Beschreibung

Die Erfindung betrifft neuartige 4-Amino-3-phenylamino-6-phenylpyrazolo[3,4-d]pyrimidin- Derivate und deren Verwendung als antivirale Wirkstoffe, vorzugsweise zur Behandlung von Pi- cornavirusinfektionen.

Picornaviren, insbesondere Entero- und Rhinoviren, sind für ein breites Spektrum von Erkrankungen beim Menschen verantwortlich. Zu den Enteroviren gehören mehr als 60 verschiedene humanpathogene Serotypen (Melnick J in: Fields B et al., editors. Virology. Philadelphia: Lippincott-Raven Publishers; 1996, 655-712). Enterovirus-, Echovirus-, Coxsackievirus A- und B- Infektionen verlaufen oftmals mit unspezifischem Fieber und rufen Erkrankungen des oberen Respirationstraktes hervor, die sich häufig nicht von Rhinovirusinfektionen unterscheiden lassen. Zu den schwereren Krankheitsbildern, die auch epidemisch auftreten können, gehören die hämorrhagische Konjunktivitis, Herpangina, Hand-Fuß-Mund-Krankheit, aseptische Meningitis, Enzephalitis und akute Myokarditis. Dabei können verschiedene Virustypen gleiche Symptome bzw. ein Virustyp ganz unterschiedliche Krankheitsbilder herbeiführen. Mit der Einführung moderner und sensitiver Methoden in die Virusdiagnostik gelang der Nachweis persistierender enteroviraler RNA sowie von Virusproteinen im Zusammenhang mit chronischen Erkrankungen wie z. B. dem Typ I I Diabetes, Poliomyositis und vor allem der chronischen Myokarditis. Persistierende Entero- virusinfektionen kommen auch bei Patienten mit Agammaglobulinämie vor und äußern sich hierbei als persistierende Enterovirus-Meningoenzephalitis. Als Begleiterscheinungen traten häufig eine Dermatomyositis oder Polymyositis auf. Zu den Rhinoviren gehören ca. 100 Serotypen. Rhinovirusinfektionen verursachen mehr als die Hälfte aller respiratorischen Erkrankungen des obe- ren Respirationstraktes beim Menschen (Couch RB in : Fields BM et al., editors: Fields Virology, 3rd edition. Lippincott-Raven, Philadelphia, 1 996, 713-35). Bei einer mittleren Krankheitsdauer von ca. 1 0 Tagen führen diese meist harmlos verlaufenden Erkältungen jährlich zu millionenfachen Arztbesuchen, Arbeits- und Schulausfällen. Als Komplikationen können eine Otitis media, Sinusitis, Exazerbation von Asthma und zystischer Fibrose sowie Infekte des unteren Respirationstraktes vor allem bei Kleinkindern, älteren Patienten und immunsupprimierten Patienten auftreten. Auf Grund der Typenvielfalt ist eine Impfprophylaxe zurzeit nicht möglich. Bedingt durch die mit diesen Erkrankungen verbundenen Arbeitsausfälle, Arztbesuche und Medikamente verursachen Rhino- und Enteroviren jährlich enorme Kosten. Die Behandlung dieser Virusinfektionen erfolgt bisher symptombezogen, da keine virusspezifischen Therapeutika zur Verfügung stehen (Rotbart HA: Antiviral Res 2002, 53(2), 83-98). Zudem werden häufig unnütz Antibiotika verordnet. Die Entwicklung von neuen Virustatika ist deshalb unbedingt notwendig.

Die Ergebnisse der intensiven Suche nach Behandlungsmöglichkeiten von Enterovirus- und Rhi- novirus-lnfektionen wurden von Rotbart 2002 in einem Übersichtsartikel zusammengefasst (Rotbart HA: Antiviral Res 2002, 53(2), 83-98). Beispielsweise hemmt Ribavirin ein Wirtszellenzym , die Inosin 5'-Monophosphat (IMP)-Dehydrogenase. Durch die Ausschaltung dieses Schlüsselen- zymes für die Synthese von Purinnukleotiden, lässt sich die Replikation von Picornaviren in vitro und in vivo hemmen. Ribavirin soll außerdem direkt in das Genom von Polioviren eingebaut werden und dadurch zusätzlich als Mutagen für RNA- Viren wirken (Crotty S et al. : Nat Med, 2000, 6(12), 1375-9). Wegen starker Nebenwirkungen werden diese Verbindungen nicht zur Behandlung von Rhino- und Enterovirusinfektionen eingesetzt. Spezifische Targets zur Hemmung der viralen RNA-Synthese stellen das Genom an sich, die virale RNA-abhängige RNA-Polymerase sowie weitere für den Replikationskomplex notwendige virale Proteine dar. Guanidine, Thiosemi- carbazone, Benzimidazole, Dipyridamole und Flavone sind seit langem als Inhibitoren der Polymerasen von verschiedenen Picornaviren in der Zellkultur bekannt. Sehr unterschiedliche Erfolge wurden damit in vivo erzielt. Als aussichtsreichster Kandidat mit breiter anti-Enterovirus- und antiRhin ovi rus- Aktivität gelten Enviroximderivate. Enviroxim verhindert die Synthese von Plusstrang RNA durch Bindung an das Virusprotein 3A, welches zur Bildung von RNA- Intermediaten bei der Virusvermehrung notwendig ist (Heinz BA und Vance LM: J Virol, 1995, 69(7), 4189-97). In klinischen Studien wurden moderate oder keine therapeutische Wirkungen, eine schlechte Pharmakokinetik und unerwünschte Nebenwirkungen festgestellt (Miller FD et al. : Antimicrob Agents Chemother, 1985, 27(1 ), 1 02-6). Von neueren Derivaten mit besserer Bioverfügbarkeit und Verträglichkeit liegen bisher keine klinischen Daten vor.

Basierend auf dem Wissen der Feinstruktur und Funktion der viralen Protease 2C wurde der Pro- teaseinhibitor AG 7088 entwickelt. AG 7088 wirkt in der Zellkultur im nanomolaren Konzentrationsbereich gegen 48 Rhinovirustypen sowie Coxsackievirus A21 , B3, Enterovirus 70 und Echovi- rus 1 1 (Pattick AK et al. : Antimicrobila Agents Chemother, 1999, 43(10), 2444-50). Bisher sind die abschließenden Daten der klinischen Studien nicht bekannt.

