ihre Herstellung und Verwendung zur Herstellung eines Therapeutikums, Diagnostikums und/oder elektronischen Bauteils.

Pyranosyl-Nucleinsäuren (p-NA's) sind im allgemeinen zur natürlichen RNA isomere Strukturtypen, bei denen die Pentose-Einheiten in der Pyranoseform vorliegen und durch Phosphodiestergruppen zwischen den Positionen C-2'und C-4'repetitiv verknüpft sind. Unter "Nucleobase"werden dabei die kanonischen Nucleobasen A, T, U, C, G, aber auch die Paare Isoguanin/Isocytosin und 2,6-Diaminopurin/Xanthin und im Sinne der vorliegenden Erfindung auch andere Purine und Pyrimidine verstanden. p-NA's, und zwar die von der Ribose abgeleitete p-RNA's, wurden zum erstenmal von Eschenmoser et al. beschrieben (Helv. Chim. Acta 1993,76,2161 ; Helv. Chim Acta 1995,78,1621 ; Angew. Chem. 1996, 108,1619-1623). Sie bilden ausschließlich sogenannte Watson-Crick-gepaarte, d. h. Purin- Pyrimidin-und Purin-Purin-gepaarte, antiparallele, reversibel"schmelzende", quasi-lineare

und stabile Duplices. Homochirale p-RNA-Stränge entgegengesetzten Chiralitätssinns paaren ebenfalls kontrollierbar und sind in der gebildeten Duplex streng nicht-helical. Diese für den Aufbau supramolekularer Einheiten wertvolle Spezifität hängt mit der relativ geringen Flexibilität des Ribopyranosephosphat-Rückgrats sowie mit der starken Neigung der Basenebene zur Strangachse und der hieraus folgenden Tendenz zu intercatenarer Basenstapelung im resultierenden Duplex zusammen und läßt sich letzlich auf die Teilnahme eines 2', 4'-cis-disubstituierten Ribopyranoserings am Aufbau des Rückgrates zurückführen.

Diese wesentlich besseren Paarungseigenschaften machen p-NA's gegenüber DNA und RNA für die Anwendung des Aufbaus supramolekularer Einheiten zu bevorzugten Paarungssystemen. Sie bilden ein zu natürlichen Nucleinsäuren orthogonales Paarungsystem, d. h. sie paaren nicht mit in der natürlich Form vorkommenden DNA's und RNA's, was im besonderen im diagnostischen Bereich von Bedeutung ist.

Die p-RNA zeigt jedoch folgende Nachteile, die auf die Anwesenheit der 3'- Hydroxylfunktion zurückzuführen sind : 1. Der notwendige Schutz der 3'-Hydroxylgruppe mit einer Benzoylschutzgruppe erschwert und verlängert den Syntheseweg zu den monomeren Bausteinen erheblich.

2. Aufgrund der Verwendung des Allylrestes als Basen-und Phosphatschutzgruppe muß die Entschützung und die Abspaltung des Oligonucleotids durch zwei hintereinandergeschaltete Schritte erfolgen. Zuerst werden die Allylreste nach der Noyori-Methode (R. Noyori, J. Am. Chem. Soc. 1990,112,1691-6) entfernt. Anschliessend müssen die basenlabilen Acylgruppen abgespalten und das Oligonucleotid vom Träger entfernt werden.

3. Nach beendeter Oligonucleotidsynthese bereitet die Abspaltung der 3'-Benzoylreste vom Oligonucleotid Schwierigkeiten. Um diese Reste effektiv zu entfernen ist die Verwendung von Hydrazin notwendig, was zu Ringöffnungen der Pyrimidinbasen, vor allem Uracil und Thymin, führen kann 4. Bei der Synthese der Oligonucleotide wird 5- (4-Nitrophenyl)-1H-tetrazol als Kupplungsreagenz in der automatisierten p-RNA-Synthese eingesetzt. Die Konzentration dieses Reagenz in der Lösung von Tetrazol in Acetonitril ist dabei so hoch, daß im allgemeinen das 5- (4-Nitrophenyl)-lH-tetrazol in den dünnen Schläuchen des Synthesizers

auskristallisiert und die Synthese somit zu einem vorzeitigen Ende kommt. Zudem wurde beobachtet, daß die Oligomeren mit 5- (4-Nitrophenyl)-lH-tetrazol verunreinigt waren. Auch das alternativ verwendete Benzimidazolium-Triflat weist negative Seiten auf : es kristallisiert, wenn auch seltener, in den Schläuchen aus, ist teuer und muß vor seiner Verwendung zudem umkristallisiert werden.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es daher, neue Pentopyranosyl-Nucleoside für orthogonale Paarungssysteme bereitzustellen und zu oligomerisieren, wodurch die oben beschriebenen Nachteile umgangen werden können.

Überraschenderweise wurde nun gefunden, daß 3'-Desoxypentopyranosyl-Nucleinsäuren (p- DNA) die beschriebenen Nachteile nicht aufweisen und dennoch die vorteilhaften orthogonalen Paarungseigenschaften besitzen (siehe Fig. 3).

Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher eine 3'-Desoxypentopyranosyl- Nucleinsäure bestehend im wesentlichen aus 3'-Desoxypentopyranosyl-Nucleosiden der Formel (I), worin R'gleich H, OH, Hal mit Hal gleich Br oder Cl, ein Rest ausgewählt aus Pr gleich Isopropyl, oder-O-PH- (=O) (-O-),

R2, R3 und R4 unabhängig voneinander, gleich oder verschieden, jeweils H, NR5R6, OR7, SRS.

=O, CH2+i mit n eine ganze Zahl von 1-12, vorzugsweise 1-8, insbesondere 1-4, eine ß- eliminierbare Gruppe, vorzugsweise eine Gruppe der Formel-OCH2CH2Rl8 mit RI8 gleich ein Cyano-oder p-Nitrophenylrest oder ein Fluorenylmethyloxycarbonyl- (Fmoc)-Rest, oder (CnH2n)NR10R11 mit R10R11 gleich H, CnH2n+1 oder RIOR"verbunden tiber einen Rest der Formel worin Rut2, Rl3, R14 und Ri unabhängig voneinander, gleich oder verschieden, jeweils H, OR7, wobei R7 die oben genannte Bedeutung hat, oder CnH2n+1, oder CnH2n 1, wobei n die oben genannte Bedeutung hat, bedeuten und R5, R6, R7 und R8 unabhängig voneinander, gleich oder verschieden, jeweils H, C H oder CnH2n-1, wobei n die oben genannte Bedeutung hat,-C (O) R9 mit R9 gleich ein linearer oder verzweigter, gegebenenfalls substituierter Alkyl-, Aryl-, vorzugsweise Phenyl-Rest, X, Y und Z unabhängig voneinander, gleich oder verschieden, jeweils =N-, =C (R'6)- oder- N (R17)- mit R16 und R17 unabhängig voneinander, gleich oder verschieden, jeweils H oder CnH2n+1 oder (CnH2n)NR10R11 mit den oben genannten Bedeutungen, bedeutet, und Scl Wasserstoff oder eine Schutzgruppe ausgewählt aus einer Acyl-, Trityl-, Allyloxycarbonyl-, einer photolabilen oder ß-eliminierbaren Schutzgruppe, vorzugsweise eine Fluorenymethyloxycarbonyl- (Fmoc)- oder 4,4f-Dimethoxytrityl-(DMT)-gruppe, oder der Formel (II)

worin R''gleich H, OH, Hal mit Hal gleich Br oder Cl, ein Rest ausgewählt aus oder -O-P [N (i-Pr) 21 (OCH2CH2CN) mit i-Pr gleich Isopropyl, oder-O-PH- (=O) (-O-) R2', R3' und R4 unabhängig voneinander, gleich oder verschieden, jeweils H, =O, CnH2n+1 oder OCnH2n-1, eine p-eliminierbare Gruppe, vorzugsweise eine Gruppe der Formel-OCH2CH2Rl8 mit Rl8 gleich ein Cyano-oder p-Nitrophenylrest oder ein Fluorenylmethyloxycarbonyl- (Fmoc)-Rest oder (CnH2n)NR10'R11', wobei Riz', R"', unabhängig voneinander die oben genannte Bedeutung von RIO bzw. R11 hat, und X', Y'und Z'unabhängig voneinander, gleich oder verschieden, jeweils =N-, =C (RI6')-oder- N (R17')- bedeutet,-wobei R16' und R17' unabhängig voneinander die oben genannte Bedeutung von Rl6 bzw. Rl7 haben, und S die oben genannte Bedeutung von Scl hat.

