DOMAINE TECHNIQUE

La présente invention concerne des dérivés furfuryliques de 5-[2-(4'-alcoxyphényl)quinoléin-4-yl]-4H-1 ,2,4-triazol-3-thiol, des compositions pharmaceutiques les comprenant, un procédé de préparation de ceux-ci, ainsi que leur utilisation dans le traitement du cancer.

ETAT DE LA TECHNIQUE ANTERIEURE

Le ciblage du site de liaison à ΑΤΡ du récepteur du facteur de croissance épidermique (Epidermal Growth Factor Receptor - EGFR) par les inhibiteurs de la tyrosine kinase (TKI) permet d'interrompre les cascades de signalisation aberrantes dans les cellules cancéreuses.

L'EGFR appartient à une famille de protéines transmembranaires ErbB qui contrôlent les voies de signalisation et l'expression des gènes impliqués dans la prolifération, la survie, l'angiogenèse, l'adhésion et la motilité des cellules. Un ligand protéique, tel que EGF, se liant à la région extracellulaire de l'EGFR conduit à l'activation de la tyrosine kinase et à l'autophosphorylation de tyrosine à plusieurs sites de la région cytoplasmique du récepteur (Schlessinger, 2014). Il a été montré que les mutations entraînant une surexpression ou une dérégulation de l'EGFR sont associées à la progression de différents types de cancer. Par conséquent, le ciblage de cette protéine a été un objectif important dans la chimie médicinale des deux dernières décennies (Mendelsohn et Baselga, 2006). Des inhibiteurs de tyrosine kinase (TKI) compétitifs de ΑΤΡ, incluant le Gefitinib (ZD1839) approuvé par la FDA, ont été développés pour inhiber le site catalytique de l'EGFR (Herbst et al., 2004). Des TKI ayant des modes d'action alternatifs, tels que le Carnetinib (CI-1033), ont également été conçus pour se lier à une cystéine nucléophile (Cys797) à proximité du site catalytique de l'EGFR (Allen et al., 2003). Les inhibiteurs covalents réversibles et irréversibles bloquent efficacement le site catalytique dans l'EGFR et prolongent l'atténuation de la cascade de signalisation en aval par rapport aux inhibiteurs compétitifs (Kawakita et al., 2013 ; Jia et al., 2016 ; Smail et al., 2016 ; Cheng et al., 2016). Cependant, une limitation des TKI anti-EGFR est l'acquisition de mutations somatiques dans la poche catalytique ou d'autres sites du récepteur conduisant à la résistance aux médicaments antitumoraux dans les essais cliniques (Campbell et al., 2008 ; Hao et al., 2016 ; Wang et al., 2016).

L'inactivation de la tyrosine kinase dans l'EGFR par de petites molécules est basée sur le constat que la force motrice pour activer le site de liaison à ΑΤΡ est l'action du peroxyde d'hydrogène (H2O2) généré lors de la liaison du ligand parent au récepteur (Bae et al., 1997 ; Paulsen et al., 2012). Il a aussi été démontré que l'action de petites molécules, telles que des dérivés du 4-nitro-benzoxadiazole, dépend de la génération de H2O2 par la superoxyde dismutase cytoplasmique dans des cellules cancéreuses (Sakanyan et al., 2016).

Ces résultats suggèrent ainsi que le peroxyde d'hydrogène hautement réactif généré par une variété de réactions métaboliques pourrait augmenter la phosphorylation dans les voies déclenchées par l'EGFR et éteindre les effets des TKI dans les cellules cancéreuses et, par conséquent, diminuer les attentes thérapeutiques. Aussi, le développement de composés anti-EGFR entraînant une réduction du niveau du récepteur pourrait être une stratégie alternative pour perturber la signalisation aberrante dans les cellules cancéreuses.

