentancarboxylat (Racemat)

Zu einer Lösung von 1.00 g (1.78 mmol) der Verbindung aus Beispiel 8A in 5.0 ml Dichlormethan unter Argon wurden bei 0°C zunächst 0.25 ml (3.12 mmol) Pyridin und anschließend langsam 0.45 ml (2.67 mmol) Trifluormethansulfonsäureanhydrid hinzugegeben. Das Gemisch wurde 1 h bei 0°C gerührt, anschließend mit Dichlormethan versetzt und jeweils einmal mit Wasser und gesättigter Natriumhydrogencarbonat-Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und eingeengt. Es wurden 1.21 g (98% d. Th., Reinheit 100%) der Titelverbindung erhalten.

LC/MS (Methode 2, ESIpos): R _t = 3.41 min, m/z = 694 [M+H] ⁺ . Beispiel 12A

2-(Trimethylsilyl)ethyl (lRS,2SR^^

methyl } -5-(4-sulfanylbenzoyl)cyclopentancarboxylat (Racemat)

Zu einer Lösung von 800 mg (1.15 mmol) der Verbindung aus Beispiel I IA in 10 ml Dioxan wur- den nacheinander 264 mg (1.38 mmol) Triisopropylsilanthiol, 298 mg (2.31 mmol) NN-Diiso- propylethylamin, 26 mg (0.03 mmol) Tris(dibenzylidenaceton)dipalladium und 33 mg (0.06 mmol) 4,5-Bis(diphenylphosphin)-9,9-dimethylxanthen (Xantphos) gegeben. Anschließend wurde das Ge- misch entgast, mit Argon gespült und 2.5 h unter Rückfluss gerührt. Nach Abkühlen auf RT wurde das Gemisch mit Ethylacetat versetzt und einmal mit Wasser gewaschen. Nach einmaliger Extraktion der wässrigen Phase mit Ethylacetat wurden die vereinigten organischen Phasen einmal mit gesättigter Natriumchlorid-Lösung gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und ein- geengt. Der Rückstand wurde mittels präparativer HPLC (Methode 4) gereinigt. Die produkt- haltigen Fraktionen wurden vereinigt, mit gesättigter wässriger Natriumhydrogencarbonat-Lösung neutralisiert und bis auf ein kleines Restvolumen an Wasser eingeengt. Nach zweimaliger Extraktion dieser wässrigen Phase mit Dichlormethan wurden die vereinigten organischen Phasen über Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert, eingeengt und der Rückstand im Vakuum getrocknet. Es wurden 350 mg (35% d. Th., Reinheit 67%) der Titelverbindung erhalten. Laut LC/MS war darin das korrespondierende Disulfid (dimerisiertes Produkt, (+/-)-Bis[2-(trimethylsilyl)ethyl] 2,2'-[di- sulf andiylbis(benzol-4, 1 -diylcarbonyl)]bis(5- { [4-oxo-6-(trifluormethyl)- 1 ,2,3-benzotriazin-3(4 /)- yl]methyl}cyclopentancarboxylat) zu 25% enthalten.

Ή-NMR (400 MHz, DMSO-d ₆ ): δ [ppm] = 8.52 (s, 1H), 8.44 (s, 2H), 7.83 (d, 2H), 7.42 (d, 2H), 6.03 (br. s, 1H), 4.60-4.48 (m, 2H), 4.08 (q, 1H), 3.64-3.48 (m, 2H), 3.23 (t, 1H), 2.97-2.81 (m, 1H), 2.19-2.06 (m, 1H), 2.06-1.94 (m, 1H), 1.79-1.67 (m, 1H), 1.62-1.48 (m, 1H), 0.37-0.22 (m, 2H), -0.18 (s, 9H).

LC/MS (Methode 1, ESIpos): R _t = 1.44 min, m/z = 578 [M+H] ⁺ . Beispiel 13A 2-(Trimethylsilyl)ethyl (lR _l S ^, ,2 _l S ^, R,5R.S ^, )-2-{ [4-oxo-6-(trifluormethyl)-l,2,3-benzotriazin-3(4 /)-yl]- methyl}-5-{4-[(tetrahydro-2ii-pyran-4-ylmethyl)sulfanyl]benz oyl}cyclopentancarboxylat

(Racemat)

Zu einer Lösung von 200 mg der Verbindung aus Beispiel 12A (0.35 mmol, nicht reinheits- korrigiert, ca. 25% korrespondierendes Disulfid enthalten) in 14 ml DMF wurden 96 mg (0.69 mmol) Kaliumcarbonat gegeben und das Gemisch 2 min bei RT gerührt. Anschließend wurden 136 mg (0.76 mmol) 4-(Brommethyl)tetrahydropyran sowie 123 mg (1.04 mmol) Natriumhydroxy- methansulfinat hinzugegeben und das Gemisch weitere 30 min bei RT gerührt. Das Gemisch wurde danach eingeengt, und der Rückstand wurde mit Wasser versetzt und zweimal mit Ethylacetat extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden einmal mit gesättigter Natriumchlorid- Lösung gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und eingeengt. Es wurden 248 mg (100% d. Th., Reinheit 95%) der Titelverbindung erhalten. LC/MS (Methode 1, ESIpos): R _t = 1.50 min, m/z = 676 [M+H] ⁺ .

Beispiel 14A

2-(Trimethylsilyl)ethyl (lR _l S ^, ,2R _l S ^, ,5.S ^, R)-2-[4-(benzyloxy)benzoyl]-5-[(6-methyl-4-oxo-l,2,3-b enzo- triazin-3(4 /)-yl)methyl]cyclopentancarboxylat (Racemat)

Zu einer Suspension von 9.60 g (20.06 mmol, Reinheit 95%) der Verbindung aus Beispiel 3A / Schritt 5 in 110 ml Toluol unter Argon wurden 3.88 g (24.07 mmol) der Verbindung aus Beispiel 2A gegeben. Anschließend wurden 25.1 ml (100.30 mmol) Tributylphosphan und 27.4 ml (60.18 mmol) einer 40%-igen Lösung von Diethylazodicarboxylat in Toluol bei 0°C hinzugetropft. Nach 2 h Rühren bei RT wurde das Gemisch mit Ethylacetat verdünnt und einmal mit Wasser gewa- sehen. Die wässrige Phase wurde einmal mit Ethylacetat rückextrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden einmal mit gesättigter Natriumchlorid-Lösung gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und eingeengt. Der Rückstand wurde mittels Flash-Chromatographie gereinigt (Kieselgel, Laufmittel Cyclohexan/Ethylacetat 85: 15 -> 80:20). Es wurden 6.28 g (51 % d. Th., Reinheit 98%) der Titel Verbindung erhalten. Ή-NMR (400 MHz, DMSO-d ₆ ): δ [ppm] = 8.12-8.05 (m, 2H), 7.97-7.88 (m, 3H), 7.48-7.27 (m, 5H), 7.12 (d, 2H), 5.20 (s, 2H), 4.56-4.42 (m, 2H), 4.08 (q, 1H), 3.61-3.46 (m, 2H), 3.22 (t, 1H), 2.96-2.83 (m, 1H), 2.55 (s, 3H), 2.17-2.05 (m, 1H), 2.03-1.92 (m, 1H), 1.78-1.67 (m, 1H), 1.59- 1.47 (m, 1H), 0.38-0.23 (m, 2H), -0.17 (s, 9H). LC/MS (Methode 1, ESIpos): R _t = 1.49 min, m/z = 598 [M+H] ⁺ .

Beispiel 15A

2-(Trimethylsilyl)ethyl (lR _l S ^, ,2R _l S ^, ,5.S ^, R)-2-(4-hydroxybenzoyl)-5-[(6-methyl-4-oxo-l,2,3-benzo - triazin-3(4//)-yl)mefhyl]cyclopentancarboxylat (Racemat)

Zu einer Lösung von 6.25 g (10.25 mmol, Reinheit 98%) der Verbindung aus Beispiel 14A in einem Gemisch aus 50 ml Ethylacetat und 50 ml Ethanol unter Argon wurden 273 mg (0.26 mmol) Palladium auf Aktivkohle (10% Pd) und 969 mg (15.37 mmol) Ammoniumformiat gegeben. Anschließend wurde das Gemisch 2 h bei 70°C gerührt. Nach Abkühlen auf RT wurde das Gemisch über Kieselgur filtriert, der Filter-Rückstand mit Ethylacetat nachgewaschen, das Filtrat eingeengt und der Rückstand im Vakuum getrocknet. Es wurden 5.20 g (97% d. Th., Reinheit 97%) der Titelverbindung erhalten.

Ή-NMR (400 MHz, DMSO-d ₆ ): δ [ppm] = 10.40 (br. s, 1H), 8.12-8.05 (m, 2H), 7.92 (dd, 1H), 7.84 (d, 2H), 6.84 (d, 2H), 4.57-4.42 (m, 2H), 4.03 (q, 1H), 3.62-3.46 (m, 2H), 3.21 (t, 1H), 2.96- 2.83 (m, 1H), 2.55 (s, 3H), 2.17-2.04 (m, 1H), 2.03-1.91 (m, 1H), 1.78-1.66 (m, 1H), 1.60-1.48 (m, 1H), 0.39-0.25 (m, 2H), -0.17 (s, 9H).

LC/MS (Methode 1, ESIpos): R _t = 1.28 min, m/z = 508 [M+H] Beispiel 16A

2-(Trimethylsilyl)ethyl (lRS,2SR,5^

5-[4-(tetrahydro-2/f-pyran-4-ylmefhoxy)benzoyl]cyclopentanca rboxylat (Racemat)

Zu einer Lösung von 500 mg (0.96 mmol, Reinheit 97%) der Verbindung aus Beispiel 15A in 5.3 ml DMF unter Argon wurden 129 mg (1.15 mmol) Kalium-ieri.-butylat gegeben. Nach 5 min Rühren bei RT wurden 205 mg (1.15 mmol) 4-(Brommethyl)tetrahydro-2i7-pyran hinzugegeben, und das Gemisch wurde 1 h bei 100°C Badtemperatur gerührt. Nach Abkühlen und Stehenlassen über Nacht bei RT wurden dem Gemisch 60 ml Wasser und 60 ml Ethylacetat zugesetzt. Nach Trennen der Phasen wurde die wässrige Phase einmal mit 30 ml Ethylacetat extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden einmal mit gesättigter Natriumchlorid-Lösung gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und eingeengt. Der Rückstand wurde mittels Säulenchromatographie gereinigt (90 g Kieselgel, Laufmittel Cyclohexan/Ethylacetat 7:3). Es wurden 290 mg (41 % d. Th., Reinheit 82%) der Titelverbindung erhalten. LC/MS (Methode 1, ESIpos): R _t = 1.43 min, m/z = 606 [M+H] ⁺ .

Beispiel 17A

2-(Trimethylsilyl)ethyl (lRS,2SR,5^

5-{4-[2-(tetrahydro-2 i-pyran-4-yl)ethoxy]benzoyl}cyclopentancarboxylat (Racemat)

Zu einer Lösung von 200 mg (0.38 mmol, Reinheit 97%) der Verbindung aus Beispiel 15A in 2.1 ml DMF unter Argon wurden 51 mg (0.46 mmol) Kalium-ieri. -butylat gegeben. Nach 5 min Rühren bei RT wurden 89 mg (0.46 mmol) 4-(2-Bromethyl)tetrahydro-2i7-pyran hinzugegeben, und das Gemisch wurde 2 h bei 100°C Badtemperatur gerührt. Nach Abkühlen auf RT wurden dem Gemisch 60 ml Wasser und 60 ml Ethylacetat zugesetzt. Nach Trennen der Phasen wurde die wässrige Phase einmal mit 30 ml Ethylacetat extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden einmal mit gesättigter Natriumchlorid-Lösung gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und eingeengt. Der Rückstand wurde mittels Säulenchromatographie gereinigt (40 g Kie- selgel, Laufmittel Cyclohexan/Ethylacetat 7:3). Es wurden 142 mg (60% d. Th., Reinheit 100%) der Titelverbindung erhalten.

LC/MS (Methode 1, ESIpos): R _t = 1.46 min, m/z = 620 [M+H]

Ausf ührungsbeispiele :

Beispiel 1

(+/-)-(lRS,2SR,5RS)-2-[(4-Oxo-l,2,3-benzotria^^

ylmethoxy)benzoyl] cyclopentancarbonsäure (Racemat)

Eine Lösung von 83 mg (0.14 mmol) der Verbindung aus Beispiel 5A in 0.5 ml Dichlormethan wurde bei 0°C mit 0.25 ml (3.24 mmol) Trifluoressigsäure versetzt. Das Gemisch wurde 2.5 h bei 0°C gerührt und danach eingeengt. Der Rückstand wurde in Acetonitril aufgenommen und mittels präparativer HPLC (Methode 4) gereinigt. Es wurden 60 mg (85% d. Th., Reinheit 98%) der Titel- Verbindung erhalten.