Gemäß der vorliegenden Erfindung ist die erfindungsgemäße Nucleinsäure aus 3'- Desoxypentopyranosyl-Nucleosiden aufgebaut, wobei weitere Modifikationen, wie z. B. die unten näher beschriebenen Konjugate, ebenso von der Erfindung umfaßt werden.

Die 3'-Desoxypentopyranosyl-Nucleoside sind im allgemeinen 3'-Desoxyribo-, 3'- Desoxyarabino-, 3'-Desoxylyxo-und/oder 3'-Desoxyxylo-pyranosyl-Nucleoside, vorzugsweise 3'-Desoxyribopyranosyl-Nucleoside, wobei der 3B-Desoxypentopyranosyl-Teil D-konfiguriert, aber auch L-konfiguriert sein kann Üblicherweise handelt es sich bei den 3'-Desoxypentopyranosyl-Nucleosiden um 3'- Desoxypentopyranosyl-purin,-2,6-diaminopurin,-6-purinthiol,- pyridin,-pyrimidin,-

adenosin,-guanosin,-isoguanosin,-6-thioguanosin,-xanthin,-hy poxanthin,-thymidin,- cytosin,-isocytosin,-indol,-tryptamin,-N-phthaloyltryptamin, -uracil,-coffein,-theobromin, -theophyllin,-benzotriazol oder-acridin, insbesondere um 3'-Desoxypentopyranosyl-purin,- pyrimidin,-adenosin,-guanosin,-thymidin,-cytosin, tryptamin,-N-phthalotryptamin oder- uracil.

Unter die Verbindungen fallen auch 3'-Desoxypentopyranosyl-Nucleoside, die als Linker verwendet werden können, d. h. als Verbindungen mit funktionellen Gruppen, die kovalent an Biomoleküle, wie z. B. in ihrer natürlichen Form vorkommende oder modifizierte Nucleinsäuren, wie DNA, RNA aber auch p-NA's, vorzugsweise p-DNA's, binden können.

Beispielsweise fallen hierunter 3'-Desoxypentopyranosyl-Nucleoside, bei denen R2, R3, R4, R2', R3'und/oder R4'ein 2-Phthalimidoethyl-oder Allyloxy-Rest bedeutet. Bevorzugt sind gemäß der vorliegenden Erfindung beispielsweise Uracil-basierende Linker, bei denen vorzugsweise die 5-Position des Uracils modifiziert wurde, z. B. N- Phthaloylaminoethyluracil, aber auch Indol-basierende Linker, vorzugsweise Tryptaminderivate, wie z. B. N-Phthaloyltryptamin.

Darüberhinaus werden von der vorliegenden Erfindung 3'-Desoxypentopyranosyl-Nucleoside umfaßt, die ausschließlich am 4'-Sauerstoffatom des 3'-Desoxypentopyranosid-Teils eine Schutzgruppe, vorzugsweise eine säure-, basen-, photolabile oder ß-eliminierbare Schutzgruppe,insbesondere eine Tritylgruppe, besonders bevorzugt eine Dimethoxytritylgruppe, tragen.

Folgende Verbindungen stellen bevorzugte Beispiele von Pentopyranosyl-Nucleosiden dar, die in der erfindungsgemäßen Nucleinsäure vorhanden sein können, bzw. für deren Herstellung besonders geeignet sind : A) (2', 4'-Di-O-Benzoyl)-3'-desoxy-ß-ribopyranosyl-Nucleoside, inbesondere ein (2', 4'-Di- O-Benzoyl)-3'-desoxy-ß-ribopyranosyl-adenin,-guanin,-cytosi n,-thymidin,-uracil,-xanthin oder-hypoxanthin, sowie ein N-Benzoyl-2', 4'-di-O-benzoyl-3'-desoxy-ribopyranosyl- Nucleosid, insbesondere ein-adenin,-guanin oder-cytosin, sowie ein N-Isobutyroyl-2', 4'-di- O-benzoyl-3'-desoxy-ribopyranosyl-Nucleosid, insbesondere ein-adenin,-guanin oder- cytosin, sowie ein 06- (2-Cyanoethyl)-N2-isobutyroyl-2', 4'-di-O-benzoyl-3'-desoxy-

ribopyranosyl-Nucleosid, insbesondere ein-guanin, sowie ein 06- (2- (4-Nitrophenyl) ethyl)- N2-isobutyroyl-2', 4'-di-O-benzoyl-3'-desoxy-ribopyranosyl-Nucleosid. insbesondere ein- guanin.

B) 3'-Desoxy-ß-ribopyranosyl-Nucleoside, inbesondere ein 3'-Desoxy-ß-ribopyranosyl- adenin,-guanin,-cytosin,-thymidin,-uracil,-xanthin oder hypoxanthin, sowie ein N- Benzoyl-, N-Isobutyroyl-, 06- (2-Cyanoethyl)- oder 06- (2- (4-Nitrophenyl) ethyl)-N2- isobutyroyl-3'-Desoxy-ß-ribopyranosyl-Nucleosid, insbesondere ein-guanin.

C) 4'-DMT-3'-desoxy-pentopyranosyl-Nucleoside, vorzugsweise ein 4'-DMT-3'-desoxy- ribopyranosyl-Nucleosid, insbesondere ein 4'-DMT-3'-desoxyribopyranosyl-adenin,-guanin, -cytosin,-thymidin,-uracil,-xanthin oder-hypoxanthin, sowie ein N-Benzoyl-4'-DMT-3'- desoxy-ribopyranosyl-Nucleosid, insbesondere ein N-Benzoyl-4'-DMT-3'-desoxy- ribopyranosyl-adenin,-guanin oder-cytosin, sowie ein N-Isobutyroyl-4'-DMT-3'-desoxy- ribopyranosyl-Nucleosid, insbesondere ein N-Isobutyroyl-4'-DMT-3'-desoxy-ribopyranosyl- adenin,-guanin oder-cytosin sowie ein 06- (2-Cyanoethyl)-N2-isobutyroyl-4'-DMT-3'- desoxyribopyranosyl-Nucleosid, insbesondere ein O6- (2-Cyanoethyl)-N2-isobutyroyl-4'- DMT-3'-desoxy-ribopyranosyl-guanin, sowie ein 06- (2- (4-Nitrophenyl) ethyl)-N2- isobutyroyl-4'-DMT-3'-desoxyribopyranosyl-Nucleosid, insbesondere ein 06- (2- (4- Nitrophenyl) ethyl)-N2-isobutyroyl-4'-DMT-3'-desoxyribopyranosyl-guanin.

D) 3'-Desoxy-ß-ribopyranosyl-N, N'-dibenzoyl-adenosin oder 3-Desoxy-ß-Ribopyranosyl- N,N'-dibenzoyl-guanosin.

Als Vorstufe für die Oligonucleotidsynthese eignen sich beispielsweise 4'-DMT-3'-desoxy- pentopyranosyl-Nucleoside-2'-phosphitamid/-H-phosphonat, vorzugsweise ein 4'-DMT-3'- desoxy-ribopyranosyl-Nucleosid-2'-phosphitamid/-H-phosphonat , insbesondere ein 4'-DMT- 3'-desoxyribopyranosyl-adenin-,-guanin-,-cytosin-,-thymidin- ,-xanthin-,-hypoxanthin-, oder-uracil-2'-phosphitamid/-H-phosphonat, sowie ein N-Benzoyl-4'-DMT-3'-desoxy- ribopyranosyl-adenin-,-guanin-oder-cytosin-2'-phosphitamid/- H-phosphonat sowie ein N- Isobutyroyl-4'-DMT-3'-desoxy-ribopyranosyl-adenin-,-guanin-o der-cytosin-2'- phosphitamid/-H-phosphonat, 06- (2-Cyanoethyl)-4'-DMT-3'-desoxy-ribopyranosyl-guanin-, -xanthin-,-hypoxanthin-2'-phosphitamid/-H-phosphonat oder 06- (2- (4-Nitrophenyl) ethyl)-N2- isobutyroyl-4'-DMT-3'-desoxyribopyranosyl-guanin, und für die Kopplung an den festen

Träger beispielsweise 4'-DMT-3'-desoxy-pentopyranosyl-Nucleoside-2'-succinat, vorzugsweise ein 4'-DMT-3'-desoxy-ribopyranosyl-Nucleosid-2'-succinat, insbesondere ein 4'-DMT-3'-desoxyribopyranosyl-adenin-,-guanin-,-cytosin-,-th ymidin-,-xanthin-,- hypoxanthin-oder-uracil-2'-succinat sowie ein N-Benzoyl-4'-DMT-3'-desoxy- ribopyranosyl-adenin-,-guanin-oder-cytosin-2'-succinat sowie ein N-Isobutyroyl-4'-DMT- 3'-desoxy-ribopyranosyl-adenin-,-guanin-oder-cytosin-2'-succ inat, 0-(2-Cyanoethyl)-4'- DMT-3'-desoxy-ribopyranosyl-guanin-2'-succinat sowie ein 06- (2- (4-Nitrophenyl) ethyl)-N2- isobutyroyl-4'-DMT-3'-desoxyribopyranosyl-guanin-2'-succinat .