Mit der Aufklärung der molekularen Struktur der viralen Kapside wurden die Voraussetzungen für ein zielgerichtetes Design von Kapsidblockern, den "WIN-Substanzen", geschaffen (Diana GD: Curr Med Chem 2003, 2, 1 -12). Sie verhindern die Adsorption und/oder das Uncoating von Rhino- und Enteroviren. Einige der WIN-Substanzen wirken hochspezifisch nur gegen einzelne Gattungen oder Virustypen der Picornaviren. Andere Derivate hemmen die Vermehrung von Rhino- als auch Enteroviren. Zu den WIN-Substanzen gehören z. B. Arildone, Disoxaril und Pirodavir. Diese Verbindungen zeigten sehr gute antivirale Wirkungen in der Zellkultur. Eine schlechte Löslichkeit (Arildone), niedrige Bioverfügbarkeit (Arildone und Disoxaril), schnelle Metabolisierung und Ausscheidung (Disoxaril und W IN 54954) sowie Nebenwirkungen, wie beispielsweise Hautausschlag (WIN 54954), machten eine klinische Anwendung unmöglich. Große Hoffnungen wurden auf Pleconaril, einen weiteren Kapsidblocker, gesetzt. Pleconaril besitzt eine sehr gute orale Bioverfügbarkeit und hemmt nach seiner Bindung in die hydrophobe Tasche im Viruskapsid die Penetration von Rhino-, Echo- und Coxsackieviren (Pevear DC et al.: Antimicrob Agents Chemother 1999, 43(9), 21 09-15; McKinlay MA et al.: Annu Rev Microbiol 1992, 46, 635-54). Dadurch ist es potenziell wirksam gegen ein breites Spektrum von Viruserkrankungen, von der gewöhnlichen Erkältung bis hin zur viralen Meningitis oder Myokarditis. Resistenzen wurden bei Rhinoviren, Enterovirus 71 und Coxsackievirus B3 beobachtet (Ledford RM et al. : J Virol 2004, 78(7), 3663-74; Groarke JM et al.: J Infect Dis 1 999, 179(6), 1538-41 ). Klinische Studien bei Kindern und Erwachsenen mit einer Enterovirusmeningitis (Abzug MJ et al. : Pediatr Infect Dis J, 2003, 22, 335-41 ) sowie Rhinovirus-verursachten respiratorischen Infektionen (Hayden FG et al.: Antivir Ther, 2002, 7, 53-65; Hayden FG et al. : Clin Infect Dis, 2003, 36, 1 523-32) verliefen positiv. Die nachgewiesene therapeutische Wirkung reichte jedoch nicht für die Zulassung von Pleconaril (Picovir, Viropharma, USA) zur Behandlung von Rhinovirusinfektionen in den USA. Im März 2002 wurde ein entsprechender Antrag von der Nahrungs- und Arzneimittel-Behörde (Food and Drug Administration: FDA) wegen einer ungünstigen Nutzen-Risiko-Bewertung abgelehnt.

Es sind auch Pyrazolopyrimidine als CRF-Antagonisten (Corticotropin-Releasing Factor Antagonisten) beschrieben (z. B. EP 674 642 und EP 691 128), welche beispielsweise die Adenosinki- nase (EP 496 617 oder US 4,904,666), die Xanthinoxigenase (J. Heterocyc. Chem. 19, 1565, 1982) oder andere Enzymsysteme (US 2,965,643 und US 3,600,389) hemmen.

Somit besteht weiterhin als eine dringliche Aufgabe der antiviralen Forschung die Entwicklung hocheffektiver Virustatika zur Behandlung von Rhino- und Enteroviruserkrankungen. Die neuen Verbindungen sollten gut verträglich sein und existierende Resistenzen, z. B. gegenüber Pleconaril, überwinden. WO 00/43394 A offenbart substituierte Pyrazolo[3,4-d]pyrimidin-Derivate und deren Verwendung als antivirale Wirkstoffe.

Auch EP 2 049 540 offenbart 4-Amino-3-arylamino-6-arylpyrazolo[3,4-d]pyrimidin-Derivate und deren Verwendung als antivirale Wirkstoffe.

Aufgabe der Erfindung ist es, weitere Pyrazolo[3,4-d]pyrimidin-Derivate sowie deren Herstellung und Verwendung anzugeben, welche als antivirale Wirkstoffe gegenüber Enteroviren und Rhinoviren einsetzbar sind sowie die angegebenen Nachteile des Standes der Technik zum Beispiel hinsichtlich Stabilität und Bioverfügbarkeit der Substanzen vermeiden.

Gelöst wird diese Aufgabe durch spezifisch substituierte 4-Amino-3-phenylamino-6- phenylpyrazolo[3,4-d]pyrimidin-Derivate der allgemeinen Formel I, einschließlich ihrer pharmazeutisch verträglichen Salzverbindungen und ihrer Pro-Pharmaka,

wobei zumindest ein Wasserstoffatom in zumindest einer der Phenylgruppen A und B durch einen Substituenten R ^H ersetzt ist, der eine H am mett- Konstante σ _ρ größer als 0,23 aufweist, wobei jedes weitere Wasserstoffatom in jeder der Phenylgruppen A und B unabhängig voneinander ersetzt sein kann durch einen Rest R ¹ , wobei jedes R ¹ unabhängig ein Halogen, ein gesättigtes oder ungesättigtes, lineares oder verzweigtes aliphatisches Radikal mit 1 -7 Kettengliedern, ein gesättigtes oder ungesättigtes, lineares oder verzweigtes alkanoles Radikal mit 1 -8 Kettengliedern, N0 ₂ , CN, CONR ² ₂ , COR ² , COOR ² , OR ² , SR ² , NR ² ₂ , S0 ₂ NR ² ₂ , CX ₃ , CR ² X ₂ , OCX ₃ , OCR ² X ₂ , oder Phenyl sein kann; jedes R ² unabhängig Wasserstoff, ein gesättigtes oder ungesättigtes, halogeniertes oder nicht halogeniertes, lineares oder verzweigtes aliphatisches Radikal mit 1 -7 Kettengliedern, Benzyl, Phenyl oder Naphtyl, ein gesättigter oder ungesättigter, Mono- oder Polyheterozyklus mit den Heteroatomen N, S oder 0 ist, wobei jede der vorstehenden genannten Gruppen un- abhängig mit Fluor, Chlor, Brom, Trifluormethyl, Alkyl, Alkoxy, Cyano, Nitro, Amino, Aminoal- kyl, C(0)-Alkyl, C(0)0-Alkyl, Benzyl, Phenyl oder Naphtyl substituiert sein kann; und

X unabhängig F, Cl, Br, oder I ist.

In den Unteransprüchen sind vorteilhafte Ausführungen der spezifisch substituierten 4-Amino-3- phenylamino-6-phenylpyrazolo[3,4-d]pyrimidin-Derivate sowie Anwendungsmöglichkeiten ausgeführt, ohne die Erfindung jeweils darauf zu beschränken.

Vorteilhaft sind 4-Amino-3-phenylamino-6-phenylpyrazolo[3,4-d]pyrimidin-Deriv ate der allgemeinen Formel I, wobei zumindest ein Wasserstoffatom in zumindest einer der Phenylgruppen A und B durch einen Substituenten R ^H ersetzt ist, ausgewählt aus N0 ₂ , CN , CF ₃ , CCI ₃ , CBr ₃ , OCF ₃ , OCCI ₃ , OCBr ₃ , CHF ₂ , CHCI ₂ , CHBr ₂ , OCHCI ₂ , CHO, COOH, COMe, COEt, COOMe oder COOEt, bevorzugt CF ₃ oder OCF ₃ . Vorteilhaft sind in einer oder beiden Phenylgruppen A und B ein, zwei oder drei Wasserstoffatome durch einen Substituenten R ^H ersetzt. In einer speziellen Ausführungsform ist genau ein Wasserstoffatom in einer der Phenylgruppen A und B durch einen Substituenten R ^H ersetzt. Der Substituent R ^H kann sich in para-Position des Phenylrings A oder B befinden.

Zusätzlich zu R ^H kann jede der Phenylgruppen A und B unabhängig voneinander weitere Reste R ¹ tragen. Vorzugsweise tragen die Phenylgruppen A und B unabhängig voneinander keinen, einen, zwei oder drei weitere Reste R ¹ , bevorzugt keinen oder einen weiteren Rest R ¹ .

Als Alkyle kommen im Zusammenhang mit der Erfindung insbesondere lineare oder verzweigte zum Beispiel Methyl, Ethyl, n-Propyl, i-Propyl und Butyl infrage. Entsprechendes gilt für Alkanole, Alkylamine und Alkylamide im Zusammenhang mit der Erfindung.