Ή-NMR (400 MHz, DMSO-d ₆ ): δ [ppm] = 12.12 (s, 1H), 8.26 (dd, 1H), 8.20 (d, 1H), 8.08 (td, 1H), 7.99-7.90 (m, 3H), 7.04 (d, 2H), 4.59-4.46 (m, 2H), 4.14-4.05 (m, 1H), 3.93 (d, 2H), 3.87 (dd, 2H), 3.38-3.32 (teilweise verdeckt, 2H), 3.23 (t, 1H), 2.94-2.81 (m, 1H), 2.17-1.95 (m, 2H), 1.95- 1.83 (m, 1H), 1.72-1.61 (m, 3H), 1.57-1.45 (m, 1H), 1.33 (qd, 2H). LC/MS (Methode 1, ESIpos): R _t = 1.06 min, m/z = 492 [M+H] ⁺ .

Trennung der Enantiomere:

30 mg der racemischen Verbindung aus Beispiel 1 wurden in 12 ml Methanol/ Acetonitril in der Wärme gelöst und mittels präparativer SFC an chiraler Phase in die Enantiomere getrennt (siehe Beispiele 2 und 3) [Säule: Daicel Chiralpak AZ-H, 5 μιη, 250 mm x 20 mm; Fluss: 80 ml/min; Detektion: 210 nm; Injektionsvolumen: 1.0 ml; Temperatur: 40°C; Eluent: 60% Kohlendioxid / 40% Ethanol].

Beispiel 2

(+)-(lR5,25R,5R5)-2-[(4-Oxo-l,2,3-benzotriazin-3(4 /)-yl)methyl]-5-[4-(tetrahydro-2ii-pyran-4-yl- methoxy)benzoyl]cyclopentancarbonsäure (Enantiomer 1) Ausbeute: 14 mg; ehem. Reinheit = 100%; ee-Wert = 99% [a] _D ²⁰ = +66.9°, 589 nm, c = 0.27 g/100 ml, Chloroform

Ή-NMR (400 MHz, DMSO-de): δ [ppm] = 12.10 (br. s, 1H), 8.26 (d, 1H), 8.20 (d, 1H), 8.11-8.05 (m, 1H), 7.99-7.89 (m, 3H), 7.04 (d, 2H), 4.59-4.46 (m, 2H), 4.14-4.05 (m, 1H), 3.93 (d, 2H), 3.87 (dd, 2H), 3.32-3.19 (m, teilweise verdeckt, 3H), 2.94-2.80 (m, 1H), 2.18-1.96 (m, 2H), 1.95-1.84 (m, 1H), 1.72-1.61 (m, 3H), 1.58-1.44 (m, 1H), 1.33 (qd, 2H).

LC/MS (Methode 1, ESIpos): R _t = 1.04 min, m/z = 492 [M+H] ⁺ .

Beispiel 3

(-)-(lR5,25R,5R^-2-[(4-Oxo-l,2,3-benzotriazin-3(4 /)-yl)methyl]-5-[4-(tetrahydro-2ii-pyran-4-yl- methoxy)benzoyl]cyclopentancarbonsäure (Enantiomer 2)

Ausbeute: 17 mg; ehem. Reinheit = 100%; ee-Wert = 99%

[a] _D ²⁰ = -56.4°, 589 nm, c = 0.28 g/100 ml, Chloroform

Ή-NMR (400 MHz, DMSO-d ₆ ): δ [ppm] = 12.07 (br. s, 1H), 8.26 (dd, 1H), 8.20 (d, 1H), 8.08 (td, 1H), 7.99-7.89 (m, 3H), 7.04 (d, 2H), 4.53 (dd, 2H), 4.14-4.05 (m, 1H), 3.93 (d, 2H), 3.87 (dd, 2H), 3.34-3.28 (m, teilweise verdeckt, 2H), 3.24 (t, 1H), 2.98-2.81 (m, 1H), 2.17-1.96 (m, 2H), 1.95- 1.83 (m, 1H), 1.73-1.60 (m, 3H), 1.57-1.45 (m, 1H), 1.33 (qd, 2H).

LC/MS (Methode 1, ESIpos): R _t = 1.04 min, m/z = 492 [M+H] ⁺ .

Beispiel 4

(+/-)-(lR5,25R,5R5)-2-[(4-Oxo-l,2,3-benzotriazin-3(4 /)-yl)methyl]-5-{4-[2-(tetrahydro-2ii-pyran- 4-yl)ethoxy]benzoyl}cyclopentancarbonsäure (Racemat)

Eine Lösung von 2.91 g (4.75 mmol, Reinheit 99%) der Verbindung aus Beispiel 6A in 16 ml Dichlormethan wurde bei 0°C mit 8.0 ml (104 mmol) Trifluoressigsäure versetzt und 2 h bei 0°C gerührt. Anschließend wurde das Gemisch eingeengt und der Rückstand im Vakuum getrocknet. Nach Zugabe von wenig Ethylacetat wurde ein Feststoff erhalten, welcher abfiltriert, einmal mit wenig Ethylacetat und Pentan nachgewaschen und im Vakuum getrocknet wurde. Es wurden so 2.11 g (88% d. Th., Reinheit 100%) einer ersten Charge der Titelverbindung erhalten. Die verbliebene Mutterlauge wurde eingeengt und der Rückstand mittels präparativer HPLC gereinigt [Säule: Kinetix C18, 5 μιη, 100 mm x 21.2 mm; Fluss: 25 ml/min; Detektion: 210 nm; Injektionsvolumen: 0.5 ml; Temperatur: 40°C; Eluent: 44% Wasser / 45% Acetonitril / 11 % Ameisensäure in Wasser, isokratisch über 8 min] . Es wurden auf diese Weise 52 mg (2% d. Th., Reinheit 100%) einer zweiten Charge der Titelverbindung erhalten.

Ή-NMR (400 MHz, DMSO-de): δ [ppm] = 12.14 (br. s, 1H), 8.26 (d, 1H), 8.20 (d, 1H), 8.11-8.05 (m, 1H), 7.99-7.90 (m, 3H), 7.04 (d, 2H), 4.58-4.47 (m, 2H), 4.15-4.05 (m, 3H), 3.83 (dd, 2H), 3.34-3.19 (m, 3H), 2.94-2.81 (m, 1H), 2.16-2.04 (m, 1H), 1.95-1.83 (m, 1H), 1.75-1.58 (m, 6H), 1.57-1.45 (m, 1H), 1.29-1.14 (m, 2H).

LC/MS (Methode 1, ESIpos): R _t = 1.05 min, m/z = 506 [M+H] ⁺ .

Trennung der Enantiomere:

2.00 g der racemischen Verbindung aus Beispiel 4 wurden in 20 ml Dioxan angelöst, mit 180 ml eines Methanol/ Acetonitril-Gemisches versetzt, in der Wärme in Lösung gebracht und anschließend mittels präparativer SFC an chiraler Phase in die Enantiomere getrennt (siehe Beispiele 5 und 6) [Säule: Daicel Chiralpak AY-H, 5 μιη, 250 mm x 20 mm; Fluss: 80 ml/min; Detektion: 210 nm; Injektionsvolumen: 1.2 ml; Temperatur: 40°C; Eluent: 70% Kohlendioxid / 30% Ethanol, Laufzeit 16 min] .

Beispiel 5

(+)-(lR5,25R,5R5)-2-[(4-Oxo-l,2,3-benzotriazin-3(4 /)-yl)methyl]-5-{4-[2-(tetrahydro-2ii-pyran- 4-yl)ethoxy]benzoyl}cyclopentancarbonsäure (Enantiomer 1)

Es wurden 910 mg (ehem. Reinheit = 97%, ee-Wert = 100%) der Titelverbindung erhalten, welche in 20 ml Acetonitril aufgenommen und nochmals chromatographisch nachgereinigt wurden [Säule: Kinetix C18, 5 μιη, 100 mm x 30 mm; Fluss: 60 ml/min; Detektion: 210 nm; Injektionsvolumen: 1.0 ml; Temperatur: 30°C; Eluent: 45% Wasser / 50% Acetonitril / 5% Ameisensäure in Wasser, isokratisch über 4 min] . Es wurden so 850 mg der Titelverbindung in einer ehem. Reinheit von 100% erhalten. [a] _D ²⁰ = +71.0°, 589 nm, c = 0.37 g/100 ml, Chloroform Ή-NMR (500 MHz, DMSO-d ₆ ): δ [ppm] = 12.13 (br. s, 1H), 8.26 (dd, 1H), 8.20 (d, 1H), 8.08 (td, 1H), 7.98-7.90 (m, 3H), 7.04 (d, 2H), 4.58-4.47 (m, 2H), 4.14-4.05 (m, 3H), 3.83 (dd, 2H), 3.32- 3.20 (m, teilweise verdeckt, 3H), 2.88 (sext, 1H), 2.15-2.05 (m, 1H), 1.93-1.84 (m, 1H), 1.76-1.58 (m, 6H), 1.56-1.47 (m, 1H), 1.27-1.16 (m, 2H). LC/MS (Methode 1, ESIpos): R _t = 1.07 min, m/z = 506 [M+H] ⁺ .

Beispiel 6

(-)-(lR5,25R,5R^-2-[(4-Oxo-l,2,3-benzotriazin-3(4 /)-yl)methyl]-5-{4-[2-(tetrahydro-2ii-pyran-4- yl)ethoxy]benzoyl}cyclopentancarbonsäure (Enantiomer 2)

Ausbeute: 903 mg; ehem. Reinheit = 100%; ee-Wert = 100% [a] _D ²⁰ = -70.1°, 589 nm, c = 0.35 g/100 ml, Chloroform

Ή-NMR (400 MHz, DMSO-d ₆ ): δ [ppm] = 8.26 (d, 1H), 8.20 (d, 1H), 8.11-8.05 (m, 1H), 7.99- 7.90 (m, 3H), 7.04 (d, 2H), 4.59-4.47 (m, 2H), 4.14-4.06 (m, 3H), 3.83 (dd, 2H), 3.32-3.20 (m, 3H), 2.87 (sext, 1H), 2.17-2.04 (m, 1H), 1.95-1.83 (m, 1H), 1.75-1.58 (m, 6H), 1.57-1.45 (m, 1H), 1.29-1.15 (m, 2H). LC/MS (Methode 1, ESIpos): R _t = 1.05 min, m/z = 506 [M+H] ⁺ .

Beispiel 7

(+/-)-(lRS,2SR,5RS)-2-{ [4-Oxo-6-(trifl^^

hydro-2 i-pyran-4-ylmethoxy)benzoyl]cyclopentancarbonsäure (Racemat)

Eine Lösung von 585 mg (0.89 mmol) der Verbindung aus Beispiel 9A in 3 ml Dichlormethan wurde bei 0°C mit 1.5 ml (19.47 mmol) Trifluoressigsäure versetzt. Das Gemisch wurde 5.5 h bei 0°C gerührt und danach eingeengt. Der Rückstand wurde in 5 ml Acetonitril aufgenommen. Dabei fiel ein Feststoff aus, welcher abfiltriert und im Vakuum getrocknet wurde. Es wurden 468 mg (95% d. Th., Reinheit 100%) der Titelverbindung erhalten. Ή-NMR (400 MHz, DMSO-d ₆ ): δ [ppm] = 12.13 (s, IH), 8.51 (s, IH), 8.46-8.38 (m, 2H), 7.96 (d, 2H), 7.04 (d, 2H), 4.57 (d, 2H), 4.15-4.05 (m, IH), 3.93 (d, 2H), 3.87 (dd, 2H), 3.38-3.28 (verdeckt, 2H), 3.24 (t, IH), 2.94-2.79 (m, IH), 2.18-1.87 (m, 3H), 1.73-1.61 (m, 3H), 1.59-1.46 (m, IH), 1.33 (qd, 2H). LC/MS (Methode 1, ESIpos): R _t = 1.17 min, m/z = 660 [M+H] ⁺ .

Trennung der Enantiomere:

465 mg der racemischen Verbindung aus Beispiel 7 wurden in 15 ml DMSO und 30 ml Ethanol gelöst und mittels präparativer SFC an chiraler Phase in die Enantiomere getrennt (siehe Beispiele 8 und 9) [Säule: Daicel Chiralpak AY, 20 μιη, 250 mm x 30 mm; Fluss: 175 ml/min; Detektion: 210 nm; Injektionsvolumen: 1.3 ml; Temperatur: 38°C; Eluent: 75% Kohlendioxid / 25% Ethanol, Laufzeit 16.5 min].

Beispiel 8

(+)-(lRS,2SR,5RS)-2-{ [4-Oxo-6-(trifluom^

hydro-2 i-pyran-4-ylmethoxy)benzoyl]cyclopentancarbonsäure (Enantiomer 1) Ausbeute: 239 mg; ehem. Reinheit = 100%; ee-Wert = 100% [ab ²⁰ = +80.2°, 589 nm, c = 0.31 g/100 ml, Chloroform

Ή-NMR (400 MHz, DMSO-d ₆ ): δ [ppm] = 12.13 (br. s, IH), 8.51 (s, IH), 8.46-8.38 (m, 2H), 7.96 (d, 2H), 7.04 (d, 2H), 4.57 (d, 2H), 4.15-4.05 (m, IH), 3.93 (d, 2H), 3.87 (dd, 2H), 3.37-3.28 (verdeckt, 2H), 3.24 (t, IH), 2.94-2.80 (m, IH), 2.17-1.88 (m, 3H), 1.72-1.61 (m, 3H), 1.58-1.46 (m, IH), 1.33 (qd, 2H).