Die 3'-Desoxyribopyranosyl-nucleoside können z. B. durch ein Verfahren hergestellt werden, bei dem (a) eine gegebenenfalls geschützte Nucleobase mit einer geschützten 3'-Desoxyribopyranose umgesetzt wird, (b) die Schutzgruppen von dem 3'-Desoxyribopyranosyl-Teil des Produktes aus Schritt (a) abgespalten werden, und gegebenenfalls (c) das Produkt aus Schritt (b) an der 4'-Position des 3'-Desoxypentopyranosid geschützt wird.

In einer besonderen Ausführungsform ist das 3'-Desoxy-pyranosylnucleosid durch eine säurelabile, basenlabile, photolabile ß-eliminierbare oder metallkatalysiert abspaltbare Schutzgruppe Scl, oder S,,, geschützt.

Im allgemeinen handelt es sich bei den genannten Schutzgruppen um eine ß-eliminierbare Schutzgruppe, vorzugsweise eine Fluorenylmethyloxycarbonyl- (Fmoc) Gruppe, um eine photolabile Schutzgruppe, um eine Acylgruppe, vorzugsweise um eine Acetyl-, Benzoyl-, Nitrobenzoyl-und/oder Methoxybenzoyl-Gruppe, oder um Tritylgruppen, vorzugsweise um eine 4,4'-Dimethoxytrityl-(DMT)-Gruppe.

So erfolgt beispielsweise die Einführung einer DMT-Gruppe durch Umsetzen mit DMTCI in Anwesenheit einer Base, z. B. von N-Ethyldiisopropylamin (Hünig-Base), und z. B. von Pyridin, Methylenchlorid oder einem Pyridin/Methylenchlorid-Gemisch bei Raumtemperatur.

Der vorzugsweise anomerenreine Ribopyranosyl-Baustein wird im allgemeinen ausgehend von der 1, 2-0-Isopropyliden-5-0-triphenylmethyl-a-D-xylofuranose (1 in Fig. 1) nach

bekannten Verfahren (W. Sowa, Can. J. Chem, 1968,46,1568 ; Z. J. Witczak et. al.

Carbohydrate Research, 1982,110.326) aber im allgemeinen mit verbesserten Ausbeuten hergestellt. Analog dem bekannten Verfahren wird 1 (Fig. 1) trityliert und vorzugsweise Natriumhydrid an Stelle von Natronlauge für die Darstellung des Methylxanthogenatesters in der 3'-Position (2 in Fig. 1) verwendet. Nach Entfernen des Methylxanthogenats werden die Trityl-und die Isopropylidenschutzgruppe vorzugsweise mit Trifluoressigsäure an Stelle des in der Literatur beschriebenen 80% Eisessigs abgespalten. Durch diese Modifikationen konnten die Ausbeuten z. T. erheblich verbessert werden.

In einer weiteren Ausführungsform wird ein Linker gemäß Formel (II), worin R4' (CnH2n) NRl°'Rll-bedeutet und R'o'R"'über einen Rest der Formel (III) mit der bereits bezeichneten Bedeutung verbunden ist, durch folgendes Verfahren auf vorteilhafte Weise hergestellt : (a) eine Verbindung der Formel (II) mit R4'gleich (CnH2n) OSC3 oder (CnH2n) Hal, worin n die oben genannte Bedeutung hat, Sc3 eine Schutzgruppe, vorzugsweise eine Mesylat-Gruppe, und Hal Chlor oder Brom bedeutet, wird mit einem Azid, vorzugsweise in DMF, umgesetzt, anschließend wird (b) das Reaktionprodukt aus (a), vorzugsweise mit Triphenylphosphin z. B. in Pyridin reduziert, dann (c) das Reaktionsprodukt aus (b) mit einem entsprechenden Phthalimid, z. B. N- Ethoxycarbonylphthalimid, umgesetzt, und (d) das Reaktionsprodukt aus (c) mit einer entsprechenden geschützten Pyranose, z. B. 2', 4'- Di-O-Benzoyl-3'-desoxyribopyranose, umgesetzt, und schließlich (e) werden die Schutzgruppen, z. B. mit Methylat, abgespalten, und (f) die weiteren Schritte, wie oben bereits beschrieben, durchgeführt.

Daneben weisen Indolderivate als Linker den Vorzug der Fluoreszenzfähigkeit auf und sind daher für Nanotechnologie-Anwendungen, bei denen es ggf. um den Nachweis kleinster Substanzmengen geht, besonders bevorzugt. So wurden Indol-1-riboside bei N. N. Suvorov et al., Biol. Aktivn. Soedin., Akad. Nauk SSSR 1965,60 und Tetrahedron 1967,23,4653 bereits beschrieben. Allerdings gibt es kein analoges Verfahren, 3-substituierte Derivate herzustellen.

Im allgemeinen erfolgt ihre Herstellung über die Bildung eines Aminals der ungeschützten Zuckerkomponente und einem Indolin, welches dann durch Oxidation in das Indol-1-ribosid übergeführt wird. Beschrieben wurden z. B. Indol-1-glucoside und-1-arabinoside (Y. V.

Dobriynin et al, Khim.-Farm. Zh. 1978,12, 33), deren 3-substituierte Derivate meist über Vielsmeier-Reaktion hergestellt wurden. Dieser Weg der Einführung von Aminoethyl- Einheiten in 3-Position des Indols ist für eine industrielle Anwendung jedoch zu aufwendig.

In einer weiteren besonderen Ausführungsform wird daher ein Linker gemäß Formel (I), worin X und Y unabhängig voneinander, gleich oder verschieden, jeweils =C (Rl6) mit Rl6 gleich H oder CH und Z =C (R16)- mit R16 gleich (CnH2n) NRI°Rll durch folgendes Verfahren auf vorteilhafte Weise hergestellt : (a) das entsprechende Indolin, z. B. N-Phthaloyltryptamin, wird mit einer Pyranose, z. B. D- 3'-Desoxyribose, zum Nucleosiddiol umgesetzt, dann werden (b) die Hydroxylgruppen des Pyranosyl-Teils des Produktes aus (a) vorzugsweise mit Acylgruppen, z. B. mittels Essigsäureanhydrid, geschützt, anschließend wird (c) das Produkt aus (b), z. B. durch 2,3-Dichlor-5,6-dicyanoparachinon, oxidiert, und (d) die Hydroxyl-Schutzgruppen des Pyranosyl-Teils des Produktes aus (c) werden z. B. mittels Methylat abgespalten und anschließend werden (e) die weiteren Schritte, wie oben bereits beschrieben, durchgeführt.

In einer weiteren Ausführungsform werden die 4'-bzw. 2'-geschützten, 3'- Desoxypentopyranosyl-Nucleoside in einem weiteren Schritt phosphityliert oder an eine feste Phase gebunden.

Die Phosphitylierung erfolgt beispielsweise durch Phosphorigsäurecyanoethylester- diisopropyl-amidchlorid in Anwesenheit einer Base, z. B. N-Ethyldiisopropylamin oder durch Phosphortrichlorid und Imidazol bzw. Tetrazol und nachfolgender Hydrolyse unter Basenzusatz. Im ersten Fall ist das Produkt ein Phosphoramidit und im zweiten Fall ein H- Phosphonat. Die Bindung eines geschützten erfindungsgemäßen Pentopyranosyl-Nucleosids an eine feste Phase, z. B."long-chain-alkylamino-controlled pore glass" (CPG, Sigma Chemie, München) kann beispielsweise über einen Succinoyl-Linker erfolgen.