Umfasst sind von der Erfindung insbesondere 4-Amino-3-phenylamino-6-phenylpyrazolo[3,4- djpyrimidin-Derivate der allgemeinen Formel I I

wobei jeder Substituent R ^A , R ^B unabhängig Wasserstoff, ein Halogen, ein gesättigtes oder ungesättigtes, lineares oder verzweigtes aliphatisches Radikal mit 1 -7 Kettengliedern, ein gesättigtes oder ungesättigtes, lineares oder verzweigtes alkanoles Radikal mit 1 -8 Kettengliedern, N0 ₂ , CN, CONR ² ₂ , COR ² , COOR ² , OR ² , SR ² , NR ² ₂ , S0 ₂ NR ² ₂ , CX ₃ , CR ² X ₂ , OCX ₃ , OCR ² X ₂ , oder Phenyl sein kann; und R ² und X wie oben definiert sind; wobei zumindest einer der Substituenten R ^A , R ^B eine Hammett-Konstante σ _ρ größer 0,23 aufweist.

Die Erfindung umfasst insbesondere 4-Amino-3-phenylamino-6-phenylpyrazolo[3,4-d]pyrimidin- Derivate der allgemeinen Formel IIa

oder IIb

wobei R ^H ausgewählt ist aus N0 ₂ , CN, CF ₃ , CCI ₃ , CBr ₃ , OCF ₃ , OCCI ₃ , OCBr ₃ , CHF ₂ , CHCI ₂ , CHBr ₂ , OCHCI ₂ , CHO, COOH, COMe, COEt, COOMe oder COOEt ist, bevorzugt CF ₃ oder OCF ₃ .

Ebenfalls umfasst sind pharmazeutische Zusammensetzungen, die ein 4-Amino-3-phenylamino- 6-phenylpyrazolo[3,4-d]pyrimidin-Derivat gemäß der allgemeinen Formeln I, I I, I Ia oder IIb enthalten. Solche pharmazeutischen Zusammensetzungen können weitere Substanzen enthalten, beispielsweise pharmazeutisch akzeptable Hilfsstoffe und Träger. In einem besonderen Aspekt können die pharmazeutischen Zusammensetzungen weitere Wirkstoffe umfassen, insbesondere antivirale Wirkstoffe, vor allem Wirkstoffe gegen Picornaviren. Es hat sich überraschend gezeigt, dass die erfindungsgemäßen 4-Amino-3-phenylam ino-6- phenylpyrazolo[3,4-d]pyrim idin-Derivate über eine deutlich verbesserte Stabilität in Leberm ikro- somen gegenüber den Substanzen des Standes der Technik verfügen. Darüber hinaus haben Untersuchungen zur Pharmakokinetik in der Maus ergeben, dass die erfindungsgemäßen 4- Amino-3-phenylamino-6-phenylpyrazolo[3,4-d]pyrim idin-Derivate eine deutlich bessere Bioverfügbarkeit aufweisen als Substanzen des Standes der Technik. Gleichzeitig zeigen die Verbindungen der vorliegenden Erfindung eine starke antivirale Aktivität gegenüber Picornaviren, insbesondere Entero- und Rhinoviren im nano- bzw. m ikromolaren Konzentrationsbereich.

Daher sind die pharmazeutischen Zubereitungen, die eine Verbindung der Formeln I , I I , I Ia oder I Ib enthalten, besonders geeignet für die Behandlung von respiratorischen Infekten, der aseptischen Meningitis, der Enzephalitis, Herpangina usw. bei Mensch und Tier, die von Picornaviren insbesondere Entero- und Rhinoviren hervorgerufen werden können.

Die 4-Am ino-3-phenylam ino-6-phenylpyrazolo[3,4-d]pyrimidin-Derivate zeichnen sich dadurch aus, dass sie an einer oder an beiden Phenylgruppen mindestens einen Substituenten R ^H tragen, der eine Hammett-Konstante σ _ρ größer als 0,23 aufweist. Dieser Wert 0,23 entspricht der Ham- mett-Konstante σ _ρ des Broms, das unter den Halogenen die höchste Hammett-Konstante für die para-Position zeigt.

Die Bestimmung der Hammett-Konstanten für verschiedene Substituenten basiert auf den loni- sierungskonstanten der Benzoesäure gemäß der Hammett-Gleichung σ _χ = log Κχ - log K _H wobei KH die lonisierungskonstante für Benzoesäure in Wasser bei 25 °C ist und K _x die korrespondierende Konstante für eine meta- oder para-substituierte Benzoesäure ist. Ein Verfahren zur Bestimmung der Hammett-Konstante für verschiedene Substituenten in meta- (a _m ) und paraPosition (σ _ρ ) sowie bereits erm ittelte Werte einer Vielzahl von Substituenten können der Veröffentlichung von Hansch et al. ,„A Survey of Hammett Substituent Constants and Resonance and Field Parameters", in Chem . Rev. 1 991 . 97, 1 65-1 95, entnommen werden, die hierin in ihrer Gesamtheit eingearbeitet ist. Für die vorliegende Erfindung von Bedeutung ist dabei jeweils ausschließlich der Wert σ für die para-Position (σ _ρ ), unabhängig davon, an welcher Position sich der zumindest eine Substituent R ^H letztlich befindet.

Beispiele der Erfindung sind Verbindungen der Tabelle 1 , einschließlich ihrer pharmazeutisch verträglichen Salzverbindungen .

Tabelle 1

Ebenfalls umfasst sind Pro-Pharmaka (Prodrugs) der Verbindungen, insbesondere jene, die sich durch einen Substituenten am Pyrazol-Heteroatom in Position 1 auszeichnen. Es hat sich gezeigt, dass derartige Verbindungen in vivo zur 1 H Pyrazol-Verbindung umgesetzt werden. Beispielhalber erwähnt seien Verbindungen, bei denen das Pyrazol-Heteroatom in Position 1 durch einen lmino(phenyl)methyl-Substituenten substituiert ist, wie beispielsweise 1 - [lmino(phenyl)methyl]-4-amino-3-(4-trifluormethyl-phenyl)ami no-6-phenylpyrazolo[3,4-d]pyrimidin, auch bezeichnet mit dem IUPAC Namen 1 -Benzylcarboximidoyl-6-phenyl-3-N-[4- (trifluormethyl)phenyl]-1 H-pyrazolo[3,4-d]-pyrimidin-3,4-diamin. Hierbei handelt es sich um ein Nebenprodukt bei der Herstellung der oben bezeichneten Verbindung CRCV-340, das aus der Reaktion der Verbindung CRCV-340 mit einem Überschuss an Benzamidin in der Reaktionsmischung resultiert und folgende Formel aufweist:

CRCV-340-Prodrug

Es wurde gefunden, dass diese Verbindungen (z.B. CRCV-340-Prodrug) in vivo sehr leicht zur Zielverbindung umgesetzt werden, derart dass im Serum im Wesentlichen nur noch der letztendliche Wirkstoff (z.B. CRCV-340) nachgewiesen werden kann. Weiterhin umfasst sind die aus den vorstehenden Verbindungen hergestellten Salze, Solvate oder Solvate der Salze. Als Salze sind im Rahmen der vorliegenden Erfindung physiologisch unbedenkliche Salze der erfindungsgemäßen Verbindungen bevorzugt. Physiologisch unbedenkliche Salze der erfindungsgemäßen Verbindung umfassen Additionssalze von Mineralsäuren, Carbonsäuren und Sulfonsäuren, z.B. Salze der Chlorwasserstoffsäure, Bromwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure, Methan- sulfonsäure, Ethansulfonsäure, Toluolsulfonsäure, Benzolsulfonsäure, Naphthalinsulfonsäure, Essigsäure, Trifluoressigsäure, Propionsäure, Milchsäure, Weinsäure, Äpfelsäure, Citronensäure, Fumarsäure, Maleinsäure und Benzoesäure.