LC/MS (Methode 1, ESIpos): R _t = 1.17 min, m/z = 660 [M+H] ⁺ .

Beispiel 9

(-)-(lRS,2SR,5R^-2-{ [4-Oxo-6-(trifluorme

hydro-2 i-pyran-4-ylmethoxy)benzoyl]cyclopentancarbonsäure (Enantiomer 2) Ausbeute: 228 mg; ee-Wert = 100%

[a] _D ²⁰ = -88.9°, 589 nm, c = 0.31 g/100 ml, Chloroform

Ή-NMR (400 MHz, DMSO-de): δ [ppm] = 12.13 (br. s, IH), 8.51 (s, IH), 8.46-8.37 (m, 2H), 7.96 (d, 2H), 7.04 (d, 2H), 4.57 (d, 2H), 4.14-4.05 (m, IH), 3.93 (d, 2H), 3.87 (dd, 2H), 3.37-3.28 (ver- deckt, 2H), 3.23 (t, 1H), 2.94-2.80 (m, 1H), 2.17-1.87 (m, 3H), 1.73-1.61 (m, 3H), 1.58-1.46 (m, 1H), 1.33 (qd, 2H).

LC/MS (Methode 1, ESIpos): R _t = 1.17 min, m/z = 660 [M+H] ⁺ . Beispiel 10 (+/-)-(lRS,2SR,5RS)-2- { [4-Oxo-6-(trifluormethyl)- 1 ,2,3-benzotriazin-3(4//)-yl] methyl } -5- { 4- [2- (tetrahydro-2/i-pyran-4-yl)ethoxy]benzoyl}cyclopentancarbons äure (Racemat)

Eine Lösung von 135 mg (0.20 mmol) der Verbindung aus Beispiel 10A in 0.7 ml Dichlormethan wurde bei 0°C mit 0.35 ml (4.54 mmol) Trifluoressigsäure versetzt. Das Gemisch wurde 2.5 h bei 0°C gerührt und danach eingeengt. Der Rückstand wurde in 2 ml Acetonitril aufgenommen und mittels präparativer HPLC (Methode 5) gereinigt. Es wurden 91 mg (80% d. Th., Reinheit 100%) der Titelverbindung erhalten.

Ή-NMR (400 MHz, DMSO-d ₆ ): δ [ppm] = 12.13 (s, 1H), 8.51 (s, 1H), 8.46-8.38 (m, 2H), 7.96 (d, 2H), 7.04 (d, 2H), 4.57 (d, 2H), 4.14-4.05 (m, 3H), 3.83 (dd, 2H), 3.32-3.20 (m, 3H), 2.93-2.81 (m, 1H), 2.17-2.03 (m, 1H), 2.00-1.88 (m, 1H), 1.76-1.45 (m, 7H), 1.29-1.14 (m, 2H).

LC/MS (Methode 1, ESIpos): R _t = 1.21 min, m/z = 574 [M+H] ⁺ .

Trennung der Enantiomere:

83 mg der racemischen Verbindung aus Beispiel 10 wurden in 2 ml Ethanol gelöst und mittels präparativer HPLC an chiraler Phase in die Enantiomere getrennt (siehe Beispiele 11 und 12) [Säule: Daicel Chiralpak AY-H, 5 μιη, 250 mm x 20 mm; Fluss: 15 ml/min; Detektion: 220 nm; Injektionsvolumen: 1 ml; Temperatur: 45°C; Eluent: t = 0-15 min 25% Isohexan / 75% Ethanol + 0.2% Essigsäure].

Beispiel 11

(+)-(lRS,2SR,5RS)-2- { [4-Oxo-6-(trifluormefhyl)- 1 ,2,3-benzotriazin-3(4//)-yl] methyl } -5- { 4- [2- (tetrahydro-2 i-pyran-4-yl)ethoxy]benzoyl}cyclopentancarbonsäure (Enantiomer 1) Ausbeute: 38 mg; ee-Wert = 100%

[a] _D ²⁰ = +70.7°, 589 nm, c = 0.10 g/100 ml, Chloroform

Ή-NMR (400 MHz, DMSO-de): δ [ppm] = 12.13 (s, 1H), 8.51 (s, 1H), 8.46-8.38 (m, 2H), 7.96 (d, 2H), 7.04 (d, 2H), 4.57 (d, 2H), 4.14-4.06 (m, 3H), 3.83 (dd, 2H), 3.32-3.20 (m, 3H), 2.91-2.83 (m, 1H), 2.16-2.04 (m, 1H), 1.99-1.88 (m, 1H), 1.75-1.58 (m, 6H), 1.57-1.47 (m, 1H), 1.29-1.15 (m, 2H).

LC/MS (Methode 1, ESIpos): R _t = 1.22 min, m/z = 574 [M+H] ⁺ . Beispiel 12

(-)-(lR5,25R,5R^-2-{ [4-Oxo-6-(trifluormethyl)-l,2,3-benzotriazin-3(4 ^-yl]methyl }-5-{4-[2- (tetrahydro-2/i-pyran-4-yl)ethoxy]benzoyl}cyclopentancarbons äure (Enantiomer 2)

Ausbeute: 45 mg; ee-Wert = 100%

[a] _D ²⁰ = -77.1°, 589 nm, c = 0.37 g/100 ml, Chloroform

Ή-NMR (400 MHz, DMSO-d ₆ ): δ [ppm] = 12.13 (s, 1H), 8.51 (s, 1H), 8.46-8.38 (m, 2H), 7.96 (d, 2H), 7.04 (d, 2H), 4.57 (d, 2H), 4.15-4.05 (m, 3H), 3.83 (dd, 2H), 3.32-3.20 (m, 3H), 2.93-2.81 (m, 1H), 2.17-2.04 (m, 1H), 1.99-1.87 (m, 1H), 1.74-1.58 (m, 6H), 1.58-1.47 (m, 1H), 1.29-1.15 (m, 2H).

LC/MS (Methode 1, ESIpos): R _t = 1.22 min, m/z = 574 [M+H] ⁺ .

Beispiel 13

(+/-)-(lR5,25R,5R5)-2-{ [4-Oxo-6-(trifluormethyl)-l,2,3-benzotriazin-3(4 /)-yl]methyl}-5-{4- [(tetrahydro-2i7-pyran-4-ylmefhyl)sulfanyl]benzoyl Jcyclopentancarbonsäure (Racemat)

Eine Lösung von 249 mg (0.35 mmol, Reinheit 95%) der Verbindung aus Beispiel 13A in 3.5 ml Dichlormethan wurde bei 0°C mit 1.75 ml Trifluoressigsäure versetzt. Das Gemisch wurde zu- nächst 15 min bei 0°C und dann 1 h bei RT gerührt und anschließend eingeengt. Der Rückstand wurde mittels präparativer HPLC (Methode 4) gereinigt. Es wurden 163 mg (81 % d. Th., Reinheit 100%) der Titelverbindung erhalten.

Ή-NMR (400 MHz, DMSO-d ₆ ): δ [ppm] = 12.16 (br. s, 1H), 8.51 (s, 1H), 8.46-8.37 (m, 2H), 7.90 (d, 2H), 7.41 (d, 2H), 4.62-4.52 (m, 2H), 4.15-4.06 (m, 1H), 3.83 (dd, 2H), 3.30-3.19 (m, 3H), 3.02 (d, 2H), 2.94-2.81 (m, 1H), 2.20-2.04 (m, 1H), 2.01-1.87 (m, 1H), 1.84-1.61 (m, 4H), 1.60-1.45 (m, 1H), 1.35-1.17 (m, 2H).

LC/MS (Methode 1, ESIpos): R _t = 1.20 min, m/z = 576 [M+H] ⁺ .

Trennung der Enantiomere:

150 mg der racemischen Verbindung aus Beispiel 13 wurden in 3 ml Acetonitril/Ethanol gelöst und mittels präparativer HPLC an chiraler Phase in die Enantiomere getrennt (siehe Beispiele 14 und 15) [Säule: Daicel Chiralpak AS-H, 5 μιη, 250 mm x 4.6 mm; Fluss: 20 ml/min; Detektion: 230 nm; Injektionsvolumen: 0.06 ml; Temperatur: 25°C; Eluent: t = 0-16 min 20% Ethanol / 76% Acetonitril / 4% 5%-ige Essigsäure in Acetonitril] . Beispiel 14

(-)-(lRS,2SR,5R^-2-{ [4-Oxo-6-(trifluorme

hydro-2 i-pyran-4-ylmethyl)sulfanyl]benzoyl}cyclopentancarbonsäure (Enantiomer 1)

Ausbeute: 59 mg; ehem. Reinheit = 100%; ee-Wert = 100%

[a] _D ²⁰ = -85.6°, 589 nm, c = 0.39 g/100 ml, Chloroform Ή-NMR (400 MHz, DMSO-d ₆ ): δ [ppm] = 12.15 (br. s, 1H), 8.51 (s, 1H), 8.46-8.37 (m, 2H), 7.90 (d, 2H), 7.41 (d, 2H), 4.63-4.51 (m, 2H), 4.16-4.03 (m, 1H), 3.83 (dd, 2H), 3.29-3.19 (m, 3H), 3.02 (d, 2H), 2.94-2.81 (m, 1H), 2.18-2.05 (m, 1H), 2.02-1.86 (m, 1H), 1.83-1.61 (m, 3H), 1.59-1.44 (m, 1H), 1.36-1.19 (m, 2H).

LC/MS (Methode 1, ESIpos): R _t = 1.21 min, m/z = 576 [M+H] ⁺ . Beispiel 15

(+)-(lRS,2SR,5RS)-2- { [4-Oxo-6-(trifluormethyl)- 1 ,2,3-benzotriazin-3(4 /)-yl] methyl } -5- { 4- [(tetra- hydro-2 i-pyran-4-ylmethyl)sulfanyl]benzoyl}cyclopentancarbonsäure (Enantiomer 2)

Ausbeute: 61 mg; ehem. Reinheit = 100%; ee-Wert [a] _D ²⁰ = +53.1°, 589 nm, c = 0.16 g/100 ml, Chloroform

Ή-NMR (400 MHz, DMSO-d ₆ ): δ [ppm] = 12.14 (br. s, IH), 8.51 (s, IH), 8.46-8.37 (m, 2H), 7.90 (d, 2H), 7.41 (d, 2H), 4.63-4.50 (m, 2H), 4.16-4.05 (m, IH), 3.83 (dd, 2H), 3.29-3.17 (m, 3H), 3.02 (d, 2H), 2.94-2.77 (m, IH), 2.18-2.04 (m, IH), 2.02-1.86 (m, IH), 1.83-1.62 (m, 3H), 1.60-1.45 (m, IH), 1.35-1.20 (m, 2H).

LC/MS (Methode 1, ESIpos): R _t = 1.21 min, m/z = 576 [M+H] ⁺ .

Beispiel 16

(+/-)-(lR5,25R,5R5)-2-[(6-Methyl-4-oxo-l,2,3-benzotriazin -3(4 /)-yl)methyl]-5-[4-(tetrahydro-2ii- pyran-4-ylmethoxy)benzoyl]cyclopentancarbonsäure (Racemat)

Eine Lösung von 290 mg (0.39 mmol, Reinheit 82%) der Verbindung aus Beispiel 16A in 1.3 ml Dichlormethan wurde bei 0°C mit 0.7 ml (8.65 mmol) Trifluoressigsäure versetzt. Das Gemisch wurde 1 h bei RT gerührt und anschließend eingeengt. Der Rückstand wurde mittels präparativer HPLC (Methode 4) gereinigt. Es wurden 153 mg (77% d. Th., Reinheit 100%) der Titelverbindung erhalten.

Ή-NMR (400 MHz, DMSO-d ₆ ): δ [ppm] = 12.12 (br. s, IH), 8.12-8.04 (m, 2H), 7.96 (d, 2H), 7.90 (dd, IH), 7.04 (d, 2H), 4.51 (d, 2H), 4.13-4.04 (m, IH), 3.93 (d, 2H), 3.88 (dd, 2H), 3.37-3.28 (m, 2H), 3.23 (t, IH), 2.93-2.80 (m, IH), 2.55 (s, 3H), 2.16-1.95 (m, 2H), 1.93-1.82 (m, IH), 1.71-1.61 (m, 3H), 1.50 (dd, IH), 1.33 (qd, 2H). LC/MS (Methode 1, ESIpos): R _t = 1.06 min, m/z = 506 [M+H] ⁺ .

Trennung der Enantiomere:

144 mg der racemischen Verbindung aus Beispiel 16 wurden in 11 ml Ethanol gelöst und mittels präparativer SFC an chiraler Phase in die Enantiomere getrennt (siehe Beispiele 17 und 18) [Säule: Phenomenex Amylose Π, 5 μιη, 250 mm x 20 mm; Fluss: 100 ml/min; Detektion: 210 nm; Injek- tionsvolumen: 0.40 ml; Temperatur: 40°C; Eluent: 65% Kohlendioxid / 35% Ethanol, Laufzeit 15 min] .