Die erhaltenen Verbindungen können für die Herstellung der erfindungsgemäßen 3'- Desoxypentopyranosyl-Nucleinsãuren dienen.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ein Verfahren zur Herstellung einer 3'-Desoxypentopyranosyl-Nucleinsäure, mit folgenden Schritten :

(a) in einem ersten Schritt wird ein geschütztes 33-Desoxypentopyranosyl-NucleosidS wie oben bereits beschrieben, an eine feste Phase gebunden wird und (b) in einem zweiten Schritt wird das gemäß Schritt (a) an eine feste Phase gebundene 4'- geschützte 3'-Desoxypentopyranosylnukleosid um ein 2'-phosphityliertes 4'-geschütztes 3'- Desoxypentopyranosyl-Nucleosid verlängert und bei Einsatz von Phosphoramiditen anschließend z. B. durch eine wãßrige Jodlösung oxidiert wird, und (c) Schritt (b) solange mit gleichen oder unterschiedlichen phosphitylierten 3'-, 4'- geschützten 3'-Desoxypentopyranosyl-Nucleosiden wiederholt, bis die gewünschte 3'- Desoxypentopyranosyl-Nucleinsãure vorliegt.

Bei Einsatz von H-Phosphonaten erfolgt die Oxidation zu den entsprechenden Phosphorsäurediestem im allgemeinen am Ende der Reaktionskette z. B. durch eine wäßrige Jodlösung.

Als Kupplungsreagenz bei Einsatz von Phosphoramiditen eignet sich besonders Pyridinium- Hydrochlorid, da im Gegensatz zu üblicherweise verwendeten Kupplungsreagenzien keine Umkristallisation des Kupplungsreagenzes, keine Verstopfung der Kupplungsreagenz- Leitungen und eine wesentlich schnellere Kondensation erfolgt.

Als Kupplungsreagenz beim Einsatz von H-Phosphonaten eignen sich besonders Arylsulfonylchloride, Diphenylchlorophosphat, Pivaloylchlorid oder Adamantoylchlorid.

Ein wesentlicher Vorteil der H-Phosphonatmethode ist, daß keine Phosphatschutzgruppen benötigt werden. Die Acylschutzgruppen der Basen können z. B. durch wäßrigen Ammoniak abgespalten werden. Bei Verwendung des 2- (4-Nitrophenyl) ethyl-Restes als Schutzgruppe der 06-Position des Guanins kann dieser beispielsweise problemlos durch eine ca. 40minütige Behandlung mit 1 M DBU entfernt werden.

Weiterhin ist es von Vorteil, dal3 keine schutzgruppenabspaltenden Hydrazinolyse von Oligonukleotiden notwendig ist, und somit keine Ringöffnung, vor allem bei Uracil und Thymin, zu befürchten ist. Die Cyanoethylreste können gemeinsam mit den Acylschutzgruppen der Basen durch wäßrigen Ammoniak abgespalten werden. Bei der Verwendung des 2- (4-Nitrophenyl) ethyl-Restes als Schutzgruppe der 06-Position des

Guanins kann der Rest ohne Probleme durch ca. 40 minütige Behandlung mit 1 M DBU entfernt werden.

In einer weiteren besonderen Ausführungsforrn können in Schritt (a) und/oder Schritt (b) auch Pentofuranosyl-nucleoside, z. B. das in ihrer natürlichen Form vorkommende Adenosin, Guanosin, Cytidin, Thymidin und/oder Uracil, eingebaut werden, was z. B. zu einer gemischten p-DNA-DNA bzw. p-DNA-RNA führt. p-NA's und insbesondere die p-DNA's bilden untereinander stabile Duplices und paaren im allgemeinen nicht mit den in ihrer natürlichen Form vorkommenden DNA's und RNA's.

Diese Eigenschaft macht p-NA's zu bevorzugten Paarungssystemen.

Solche Paarungssysteme sind supramolekulare Systeme nicht kovalenter Wechselwirkung, die sich durch Selektivitãt, Stabilitat und Reversiblität auszeichnen, und deren Eigenschaften bevorzugt thermodynamisch, d. h. durch Temperatur, pH-Wert und Konzentration beeinflußt werden. Solche Paarungssysteme können z. B. aufgrund ihrer selektiven Eigenschaften auch als"molekularer Klebstoff'für die Zusammenführung von unterschiedlichen Metallclustern zu Cluster-Verbãnden mit potentiell neuen Eigenschaften verwendet werden [siehe z. B. R.

L. Letsinger, et al., Nature 1996,382,607-9 ; P. G. Schultz et al., Nature 1996,382,609-11].

Folglich eignen sich die p-NA's auch für die Anwendung im Bereich der Nanotechnologie, beispielsweise zur Herstellung neuer Materialien, Diagnostika und Therapeutika sowie mikroelektronischer, photonischer bzw. optoelektronischer Bauteile und für das kontrollierte Zusammenführen molekularer Species zu supramolekularen Einheiten, wie z. B. für den (kombinatorischen) Aufbau von Proteinassemblies [siehe z. B. A. Lombardi, J. W. Bryson, W. F. DeGrado, Biomoleküls (Pept. Sci.) 1997,40,495-504, da p-NA's Paarungssysteme bilden, die stark und thermodynamisch kontrollierbar sind. Eine weitere Anwendung ergibt sich daher gerade im diagnostischen und drug discovery-Bereich durch die Möglichkeit, funktionelle, bevorzugt biologische Einheiten wie Proteine oder DNA/RNA-Abschnitte, mit einem p-NA-Code zu versehen, der nicht mit den natürlichen Nucleinsäuren interferiert (siehe z. B. W093/20242).

Ein anderer Gegenstand der Erfindung ist daher die Verwendung einer erfindungsgemäßen 3'- Desoxypentopyranosyl-Nucleinsãure zur Herstellung eines Arzneimittels, insbesondere eines Therapeutikums, Diagnostikums und/oder elektronischen Bauteils.

Ein Biomolekül, z. B. DNA oder RNA, kann zum nicht-kovalenten Verbinden (Linken) mit einem anderen Biomolekül, z. B. DNA oder RNA, verwendet werden, wenn beide Biomoleküle Abschnitte enthalten, die aufgrund komplementärer Sequenzen von Nucleobasen durch Ausbildung von Wasserstoffbrücken aneinander binden können. Derartige Biomoleküle finden z. B. in analytischen Systemen zur Signalamplifizierung Verwendung, wo ein in seiner Sequenz zu analysierendes DNA-Molekül über einen solchen nicht-kovalenten DNA-Linker zum einen an einen festen Rager immobilisiert, und zum anderen an ein signalverstärkendes branchedDNA-Molekül (bDNA) gebunden werden soll (siehe Fig. 3 in S. Urdea, Bio/Technol. 1994,12,926 oder US-Patent Nr. 5,624,802). Ein wesentlicher Nachteil der zuletzt beschriebenen Systeme ist, daß sie den Verfahren zur Nucleinsãure-Diagnostik durch Polymerase-Chain-Reaction (PCR) (K. Mullis, Methods Enzymol. 1987,155,335) hinsichtlich der Empfindlichkeit bis jetzt unterlegen sind. Das ist u. a. darauf zurückzuführen, daß die nicht-kovalente Bindung vom festen Rager an das zu analysierende DNA-Molekül ebenso wie die nicht-kovalente Bindung des zu analysierenden DNA-Moleküls nicht immer spezifisch erfolgt, wodurch es zu einer Vermischung der Funktionen"Sequenzerkennung" und"nicht-kovalente Bindung"kommt. Die Verwendung von p-NA's als orthogonales Paarungssystem, welches nicht in das DNA-bzw. RNA-Paarungsgeschehen eingreift, löst dieses Problem auf vorteilhafte Weise, wodurch die Empfindlichkeit der beschriebenen analytischen Verfahren deutlich erhöht werden kann Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ein Konjugat enthaltend ein erfindungsmäßiges 3'-Desoxypentopyranosyl-Nucleosid der Formel (I) oder (II) und ein Biomolekül.

Unter Biomeolekül versteht man im Sinne der vorliegenden Erfindung eine natürlich vor- kommende oder eine von einer natürlich vorkommenden Substanz abgeleitete Substanz.