L'endocytose de l'EGFR est un processus autophagique, connu sous le nom de micro-autophagie qui régit le sort du récepteur dans les cellules (Klionsky et al., 201 ). L'EGFR lié au ligand EGF subit une endocytose dépendant ou non de la clathrine, suivie d'un recyclage et/ou d'une dégradation du récepteur avec des enzymes protéolytiques dans les lysosomes fusionnés aux endosomes (Goh et Sorkin, 2013). Les faibles doses d'EGF activent l'endocytose dépendant de la clathrine alors que les doses élevées du ligand favorisent l'endocytose dépendant ou non de la clathrine (Sigismund et al., 2005 ; Sigismund et al., 2008). La dégradation endocytique de l'EGFR lié au ligand EGF est effectuée plus rapidement que pour le récepteur non lié (Stoscheck et Carpenter, 1984). Il a été montré que le Gefitinib supprime l'endocytose stimulée par l'EGF (Nisimura et al., 2007) et induit une dégradation endocytique du récepteur en tant que réponse cytoprotectrice dans les cellules cancéreuses du poumon (Han et al., 2011 ).

En outre, l'EGFR est une protéine client pour Hsp90a, qui, en coopération avec Hsp70, contrôle le repliement et la maturation appropriés des polypeptides naissants par un complexe super-chaperon dans des cellules normales et cancéreuses (Taipale et al., 2010). Le chaperon Hsp70 reconnaît initialement une protéine client incorrectement repliée, puis assure la translocation de la protéine liée à Hsp90a, et cette dernière qui complète la maturation de la protéine client (Li et al., 2012). Environ 700 protéines ont été identifiées comme partenaires d'interaction avec Hsp90a (Echeverria et al., 2011 ), et une séquence de 20 acides aminés, appelée aC64 dans l'EGFR, est conservée dans les protéines kinases reconnues par Hsp90a (Citri et al., 2006). Le chaperon Hsp90a est fortement exprimé dans les cellules cancéreuses (Pick et al., 2007) et l'inhibition de Hsp90/Hsp70 conduit à la dégradation des protéines clients mal repliées par le protéasome cellulaire (Miyata et al., 2013).

L'état de phosphorylation de EGFR détermine les fonctions des intégrines, des récepteurs transmembranaires qui permettent l'adhésion des cellules à la matrice extracellulaire (MEC) (Vlahakis et Debnath, 2017). La liaison d'EGF à EGFR déclenche, par phosphorylation de la voie MAPK/ERK, l'activation des protéines Bim et Beclin-1 qui se lient aux microtubules et à l'actine qui, en concertation avec d'autres protéines, fournissent l'attachement des α/β-integrines à la MEC. La privation de nutriments nuit à la cascade de signalisation de l'EGFR, entraînant le détachement des cellules et finalement une mort programmée, appelée anoïkose (Frish et Francis, 1994). L'anoïkose est précédée d'une dégradation autophagique des protéines endommagées et d'une séquestration du cytosquelette (Fung et al., 2008). En comparaison des cellules saines, les cellules cancéreuses possèdent une tolérance plus élevée à l'anoïkose, et cette particularité semble être importante pour la progression métastatique des tumeurs inflammatoires (Buchheit et al., 2015).

Ainsi, il existe une possible fenêtre pharmacologique pour atténuer la signalisation aberrante dans les tumeurs en ciblant la dégradation de l'EGFR par de petites molécules en vue de surmonter les limitations des thérapies actuelles dues à l'hétérogénéité des mutations somatiques acquises dans les cellules de la même tumeur qui représente un obstacle majeur dans la lutte contre la progression du cancer.

RESUME DE L'INVENTION

Il a ainsi été démontré dans le cadre de la présente invention que des dérivés furfuryliques du 5-[2-(4'-alcoxyphényl)quinoléin-4-yl]-4H-1 ,2,4-triazol-3-thiol permettaient de réduire l'abondance de l'EGFR grâce à l'activation des voies de dégradation authentiques du récepteur. En effet, ces dérivés se lient à l'EGFR et en diminuent la concentration du récepteur dans des cellules d'un cancer du sein. Les composés actifs inhibent brièvement la phosphorylation de l'EGFR et induisent rapidement une dégradation de l'EGFR et concomitamment du chaperon Hsp90a par endocytose. La diminution du récepteur et des protéines chaperon dégrade les protéines du cytosquelette conduisant au détachement des cellules cancéreuses et finalement à leur mort (anoïkose). Les composés selon l'invention inhibent ainsi la croissance de la tumeur, ce qui a été démontré chez la souris, et représentent un outil prometteur pour atténuer la progression des formes de cancer métastatiques et résistantes aux médicaments.