Beispiel 17

(+)-(lR5,25R,5R5)-2-[(6-Methyl-4-oxo-l,2,3-benzotriazin-3 (4 /)-yl)methyl]-5-[4-(tetrahydro-2ii- pyran-4-ylmethoxy)benzoyl]cyclopentancarbonsäure (Enantiomer 1)

Ausbeute: 63 mg; ehem. Reinheit = 94%; ee-Wert = 100%

[ab ²⁰ = +68.4°, 589 nm, c = 0.39 g/100 ml, Chloroform

Ή-NMR (400 MHz, DMSO-d ₆ ): δ [ppm] = 12.12 (br. s, IH), 8.11-8.04 (m, 2H), 7.96 (d, 2H), 7.90 (dd, IH), 7.04 (d, 2H), 4.51 (d, 2H), 4.14-4.04 (m, IH), 3.93 (d, 2H), 3.87 (dd, 2H), 3.37-3.28 (teil- weise verdeckt, 2H), 3.23 (t, IH), 2.92-2.80 (m, IH), 2.55 (s, 3H), 2.16-1.94 (m, 2H), 1.93-1.82 (m, IH), 1.67 (d, 3H), 1.56-1.44 (m, IH), 1.33 (qd, 2H).

LC/MS (Methode 1, ESIpos): R _t = 1.07 min, m/z = 506 [M+H] ⁺ .

Beispiel 18

(-)-(lR5,25R,5R^-2-[(6-Methyl-4-oxo-l,2,3-benzotriazin-3( 4 /)-yl)methyl]-5-[4-(tetrahydro-2ii- pyran-4-ylmethoxy)benzoyl]cyclopentancarbonsäure (Enantiomer 2)

Ausbeute: 63 mg; ehem. Reinheit = 100%; ee-Wert = 100%

[a] _D ²⁰ = -63.7°, 589 nm, c = 0.37 g/100 ml, Chloroform

Ή-NMR (400 MHz, DMSO-d ₆ ): δ [ppm] = 12.12 (br. s, IH), 8.12-8.04 (m, 2H), 7.96 (d, 2H), 7.90 (dd, IH), 7.04 (d, 2H), 4.51 (d, 2H), 4.14-4.04 (m, IH), 3.93 (d, 2H), 3.87 (dd, 2H), 3.37-3.28 (teil- weise verdeckt, 2H), 3.22 (t, IH), 2.93-2.79 (m, IH), 2.55 (s, 3H), 2.16-1.96 (m, 2H), 1.94-1.81 (m, IH), 1.72-1.60 (m, 3H), 1.56-1.43 (m, IH), 1.33 (qd, 2H).

LC/MS (Methode 1, ESIpos): R _t = 1.07 min, m/z = 506 [M+H] ⁺ .

Beispiel 19

(+/-)-(lR5,25R,5R5)-2-[(6-Methyl-4-oxo-l,2,3-benzotriazin -3(4 /)-yl)methyl]-5-{4-[2-(tetrahydro- 2i7-pyran-4-yl)efhoxy]benzoyl}cyclopentancarbonsäure (Racemat)

Eine Lösung von 142 mg (0.23 mmol) der Verbindung aus Beispiel 17A in 0.8 ml Dichlormethan wurde bei 0°C mit 0.4 ml (5.03 mmol) Trifluoressigsäure versetzt. Das Gemisch wurde 1 h bei RT gerührt und anschließend eingeengt. Der Rückstand wurde mittels präparativer HPLC (Methode 6) gereinigt. Es wurden 84 mg (71 % d. Th., Reinheit 100%) der Titelverbindung erhalten.

Ή-NMR (400 MHz, DMSO-d ₆ ): δ [ppm] = 12.12 (br. s, 1H), 8.11-8.04 (m, 2H), 7.96 (d, 2H), 7.90 (dd, 1H), 7.04 (d, 2H), 4.51 (d, 2H), 4.15-4.05 (m, 3H), 3.83 (dd, 2H), 3.32-3.20 (m, 3H), 2.93- 2.80 (m, 1H), 2.55 (s, 3H), 2.16-2.04 (m, 1H), 1.93-1.82 (m, 1H), 1.76-1.57 (m, 6H), 1.57-1.44 (m, 1H), 1.30-1.12 (m, 2H). LC/MS (Methode 1, ESIpos): R _t = 1.14 min, m/z = 520 [M+H] ⁺ .

Trennung der Enantiomere:

69 mg der racemischen Verbindung aus Beispiel 19 wurden in 10 ml Ethanol/Acetonitril gelöst und mittels präparativer SFC an chiraler Phase in die Enantiomere getrennt (siehe Beispiele 20 und 21) [Säule: Phenomenex Amylose II, 5 μιη, 250 mm x 20 mm; Fluss: 100 ml/min; Detektion: 210 nm; Injektionsvolumen: 0.40 ml; Temperatur: 40°C; Eluent: 70% Kohlendioxid / 30% Ethanol, Laufzeit 18 min] .

Beispiel 20

(+)-( lRS,2SR,5RS)-2- [(6-Methyl-4-oxo- 1 ,2,3-benzotriazin-3(4 /)-yl)methyl] -5- { 4- [2-(tetrahydro- 2i7-pyran-4-yl)ethoxy]benzoyl}cyclopentancarbonsäure (Enantiomer 1) Ausbeute: 22 mg; ehem. Reinheit = 100%; ee-Wert = 100%

[a] _D ²⁰ = +50.6°, 589 nm, c = 0.32 g/100 ml, Chloroform

Ή-NMR (400 MHz, DMSO-de): δ [ppm] = 12.10 (br. s, 1H), 8.12-8.04 (m, 2H), 7.96 (d, 2H), 7.90 (d, 1H), 7.04 (d, 2H), 4.51 (d, 2H), 4.16-4.04 (m, 3H), 3.83 (dd, 2H), 3.32-3.19 (m, teilweise verdeckt, 3H), 2.93-2.79 (m, 1H), 2.55 (s, 3H), 2.17-2.04 (m, 1H), 1.94-1.82 (m, 1H), 1.76-1.58 (m, 6H), 1.56-1.44 (m, 1H), 1.29-1.11 (m, 2H).

LC/MS (Methode 1, ESIpos): R _t = 1.10 min, m/z = 520 [M+H] ⁺ . Beispiel 21

(-)-(lR5,25R,5R^-2-[(6-Methyl-4-oxo-l,23-benzotriazin-3(4 /)-yl)methyl]-5-{4-[2-(tetrahydro- 2/f-pyran-4-yl)ethoxy]berizoyl}cyclopentaricarborisäure (Enantiomer 2)

Ausbeute: 20 mg; ehem. Reinheit = 95%; ee-Wert = 100% [a] _D ²⁰ = -50.6°, 589 nm, c = 0.31 g/100 ml, Chloroform

Ή-NMR (400 MHz, DMSO-d ₆ ): δ [ppm] = 12.10 (br. s, IH), 8.11-8.04 (m, 2H), 7.96 (d, 2H), 7.90 (dd, IH), 7.04 (d, 2H), 4.51 (d, 2H), 4.15-4.04 (m, 3H), 3.83 (dd, 2H), 3.32-3.19 (m, teilweise verdeckt, 3H), 2.93-2.79 (m, IH), 2.55 (s, 3H), 2.16-2.04 (m, IH), 1.94-1.81 (m, IH), 1.74-1.57 (m, 6H), 1.56-1.44 (m, IH), 1.29-1.14 (m, 2H).

B. Bewertung der pharmakologischen Wirksamkeit

Die pharmakologische Aktivität der erfindungsgemäßen Verbindungen kann durch in vitro- und in vzvo-Untersuchungen, wie sie dem Fachmann bekannt sind, nachgewiesen werden. Die nachfolgenden Anwendungsbeispiele beschreiben die biologische Wirkung der erfindungsgemäßen Verbindungen, ohne die Erfindung auf diese Beispiele zu beschränken.

Abkürzungen und Akronyme:

APMA 4-Aminophenylquecksilberacetat

Brij ^® -35 Polyoxyethylenlaurylether

BSA bovines Serumalbumin

CYP Cytochrom P450

Dap (oder Dpa) L-2,3-Diaminopropionsäure (ß-Amino-L-alanin)

DMSO Dimethylsulfoxid

Dnp 2,4-Dinitrophenyl

EDTA Ethylendiamintetraessigsäure

HEPES 2-[4-(2-Hydroxyethyl)piperazin-l-yl]ethansulfonsäure

HME humane Makrophagen-Elastase

IC Inhibitionskonzentration

Mca (7 -Methoxycumarin-4-yl) acetyl

MMP Matrixmetallopeptidase

MTP Mikrotiterplatte

NADP ⁺ Nikotinsäureamid-Adenin-Dinukleotid-Phosphat (oxidierte Form)

NADPH Nikotinsäureamid-Adenin-Dinukleotid-Phosphat (reduzierte Form)

Nval Norvalin

PBS Phosphat-gepufferte Salzlösung

PEG Polyethylenglykol

Tris Tris(hydroxymethyl)aminomethan

v/v Volumen zu Volumen- Verhältnis (einer Lösung)

w/w Gewicht zu Gewicht- Verhältnis (einer Lösung)

B-l. In vitro HME-Inhibitionstest

Die Wirkstärke der erfindungsgemäßen Verbindungen gegenüber HME (MMP-12) wird in einem in vi tro -Hemmte st ermittelt. Die HME-vermittelte amidolytische Spaltung eines geeigneten Peptid- substrats führt hierin zu einer Fluoreszenzlichtzunahme. Die Signalintensität des Fluoreszenz- lichtes ist direkt proportional zur Enzymaktivität. Die Wirkkonzentration einer Testverbindung, bei der die Hälfte des Enzyms inhibiert ist (50% Signalintensität des Fluoreszenzlichtes), wird als IC ₅ o-Wert angegeben.

Standard-m vitro HME-Inhibitionstest:

In einer 384 Loch-Mikrotiterplatte werden in einem Testvolumen von insgesamt 41 μΐ der Testpuffer (0.1 M HEPES pH 7.4, 0.15 M NaCl, 0.03 M CaCl ₂ , 0.004 mM ZnCl ₂ , 0.02 M EDTA, 0.005% Brij ^® ), das Enzym (0.5 nM HME; Fa. R&D Systems, 917-MP, autokatalytische Aktivierung nach Angaben des Herstellers) und das intramolekular gequenchte Substrat [5 μΜ Mca-Pro- Leu-Gly-Leu-Glu-Glu-Ala-Dap(Dnp)-NH ₂ ; Fa. Bachem, M-2670] bei An- und Abwesenheit der Testsubstanz (als Lösung in DMSO) zwei Stunden lang bei 37°C inkubiert. Die Fluoreszenzlichtintensität der Testansätze wird gemessen (Excitation 323 nm, Emission 393 nm). Die ICso-Werte werden durch eine Auftragung der Fluoreszenzlichtintensität gegenüber der Wirkstoffkonzentration ermittelt.

Hochsensitiver in vitro HME-Inhibitionstest:

Ergeben sich bei hochpotenten Testsubstanzen im oben beschriebenen Standard-HME-Inhibitions- test subnanomolare IC-Werte, so wird zu deren genauerer Ermittlung ein modifizierter Test verwendet. Hierbei wird eine zehnfach niedrigere Enzymkonzentration eingesetzt (finale Konzentration z.B. 0.05 nM), um eine erhöhte Sensitivität des Tests zu erreichen. Die Inkubationszeit des Tests wird entsprechend länger gewählt (z.B. 16 Stunden). In vitro HME-Inhibitionstest in Anwesenheit von Serumalbumin im Reaktionspuffer:

Dieser Test entspricht dem oben beschriebenen Standard-HME-Inhibitionstest, jedoch unter Verwendung eines modifizierten Reaktionspuffers. Dieser Reaktionspuffer enthält zusätzlich Rinderserumalbumin (BSA, fettsäurefrei, A6003, Fa. Sigma-Aldrich) einer finalen Konzentration von 2% (w/w), was in etwa der Hälfte des physiologischen Serumalbumingehaltes entspricht. Die Enzym- konzentration in diesem modifizierten Test ist leicht erhöht (z.B. 0.75 nM), ebenso die Inkubationsdauer (z.B. drei Stunden).