Konjugate sind im Sinne der vorliegenden Erfindung kovalent gebundene Hybride aus p- NA's und anderen Biomolekülen, vorzugsweise ein Peptid, Protein oder eine Nucleinsãure, beispielsweise ein Antikörper oder ein funktioneller Teil davon oder eine in ihrer natürlichen Form vorkommende DNA und/oder RNA. Funktionelle Teile von Antikörper sind beispielsweise Fv-Fragmente (Skerra & Plückthun (1988) Science 240,1038), einzelkettige

Fv-Fragmente (scFv ; Bird et al. (1988), Science 242,423 ; Huston et al. (1988) Proc. Natl.

Acad. Sci. U. S. A., 85,5879) oder Fab-Fragmente (Better et al. (1988) Science 240,1041).

In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich dabei um p-DNA/DNA-bzw p- DNA/RNA-Konj ugate.

Konjugate werden dann vorzugsweise verwendet, wenn die Funktionen"Sequenzerkennung" und"nicht-kovalente Bindung"in einem Molekul realisiert werden musse, da die erfindungsgemäßen Konjugate zwei zueinander orthogonale Paarungssysteme enthalten.

Für die Herstellung von Konjugaten sind sowohl sequentielle als auch konvergente Verfahren geeignet.

In einem sequentiellen Verfahren wird z. B. nach erfolgter automatisierter Synthese eines p- RNA-Oligomeren direkt am gleichen Synthesizer-nach Umstellung der Reagenzien und des Kupplungsprotokolls-z. B. ein DNA-Oligonukleotid weitersynthetisiert. Dieser Vorgang läßt sich auch in umgekehrter Reihenfolge durchführen.

In einem konvergenten Verfahren werden z. B. p-RNA-Oligomere mit Aminoterminalen- Linkern und z. B. DNA-Oligomere mit z. B. Thiol-Linkern in getrennten Vorgängen synthetisiert. Anschließend erfolgt vorzugsweise eine Jodacetylierung des p-DNA- Oligomeren und die Kupplung der beiden Einheiten nach literaturbekannten Protokollen (T.

Zhu et al., Bioconjug. Chem. 1994,5,312).

Konvergente Verfahren erweisen sich aufgrund ihrer Flexibilitat als besonders bevorzugt.

Unter dem Begriff Konjugat im Sinne der vorliegenden Erfindung sind auch sogenannte Arrays zu verstehen. Arrays sind Anordnungen von immobilisierten Erkennungsspecies, die speziell in der Analytik und Diagnostik eine wichtige Rolle bei der simultanen Bestimmung von Analyten spielen. Beispiele sind Peptide-Arrays (Fodor et al., Nature 1993,364,555) und Nucleinsäure-Arrays (Southern et al. Genomics 1992,13,1008 ; Heller, US-Patent Nr.

5,632,957). Eine höhere Flexibilität dieser Arrays kann dadurch erreicht werden, daß die Erkennungsspecies an codierende Oligonucleotide gebunden werden und die zugehörigen, komplementären Stränge an bestimmte Positionen auf einem festen Träger. Durch Aufbringen der codierten Erkennungsspecies auf den"anti-codierten'festen Trãger und Einstellung von

Hybridisierungsbedingungen werden die Erkennungsspecies an den gewünschten Positionen nicht-kovalent gebunden. Dadurch können verschiedene Typen von Erkennungsspecies, wie z. B. DNA-Abschnitte, Antikörper, nur durch Anwendung von Hybridisierungsbedingungen gleichzeitig auf einem festen Träger angeordnet werden (siehe Fig. 4.). Voraussetzung hierzu sind aber äußerst starke, selektive-um die codierenden Abschnitte möglichst kurz zu halten- und mit natürlicher Nucleinsäure nicht interferierender Codons und Anticodons notwendig. p- NA's, vorzugsweise p-DNA's eignen sich hierzu in besonders vorteilhafter Weise.

Die vorliegende Erfindung betrifft daher auch ein Verfahren, mit denen Erkennungsspecies, bevorzugt natürliche DNA-oder RNA-Stränge und Proteine, dabei bevorzugt Antikörper oder funktionelle Teile von Antikörper, durch p-NA-Abschnitte, bevorzugt p-DNA-Abschnitte, eindeutig codiert werden. Diese können dann gemäß Fig. 4. mit den zugehörigen Codons auf einem festen Träger hybridisiert werden. Damit kann auf einem festen Träger, der in Form eines Arrays mit Codons ausgestattet ist, nur durch Einstellung von Hybridisierungsbedingungen mit immer neuen Kombinationen von Erkennungsspecies an den gewünschten Positionen immer neue, diagnostisch nützliche Arrays aufgebaut werden. Wird dann der Analyt, beispielsweise eine biologische Probe wie Serum o. ä. aufgebracht, dann werden die zu detektierenden Species in einem bestimmten Muster auf dem Array gebunden, welches dann indirekt (z. B. durch Fluoreszenzmarkierung der Erkennungsspecies) oder direkt (z. B. durch Impedanzmessung am Anknüpfungspunkt der Codons) registriert wird. Dann wird die Hybridisierung durch geeignete Bedingung aufgehoben (Temperatur, Salze, Lösungsmittel, elektrophoretische Vorgänge) so daß wieder nur der Träger mit den Codons zurückbleibt. Dieser wird dann erneut mit anderen Erkennungsspecies beladen und wird z. B. für den gleichen Analyten für die Ermittlung eines anderen Musters verwendet. Die immer neue Anordnung von Erkennungsspecies im Array- Format und die Verwendung von p-NA's als Paarungssysteme ist gegenüber anderen Systemen, siehe z. B. WO 96/13522 (s. 16, unten), besonders vorteilhaft.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung bezieht sich daher insbesondere auch auf ein Diagnostikum und/oder einen elektronischen Bauteil enthaltend ein erfindungsgemäßes Konjugat, wie oben bereits näher beschrieben.

Die folgenden Figuren und Beispiele sollen die Erfindung näher beschreiben, ohne sie zu beschränken.

BESCHREIBUNG DER FIGUREN Fig. 1 zeigt die Synthese der Zuckerkomponente, wobei T Triphenylmethyl (Trityl) bedeutet.

Fig. 2 zeigt den Syntheseweg zu den monomeren Bausteinen, wobei B eine in der Natur vorkommende oder synthetische Nucleobase bedeutet.

Fig. 3 zeigt einen Ausschnitt aus der Struktur von RNA in ihrer natürlich vorkommenden Form (links) und eine p-DNA (rechts).

Fig. 4 zeigt schematisch eine Anordnung von immobilisierten Erkennungsstrukturen (Arrays) auf einem festen Träger.

BEISPIELE Beispiel 1 1,2-0-Isopropyliden-3-0- ( (methylthio) thiocarbonylJ-5-0-trityl-a-D-xylofuranose (3) 444,3 g (1,027 mol) 1,2-O-Isopropyliden-5-O-trityl-a-D-xylofuranose (2) wurden in 1000 ml abs DMF gelöst. Unter Kühlung, KPG-Rührung, N2-Atmosphäre und leichtem N2-Strom bei 0-50 C wurden portionsweise innerhalb von 1 h 29,58 g (1,232 mol) NaH zugegeben. Nach beendeter NaH Zugabe wurde noch weitere 15 Minuten unter Kühlung gerührt. Man rührte noch eine weitere Stunde ohne Kühlung bis kein Wasserstoff mehr entsteht. Die Innentemperatur der klaren Lösung betrug 120 C. Nun wurden 57,7 ml (1,027 mol) Schwefelkohlenstoff innerhalb von 20 Minuten zugetropft. Die Reaktionstemperatur wurde durch Kühlung bei 20-250 C gehalten. Nach 30 Minuten wurden 77,4 ml (1,027 mol) Jodmethan innerhalb von 20 Minuten unter leichter Kühlung langsam zugegeben (T=20- 25°C). Während der Reaktion mu#ten weitere 500 ml DMF zugegeben werden. Nach weiteren 2 h wurde der Ansatz auf 2 1 Eiswasser und 1,5 1 Dichlormethan gegeben und

ausgerührt. Die org. Phase wurde mit 4 x 0,7 1 Wasser extrahiert, über Na2SO4 getrocknet, filtriert und eingeengt. Man erhielt 610.5 g rohes Produkt welches direkt weiter umgesetzt wurde.

DC (Kieselgel, Aceton/Heptan 1 : 4) : Rf=0.30.