Die Erfindung soll nachfolgend anhand von Syntheseverfahren, speziellen 4-Amino-3- phenylamino-6-phenylpyrazolo[3,4-d]pyrimidin-Derivaten der allgemeinen Formel (I) sowie deren Wirkung und Anwendung gegen Picornavirusinfektionen näher erläutert werden. Abb. 1 zeigt ein allgemeines Schema zur Synthese von Pyrazolo[3,4-d]Pyrimidin 1 und schließt im ersten Schritt die Kondensation von [Bis(methylthio)methylen]malononitril 2 mit Phenylaminen 3 in Alkohol zu Phenylderivaten 4 ein. Letztere können jeweils isoliert und für weitere Reaktionen aufgereinigt werden oder direkt ohne Aufreinigung für nachfolgende Reaktion verwendet werden ("one-pot" Reaktion). Der darauf folgende Schritt besteht in der Wechselwirkung des Phenylderi- vats 4 mit Hydrazin oder Hydrazinderivaten. Die Reaktion verläuft unter Kochen über 1 bis 4 Stunden und führt zu einer hohen Ausbeute an Pyrazol 5. Der abschließende Schritt der Synthese von Pyrazolo [3,4-d]Pyrimidin 1 besteht in der Kondensation des Pyrazol 5 mit Phenylamidi- nen 6 in Gegenwart von Essigsäure, Trifluoressigsäure oder Natriumacetat.

Die Verbindungen können vorteilhaft dadurch erhalten werden, dass das Pyrazol (5) im letzten Syntheseschritt mit korrespondierendem Benzamidinhydrochlorid in der Anwesenheit eines Überschusses an Natriumacetat bei 200-220 °C in Abwesenheit von Lösungsmittel umgesetzt wird. Alternativ können die Verbindungen dadurch erhalten werden, dass das Pyrazol (5) im letzten Syntheseschritt mit korrespondierendem Benzonitril (in großem Überschuss) unter Mikrowellenbestrahlung und unter Anwesenheit von Kalium-ferf-butylat umgesetzt wird.

Eine alternative Synthesemethode besteht in der "one-pot" Reaktion von Malononitril mit Aryli- sothiocyanaten in Anwesenheit von Natriumhydrid und einer nachfolgenden Behandlung des Reaktionsgemisches mit Jodmethyl oder Dimethylsulfat. Dabei werden große Mengen an Enami- nen gebildet. Auch hier ist wiederum die Kondensation von Pyrazol 5 mit Arylamidinen 6 in Gegenwart von Säure, wie Essigsäure oder Trifluoressigsäure, bzw. deren Salzen (Acetat) der abschließende Syntheseschritt zur Herstellung von Pyrazolo[3,4-d]Pyrimidin 1 .

Es hat sich gezeigt, dass die Umsetzung des Pyrazols (5) zum Pyrazolo[3,4-d]Pyrimidin mit besonders hohen Ausbeuten durchgeführt werden kann, indem die Benzamidin-Komponente als freie Base verwendet und die Reaktion in polaren Lösungsmitteln durchgeführt wird. Ein Vorteil dieses Vorgehens besteht zusätzlich darin, dass der Anteil schwer abtrennbarer Nebenprodukte minimiert werden kann. Diese Reaktion lässt sich, ausgehend von substituierten 5-Amino-4- cyano-3-phenylamino-Pyrazolen (5) mit optional substituierten Benzamidinen als freie Base (6) zu 4-Amino-3-(phenylamino)-6-phenylpyrazolo[3,4-d]Pyrimidin (1 ) gemäß dem folgenden Reaktionsschema durchführen.

Abb. 2

Die Reste R ^A und R ^B sind Substituenten, wie sie vorstehend für R ¹ definiert sind.

Während sich die wie vorstehend beschriebene Umsetzung insbesondere für die Herstellung von 4-Amino-3-phenylamino-6-phenylpyrazolo[3,4-d]pyrimidin-Deriv aten der vorstehenden allgemeinen Formel (I) eignet, wobei mindestens ein Wasserstoffatom in mindestens einer der Phenyl- gruppen A und B durch einen Substituenten R ^H ersetzt ist, der eine Hammett-Konstante σ _ρ > 0,23 aufweist, kann das Verfahren ebenso für die Herstellung von 4-Amino-3-phenylamino-6- phenylpyrazolo[3,4-d]pyrimidinen, die keinen solchen Substituenten aufweisen, d.h. in denen dieser Rest Wasserstoff oder einen Rest R ¹ , wie er vorstehend im Zusammenhang mit der Formel I definiert ist, darstellt. Bevorzugt betrifft die vorliegende Erfindung auch Reaktionen, wie vorstehend beschrieben, indem die Reste R ^A und R ^B voneinander unabhängig aus N0 ₂ , CN, CONR ³ ₂ , COOR ³ , CHO, CHONH ₂ , einem Halogen, einem ungesättigten oder gesättigten linearen oder verzweigten aliphatischen Radikal (Alkylgruppe genannt) mit 1 bis 6 Kettengliedern, einem gesättigten oder ungesättigten linearen oder verzweigten Alkanolradikal (auch Alkoxygruppe genannt) mit 1 bis 6 Kettengliedern, OR ³ , SR ³ , NR ³ ₂ , S0 ₂ NR ³ , Di- oder Trifluormethyl ausgewählt sein können und der Rest R ³ aus H, Methyl-, Ethyl-, Propyl- oder Butylgruppen bestehen kann. Sofern die erfindungsgemäßen Verbindungen in tautomeren Formen vorkommen können, umfasst die vorliegende Erfindung sämtliche tautomere Formen.

Die im vorstehenden Absatz genannten Substituenten haben, soweit nicht anders spezifiziert, die folgende Bedeutung:

Alkyl sowie die Alkylteile in Alkoxy stehen für geradkettige oder verzweigte Alkyle und umfassen, wenn nicht anders angegeben, (C1 -C6)-Alkyl, insbesondere (C1 -C4)-Alkyl, wie z.B. Methyl, Ethyl, Propyl, Isopropyl, Butyl, Isobutyl. Alkoxy steht vorzugsweise für einen geradkettigen oder verzweigten Alkoxyrest, insbesondere mit 1 bis 6, besonders bevorzugt 1 bis 4 und am meisten bevorzugt 1 bis 3 Kohlenstoffatomen. Beispielhaft und vorzugsweise seien genannt Methoxy, Ethoxy, N-Propoxy, Isopropoxy, t-Butoxy, n-Pentoxy und n-Hexoxy. Aryl steht für einen mono- bis tricyclischen aromatischen, carbocyclischen Rest mit in der Regel 6 bis 14 Kohlenstoffatomen. Beispielhaft und vorzugsweise ist Aryl ausgewählt aus Phenyl, Naphthyl und Phenantrenyl, besonders bevorzugt Phenyl. Halogen steht für Fluor, Chlor, Brom und Jod, bevorzugt Fluor und Chlor.

Es ist auch möglich mit diesem Verfahren allgemein Arylpyrazolo[3,4d]pyrimidin-Derivate herzustellen, wobei in diesem Fall das Phenylamidin 6 durch ein entsprechendes Arylamidin zu ersetzen ist. Insbesondere können anstelle der Phenylringe A und B auch Naphthyl, Pyridyl, Chinolyl, Pyrazinyl, Pyrimidyl, Pyrazolyl, Triazinyl, Imidazolyl, Furanyl, Thienyl im Endprodukt enthalten sein, wobei jedes Wassertstoffatom in jeder der vorstehend genannten Gruppe unabhängig voneinander durch einen Rest R ¹ , wie er vorstehend im Zusammenhang mit der Formel I definiert ist, ersetzt sein kann. Ein solches Verfahren ist ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung.