In der folgenden Tabelle 1A sind für individuelle Ausführungsbeispiele der Erfindung die ICso- Werte aus dem Standard- bzw. hochsensitiven HME-Inhibitionstest wiedergegeben (zum Teil als Mittelwerte aus mehreren unabhängigen Einzelbestimmungen und gerundet auf zwei signifikante Stellen): Tabelle 1A: Hemmung der humanen Makrophagen-Elastase (HME / hMMP-12)

In der folgenden Tabelle 1B sind für repräsentative Ausführungsbeispiele der Erfindung die IC ₅₀ - Werte aus dem HME-Inhibitionstest in Abwesenheit (vgl. Daten in Tabelle 1A) bzw. Anwesenheit von Serumalbumin gegenübergestellt (zum Teil als Mittelwerte aus mehreren unabhängigen Einzelbestimmungen und gerundet auf zwei signifikante Stellen):

Tabelle 1B: Hemmung der humanen Makrophagen-Elastase (HME / hMMP-12) in Abwesenheit (-) bzw. Anwesenheit (+) von Serumalbumin (BSA)

Beispiel HME ICso [nM] HME ICso [nM]

Nr. (- BSA) (+ BSA)

1 0.040 6.45

2 0.071 6.71

4 0.37 37.3

5 0.085 4.06

8 0.016 2.45

11 0.19 39.2

15 0.026 16.0

19 0.12 32.0 Beispiel HME ICso [nM] HME ICso [nM]

Nr. (- BSA) (+ BSA)

20 0.053 12.2

Beim Vergleich der in Tabelle 1B wiedergegebenen Daten zeigt sich, dass die erfindungsgemäßen Verbindungen auch in Gegenwart von Serumalbumin noch eine hohe inhibitorische Potenz (häufig im nanomolaren Bereich) gegenüber HME aufweisen. Dies deutet auf eine weniger stark aus- geprägte unspezifische Wechselwirkung der erfindungsgemäßen Verbindungen mit Blutplasma- Bestandteilen hin und lässt so eine erhöhte "freie Fraktion" dieser Verbindungen im Blut erwarten, was sich günstig auf die in vzVo-Wirksamkeit auswirken sollte.

B-2. In vitro MMP-Inhibitionstests

Die Wirkstärke der erfindungsgemäßen Verbindungen gegenüber anderen MMPs (und damit ihre Selekivität) wird ebenfalls in in vz ^' iro-Hemmtests ermittelt. Die MMP-vermittelte amidolytische Spaltung eines geeigneten Peptidsubstrats führt auch hier zu einer Fluoreszenzlichtzunahme. Die Signalintensität des Fluoreszenzlichtes ist direkt proportional zur Enzymaktivität. Die Wirkkonzentration einer Testverbindung, bei der die Hälfte des Enzyms inhibiert ist (50% Signalintensität des Fluoreszenzlichtes), wird als ICso-Wert angegeben. a) Humane MMPs:

In vitro MMP-1 -Inhibitionstest:

Rekombinantes MMP-1 (Fa. R&D Systems, 901-MP) wird den Herstellerangaben entsprechend durch Verwenden von APMA chemisch aktiviert. Zu 24 μΐ aktivierten Enzyms (finale Konzentration z.B. 2 nM) in Reaktionspuffer (50 mM Tris/HCl pH 7.5, 10 mM CaCl ₂ , 150 mM NaCl, 0.05% Brij ^® -35) wird 1 μΐ der zu untersuchenden Testverbindung (als Lösung in DMSO, geeignete Konzentrationen z.B. 1 nM bis 30 μΜ) in einer weißen 384 Loch-Mikrotiterplatte (MTP) pipettiert. Die enzymatische Reaktion wird durch Zugabe des intramolekular gequenchten Substrats Mca- Pro-Leu-Gly-Leu-Dpa(Dnp)-Ala-Arg-NH ₂ (finale Konzentration z.B. 10 μΜ; R&D Systems, ES- 001) gestartet, so dass ein Gesamttestvolumen von 50 μΐ resultiert. Der Verlauf der MMP-l-Reak- tion wird durch Messung der Fluoreszenzintensität (Excitation 320 nm, Emission 410 nm) über einen geeigneten Zeitraum hinweg gemessen (z.B. über 120 min bei einer Temperatur von 32°C).

In vitro MMP-2 -Inhibitionstest:

Rekombinantes MMP-2 (Fa. R&D Systems, 902-MP) wird den Herstellerangaben entsprechend durch Verwenden von APMA chemisch aktiviert. Zu 24 μΐ aktivierten Enzyms (finale Konzentra- tion z.B. 2 nM) in Reaktionspuffer (50 mM Tris/HCl pH 7.5, 10 mM CaCh, 150 mM NaCl, 0.05% Brij ^® -35) wird 1 μΐ der zu untersuchenden Testverbindung (als Lösung in DMSO, geeignete Konzentrationen z.B. 1 nM bis 30 μΜ) in einer weißen 384 Loch-Mikrotiterplatte (MTP) pipettiert. Die enzymatische Reaktion wird durch Zugabe des intramolekular gequenchten Substrats Mca- Pro-Leu-Gly-Leu-Dpa(Dnp)-Ala-Arg-NH ₂ (finale Konzentration z.B. 10 μΜ; R&D Systems, ES- 001) gestartet, so dass ein Gesamttestvolumen von 50 μΐ resultiert. Der Verlauf der MMP-2-Reak- tion wird durch Messung der Fluoreszenzintensität (Excitation 320 nm, Emission 410 nm) über einen geeigneten Zeitraum hinweg gemessen (z.B. über 120 min bei einer Temperatur von 32°C).

In vitro MMP-3-Inhibitionstest:

Rekombinantes MMP-3 (Fa. R&D Systems, 513-MP) wird den Herstellerangaben entsprechend durch Verwenden von APMA chemisch aktiviert. Zu 24 μΐ aktivierten Enzyms (finale Konzentration z.B. 2 nM) in Reaktionspuffer (50 mM Tris/HCl pH 7.5, 10 mM CaCh, 150 mM NaCl, 0.05% Brij ^® -35) wird 1 μΐ der zu untersuchenden Testverbindung (als Lösung in DMSO, geeignete Konzentrationen z.B. 1 nM bis 30 μΜ) in einer weißen 384 Loch-Mikrotiterplatte (MTP) pipettiert. Die enzymatische Reaktion wird durch Zugabe des intramolekular gequenchten Substrats Mca- Arg-Pro-Lys-Pro-Val-Glu-Nval-Trp-Arg-Lys(Dnp)-NH ₂ (finale Konzentration z.B. 10 μΜ; R&D Systems, ES-002) gestartet, so dass ein Gesamttestvolumen von 50 μΐ resultiert. Der Verlauf der MMP-3 -Reaktion wird durch Messung der Fluoreszenzintensität (Excitation 320 nm, Emission 410 nm) über einen geeigneten Zeitraum hinweg gemessen (z.B. über 120 min bei einer Temperatur von 32°C).

In vitro MMP-7 -Inhibitionstest:

Rekombinantes MMP-7 (Fa. R&D Systems, 907-MP) wird den Herstellerangaben entsprechend durch Verwenden von APMA chemisch aktiviert. Zu 24 μΐ aktivierten Enzyms (finale Konzentration z.B. 0.5 nM) in Reaktionspuffer (50 mM Tris/HCl pH 7.5, 10 mM CaCl ₂ , 150 mM NaCl, 0.05% Brij ^® -35) wird 1 μΐ der zu untersuchenden Testverbindung (als Lösung in DMSO, geeignete Konzentrationen z.B. 1 nM bis 30 μΜ) in einer weißen 384 Loch-Mikrotiterplatte (MTP) pipettiert. Die enzymatische Reaktion wird durch Zugabe des intramolekular gequenchten Substrats Mca-Pro-Leu-Gly-Leu-Dpa(Dnp)-Ala-Arg-NH ₂ (finale Konzentration z.B. 10 μΜ; R&D Systems, ES-001) gestartet, so dass ein Gesamttestvolumen von 50 μΐ resultiert. Der Verlauf der MMP-7 - Reaktion wird durch Messung der Fluoreszenzintensität (Excitation 320 nm, Emission 410 nm) über einen geeigneten Zeitraum hinweg gemessen (z.B. über 120 min bei einer Temperatur von 32°C). In vitro MMP-8-Inhibitionstest:

Rekombinantes MMP-8 (Fa. R&D Systems, 908-MP) wird den Herstellerangaben entsprechend durch Verwenden von APMA chemisch aktiviert. Zu 24 μΐ aktivierten Enzyms (finale Konzentration z.B. 0.5 nM) in Reaktionspuffer (50 mM Tris/HCl pH 7.5, 10 mM CaCh, 150 mM NaCl, 0.05% Brij ^® -35) wird 1 μΐ der zu untersuchenden Testverbindung (als Lösung in DMSO, geeignete Konzentrationen z.B. 1 nM bis 30 μΜ) in einer weißen 384 Loch-Mikrotiterplatte (MTP) pipettiert. Die enzymatische Reaktion wird durch Zugabe des intramolekular gequenchten Substrats Mca-Pro-Leu-Gly-Leu-Dpa(Dnp)-Ala-Arg-NH ₂ (finale Konzentration z.B. 10 μΜ; R&D Systems, ES-001) gestartet, so dass ein Gesamttestvolumen von 50 μΐ resultiert. Der Verlauf der MMP-8- Reaktion wird durch Messung der Fluoreszenzintensität (Excitation 320 nm, Emission 410 nm) über einen geeigneten Zeitraum hinweg gemessen (z.B. über 120 min bei einer Temperatur von 32°C).

In vitro MMP-9-Inhibitionstest:

Rekombinantes MMP-9 (Fa. R&D Systems, 911-MP) wird den Herstellerangaben entsprechend durch Verwenden von APMA chemisch aktiviert. Zu 24 μΐ aktivierten Enzyms (finale Konzentration z.B. 0.1 nM) in Reaktionspuffer (50 mM Tris/HCl pH 7.5, 10 mM CaCl ₂ , 150 mM NaCl, 0.05% Brij ^® -35) wird 1 μΐ der zu untersuchenden Testverbindung (als Lösung in DMSO, geeignete Konzentrationen z.B. 1 nM bis 30 μΜ) in einer weißen 384 Loch-Mikrotiterplatte (MTP) pipettiert. Die enzymatische Reaktion wird durch Zugabe des intramolekular gequenchten Substrats Mca-Pro-Leu-Gly-Leu-Dpa(Dnp)-Ala-Arg-NH ₂ (finale Konzentration z.B. 10 μΜ; R&D Systems, ES-001) gestartet, so dass ein Gesamttestvolumen von 50 μΐ resultiert. Der Verlauf der MMP-9- Reaktion wird durch Messung der Fluoreszenzintensität (Excitation 320 nm, Emission 410 nm) über einen geeigneten Zeitraum hinweg gemessen (z.B. über 120 min bei einer Temperatur von 32°C). In vitro ΜΜΡ-10-Inhibitionstest:

Rekombinantes MMP-10 (Fa. R&D Systems, 910-MP) wird den Herstellerangaben entsprechend durch Verwenden von APMA chemisch aktiviert. Zu 24 μΐ aktivierten Enzyms (finale Konzentration z.B. 2 nM) in Reaktionspuffer (50 mM Tris/HCl pH 7.5, 10 mM CaCl ₂ , 150 mM NaCl, 0.05% Brij ^® -35) wird 1 μΐ der zu untersuchenden Testverbindung (als Lösung in DMSO, geeignete Kon- zentrationen z.B. 1 nM bis 30 μΜ) in einer weißen 384 Loch-Mikrotiterplatte (MTP) pipettiert. Die enzymatische Reaktion wird durch Zugabe des intramolekular gequenchten Substrats Mca- Arg-Pro-Lys-Pro-Val-Glu-Nval-Trp-Arg-Lys(Dnp)-NH ₂ (finale Konzentration z.B. 10 μΜ; R&D Systems, ES-002) gestartet, so dass ein Gesamttestvolumen von 50 μΐ resultiert. Der Verlauf der MMP-10-Reaktion wird durch Messung der Fluoreszenzintensität (Excitation 320 nm, Emission 410 nm) über einen geeigneten Zeitraum hinweg gemessen (z.B. über 120 min bei einer Temperatur von 32°C).

In vitro ΜΜΡ-13-Inhibitionstest:

Rekombinantes MMP-13 (Fa. R&D Systems, 511-MP) wird den Herstellerangaben entsprechend durch Verwenden von APMA chemisch aktiviert. Zu 24 μΐ aktivierten Enzyms (finale Konzentration z.B. 0.1 nM) in Reaktionspuffer (50 mM Tris/HCl pH 7.5, 10 mM CaCl ₂ , 150 mM NaCl, 0.05% Brij ^® -35) wird 1 μΐ der zu untersuchenden Testverbindung (als Lösung in DMSO, geeignete Konzentrationen z.B. 1 nM bis 30 μΜ) in einer weißen 384 Loch-Mikrotiterplatte (MTP) pipettiert. Die enzymatische Reaktion wird durch Zugabe des intramolekular gequenchten Substrats Mca-Pro-Leu-Gly-Leu-Dpa(Dnp)-Ala-Arg-NH ₂ (finale Konzentration z.B. 10 μΜ; R&D Systems, ES-001) gestartet, so dass ein Gesamttestvolumen von 50 μΐ resultiert. Der Verlauf der MMP-13- Reaktion wird durch Messung der Fluoreszenzintensität (Excitation 320 nm, Emission 410 nm) über einen geeigneten Zeitraum hinweg gemessen (z.B. über 120 min bei einer Temperatur von 32°C). In vitro ΜΜΡ-14-Inhibitionstest:

Rekombinantes MMP-14 (Fa. R&D Systems, 918-MP) wird den Herstellerangaben entsprechend durch Verwenden von rekombinantem Furin (Fa. R&D Systems, 1503-SE) enzymatisch aktiviert. Zu 24 μΐ aktivierten Enzyms (finale Konzentration z.B. 0.5 nM) in Reaktionspuffer (50 mM Tris/ HCl pH 7.5, 10 mM CaCl ₂ , 150 mM NaCl, 0.05% Brij ^® -35) wird 1 μΐ der zu untersuchenden Test- Verbindung (als Lösung in DMSO, geeignete Konzentrationen z.B. 1 nM bis 30 μΜ) in einer weißen 384 Loch-Mikrotiterplatte (MTP) pipettiert. Die enzymatische Reaktion wird durch Zugabe des intramolekular gequenchten Substrats Mca-Lys-Pro-Leu-Gly-Leu-Dpa(Dnp)-Ala-Arg-NH2 (finale Konzentration z.B. 5 μΜ; R&D Systems, ES-010) gestartet, so dass ein Gesamttestvolumen von 50 μΐ resultiert. Der Verlauf der MMP-14-Reaktion wird durch Messung der Fluoreszenz- Intensität (Excitation 320 nm, Emission 410 nm) über einen geeigneten Zeitraum hinweg gemessen (z.B. über 120 min bei einer Temperatur von 32°C).