IH NMR (300 MHz, CDC13) : 1,32,1,56 (2s, 3H, 2 x CH3), 2,41 (s, 3H, S-CH3), 3,32 (dd, 1H, H-C (5)), 3,47 (dd, 1H, H-C (5)), 4,54 (m, 1H, H-C (4)), 4,64 (m, 1H, H-C (2)), 5,89 (m, 1H, H-C (3)), 6,09 (d, J = 3 Hz, 1H, H-C (1)), 7,18-7,43 (m, 15H, Harom).

Beispiel 2 3-Desoxy-1, 2, 4-Tri-O-Benzoyl-a-D-erythro-pentose (6) 4,16 g (1 mmol) 3-Desoxy-1,2-O-Isopropyliden-5-O-trityl-a-D-xylofuranose (4) wurden in 20,0 ml Dichlormethan gelöst. Unter Rühren bei RT wurden 20,0 ml Wasser und 2,0 ml Trifluoressigsäure zugegeben und 17 h bei RT gerührt. Die Phasen wurden getrennt, die wässrige Phase wurde 2 x mit je 20 ml Dichlormethan extrahiert und etwas eingeengt. Der Rückstand wurde noch 2x in jeweils 20 ml Wasser gelöst und eingeengt. Der Rüchstand wurde wieder in 20 ml Wasser gelöst, mit 2,0 g stark basischem Ionentauscher 15 Minuten verrührt (pH-Wert 7-8), der Ionentauscher abfiltriert und zur Trockne eingeengt. Das leicht gelbliche 01 wurde mit 27 ml abs. Pyridin/Dichlormethan 2 : 1 versetzt, 2.0 g Molsieb 4 Å addiert und 1 h unter Argon gerührt. Nun wurden 6.1 ml Benzoylchlorid in 6.1 ml abs.

Pyridin bei-30°C zugetropft. Nach I Stunde ließ man auf Raumtemperatur kommen und rührte über Nacht. Nach der Zugabe von 2 ml MeOH wurde eingeengt, der feste Rückstand mit Toluol koevaporiert, abermals in Toluol aufgenommen, verrührt und abfiltriert. Das Filtrat wurde eingeengt und über eine Kieselgelsäule (Kieselgel 60,4 x 33 cm) mit einem linearen Gradienten von Heptan zu Heptan/EtOAC 2 : 1 in 41 gereinigt. Die erhaltenen Produktfraktionen wurden einegeengt, in 30 ml Diethylether verrührt und der Feststoff abgesaugt. Man erhielt 1.07 g (25%) eines weißen Feststoffs.

DC (Kieselgel, Dichlormethan/MeOH 4 : 1) : Rf=0. 45.

DC (Kieselgel, Heptan/EtOAc 2 : 1) : Rf=0.35.

'H NMR (300 MHz, CDCl3) : 2,51 (m, 2H, H-C (3)), 4,01 (dd, lH, H-C (5)), 4,21 (dd, lH, H-C (5)), 5,17 (m, 2H, H-C (4), H- C (2)), 6, 38 (d, J=2 Hz, lH, H-C (l)), 7,18-7.95 (m, 16 H, HJ, 7,40 (m. 4H, HJ, 7,52 (m,6H,Harom).(m,1H,Harom),7.95 13C (300 MHz, CDC13) : 27,28 (s, C (3)), 63,45 (s, C (5)), 65,56 (s, C (4)), 66,24 (s, C (2)), 91,202 (s, C (1)), 128,2-129,9 (m, 12Carom), 133,07 (s, Carom, para), 133, 22 (s, Carom, para), 133,71 (s, Carom, para), 164, 22 (s, C=O), 165,60 (s, C=O), 166,06 (s, C=O).

Beispiel 3 Synthese 1-{3'-Desoxy-4'-O-[(4,4'-dimethoxytriphenyl)-methyl]-ß-D-ri bopyranosyl}- thymin-2'-O- N-disopropyl)-phosphoramidits (I Oa) Synthese des 1-(3'-Desoxy-2, 4-Di-O-benzoyl-D-D-ribopyranosyl)-thymins (7a) 1,0 g (2,24 mmol) 3'-Desoxy-1,2,4-Tri-O-benzoyl-ribopyranose (6) und 283 mg (2,24 mmol) Thymin wurden in 11,0 ml Acetonitril suspendiert und auf 60°C erwärmt. Zu dieser Mischung wurden innerhalb von 10 Minuten 957 mg (4,7 mmol) N, O-Bis- (trimethylsilyl) acetamid (BSA) mit einer Spritze zugetropft und 15 min bei 60°C belassen. Zu der entstandenen Lösung addiert man 2,02 g (9,07 mmol) Trifluormethansulfon- säuretrimethylsilylester (=TMS-triflat) innerhalb von 45 min und rührt 2 h bei 60°C nach. Das Reaktionsgemisch läßt man auf RT abkühlen, verdünnt mit EtOAc und extrahiert gegen verdünnte NaHC03-Lösung. Die EtOAc-Phase wurde nochmals mit Wasser extrahiert, über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und eingeengt. Durch Chromatographie an Kieselgel 60 (3 x 28 cm) mit einem linearen Gradienten von Heptan bis Heptan/EE = 1/1 in 41, erhielt man nach Einengen der produkthaltigen Fraktionen einen farblos amorphen Feststoff, der in 20 ml

Diethylether aufgenommen und verrührt wurde. Es resultierten 1. 0 g (99%) des gewünschten Produkts.

DC (Kieselgel, EtOAc/Heptan 1 : 1) : Rf=0. 27.

H NMR (300 MHz, CDC13) : 1,94 (d, 3H, CH3), 2.12 (dd, 1H, H¢q-C (3')), 2,93 (m, 1H, H^x-C (3')), 3,70 (t, 1H, Heq-C (5')), 4,40 (m, 1H, Hax-C(5')), 5,25 (m, 1H, H-C (4')), 5,32 (m, 1H, H-C (2')), 5,93 (d, J=9,3 Hz, 1H, H-C (1')), 7,22 (d, 1H, H-C (6)) (m, 4H, 3, 5-Harom), 7,54-763 (m, 2H, 4-Harom), 7, 94- 8,04 (m, 4H, 2, 6-Harom), 8,26 (bs, 1H, H-N (3)).

13C (300 MHz, CDCl3) : 12,52 (CH3), 165,10 (C=O), 34,63 (C (3')), 65,85 (C (4')), 67,64 (C (2')), 69,16 (C (5')), 82,22 (C (1')), 111,94 (C (5)), 128, 50 (Carom), 128, 54 (Carom), 128,72 (Carom), 129,21 (Carom), 129,71 (Carom), 129, 85 (Car,,.)'133,51 (Carom), 133,63 (C) 134,66 (C (6)), 150,69 (C (2)), 163, 31 (C (4)), 165,34 (C=O).

Synthese des 1- (3'-Desoxy-ribopyranosyl)-thymins (8a) 807 mg (1,79 mmol) 1 wurden in 20 ml methanolischem Ammoniak 48 h bei RT gerührt.

Danach wurde die Reaktionslösung eingeengt, der feste Rückstand in EtOAc/MeOH = 9 : 1 verrührt und abgesaugt. Man erhielt 345 mg (80%) eines weißen kristallinen Feststoffs. Die Mutterlauge wurde eingeengt und über eine Kieselgelsäule (Kieselgel 60,3 x 15 cm) mit einem linearen Gradienten von EtOAc bis EtOAc/MeOH = 9 : 1 in 31 gereinigt. Man erhielt weitere 70 mg (16%) des gewünschten Produkts. Insgesamt wurden 415 mg (96%) von 2 isoliert.

DC : (Kieselgel, EtOAc/MeOH 9 : 1) Rf=0, 28 1H-NMR (300 MHz, MeOD) : 1,48 (q, 1H, Hb (3'), 1,80 (d, 3H, CH3), 2,37 (m, 1H, Hb (3')), 3,20 (t, 1H, Hb (5')), 3,24 (m, 2H, OH), 3,70 (m, 1H, H (4')), 3,75 (m, 1H, H (2')), 3,90 (ddd, IH, Ha (5')), 5,22 (d, 1H, J=9 Hz, H (1')), 7,37 (d, 1H, H (6)).