Die in Abb. 2 gezeigt Reaktion wird in inerten, polaren organischen Lösungsmitteln durchgeführt. Inerte polare organische Lösungsmittel sind beispielsweise Ether wie Diethylether, Methyl-tert.- butylether, 1 ,2-Dimethoxyethan, Glycoldiethylether oder Diethylenglycoldimethylether, cyclische Ether, wie Dioxan, Tetrahydrofuran, Kohlenwasserstoffe, wie Ethylbenzol, Xylol, Toluol oder Alkohole, wie Ethanol, Propanol, Butanol, Isobutanol und Isopropanol. Besonders reine Produkte werden bei Verwendung von n-Butanol als Lösungsmittel erhalten. n-Butanol ist vorzugsweise in einem Molverhältnis von 1 bis 1 0 , besonders bevorzugt 1 ,5 bis 3, bezogen auf den Anfangswert des Pyrazolderivats, einzusetzen.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung hat es sich als besonders zweckmäßig herausgestellt, wenn die Benzamidine (6) in Grundform (als freier Basen) frisch zubereitet werden. Die Synthese erfolgt mit üblichen Methoden aus dem entsprechenden verfügbaren Salz. Es ist am besten, Benzamidine (6) in einem Molverhältnis 1 bis 1 ,5, ausgehend von den Pyrazolderivaten (5) einzusetzen.

Die Reaktion wird bei einer Temperatur von 60 bis 1 10°C, vorzugsweise 85 bis 95 °C, im Laufe von 10-30 Stunden, vorzugsweise 1 8-20 Stunden, durchgeführt.

Die Reinigung der so erhaltenen Amino-3-(phenylamino)-6-phenylpyrazolo[3,4-d]Pyrimidine (1 ) erfolgt durch Umkristallisation. Hierfür wird vorzugsweise Tetrahydrofuran oder ein Gemisch von Tetrahydrofuran mit Wasser oder einem organischen Lösungsmittel, besonders bevorzugt mit Toluol verwendet. Alternativ dazu kann das Amino-3-(phenylamino)-6-phenylpyrazolo[3,4- d]Pyrimidin auch durch Ausfällen aus einer heißen Lösung in Tetrahydrofuran mit Wasser oder einem organischen Lösungsmittel, bevorzugt mit Toluol, gereinigt werden.

In den nachfolgenden Beispielen sind spezielle Verbindungen der allgemeinen Formel (I) aufgelistet, welche bevorzugt für Anwendungen gegen Picornavirusinfektionen geeignet sind, wobei die Verbindungen in einer Lösung oder einer Suspension in einem pharmazeutisch akzeptablen wässrigen, organischen oder wässrig-organischen Medium für die lokale oder parenterale Anwendung durch intravenöse, subkutane oder intramuskuläre Injektion oder für die intranasale Verabreichung zubereitbar ist, oder sie sind in Form einer Tablette, Kapsel bzw. wässrigen Suspension mit konventionellem Träger für die orale Verabreichung oder als Suppositorium ausgebildet.

Die vorgestellten Verbindungen der Formel (I) können dabei in Dosierungen von 0,1 bis 1000 mg/kg Körpergewicht verwendet werden.

Herstellung und Analyse der 4-Amino-3-phenylamino-6-phenylpyrazolo[3,4-d]pyrimidin- Derivate

Die Strukturaufklärung der erfindungsgemäßen Verbindungen erfolgte durch die Art der Synthese, Elementaranalysen, NMR - und Massenspektroskopie. Ausgangsmaterialien:

Die 5-Amino-4-cyano-3-phenylaminopyrazole wurden gemäß dem in Abb. 1 dargestellten Verfahren sowie nach der Beschreibung von Tominaga Y et al. (J. Heterocycl. Chem., 1990, 27, 775- 779), synthetisiert. Arylamidine werden gemäß dem bekannten Stand der Technik aus den entsprechenden Cyan-Ausgangsverbindungen synthetisiert (Boere, RT et al. : J. Organomet. Chem., 1987, 331 , 1 61 -167; Garigipati RS: Tetrahedron Lett., 1990, 31 , 1969-1978; Dann 0 et al. : Justus Liebigs Ann. Chem ., 1982, 1836-1839).

Referenzbeispiel 1 : 4-Amino-3-phenylamino-6-phenylpyrazolo [3,4-d] pyrimidin

(3-N,6-diphenyl-2H-pyrazolo[3,4-d]pyrimidin-3,4-diamin)

Unter Rühren werden zu 2,3 g (1 1 ,5 mmol) 5-Amino-4-cyano-3-phenylaminopyrazol 3,0 g (17,24 mmol) Benzamidin Hydrochlorid Hydrat und 2,2 g (23,0 mmol) Natriumacetat zugegeben. Das Reaktionsgemisch wird für 30 min bei 220 °C erhitzt. Das resultierende Material wird mit 50 ml Wasser behandelt, gefiltert und mit 20 ml kaltem Methanol sowie 20 ml kaltem Ester gewaschen. Das Produkt wird mittels Kristallisation aus DMF/Wasser gereinigt.

Hellgelber, fester kristalliner Stoff. Ausbeute 57 %. mp 253-5 °C. ^Chloroform - Methanol; 10/1 ) - 0.8 (Silikagel 60). MS m/z 302 (M ⁺ ).

Referenzbeispiel 2: 4-Amino-3-(phenylamino)-6-phenylpyrazolo[3,4-d]pyrimidin (alternative Herstellung)

5,22 g Benzamidin Hydrochlorid, das zuvor 2,5 h lang bei 1 15°C getrocknet wurde, wird langsam zu einer Lösung von 1 ,74 g Natriummethylat in 100 ml Methanol gegeben und 30 min bei Raum- temperatur gerührt. Nach Abfiltrieren des anorganischen weißen Niederschlages wird 3,5 ml n- Butanol hinzu gegeben und das Volumen im Vakuum auf 3 ml reduziert. Der Rückstand ist ein weißliches Öl, und entspricht 4,0 g Benzamidin, das sofort im nächsten Reaktionsschritt verwendet wird.

5-Amino-4-cyano-3-(phenylamino)-pyrazol (6,0 g ; Pulver Ref-1 ) wird in 10 ml n-Butanol gelöst und 4,0 g Benzamidin in 3 ml n-Butanol werden bei Raumtemperatur hinzu gegeben. Die Reaktion erfolgt im Laufe von 20 Stunden bei 85Ό. Anschließend wird die Lösung abgekühl, der gelbe Niederschlag abfiltriert und mit 5 ml n-Butanol und 5 ml Toluol gewaschen.

Ausbeute: 68%

Eigenschaften: Schmelzpunkt: 265-267°C (Tetrahydrofuran) ; MS (m/z) 302 (M ⁺ ) ; ¹ H NMR (DMSO-d ₆ ) : δ 12,38 (1 H, s, NH), 8,30-8,36 (2H, q, 2 CH), 8,23 (1 H, br. s., NH), 7,67 (2H, d, 2CH), 7,48 (2H, br. s., NH ₂ ), 7,42 (3H, m, 3CH), 7,12 (2H, d, 2CH) und 6,98 (1 H, m , CH) ppm ; Elementaranalyse C ₁₇ H ₁₄ N ₆ : Berechnet %: C, 67,54; H, 4,67; N, 27,80; Gefunden %: C, 67,49; H, 4,53; N, 27,74.