In vitro ΜΜΡ-16-Inhibitionstest:

Rekombinantes MMP-16 (Fa. R&D Systems, 1785-MP) wird den Herstellerangaben entsprechend durch Verwenden von rekombinantem Furin (Fa. R&D Systems, 1503-SE) enzymatisch aktiviert. Zu 24 μΐ aktivierten Enzyms (finale Konzentration z.B. 1 nM) in Reaktionspuffer (50 mM Tris/ HCl pH 7.5, 10 mM CaCl ₂ , 150 mM NaCl, 0.05% Brij ^® -35) wird 1 μΐ der zu untersuchenden Testverbindung (als Lösung in DMSO, geeignete Konzentrationen z.B. 1 nM bis 30 μΜ) in einer weißen 384 Loch-Mikrotiterplatte (MTP) pipettiert. Die enzymatische Reaktion wird durch Zugabe des intramolekular gequenchten Substrats Mca-Lys-Pro-Leu-Gly-Leu-Dpa(Dnp)-Ala-Arg-NH2 (finale Konzentration z.B. 5 μΜ; R&D Systems, ES-010) gestartet, so dass ein Gesamttestvolumen von 50 μΐ resultiert. Der Verlauf der MMP-16-Reaktion wird durch Messung der Fluoreszenzintensität (Excitation 320 nm, Emission 410 nm) über einen geeigneten Zeitraum hinweg gemessen (z.B. über 120 min bei einer Temperatur von 32°C). In den folgenden Tabellen 2A und 2B sind für repräsentative Ausführungsbeispiele der Erfindung die ICso-Werte aus diesen Tests zur Inhibition humaner MMPs wiedergegeben (zum Teil als Mittelwerte aus mehreren unabhängigen Einzelbestimmungen und gerundet auf zwei signifikante Stellen):

Tabelle 2A: Hemmung humaner MMPs

Tabelle 2B: Hemmung humaner MMPs

Beispiel MMP-9 MMP-10 MMP-13 MMP-14 MMP- 16

Nr. ICso [nM] ICso [nM] ICso [nM] ICso [nM] ICso [nM]

1 450 120 110 160 1500

2 360 80 49 99 550

4 5000 170 460 2700 7100

5 460 13 67 250 940 Beispiel MMP-9 MMP-10 MMP-13 MMP-14 MMP-16

Nr. ICso [nM] ICso [nM] ICso [nM] ICso [nM] ICso [nM]

7 120 11000 140 170 830

8 55 12 51 100 280

10 310 5100 230 600 1800

11 660 18 470 1200 3800

15 150 9 220 150 760

19 960 58 590 2700 2500

20 370 31 170 1000 3100

Beim Vergleich der in den Tabellen 1A und 2A/2B wiedergegebenen Inhibitionsdaten zeigt sich, dass die erfindungsgemäßen Verbindungen im Allgemeinen und deren aktivere Stereoisomere im Besonderen eine sehr hohe inhibitorische Potenz (häufig im sub-nanomolaren Bereich) gegenüber HME und zugleich eine hohe bis sehr hohe Selektivität (in der Regel ein bis drei Größenordnungen oder noch darüber) gegenüber verwandten humanen MMPs aufweisen. b ) MMPs der Nager:

In vitro MMP-2 -Inhibitionstest der Maus:

Rekombinantes MMP-2 der Maus (Fa. R&D Systems, 924-MP) wird den Herstellerangaben ent- sprechend durch Verwenden von APMA chemisch aktiviert. Zu 24 μΐ aktivierten Enzyms (finale Konzentration z.B. 0.1 nM) in Reaktionspuffer (50 mM Tris/HCl pH 7.5, 10 mM CaCl ₂ , 150 mM NaCl, 0.05% Brij ^® -35) wird 1 μΐ der zu untersuchenden Testverbindung (als Lösung in DMSO, geeignete Konzentrationen z.B. 1 nM bis 30 μΜ) in einer weißen 384 Loch-Mikrotiterplatte (MTP) pipettiert. Die enzymatische Reaktion wird durch Zugabe des intramolekular gequenchten Sub- strats Mca-Pro-Leu-Gly-Leu-Dpa(Dnp)-Ala-Arg-NH ₂ (finale Konzentration z.B. 10 μΜ; R&D Systems, ES-001) gestartet, so dass ein Gesamttestvolumen von 50 μΐ resultiert. Der Verlauf der MMP-2 -Reaktion wird durch Messung der Fluoreszenzintensität (Excitation 320 nm, Emission 410 nm) über einen geeigneten Zeitraum hinweg gemessen (z.B. über 120 min bei einer Temperatur von 32°C). In vitro MMP-3 -Inhibitionstest der Maus:

Rekombinantes MMP-3 der Maus (Fa. R&D Systems, 548-MP) wird den Herstellerangaben entsprechend durch Verwenden von APMA chemisch aktiviert. Zu 24 μΐ aktivierten Enzyms (finale Konzentration z.B. 0.5 nM) in Reaktionspuffer (50 mM Tris/HCl pH 7.5, 10 mM CaCl ₂ , 150 mM NaCl, 0.05% Brij ^® -35) wird 1 μΐ der zu untersuchenden Testverbindung (als Lösung in DMSO, geeignete Konzentrationen z.B. 1 nM bis 30 μΜ) in einer weißen 384 Loch-Mikrotiterplatte (MTP) pipettiert. Die enzymatische Reaktion wird durch Zugabe des intramolekular gequenchten Substrats Mca-Arg-Pro-Lys-Pro-Val-Glu-Nval-Trp-Arg-Lys(Dnp)-NH2 (finale Konzentration z.B. 5 μΜ; R&D Systems, ES-002) gestartet, so dass ein Gesamttestvolumen von 50 μΐ resultiert. Der Verlauf der MMP-3-Reaktion wird durch Messung der Fluoreszenzintensität (Excitation 320 nm, Emission 410 nm) über einen geeigneten Zeitraum hinweg gemessen (z.B. über 120 min bei einer Temperatur von 32°C).

In vitro MMP-7 -Inhibitionstest der Maus:

Rekombinantes MMP-7 der Maus (Fa. R&D Systems, 2967-MP) wird den Herstellerangaben entsprechend durch Verwenden von APMA chemisch aktiviert. Zu 24 μΐ aktivierten Enzyms (finale Konzentration z.B. 0.5 nM) in Reaktionspuffer (50 mM Tris/HCl pH 7.5, 10 mM CaCh, 150 mM NaCl, 0.05% Brij ^® -35) wird 1 μΐ der zu untersuchenden Testverbindung (als Lösung in DMSO, geeignete Konzentrationen z.B. 1 nM bis 30 μΜ) in einer weißen 384 Loch-Mikrotiterplatte (MTP) pipettiert. Die enzymatische Reaktion wird durch Zugabe des intramolekular gequenchten Substrats Mca-Lys-Pro-Leu-Gly-Leu-Dpa(Dnp)-Ala-Arg-NH2 (finale Konzentration z.B. 5 μΜ; R&D Systems, ES-010) gestartet, so dass ein Gesamttestvolumen von 50 μΐ resultiert. Der Verlauf der MMP-7-Reaktion wird durch Messung der Fluoreszenzintensität (Excitation 320 nm, Emission 410 nm) über einen geeigneten Zeitraum hinweg gemessen (z.B. über 120 min bei einer Tempera- tur von 32°C).

In vitro MMP-8-Inhibitionstest der Maus:

Rekombinantes MMP-8 der Maus (Fa. R&D Systems, 2904-MP) wird den Herstellerangaben entsprechend durch Verwenden von APMA chemisch aktiviert. Zu 24 μΐ aktivierten Enzyms (finale Konzentration z.B. 2 nM) in Reaktionspuffer (50 mM Tris/HCl pH 7.5, 10 mM CaCl ₂ , 150 mM NaCl, 0.05% Brij ^® -35) wird 1 μΐ der zu untersuchenden Testverbindung (als Lösung in DMSO, geeignete Konzentrationen z.B. 1 nM bis 30 μΜ) in einer weißen 384 Loch-Mikrotiterplatte (MTP) pipettiert. Die enzymatische Reaktion wird durch Zugabe des intramolekular gequenchten Substrats Mca-Lys-Pro-Leu-Gly-Leu-Dpa(Dnp)-Ala-Arg-NH2 (finale Konzentration z.B. 5 μΜ; R&D Systems, ES-010) gestartet, so dass ein Gesamttestvolumen von 50 μΐ resultiert. Der Verlauf der MMP-8-Reaktion wird durch Messung der Fluoreszenzintensität (Excitation 320 nm, Emission 410 nm) über einen geeigneten Zeitraum hinweg gemessen (z.B. über 120 min bei einer Temperatur von 32°C). In vitro MMP-9-Inhibitionstest der Maus:

Rekombinantes MMP-9 der Maus (Fa. R&D Systems, 909-MP) wird den Herstellerangaben entsprechend durch Verwenden von APMA chemisch aktiviert. Zu 24 μΐ aktivierten Enzyms (finale Konzentration z.B. 0.1 nM) in Reaktionspuffer (50 mM Tris/HCl pH 7.5, 10 mM CaCh, 150 mM NaCl, 0.05% Brij ^® -35) wird 1 μΐ der zu untersuchenden Testverbindung (als Lösung in DMSO, geeignete Konzentrationen z.B. 1 nM bis 30 μΜ) in einer weißen 384 Loch-Mikrotiterplatte (MTP) pipettiert. Die enzymatische Reaktion wird durch Zugabe des intramolekular gequenchten Substrats Mca-Pro-Leu-Gly-Leu-Dpa(Dnp)-Ala-Arg-NH ₂ (finale Konzentration z.B. 5 μΜ; R&D Systems, ES-001) gestartet, so dass ein Gesamttestvolumen von 50 μΐ resultiert. Der Verlauf der MMP-9-Reaktion wird durch Messung der Fluoreszenzintensität (Excitation 320 nm, Emission 410 nm) über einen geeigneten Zeitraum hinweg gemessen (z.B. über 120 min bei einer Temperatur von 32°C).

In vitro ΜΜΡ-12-Inhibitionstest der Maus:

Rekombinantes MMP-12 der Maus (Fa. R&D Systems, 3467-MP) wird den Herstellerangaben ent- sprechend autokatalytisch aktiviert. Zu 24 μΐ aktivierten Enzyms (finale Konzentration z.B. 1 nM) in Reaktionspuffer (50 mM Tris/HCl pH 7.5, 10 mM CaCl ₂ , 150 mM NaCl, 0.05% Brij ^® -35) wird 1 μΐ der zu untersuchenden Testverbindung (als Lösung in DMSO, geeignete Konzentrationen z.B. 1 nM bis 30 μΜ) in einer weißen 384 Loch-Mikrotiterplatte (MTP) pipettiert. Die enzymatische Reaktion wird durch Zugabe des intramolekular gequenchten Substrats Mca-Lys-Pro-Leu-Gly- Leu-Dpa(Dnp)-Ala-Arg-NH ₂ (finale Konzentration z.B. 5 μΜ; R&D Systems, ES-010) gestartet, so dass ein Gesamttestvolumen von 50 μΐ resultiert. Der Verlauf der MMP-12-Reaktion wird durch Messung der Fluoreszenzintensität (Excitation 320 nm, Emission 410 nm) über einen geeigneten Zeitraum hinweg gemessen (z.B. über 120 min bei einer Temperatur von 32°C).