Synthese des 1- {3'-Desoxy-4-O-(4, 4'-dimethoxytriphenyl)-methyl-p-D-ribopyranosyl}- thymins (9a) 320 mg (1, 32 mmol) 8a wurden unter N2-Atmosphäre in 6 ml abs. Dichlormethan/Pyridin 1 : 2 gelöst, 1g Molsieb 4 Å addiert und der Ansatz 15 min bei RT gerührt. Nun kühlte man auf- 10°C ab, addierte 0,47 ml Diisopropylamin und 0,76 g (2,24 mmol) Dimethoxytrityl-chlorid (DMTCI) ließ auf RT kommen. Es wurde über Nacht gerührt. Nochmalige Zugabe von 0,38 g (1,12 mmol) DMTCI in 2 ml abs. Dichlormethan und rühren über Nacht brachte die Reaktion zur Vollständigkeit. Der Ansatz wurde vom Molsieb abgesaugt, auf halbgesättigte NaHCO3- Lösung gegossen und mit Methylenchlorid extrahiert. Die Methylenchloridphase wurde 2x mit Wasser ausgeschüttelt, über Na2SO4 getrocknet, filtriert und eingeengt. Es wurde über eine Kieselgelsäule (Kieselgel 60 ; 3 x 20 cm) und einem Gradienten (2 1 n-Heptan und 21 n- Heptan/EE = 1/lals linearer Gradient) gereinigt. Zum Schluß wurde die Säule mit Heptan/EtOAc/MeOH 5 : 5 : 1 gewaschen, die produkthaltigen Fraktionen einrotiert, in 50 ml Tetrachlorkohlenstoff verrührt und wiederum eingeengt. Der Rückstand wurde an der HV über Nacht getrocknet. Man erhielt 352 mg (32%) des zweifach tritylierten Produkts 12a. Die polaren Fraktionen wurden noch einmal über eine Kieselgelsäule (Kieselgel 60,3 x 25 cm) mit einem linearen Gradienten von Dichlormetan bis Dichlormethan/MeOH 19=1 in 41 aufgetrennt. Man isolierte 50 mg (7%) an 1-{3'-Desoxy-2'-0-(4, 4'-dimethoxytriphenyl)- methyl-g3-D-ribopyranosyl}-thymin l la und 293 mg (41%) 9a.

DC (Kieselgel) : 9a (CH2CI2/MeOH 19 : 1) Rf=0,26 11a (CH2Cl2/MeOH 19 : 1) Rf=0,29 12a (EtOAc/Heptan 4 : 1) Rf=0,49 tH-NMR (300 MHz, CDC13) : 1,75 (s, 3H, CH3), 2,20 (m, 1H, Hax(3')), 2,92 (m, 1H, Heq(3')), 3, 11 (m, 2H, H(4'), Hax-C(5')), 3,34 (m, 1H, Heq(5')), 3,64 (m, 1H, H(2')), 3,71 (d, 6H, 2 x OCH3), 5,26 (d, 1H, J=9 Hz, H (1')), 6,76 (m, 4H, H.. m), 6,89 (d, 1H, H (6)), 7,10-7,44 (m, 9H, Harom), 9,14 (bs, 1H, H-N (3))

Synthese des 1- {3'-Desoxy-4'-O-[(4,4'-dimethoxytriphenyl)-methyl]-ß-D-ribo pyranosyl}- thymin-2'-0-(2-cyanoethyl-N, N-disopropyl)-phosphoramidits (lOa) 218 mg (0,4 mmol) 1-{3'-Desoxy-4'-O-[(4,4'-dimethoxytriphenyl)-methyl]-ß-D- ribopyranosyl}-thymin 9a wurden in 2,0 ml abs Dichlormethan gelöst und mit 155 mg (1,2 mmol) N-Ethyldiisopropylamin versetzt. Bei RT. wurden nun 237 mg (1,0 mmol) Phosphorigsäure-mono-(2-cyanoethylester)(2-cyanoethylester) diisopropyl-amidchlorid innerhalb von zwei Minuten zugetropft. Der Ansatz rührte 3 h bei RT., wurde mit CH2Cl2 auf 40 ml verdünnt und mit 50 ml Phosphatpuffer (pH=7) extrahiert, die org. Phase über Na2SO4 getrocknet, filtriert und eingeengt. Das Rohprodukt wurde über eine Kieselgelsäule (3 x 15 cm) mit einem linearen Gradienten von EE/Heptan = 1 : 2 bis EE in 41 gereinigt. Man erhielt 266 mg (89%) eines farblosen Harzes.

DC (Kieselgel, Heptan/EtOAc 4 : 1) : R f = 0,47/0.54 MHzinCDCl3):1H-NMR(400 1,10 (m, 6H, 2x CH3); 1,83 (m, 1H, Hax-C(3')); 1,88 (m, 3H, CH3-C(5)); 2,21 (m, Heq-<BR> <BR> <BR> C(3')); 2,41-2,61 (m, 2H, (m,1H,Heq-C(5'));3,19(m,1H,Hax-C(5'));3,35-2,92 3,80 (m, 6H, CH2OP, H-C(4'), H-C(2'); 2xCH); 3,8 (m, 6H, (d,J=8,86Hz,1H,5,41 H-C(1')); 4H,HDMT);6,97(m,1H,H-C(6));7,20-7,52(m,9H,Harom);8,25(s,1H,H -(m, N (3)).

Beispiel 4 Synthese N6-Benzoyl-3-{3'-Desoxy-4'-O-[(4,4'-dimethoxytriphenyl)-meth yl]-ß-D- ribopyrano-syl)-adenins-2'-O- (2-cyanoethyl-N, N-disOpropyl)-phosphoramidits (1 Ob) Synthese des N6-Benzoyl-3- (3'-desoxy-2, 4-di-O-benzoyl-ribopyranosyl)-adenins (7b) 2,23 g (5 mmol) 6 und 1,20 g (5 mmol) N6-Benzoyladenin wurden unter Argonatmosphäre in 35 ml abs. Acetonitril vesetzt und 15 Minuten gerührt. Es wurde auf leichten Rückfluß erhitzt.

Zu dieser Suspension wurde innerhalb von 20 Minuten 2,14 g (10,5 mmol) BSA zugetropft und 15 min bei 68°C gerührt. Nun wurden innerhalb 5 Minuten 4,7 g (18 mmol) Zinntetra-

chlorid zugetropft und 1h am Rückfluß gerührt. Man ließ auf RT kommen, goß auf 150 ml gesättigter NaHCO3-Lsg und extrahierte gegen 100 ml EtOAc. Der ausgefallene Niederschlag wurde abgesaugt und mit 150 ml EtOAc gewaschen. Die org. Phase wurde nochmals mit 100 ml Wasser ausgeschüttelt, über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und eingeengt. Man reinigte über eine Kieselgelsäule (3 x 26 cm) mit einem Gradienten (21 EtOAc/Heptan 2 : 1 und 21 EtOAc linearer Gradient), vereinigte die produkthaltigen Chargen und isolierte 2,7 g (96 %) eines weißen Feststoffs.

DC (Kieselgel) : 4 (EtOAc) : Rf = 0, 40.

1H-NMR (300 MHz, CDCI3) : 2,16 (m, 1H, Hax(3')), 2,97 (m, IH, H q (3')), 3,76 (m, 1H, Hax(5')), 4,41 (m, 1H, Heq (5')), 5,38 (m, 1H, H (4')), 5,62 (m, 1H, H (2')), 5,98 (d, 1H, J = 8,92 Hz, H (1')), 7,22-8,0 (m, 15H, Harom), 8,21 (s, 1H, H (8)), 8,74 (s, 1H, H (2)), 8,91 (bs, 1H, NH).

13C-NMR (300 MHz, CDCl3) : 34,57 (C (3')), 65,80 (C (4')), 68,86 (C (2')), 69,13 (C (5')), 82,67 (C (1')), 122,53 (C (6)), 127,76-133,62 (12 x C (arom)), 140,62 (C (8)), 149,63 (C (6)), 151,91 (C (4)), 153,03 (C (2)), 164,44 (C=O an N-C (6)), 164,77 (C=O), 165,32 (C=O).