Referenzbeispiel 3: 4-Amino-3-(4-chlorphenyl)amino-6-phenylpyrazolo[3,4-d]pyrimi din

(3-N-(4-chlorphenyl)-6-phenyl-2H-pyrazolo[3,4-d]pyrimidin -3,4-diamin)

Referenzbeispiel 4: 4-Amino-3-(3,4-difluorphenyl)amino-6-phenylpyrazolo[3,4-d]py rimidin

(3-N-(3,4-difluorphenyl)-6-phenyl-2H-pyrazolo[3,4-d]pyrim idin-3,4-diamin)

Referenzbeispiel 5: 4-Amino-3-[(4-fluorophenyl)amino]-6-phenylpyrazolo[3,4-d]pyr imidin

Die Verbindung Ref-5 wird auf die gleiche Weise, wie in Referenzbeispiel 2 dargestellt, hergestellt, wobei jedoch als Ausgangsstoff 5-Amino-4-cyano-3-[(4-fluorophenyl)amino)-pyrazol verwendet wurde. Dabei bildet sich ein hellgelber kristalliner Niederschlag.

Ausbeute: 70%

Eigenschaften: Schmelzpunkt: 262-263°C (THF/Toluol) ; MS (m/z) : 320 (M') ; ¹ H NMR (DMSO-d ₆ ) : δ 12,69 (1 H, s, NH), 8,33-8,41 (4H, m , 4CH), 8,18 (1 H, br. s., NH), 7,58-7,65 (5H, m , NH ₂ , 3CH), 7,27-7,31 (2H, n, 2CH) ppm ; Elementaranalyse C ₁₇ H ₁₄ FN ₆ : Berechnet %: C, 63,74; H , 4,09; N, 26,24; Gefunden %: C, 63,81 ; H, 4,1 1 ; N, 26,27.

Referenzbeispiel 6: 4-Amino-3-[(3-fluorophenyl)amino]-6-phenylpyrazolo[3,4-d]pyr imidin

Die Verbindung Ref-6 wird auf die gleiche Weise, wie in Referenzbeispiel 2 erhalten, hergestellt, wobei jedoch als Ausgangskomponente 5-Amino-4-cyano-3-[(3-fluorophenyl)amino]-pyrazol verwendet wurde. Dabei bildet sich ein hellgelber kristalliner Niederschlag.

Ausbeute: 76%

Eigenschaften: Schmelzpunkt: 278-279°C (THF/Toluol) ; MS (m/z) : 320 (M ⁺ ); ¹ H NMR (DMSO-d ₆ ); δ 12,61 (1 H, s, NH), 8,34-8,42 (2H, q, 2CH), 8,14 (1 H, br. s., NH), 7,48 (2H, br. s., NH ₂ ), 7,3-7,43 (6H, m , 6CH), 6,60 (1 H, s, CH) ppm ; Elementaranalyse für C ₁₇ H ₁₄ FN ₆ : Berechnet %: C, 63,74; H, 4,09; N, 26,24; Gefunden %: C, 63,81 ; H, 4,1 1 ; N , 26,27.

Beispiel 1 : 4-Amino-3-(4-trifluormethyl-phenyl)amino-6-phenylpyrazolo[3, 4-d]pyrimidin (CRCV-340)

(6-phenyl-3-N-[4-(trifluormethyl)phenyl]-2H-pyrazolo[3,4-d]p yrimidin-3,4-diamin)

Die Herstellung erfolgte wie im Referenzbeispiel 1 beschrieben, unter Verwendung der entsprechend substituierten Vorläuferverbindungen.

Beispiel 2: 4-Amino-6-phenyl-3-[(4-(trifluoromethyl)-phenyl]amino-pyrazo lo[3,4-d]pyrimidin Die Verbindung CRCV-340 wurde ebenfalls analog der in Referenzbeispiel 2 dargestellten Reaktionsvorschrift hergestellt. Dabei bildet sich ein hellgelber kristalliner Niederschlag.

Ausbeute: 58%

Eigenschaften: Schmelzpunkt: 313-314°C (THF/Toluol) ; MS (m/z) : 370 (M ⁺ ); ¹ H NMR (DMSO-d ₆ ): δ 12,77 (1 H, s, NH), 8,91 (1 H, s, NH), 8,47 (2H, s, N H ₂ ), 7,81 , 7,79, 7,63, 7,58 und 7,47 (9H, m, C ₆ H ₄ und C ₆ H ₅ ) ppm ; Elementaranalyse C ₁₈ H ₁₃ F ₃ N ₆ : Berechnet %: C, 58,38; H, 3,54; N, 22,69; Gefunden %: C, 58,41 ; H, 3,58; N, 22,74; HPLC: 99,30% (Säule Luna C18 (2), Acetoni- tril/Wasser - 90:10, Durchfluss von 0,6 ml/min, UV 254 nm ; t _R = 5,3 min)

Beispiel 3: 4-Amino-3-phenylamino-6-[4-(trifluormethoxy)-phenyl]pyrazolo [3,4-d]pyrimidin (MS-112)

(3-N-phenyl-6-[4-(trifluormethoxy)phenyl]-2H-pyrazolo[3,4-d] pyrimidin-3,4-diamin)

Die Herstellung erfolgte wie im Referenzbeispiel 1 beschrieben, unter Verwendung der entsprechend substituierten Vorläuferverbindungen.

Beispiel 4: 4-Amino-6-phenyl-3-[(4-(trifluoromethoxy)-phenylamino]-pyraz olo[3,4- djpyrimidin

Diese Verbindung wurde ebenfalls analog der in Referenzbeispiel 2 dargestellten Reaktionsvorschrift hergestellt, wobei 5-Amino-4-cyano-3-[(4-trifluormethoxyphenyl)amino]pyrazol aus Ausgangsverbindung verwendet wurde. Dabei bildete sich ein weißer kristalliner Niederschlag. Ausbeute: 68%

Eigenschaften: Schmelzpunkt: 260-262°C (Tetrahydrofuran/DMF) ; MS (m/z) : 386 (M') ; ¹ H NMR (DMSO-d ₆ ) : δ 12,56 (1 H, s, NH), 8,82 (2H, q, 2CH), 8,16 (1 H, br. s., NH), 7,48 (2H, br. s., NH ₂ ), 7,3-7,43 (4H, m, C ₆ H ₅ ), 7,05-7,1 1 (2H, 2 s, 2CH), 6,98 (1 H , m , CH) ppm ; Elementaranalyse C ₁₈ H ₁₃ F ₃ N ₆ 0: Berechnet %: C, 55,96; H, 3,39; N, 21 ,75; Gefunden %: C, 56,07; H , 3,36; N, 21 ,61 .

Beispiel 5: Reinigung von 4-Amino-6-phenyl-3-[(4-(trifluoromethyl)-phenyl]amino- pyrazolo[3,4-d]pyrimidin

50 g trockenes 4-Amino-6-phenyl-3-[(4-trifluoromethyl)-phenyl]amino-pyrazol o[3,4-d]pyrimidin, synthetisiert nach dem in Referenzbeispiel 2 beschriebenen Verfahren, werden unter Erwärmen in 300 ml von THF gelöst. Diese Lösung wird mit 300 ml kaltem Toluol behandelt. Die resultierende Lösung wird bei einer Temperatur unter 0°C im Laufe von 6 Stunden in einem Gefrierschrank gehalten. 36 g 4-Amino-3-(4-trifluorophenyl)amino-6-phenylpyrazolo[3,4-d]py rimidin in gelben Kristallen werden durch Filtration erhalten.