Hochsensitiver in vitro MMP-12-Inhibitionstest der Maus:

Ergeben sich bei hochpotenten Testsubstanzen im oben beschriebenen MMP-12-Inhibitionstest der Maus subnanomolare IC -Werte, so wird zu deren genauerer Ermittlung ein modifizierter Test verwendet. Hierbei wird eine zehnfach niedrigere Enzymkonzentration eingesetzt (finale Konzentration z.B. 0.1 nM), um eine erhöhte Sensitivität des Tests zu erreichen. Die Inkubationszeit des Tests wird entsprechend länger gewählt (z.B. 16 Stunden). In vitro MMP-2 -Inhibitionstest der Ratte:

Rekombinantes MMP-2 der Ratte (Fa. R&D Systems, 924-MP) wird den Herstellerangaben entsprechend durch Verwenden von APMA chemisch aktiviert. Zu 24 μΐ aktivierten Enzyms (finale Konzentration z.B. 0.1 nM) in Reaktionspuffer (50 mM Tris/HCl pH 7.5, 10 mM CaCl ₂ , 150 mM NaCl, 0.05% Brij ^® -35) wird 1 μΐ der zu untersuchenden Testverbindung (als Lösung in DMSO, geeignete Konzentrationen z.B. 1 nM bis 30 μΜ) in einer weißen 384 Loch-Mikrotiterplatte (MTP) pipettiert. Die enzymatische Reaktion wird durch Zugabe des intramolekular gequenchten Substrats Mca-Pro-Leu-Gly-Leu-Dpa(Dnp)-Ala-Arg-NH ₂ (finale Konzentration z.B. 10 μΜ; R&D Systems, ES-001) gestartet, so dass ein Gesamttestvolumen von 50 μΐ resultiert. Der Verlauf der MMP-2 -Reaktion wird durch Messung der Fluoreszenzintensität (Excitation 320 nm, Emission 410 nm) über einen geeigneten Zeitraum hinweg gemessen (z.B. über 120 min bei einer Temperatur von 32°C).

In vitro MMP-8-Inhibitionstest der Ratte:

Rekombinantes MMP-8 der Ratte (Fa. R&D Systems, 3245-MP) wird den Herstellerangaben entsprechend durch Verwenden von APMA chemisch aktiviert. Zu 24 μΐ aktivierten Enzyms (finale Konzentration z.B. 2 nM) in Reaktionspuffer (50 mM Tris/HCl pH 7.5, 10 mM CaCh, 150 mM NaCl, 0.05% Brij ^® -35) wird 1 μΐ der zu untersuchenden Testverbindung (als Lösung in DMSO, geeignete Konzentrationen z.B. 1 nM bis 30 μΜ) in einer weißen 384 Loch-Mikrotiterplatte (MTP) pipettiert. Die enzymatische Reaktion wird durch Zugabe des intramolekular gequenchten Substrats Mca-Lys-Pro-Leu-Gly-Leu-Dpa(Dnp)-Ala-Arg-NH2 (finale Konzentration z.B. 5 μΜ; R&D Systems, ES-010) gestartet, so dass ein Gesamttestvolumen von 50 μΐ resultiert. Der Verlauf der MMP-8-Reaktion wird durch Messung der Fluoreszenzintensität (Excitation 320 nm, Emission 410 nm) über einen geeigneten Zeitraum hinweg gemessen (z.B. über 120 min bei einer Tempera- tur von 32°C).

In vitro MMP-9-Inhibitionstest der Ratte:

Rekombinantes MMP-9 der Maus (Fa. R&D Systems, 5427 -MM) wird den Herstellerangaben entsprechend durch Verwenden von APMA chemisch aktiviert. Zu 24 μΐ aktivierten Enzyms (finale Konzentration z.B. 0.1 nM) in Reaktionspuffer (50 mM Tris/HCl pH 7.5, 10 mM CaCl ₂ , 150 mM NaCl, 0.05% Brij ^® -35) wird 1 μΐ der zu untersuchenden Testverbindung (als Lösung in DMSO, geeignete Konzentrationen z.B. 1 nM bis 30 μΜ) in einer weißen 384 Loch-Mikrotiterplatte (MTP) pipettiert. Die enzymatische Reaktion wird durch Zugabe des intramolekular gequenchten Substrats Mca-Pro-Leu-Gly-Leu-Dpa(Dnp)-Ala-Arg-NH ₂ (finale Konzentration z.B. 5 μΜ; R&D Systems, ES-001) gestartet, so dass ein Gesamttestvolumen von 50 μΐ resultiert. Der Verlauf der MMP-9-Reaktion wird durch Messung der Fluoreszenzintensität (Excitation 320 nm, Emission 410 nm) über einen geeigneten Zeitraum hinweg gemessen (z.B. über 120 min bei einer Temperatur von 32°C). In vitro MMP-12-Inhibitionstest der Ratte:

MMP-12 der Ratte (Uniprot NP_446415.1 ; Konstrukt L96-V277) wird mit einem zusätzlichen N-terminalen His-Tag und einer konsekutiven TEV-Spaltsequenz mittels eines pDEco7-Vektors in E. coli (BL21) exprimiert. Das so rekombinant exprimierte Protein bildet ein intrazelluläres un- lösliches Proteinkomp artiment (sog. inclusion body). Dieses wird nach Trennen und intensivem Waschen unter denaturierenden Bedingungen solubilisiert. Hierzu wird die inclusion body-Pellet- Fraktion aus einer 250 ml-E. coli-Kultur in einem Volumen von 120 ml Puffer A (50 mM Tris pH 7.4, 100 mM NaCl, 0.03 mM ZnCl ₂ , 10 mM CaCl ₂ , 8 M Harnstoff) aufgenommen. Das lösliche Protein wird renaturiert, indem je 60 ml der Probe mehrmals bei 4-8°C gegen Puffer B (50 mM Tris pH 7.4, 100 mM NaCl, 0.03 mM ZnCl ₂ , 10 mM CaCl ₂ ) dialysiert werden. Nach der Dialyse wird die Probe zentrifugiert (25.000 x g). Das rückgefaltete Protein wird im Überstand mit einer Ausbeute von 3.7 mg pro 250 ml-E. coli-Kultur erhalten. Das so gewonnene Protein ist ohne weitere Reinigungsoperationen oder Protease-vermittelte Spaltprozesse enzymatisch aktiv.

Zu 24 μΐ MMP-12-Protein (finale Konzentration z.B. 1 nM) in Reaktionspuffer (50 mM Tris/HCl pH 7.5, 10 mM CaCl ₂ , 150 mM NaCl, 0.05% Brij ^® -35) wird 1 μΐ der zu untersuchenden Testverbindung (als Lösung in DMSO, geeignete Konzentrationen z.B. 1 nM bis 30 μΜ) in einer weißen 384 Loch-Mikrotiterplatte (MTP) pipettiert. Die enzymatische Reaktion wird durch Zugabe des intramolekular gequenchten Substrats Mca-Pro-Leu-Gly-Leu-Dpa(Dnp)-Ala-Arg-NH ₂ (finale Konzentration z.B. 5 μΜ; R&D Systems, ES-001) gestartet, so dass ein Gesamttestvolumen von 50 μΐ resultiert. Der Verlauf der MMP-12-Reaktion wird durch Messung der Fluoreszenzintensität (Ex- citation 320 nm, Emission 410 nm) über einen geeigneten Zeitraum hinweg gemessen (z.B. über 120 min bei einer Temperatur von 32°C).

In der folgenden Tabelle 3 sind für repräsentative Ausführungsbeispiele der Erfindung die IC ₅₀ - Werte aus den Tests zur Inhibition von Maus-MMPs wiedergegeben (zum Teil als Mittelwerte aus mehreren unabhängigen Einzelbestimmungen und gerundet auf zwei signifikante Stellen):

Tabelle 3: Hemmung von MMPs der Maus

Beispiel MMP-2 MMP-3 MMP-7 MMP-8 MMP-9 MMP-12

Nr. IC50 [nM] IC50 [nM] IC50 [nM] IC50 [nM] IC50 [nM] IC50 [nM]

1 170 570 85 40 560 3.3

2 58 710 52 21 280 0.85

4 490 4000 1400 370 1500 7.7

5 45 270 130 54 210 0.67 Beispiel MMP-2 MMP-3 MMP-7 MMP-8 MMP-9 MMP-12 Nr. ICso [nM] ICso [nM] ICso [nM] ICso [nM] ICso [nM] ICso [nM]

10 300 120 130 14 930 2.8

11 640 620 210 34 1900 9.4

19 840 3100 630 150 2200 7.6

20 340 670 200 46 800 1.7

Beim Vergleich der in Tabelle 3 wiedergegebenen Inhibitionsdaten zeigt sich, dass die erfindungsgemäßen Verbindungen im Allgemeinen und deren aktivere Stereoisomere im Besonderen eine sehr hohe inhibitorische Potenz (häufig im nanomolaren oder sogar sub-nanomolaren Bereich) ge- genüber MMP-12 der Maus und zugleich eine hohe Selektivität (in der Regel ein bis zwei Größenordnungen) gegenüber verwandten murinen MMPs aufweisen.

B-3. Tiermodell des Lungenemphysems

Elastase-induziertes Lungenemphysem bei Maus, Ratte oder Hamster ist ein weit verbreitetes Tiermodell für Lungenemphysem [The Fas/Fas-ligand pathway does not mediate the apoptosis in elastase-induced emphysema in mice, Sawada et al., Exp. Lung Res. 33, 277-288 (2007)] . Die Tiere erhalten eine orotracheale Instillation porciner Pankreas-Elastase. Die Behandlung der Tiere mit der Testsubstanz beginnt am Tag der Instillation der porcinen Pankreas-Elastase und erstreckt sich über einen Zeitraum von 3 Wochen. Am Studienende wird die Lungen-Compliance bestimmt und eine Alveolarmorphometrie durchgeführt. B-4. Tiermodell der Silica-induzierten Lungeninflammation

Eine orotracheale Gabe von Silica bei Maus, Ratte oder Hamster führt zu einer Inflammation in der Lunge [Involvement of leukotrienes in the pathogenesis of silica-induced pulmonary fibrosis in mice, Shimbori et al., Exp. Lung Res. 36, 292-301 (2010)] . Die Tiere werden am Tag der Instillation des Silica mit der Testsubstanz behandelt. Nach 24 Stunden wird eine bronchio-alveoläre Lavage zur Bestimmung des Zellgehaltes und der Biomarker durchgeführt.

B-5. Tiermodell der Silica-induzierten Lungenfibrose

Silica-induzierte Lungenfibrose bei Maus, Ratte oder Hamster ist ein weit verbreitetes Tiermodell für Lungenfibrose [Involvement of leukotrienes in the pathogenesis of silica-induced pulmonary fibrosis in mice, Shimbori et al., Exp. Lung Res. 36, 292-301 (2010)] . Die Tiere erhalten eine oro- tracheale Instillation von Silica. Die Behandlung der Tiere mit der Testsubstanz beginnt am Tag der Instillation des Silica oder therapeutisch eine Woche später und erstreckt sich über einen Zeitraum von 6 Wochen. Am Studienende werden eine bronchio-alveoläre Lavage zur Bestimmung des Zellgehaltes und der Biomarker sowie eine histologische Beurteilung der Lungenfibrose durchgeführt. B-6. Tiermodell der ATP-induzierten pulmonalen Inflammation

Eine intratracheale Gabe von ATP (Adenosintriphosphat) an der Maus führt zu einer Inflammation in der Lunge [Acute lung inflammation and ventilator-induced lung injury caused by ATP via the P2Y receptors: An experimental study, Matsuyama et al., Respir. Res. 9:79 (2008)]. Die Tiere werden am Tag der Instillation von ATP für eine Dauer von 24 h mit der Testsubstanz behandelt (per gavage, durch Zusatz im Futter oder Trinkwasser, per osmotischer Minipumpe, per subkutaner oder intraperitonealer Injektion oder per Inhalation). Am Versuchsende wird eine bronchio-alveoläre Lavage zur Bestimmung des Zellgehalts und der pro-inflammatorischen Marker durchgeführt.

B-7. CYP-Inhibitionstest

Die Fähigkeit von Substanzen, die CYP-Enzyme CYP1A2, CYP2C9, CYP2D6 und CYP3A4 im Menschen zu inhibieren, wird untersucht mit gepoolten Human-Lebermikrosomen als Enzymquelle in Gegenwart von Standardsubstraten (s.u.), die CYP-spezifische Metaboliten bilden. Die Inhibitionseffekte werden bei sechs verschiedenen Konzentrationen der Testverbindungen untersucht [2.8, 5.6, 8.3, 16.7, 20 (oder 25) sowie 50 μΜ], mit dem Ausmaß der CYP-spezifischen Metabolitenbildung der Standardsubstrate in Abwesenheit der Testverbindungen verglichen und die entsprechenden ICso-Werte berechnet. Ein Standard-Inhibitor, der eine einzelne CYP-Isoform spezifisch inhibiert, wird immer mitinkubiert, um Ergebnisse zwischen verschiedenen Serien vergleichbar zu machen.