Synthese des N6-Benzoyl-3-(3'-Desoxy--D-ribopyranosyl)-adenins (8b) 280 mg (0,5 mmol) 7b wurden in 7 ml THF/MeOH/H2O 5 : 4 : 1 gelöst und, auf-5°C abgekühlt und 2,22 ml 32 % ige NaOH-Lösung in THF/MeOH/H20 5 : 4 : 1 langsam zugegeben, so daß die Temp. unter 0°C blieb. Man rührte 20 min unter Kühlung, versetzte mit 400 mg (7,5 mmol) Ammoniumchlorid und ließ die Lösung auf RT kommen. Die Lösungsmittel wurden abgezogen, der Rückstand in 20ml MeOH gelöst, auf 10 g Kieselgel aufgezogen und chromatographisch über eine Kieselgelsäule (3 x 12 cm mit 1 I Dichlormethan und 2 1 CH2Cl2/MeOH = 4/1 als linearer Gradient) gereinigt. Es wurden 157 mg (88%) des farblosen Feststoffs 8b isoliert.

DC (Kieselgel) : 5 (EtOAc/MeOH 4 : 1) Rf = 0,34

'H-NMR (300 MHz, MeOD) : 1,58 (q, 1H, Hax(3')), 2,45 (m, 1H, Heq(3')), 3,33 (m, 1H, Hax(5')), 3, 87 (m, 1 H, H (4')), 3,97 (m, 1H, Heq (5')), 4,25 (m, 1H, H (2')), 5,40 (d, 1H, J=9,2 Hz, H (1')), (m, 5H, Ha,..), 8,47 (s, 1H, H (8)), 8,63 (s, 1H, H (2)).

Synthese des N6-Benzoyl-3- 3'-desoxy-4'-O- (4, 4'-dimethoxytriphenyl)-methyl-p-D- ribopyranosyl}-adenins (9b) In einer Argonatmosphäre wurden 1,02 g (2,87 mmol) 8b in 9,0 ml abs Pyridin gelõst, 1,56 g (12 mmol) N-Ethyldiisopropylamin und 1,0 g Molsieb 4 A addiert und 30 min bei RT gerührt. Nun wurde auf -10°C abgekühlt, 2,2 g (6,49 mmol) DMTCI in 5,0 ml abs. Chloroform gelöst innerhalb von 30 min zugetropft. Der Versuch rührte bei RT über Nacht. Nach 22 h wurden wiederum 200 mg (0,59 mmol) DMTCI und 2 h darauf weitere 430 mg (1,27 mmol) DMTCI in fester Form zugegeben. Nach nochmals 22 h bei RT wurde der Ansatz auf 100 ml einer halbgesättigten NaHCO-Lsg. gegossen, mit 100 ml Methylenchlorid versetzt und extrahiert.

Die org. Phase wurde noch 2 x mit je 100 ml H2O rückextrahiert, über Na2SO4 getrocknet, filtriert und eingeengt. Reinigung über eine Kieselgelsäule (3 x 25 cm) mit einem Gradienten (21 EtOAc/Heptan 2 : 1 und 21 EtOAc mit einem linearen Gradienten) lieferte : 520 mg (27,5 %) 9b, 430 mg (23%) Mischung aus 9b und 1 lb, 370 mg (13,4 %) 12b und 370 mg (20%) des Edukts.

DC (Kieselgel, EtOAc) : 9b : Rif= 0.29 l lb : Rf=O. 12 12b : Rf= 0.55 'H-NMR (500 MHz in CDC13) : 1,92 (m, 1H, Hax(3')), 2,42 (m, 1H, Heq (3')), 2,99 (m, 1H, Heq(5')), 3, 21 (m, 1H, H. (5')), 3,79 (d, 6H, 2 x OCH3), 3,84 (m, 1H, H (4')), 4,13 (m, 1H, H (2')), 5,17 (bs, 1H, OH), 5,32 (d, 1H, J=8,7 Hz, H (1')), 6,86 (dd, 4H, Harom), 7,20-7,75 (m, 12H, Harom), 7,96 (m, 3H, 1H (8), 2Harom), 8,54 (s, 1H, H (2)), 8,94 (bs, 1H, NH).

13C-NMR (500 MHz in CDCl3)

39, 1 (C (3')). 55,26 (2 x OCH3), 66, 59 (C (4')), 67,72 (C (2')), 70,76 (C (5')), 86,69 (Ct, Trityl), 86,93 (C(1')), 113,31 (2Carom), 121,8 (C (5)), (11Carom), 141,74 (C (8)), 145,51 (Carom), 148, 85 (C (6)), 151,56 (C (2)), 158,74 (2Carom), 164,61 (C=O).

Synthese des N6-Benzoyl-3-{3'-Desoxy-4'-O-[(4,4'-dimethoxytriphenyl)-meth yl]-ß-D- ribopyrano-syl}-adenins-2'-O-(2-cyanoethyl-N,N-disopropyl)-p hosphoramidits(10b) 380 mg (0,58 mmol) N6-Benzoyl-3- {3'-desoxy-4'-O- (4, 4'-dimethoxytriphenyl)-methyl-ß- D-ribopyra-nosyl}-adenin 9b wurden in 2,0 ml abs Dichlormethan gelöst und mit 224 mg (1,73 mmol) N-Ethyldiisopropylamin versetzt. Bei RT wurden nun 342 mg (1,44 mmol) Phosphorigsäure-mono-(2-cyanethylester)(2-cyanethylester) diisopropylamid-chlorid innerhalb von zwei Minuten zugetropft. Der Ansatz rührte 3 h bei RT, wurde mit CH2C12 auf 40 ml verdünnt und mit 50 ml Phosphatpuffer (pH=7) extrahiert. Die org. Phase wurde über Na2SO4 getrocknet, filtriert und eingeengt. Man reinigte Kieselgelsäule (3 x 15 cm) mit einem linearen Gradienten von EtOAC/Heptan (1 : 2) bis EtOAc/Heptan (4 : 1) als lineraren Gradienten. Es wurden 400 mg (80%) eines gelblichen Schaumes erhalten.

DC (Kieselgel, EtOAc/Heptan 4 : 1) : Rf = 0,38 'H-NMR (400 MHz in CDCl3) : 1,05 (m, 6H, 2xCH3); 1,87 (m, 2,23(m,1H,Heq-C(3'));2,32&2,55(2xm,Hax-C(3')); <BR> <BR> <BR> 2H, CH2CN);3,05-3,70 (m, 6H, 2xCH, CH2OP, 2xH-C(5')); 3,79 (m, 6H, (m,3,90 <BR> <BR> <BR> <BR> 4,12(m,1H,H-C(2'));5,47(2xd,J=8,87Hz,1H,H-C(1'));6,85(m,4H,H DMT);1H,H-C(4')); 7, 20-7, 65 (m, 13 H, H^rom) ; 8, 0 (m, 2H, Harem) ; 8,09 (s, 1H, H-C (8)) ; 8,80 (s, 1H, H-C (2)) ; 8,97 (s, br, 1 H, HN) Synthese N6-Benzoyl-3-{3'-desoxy-4'-O-[(4,4'-dimethoxytriphenyl)-meth yl]-ß-D- ribopyranosyl}-adenin-2'-O-succinoyls (13b) 115 mg (0,174 mmol ; 1 eq) von N6-Benzoyl-3- {3'-desoxy-4'-O- (4, 4'-dimethoxytriphenyl)- methyl-ß-D-ribopyranosyl}-adenins (9b) wurden zusammen mit 35mg (0,35 mmol ; 2 eq) Bernsteinsäure-anhydrid und 25 mg (0,21 mmol ; 1,2 eq) DMAP in 1,0 ml abs CHOC12 unter Nz-Atmosphäre 2 # h bei RT gerührt. Dann wurde mit Methylenchlorid auf 20 ml verdünnt, 1 x mit 20 ml 10% iger Zitronensäure und 3x mit je 20 ml Wasser extrahiert. Die org. Phase

wurde über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und eingeengt. Man erhielt 130 mg (99 %) von 13b.

DC (Kieselgel, EtOAc/MeOH 19 : 1) : Rf= 0,14 'H-NMR (500 MHz, CDC13) : 1,83 (m, 2,20(m,2H,2xCH2),2,32(m,1H,Heq(3')),3,02(m,1H,Heq(5')),Hax(3 ')), <BR> 3,30 (m, 3,73(d,6H,2xOMe),3,82(m,1H,H(4')),5,06(m,1H,H(2')),5,55Hax(5 ')), <BR> <BR> <BR> (d, 9,5= Hz, 1H, H(1')), 6,97 (m, 4H, o zu OMe), 7,14-7,49 (m, 12H, 7,87-3HBz), <BR> 7,91 (m, 2H, 2HBz), 7,94 (s, 8,55(s,1H,H(2)),9,6(bs,1H,-COOH).H-C(8)),