Schmelzpunkt: 313-314Ό (THF/DMF)

HPLC: 99,16% (Säule Luna C18(2), Acetonitril/Wasser -90:1 0, Durchfluss von 0,6 ml/min, UV 254 nm ; t _R = 5,3 min)

ADMET-Studien zum Metabolismus von OBR 5-340 in vitro

Ziel: Überprüfung der Aufnahme (Absorption), Verteilung (Distribution), des biochemischen Um- bzw. Abbaus (Metabolismus), der Ausscheidung (Exkretion) sowie Toxizität (abgekürzt: ADMET) von OBR 5-340 in vitro, sowie In w ^' fro-Untersuchungen zur Plasmaproteinbindung und zur Stabilität im Plasma und in Lebermikrosomen.

Untersuchungen: Die durchgeführten In w ^' fro-Tests mit CRCV-340 sowie die erhaltenen Daten sind im Vergleich zu Ref-2 in Tabelle 2 zusammengefasst.

Tabelle 2: Zusammenfassung der Ergebnisse aus den ADMET-Studien für CRCV-340 im Vergleich zu Ref-2. Untersuchungsparameter Ref-2 CRCV-340

Bindung an Plasmaprotein 99,5 % 96,7 %

Freisetzung von Plasmaprotein 61 ,0 % 122,3 %

Plasmastabilität 1 17,0 % 100,0 %

Stabilität in Lebermikrosomen 32,0 % 1 12,0 %

Zusammenfassung: Die Substanz CRCV-340 zeichnete sich durch eine bessere Stabilität in Lebermikrosomen sowie eine stärkere Freisetzung von Plasmaprotein im Vergleich zu Ref-2 aus.

Untersuchung der Pharmakokinetik von CRCV-340 in der Maus

Ziel: Erhebung pharmakokinetischer Daten zu CRCV-340.

Untersuchungen: Substanz und Referenzsubstanz wurden jeweils einmalig in einer Konzentration von 100 mg/kg KG, in 0,5 ml einer 1 0%igen Cremophorlösung per os den Mäusen appliziert. Nach 0,5, 1 , 2, 3, 4, 5, 6 und 7 h wurde das Serum gewonnen und mittels H PLC-Analyse die Konzentrationen von CRCV-340, Ref-2 und Ref-3 im Plasma der Mäuse bestimmt.

Anhand der mittels HPLC-festgestellten Substanzkonzentrationen im Blutplasma wurden die pharmakokinetischen Parameter der Substanzen mit dem Computerprogramm ESTRIP berechnet (Tabelle 3).

Tabelle 3: Pharmakokinetische Daten nach einmaliger, intragastraler Applikation von 1 00 mg/kg CRCV-340, Ref-2 und Ref-3 in Mäuse.

Substanz C T MRT T K CL V AUC AUC C /A max max 1/2 el d o-t 0-« max uc o-t

(ng/ml) (h) (h) (h) ( (mix (ml/k (ngximl (ngximl/

h/kg) g) /h) ( h)

Ref-2 1295,4 1 ,0 2,14 2,96 0,23 36,6 156,7 2354,5 2732,1 0,55

Ref-3 424,5 0,5 2,44 1 ,47 0,55 91 ,8 168,1 1085,7 1089,4 0,39

CRCV- 1254,4 3,0 3,54 3,54 0,18 10,4 52,7 6418,3 9598,5 0,20 340

C _max Maximalkonzentration im Blut

T _max Zeit bis zum Erreichen der Maximalkonzentration im Blut MRT Mittlere Verweilzeit im Blut (mean residence time)

T _1/2 Halbwertszeit

K _e i Eliminationskonstante

CL Beseitigung (clearance)

V _d Verteilungsvolumen (volume of distribution)

AUC Fläche unter der Kurve (area under curve)

C _max /AUC Absorptionsgeschwindigkeit von Magen zum Blut

Ergebnis: Die Untersuchungen zur Pharmakokinetik in der Maus ergaben für CRCV-340 eine deutlich bessere Bioverfügbarkeit als für Ref-2 und Ref-3.

Untersuchungen zur akuten Toxizität von CRCV-340 in der Maus

Ziel: Bestimmung der 50 % letalen Dosis von CRCV-340

Untersuchungen: Die akute Toxizität der Substanz CRCV-340 wurde in 19,5 - 20,5 g schweren Mäusen überprüft, denen per os 40, 60, 80 bzw. 120 mg Substanz/Maus (je 5 Mäuse pro Substanz und Konzentration) verabreicht wurden. Dies entspricht einer Dosis von ca. 2g, 3g, 4g bzw. 6g pro Kilogramm Körpergewicht. Die im Ergebnis beobachteten toxischen Effekte korrelierten mit der applizierten Substanzdosis. Bei den 40 und 60 mg/Maus-Dosierungen wurden bis zu 3 h nach Substanzgabe Koordinationsstörungen und Hyperaktivität als Nebenwirkungen beobachtet. Nach Applikation der zwei höheren Dosierungen kamen Atembeschwerden, aggressives Verhalten und Hyperkinesie dazu. Für CRCV-340 wurde eine LD ₅₀ von 3120 mg/kg bestimmt (Tabelle 4).

Tabelle 4: Ergebnisse der Untersuchungen zur akuten Toxizität der Substanz CRCV-340 nach einmaliger peroraler Applikation in der Maus

Dosis Tote/Überlebende 72 h nach Applikation

Ref-2 CRCV-340

40 mg/Maus 0/5 1 /5

60 mg/Maus 1 /5 1 /5

80 mg/Maus 3/5 3/5

120 mg/Maus 4/5 5/5

LD ₅₀ 78,6 mg/Maus (3930 mg/kg) 62,4 mg/Maus (3120 mg/kg) Ergebnis: Die erhaltenen Daten zur Überlebensrate belegen eine sehr gute Verträglichkeit beider Testsubstanzen.

Langzeituntersuchungen zur Toxizität in der Maus

Ziel: Feststellung der subakuten Toxizität in der Maus, um mögliche Nebenwirkungen z.B. auf das Allgemeinbefinden, Gewicht, die inneren Organe und den Stoffwechsel, die bei einer subakuten Gabe von CRCV-340 über 28 Tage auftreten könnten, aufzudecken.

Untersuchungen: Dazu erhielten ca. 20 g schwere männlich und weibliche Mäuse 12,5, 50 oder 200 mg/kg der Substanz CRCV-340 in einer Cremophorformulierung bzw. die Kontrollgruppe Cremophor einmal täglich über 28 Tage intragastral über eine Sonde verabreicht. Im gesamten Versuchszeitraum wurde der Zustand des Fells und der Schleimhäute, der Exkrete und das Allgemeinbefinden bewertet. Die Protokollierung des Gewichts erfolgte an den Tagen 7, 14, 21 und 28. Ca. 24 h nach der letzten Substanzgabe wurde das Orientierungsvermögen der Tiere untersucht. Im Serum wurden folgende biochemische Parameter analysiert: Proteingehalt, Harnstoff, Creatinin, die Serumaktivität von Aspartataminotransferase, Alaninaminotransferase und alkalischer Phosphatase. Die Hämoglobinkonzentration, Hämatokrit, die Anzahl der roten und weißen Blutzellen sowie der Blutblättchen wurde im Blutausstrich bestimmt. Zum Versuchsende wurden die Mäuse unter Narkose getötet und seziert, der Zustand der inneren Organe makroskopisch eingeschätzt, das Organgewicht bestimmt und Proben für nachfolgende histologische Untersuchungen in Formalin eingelegt.