Die Inkubation von Phenacetin, Diclofenac, Tolbutamid, Dextromethorphan oder Midazolam mit Human-Lebermikrosomen in Gegenwart von jeweils sechs verschiedenen Konzentrationen einer Testverbindung (als potentiellem Inhibitor) wird auf einer Workstation durchgeführt (Tecan, Genesis, Crailsheim, Deutschland). Standard-Inkubationsgemische enthalten 1.3 mM NADP ⁺ , 3.3 mM MgC x 6 H ₂ O, 3.3 mM Glukose -6-phosphat, Glukose-6-phosphat-Dehydrogenase (0.4 U/ml) und 100 mM Phosphat-Puffer (pH 7.4) in einem Gesamtvolumen von 200 μΐ. Testverbindungen werden bevorzugt in Acetonitril gelöst. 96-Lochplatten werden eine definierte Zeit bei 37°C mit gepoolten Human-Lebermikrosomen inkubiert. Die Reaktionen werden durch Zugabe von 100 μΐ Acetonitril, worin sich ein geeigneter interner Standard befindet, abgestoppt. Gefällte Proteine werden durch Zentrifugation abgetrennt, die Überstände werden vereinigt und mittels LC- MS/MS analysiert. B-8. Hepatozytenassav zur Bestimmung der metabolischen Stabilität

Die metabolische Stabilität von Testverbindungen gegenüber Hepatozyten wird bestimmt, indem die Verbindungen bei niedrigen Konzentrationen (bevorzugt unter oder um 1 μΜ) und bei niedrigen Zellzahlen (bevorzugt bei 1 * 10 ⁶ Zellen/ml) inkubiert werden, um möglichst lineare kinetische Bedingungen im Versuch sicherzustellen. Sieben Proben aus der Inkubationslösung werden in einem festgelegten Zeitraster für die LC-MS-Analytik entnommen, um die Halbwertszeit (d.h. den Abbau) der jeweiligen Verbindung zu bestimmen. Aus dieser Halbwertszeit werden unterschiedliche "Clearance"-Parameter (CL) und "Fmax" - Werte berechnet (s.u.).

Die CL- und Fmax-Werte stellen ein Maß für den Phase 1- und Phase 2-Metabolismus der Ver- bindungen in den Hepatozyten dar. Um den Einfluss des organischen Lösungsmittels auf die Enzyme in den Inkubationsansätzen möglichst klein zu halten, wird dessen Konzentration im Allgemeinen auf 1% (Acetonitril) bzw. 0.1 % (DMSO) begrenzt.

Für alle Spezies und Rassen wird mit einer Hepatozyten-Zellzahl in der Leber von 1.1 * 10 ⁸ Zellen/g Leber gerechnet. CL-Parameter, deren Berechnung auf Halbwertszeiten beruhen, die we- sentlich über die Inkubationszeit hinausgehen (üblicherweise 90 Minuten), können nur als grobe Richtwerte angesehen werden.

Die berechneten Parameter und deren Bedeutung sind:

Fmax well-stirred [ ] maximal mögliche Bioverfügbarkeit nach oraler Applikation

Berechnung: (l-CLbi ₀₀ d well-stirred/QH) * 100

CLbiood well-stirred [L/(h*kg)] berechnete Blut-Clearance (well stirred-Modell)

Berechnung: (QH * CL';„trinsic) / (QH + CL';„trinsic)

CL'intrinsic [ml/(min*kg)] maximale Fähigkeit der Leber (der Hepatozyten), eine Verbindung zu metabolisieren (unter der Annahme, dass der Leber - blutfluss nicht geschwindigkeitslimitierend ist)

Berechnung: CL'mtrinsic, apparent * speziesspezifische Hepatozytenzahl [1.1 * 10 ⁸ / g Leber] * speziesspezifisches Lebergewicht [g/kg]

CL'mtrinsic, apparent [ml/(min*mg)] normiert die Eliminationskonstante, indem diese durch die eingesetzte Hepatozyten-Zellzahl x (x * 10 ⁶ /ml) dividiert wird Berechnung: k _e i [1/min] / (Zellzahl [x * 10 ⁶ ] / Inkubationsvolumen [ml])

(QH = speziesspezifischer Leberb lutfluss). Γη der folgenden Tabelle 4 sind für repräsentative Ausführungsbeispiele der Erfindung die CL- und Fmax-Werte aus diesem Assay nach Inkubation der Verbindungen mit Ratten-Hepatozyten wiedergegeben (zum Teil als Mittelwerte aus mehreren unabhängigen Einzelbestimmungen):

Tabelle 4: berechnete Blut-Clearance und Bioverfügbarkeit nach Inkubation mit Ratten- Hepatozyten

B-9. Metabolismus-Untersuchung

Zur Bestimmung des Metabolismus-Profils der erfindungsgemäßen Verbindungen werden diese mit Lebermikrosomen oder mit primären frischen Hepatozyten verschiedener Tierspezies (z.B. Ratte, Hund) als auch humanen Ursprungs inkubiert, um Informationen über einen möglichst kompletten hepatischen Phase I- und Phase II-Metabolismus sowie über die am Metabolismus beteiligten Enzyme zu erhalten und zu vergleichen.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen werden mit einer Konzentration von etwa 1-10 μΜ inkubiert. Dazu werden Stammlösungen der Verbindungen mit einer Konzentration von 0.1-1 mM in Acetonitril hergestellt und dann mit einer l: 100-Verdünnung in den Inkubationsansatz pipettiert. Die Lebermikrosomen werden in 50 mM Kaliumphosphatpuffer pH 7.4 mit und ohne NADPH- generierendem System, bestehend aus 1 mM NADP ⁺ , 10 mM Glukose-6-phosphat und 1 Unit Glu- kose-6-phosphat-Dehydrogenase, bei 37°C inkubiert. Primäre Hepatozyten werden in Suspension in William's E-Medium ebenfalls bei 37°C inkubiert. Nach einer Inkubationszeit von 0-4 h werden die Inkubationsansätze mit Acetonitril abgestoppt (Endkonzentration ca. 30%) und das Protein bei ca. 15000 x g abzentrifugiert. Die so abgestoppten Proben werden entweder direkt analysiert oder bis zur Analyse bei -20°C gelagert. Die Analyse erfolgt mittels Hochleistungsflüssigkeitschromatographie mit Ultraviolett- und massenspektrometrischer Detektion (HPLC-UV-MS/MS). Dazu werden die Überstände der Inkubationsproben mit geeigneten C18-reverse phase-Säulen und variablen Eluenten-Gemischen aus Acetonitril und 10 mM wässriger Ammoniumformiat-Lösung oder 0.05% wässriger Ameisensäure chromatographiert. Die UV-Chromatogramme in Verbindung mit den massenspektrometrischen Daten dienen zur Identifizierung, Strukturaufklärung und quantitativen Abschätzung der Metabolite und zur quantitativen Bestimmung der metabolischen Abnahme der erfindungsgemäßen Verbindungen in den Inkubationsansätzen.

B-10. Pharmakokinetische Untersuchungen in vivo Die zu untersuchende Substanz wird Ratten oder Mäusen intravenös als Lösung appliziert (z.B. in entsprechendem Plasma mit geringem DMSO-Zusatz oder in einem PEG/Ethanol/W asser- Gemisch), die perorale Applikation erfolgt als Lösung (z.B. in Solutol/Ethanol/W asser- oder PEG/ Ethanol/Wasser-Gemischen) oder als Suspension (z.B. in Tylose) jeweils über eine Schlundsonde. Nach Substanzgabe wird den Tieren zu festgelegten Zeitpunkten Blut entnommen. Dieses wird heparinisiert, anschließend wird daraus durch Zentrifugation Plasma gewonnen. Die Testsubstanz wird im Plasma über LC-MSMS analytisch quantifiziert. Aus den so ermittelten Plasmakonzentration-Zeit-Verläufen werden unter Verwendung eines internen Standards und mit Hilfe eines validierten Rechenprogramms die pharmakokinetischen Kenngrößen berechnet, wie AUC (Fläche unter der Konzentration-Zeit-Kurve), Cmax (maximale Plasmakonzentration), t (Halbwertszeit), Vss (Verteilungsvolumen) und CL (Clearance) sowie die absolute und die relative Bioverfügbarkeit F und F _re i (i.v./p.o. -Vergleich bzw. Vergleich von Suspension zu Lösung nach p.o.-Gabe).

B-ll. Bestimmung der Löslichkeit

Versuchsdurchführung :

Die Prüfsubstanz wird in DMSO gelöst. Aus dieser Lösung wird ein Aliquot entnommen und in PBS-Puffer pH 6.5 eingebracht (DMSO- Anteil: 1%). Diese Lösung/Suspension wird für 24 h bei Raumtemperatur geschüttelt. Nach Ultra-Zentrifugation bei 114000 g für 30 min wird der Überstand abgenommen, mit Acetonitril/Wasser 8:2 verdünnt und per LC-MSMS analysiert. Quantifiziert wird über eine Fünf-Punkt-Kalibrationskurve der Testverbindung in DMSO.

Geräte für die LC-MSMS-Quantifizierung:

AB Sciex TRIPLE QUAD 4500; Agilent 1260 mit primärer Pumpe (G1312B Minity), Degasser (G4225A Minity), Säulenthermostat (G1316C Minity); CTC Analytics PAL Injektionssystem THC-xt. HPLC-Methode:

Eluent A: 0.5 ml Ameisensäure / Liter Wasser, Eluent B: 0.5 ml Ameisensäure / Liter Acetonitril; Gradient: 0 min 90% A -> 0.5 min 5% A -> 0.84 min 5% A -> 0.85 min 90% A ^ 1.22 min 90% A; Fluss: 2.5 ml/min; Injektionsvolumen: 15 μΐ; Säule: Waters OASIS HLB, 2.1 x 20 mm, 25 μ; Säulentemperatur: 30°C; Splitter (vor MS): 1:20.

MS -Methoden:

Flow Injection Analysis (FIA) für die Optimierung, Multiple Reaction Monitoring (MRM) für die Quantifizierung; Eluent A: 0.5 ml Ameisensäure / Liter Wasser, Eluent B: 0.5 ml Ameisensäure / Liter Acetonitril; Fluss: 0.25 ml/min; Injektionsvolumen: 15 μΐ; Säule: Edelstahlkapillare; Kapil- lartemperatur: 25°C.

In der folgenden Tabelle 5 sind die so bestimmten Löslichkeitswerte repräsentativer Ausführungsbeispiele in PBS-Puffer pH 6.5 dargestellt:

Tabelle 5: Löslichkeit in PBS-Puffer pH 6.5

Beispiel-Nr. Löslichkeit [mg/Liter]

1 52.2

4 51.4

5 338.1

6 354.9

8 4.5

10 33.4

11 210

12 240

14 80

15 100

17 250

18 330

19 17

20 425.2 C. Ausführungsbeispiele für pharmazeutische Zusammensetzungen

Die erfindungsgemäßen Verbindungen können folgendermaßen in pharmazeutische Zubereitungen überführt werden:

Tablette: Zusammensetzung:

100 mg der erfindungsgemäßen Verbindung, 50 mg Lactose (Monohydrat), 50 mg Maisstärke (nativ), 10 mg Polyvinylpyrrolidon (PVP 25) (Fa. BASF, Ludwigshafen, Deutschland) und 2 mg Magnesiumstearat.

Tablettengewicht 212 mg. Durchmesser 8 mm, Wölbungsradius 12 mm. Herstellung:

Die Mischung aus erfindungsgemäßer Verbindung, Lactose und Stärke wird mit einer 5%-igen Lösung (m/m) des PVPs in Wasser granuliert. Das Granulat wird nach dem Trocknen mit dem Magnesiumstearat 5 Minuten gemischt. Diese Mischung wird mit einer üblichen Tablettenpresse verpresst (Format der Tablette siehe oben). Als Richtwert für die Verpressung wird eine Presskraft von 15 kN verwendet.

Oral applizierbare Suspension:

Zusammensetzung:

1000 mg der erfindungsgemäßen Verbindung, 1000 mg Ethanol (96%), 400 mg Rhodigel ^® (Xanthan gum der Firma FMC, Pennsylvania, USA) und 99 g Wasser. Einer Einzeldosis von 100 mg der erfindungsgemäßen Verbindung entsprechen 10 ml orale Suspension.

Herstellung:

Das Rhodigel wird in Ethanol suspendiert, die erfindungsgemäße Verbindung wird der Suspension zugefügt. Unter Rühren erfolgt die Zugabe des Wassers. Bis zum Abschluß der Quellung des Rhodigels wird ca. 6 h gerührt. Oral applizierbare Lösung:

Zusammensetzung:

500 mg der erfindungsgemäßen Verbindung, 2.5 g Polysorbat und 97 g Polyethylenglycol 400. Einer Einzeldosis von 100 mg der erfindungsgemäßen Verbindung entsprechen 20 g orale Lösung. Herstellung:

Die erfindungsgemäße Verbindung wird in der Mischung aus Polyethylenglycol und Polysorbat unter Rühren suspendiert. Der Rührvorgang wird bis zur vollständigen Auflösung der erfindungsgemäßen Verbindung fortgesetzt. i.v.-Lösung: Die erfindungsgemäße Verbindung wird in einer Konzentration unterhalb der Sättigungslöslichkeit in einem physiologisch verträglichen Lösungsmittel (z.B. isotonische Kochsalzlösung, Glucose- lösung 5% und/oder PEG 400-Lösung 30%) gelöst. Die Lösung wird steril filtriert und in sterile und pyrogenfreie Injektionsbehältnisse abgefüllt.