Ergebniszusammenfassung: Die Ergebnisse belegen eine sehr gute Verträglichkeit der untersuchten Substanzkonzentrationen. Weder das Allgemeinbefinden der Tiere, ihr Fell, die Exkrete noch das Orientierungsvermögen bzw. die Beweglichkeit veränderten sich infolge der Substanzgabe. Auch in Bezug auf die Körpergewichtsdynamik unterschieden sich die CRCV-340- behandelten Tiere nicht von der Kontrollgruppe. Es ließen sich keine Unterschiede zwischen den substanzbehandelten und vehikelbehandelten Versuchsgruppen im Blutausstrich, bei den biochemischen Blutparametern feststellen. Gleiches gilt für die makroskopische Begutachtung der inneren Organe (Leber, Niere, Herz, Lunge, Milz, Pankreas und Hoden), die Organgewichte sowie die Ergebnisse der histologischen Untersuchungen von Herz-, Lungen-, Leber-, Milz-, Thymus-, Pankreas-, Nieren-, Drüsen-, Hoden-, Magen- und Darmgewebsproben (Ergebnisse nicht dargestellt). Bestimmung des antiviralen Spektrums gegen Rhinoviren

Ziel: Bestimmung des antiviralen Wirkspektrums von CRCV-340 gegenüber 50 verschiedenen humanen Rhinovirus-Serotypen und CVB3-Patientenisolaten.

Untersuchungen: Die 50 HRV-Serotypen und 20 klinischen CVB3-lsolate wurden in HeLa-, HeLa Wis- und/oder LF-Zellen vermehrt, ihr Titer bestimmt und mittels Sequenzierung der Serotyp überprüft. Danach wurden zpE (zytopathischer Effekt)-Hemmtests mit den HRV bzw. Plaque- Reduktions-Tests mit den CVB3 Isolaten etabliert. In den entsprechenden antiviralen Tests erfolgten Dosis-Wirkungs-Untersuchungen mit Ref-3 sowie CRCV-340. Eine Übersicht zu den ermittelten mittleren 50 %-Hemmkonzentrationen geben die Tabellen 5 und 6.

Tabelle 5: Übersicht zum Wirkspektrum von Ref-3 und CRCV-340 gegenüber HRV. Zusammen- gefasst wurden die Mittelwerte und Standardabweichungen für alle 50 untersuchten Serotypen sowie für die 45 Pleconaril-sensitiven und 5 Pleconaril-resistenten Serotypen getrennt.

Substanz IC [uM] IC [μΜ] Plecon- IC [μΜ] Plecon- Anzahl der

50 ^{L r J} 50 ^{L r J} 50 ^{L r J}

alle HRV aril-sensitive aril-resistente sensitiven (n = 50) HRV HRV HRV

(n = 45) (n = 5)

mean S. D mean S. D mean S. D.

Ref-3 16,1 1 1 1 ,94 18,52 10,88 0,07 0,01 23

CRCV-340 25,73 21 ,49 26,09 18,98 22,62 40,69 49

Tabelle 6: Übersicht zum Wirkspektrum von Ref-3 und CRCV-340 gegenüber den klinischen CVB3-lsolaten. Zusammengefasst wurden die Mittelwerte und Standardabweichungen für alle 20 untersuchten Isolate sowie für die 19 Pleconaril-sensitiven Isolate und das eine Pleconaril- resistente Serotypen getrennt.

Substanz IC [μΜ] IC [μΜ] Plecon- IC [μΜ] Plecon- Anzahl der

50 ^{L r J} 50 ^{L r J} 50 ^{L r J}

alle CVB3 aril-sensitive aril-resistente sensitiven (n = 20) CVB3 CVB3 CVB3

(n = 1 9) (n = 1 )

mean S. D. mean S. D mean S. D.

Ref-3 0,68 0,90 0,71 0,91 0,13 20

CRCV-340 4,97 4,05 5,16 4,10 1 ,39 18 ^*

^* maximal getestete Konzentration 13,5 μΜ

Ergebniszusammenfassung: Das Wirkspektrum von CRCV-340 gegenüber HRV fiel im Vergleich zu Ref-3 deutlich breiter aus. Untersuchungen zur antiviralen Wirkung in vivo im Mausmodell der CVB3-induzierten chronischen Myokarditis

Ziel: Bestätigung der antiviralen Wirkung von CRCV-340 im Mausmodell

Untersuchungen: Die Wirkung des CRCV-340 wurde im Modell der CVB 3-induzierten Myokarditis in 8-Wochen-alten männlichen NMRI Mäusen untersucht. Dazu erhielten CVB3 31 -1 -93 bzw. CVB3 H3-infizierte Tiere ein- oder zweimal täglich 100 mg/kg der Substanz in 50 % oder 20 % PEG-400 in 1 % CMC in Wasser (Placebo) über 7 Tage verabreicht. Parameter zur Bewertung des therapeutischen Effekts schlössen Veränderungen im Körpergewicht, Allgemeinbefinden, Virustiter in Herz- und Pankreasgewebe sowie histopathologische Veränderungen im Herz und Pankreas ein. Scheininfizierte, Placebo-behandelte bzw. CRCV-340-behandelte Tiere dienten als Negativkontrolle und infizierte, Placebo- bzw. Pleconaril-behandelte Tiere als Positivkontrolle im Infektionsverlauf.

Ergebniszusammenfassung: Im Gegensatz zu Placebo und Pleconaril wirkte CRCV-340 im Modell der CVB3 31 -1 -93-induzierten chronischen Myokarditis in NMRI-Mäusen. Dabei waren klinisch und statistisch signifikante Effekte für alle untersuchten Parameter (Körpergewicht, Allgemeinbefinden, die Virustiter im Herz- und Pankreasgewebe am Tag 7 p.L, die Histopathologie im Herz- und Pankreas am Tag 7 und 21 p.i.) zu beobachten.

Studien zur in vivo-Wirksamkeit von CRCV-340 im letalen Mausmodell im Vergleich zur Referenzsubstanz Pleconaril

Ziel: Verifizierung der antiviralen Wirkung von CRCV-340 im letalen Mausmodell

Untersuchungen: Die Wirkung des Entwicklungskandidaten CRCV-340 wurde nach Austestung der Infektionsdosis im Modell der CVB 3-induzierten Myokarditis in 6 - 7 Wochen alten männlichen BALB/c Mäusen untersucht. Dazu erhielten CVB3 31 -1 -93 bzw. CVB3 H3-infizierte Tiere zweimal täglich 100 mg/kg der Substanz in 20 % PEG-400 in 1 % CMC in Wasser (Placebo) über 7 Tage verabreicht. Veränderungen im Körpergewicht, Allgemeinbefinden und die über den Sur- rogatmarker 25 % Körpergewichtsverlust definierte Letalität dienten als Parameter zur Bewertung des therapeutischen Effekts. Scheininfizierte, Placebo-behandelte bzw. CRCV-340-behandelte Tiere stellten die Negativkontrolle und infizierte, Placebo- bzw. Pleconaril-behandelte Tiere die Positivkontrolle im Infektionsverlauf dar. Ergebniszusammenfassung: Im Gegensatz zu Placebo und Pleconaril wirkte CRCV-340 im letalen BALB/c-Mausmodell nach Infektion mit CVB3 31 -1 -93. Dabei waren klinisch und statistisch signifikante Effekte für alle untersuchten Parameter (Körpergewicht, Allgemeinbefinden sowie die Letalität) zu beobachten.