La présente invention concerne donc un composé de formule (I) ci-dessous :

ou un sel pharmaceutiquement acceptable de celui-ci,

dans laquelle R représente un groupe alkyle comprenant 1 à 10 atomes de carbone.

Les résultats obtenus avec les composés selon l'invention ouvrent des possibilités prometteuses pour améliorer la thérapie anti-cancéreuse ciblée avec des agents chimiques, en renforçant la dégradation de l'EGFR qui mène à la mort des cellules cancéreuses. À ce jour, aucune molécule anti-EGFR n'a été décrite avec une action associée au détachement de cellules cancéreuses de la MEC. Les nouveaux dérivés furfuryliques du 5-[2-(4'-alcoxyphényl)quinoléin-4-yl]-4H-1 ,2,4-triazole-3-thiol possèdent une faible capacité à inhiber la tyrosine kinase EGFR, mais une capacité accrue à dégrader les protéines.

La capacité de molécules similaires à dégrader EGFR (dans l'ordre d'efficacité 26 > 25> 24> 23) est en corrélation avec la longueur de la chaîne alkyl-éther dans leurs structures, CH3(CH2)4, CH3(CH2)3, CH3(CH2)2, and CH3CH2, respectivement. Par conséquent, l'hydrophobicité locale dans la poche catalytique causée par un substituant alkyl-éther plus long (CH2) _n dans des composés pourrait renforcer la dégradation du complexe EGFR/Hsp90a par des protéases.

La suppression du flux de phosphorylation dans la voie MAPK/ERK a été considérée comme un moyen prometteur de réduire la dissémination métastatique des cellules cancéreuses (Akiyama et al., 2009). Selon l'invention, une faible inhibition du site catalytique dans l'EGFR peut être compensée par la dégradation accrue du récepteur et le chaperon Hsp90a associé pendant l'endocytose. La dégradation de l'EGFR semble être avantageuse par rapport à une forte inhibition des voies de signalisation par les molécules connues TKIs, puisqu'elle fournit plus spécifiquement l'interruption de la phosphorylation de la protéine Bim et la séquestration des protéines du cytosquelette.

La mort apoptotique des cellules cancéreuses avec une intervention chimique due à une augmentation de la dégradation des protéines attire une attention particulière dans la thérapie de formes résistantes de tumeurs. En effet, l'interruption totale des voies de phosphorylation avec les TKIs crée des conditions sélectives favorisant la survie des formes mutantes de l'EGFR grâce à des mécanismes alternatifs d'activation du récepteur avec H2O2 généré dans la toile ramifiée des interactions des protéines en relation avec le métabolisme et le microenvironnement tumoral. En revanche, la dégradation directe et double des protéines en réduisant simultanément la quantité d'EGFR et de Hsp90a diminue le développement de telles conditions sélectives et, par conséquent, peut être moins prédisposant à l'apparition de mutants résistants à l'EGFR.

Ainsi, le ciblage de la dégradation de l'EGFR représente une alternative fondamentalement différente et une alternative à l'inhibition de la tyrosine kinase, ce qui est attrayant pour atténuer la progression métastatique et diminuer la résistance aux médicaments des cellules cancéreuses mutées et des tumeurs malignes.

DEFINITIONS

Dans la présente invention, on entend désigner par « pharmaceutiquement acceptable » ce qui est utile dans la préparation d'une composition pharmaceutique qui est généralement sûr, non toxique et ni biologiquement ni autrement non souhaitable et qui est acceptable pour une utilisation vétérinaire de même que pharmaceutique humaine.

Les sels pharmaceutiquement acceptables comprennent notamment :

(1 ) les sels d'addition d'acide pharmaceutiquement acceptable formés avec des acides inorganiques pharmaceutiquement acceptables tels que l'acide chlorhydrique, l'acide bromhydrique, l'acide sulfurique, l'acide nitrique, l'acide phosphorique et similaires ; ou formés avec des acides organiques pharmaceutiquement acceptables tels que l'acide acétique, l'acide benzènesulfonique, l'acide benzoïque, l'acide camphresulfonique, l'acide citrique, l'acide éthane-sulfonique, l'acide fumarique, l'acide glucoheptonique, l'acide gluconique, l'acide glutamique, l'acide glycolique, l'acide hydroxynaphtoïque, l'acide 2-hydroxyéthanesulfonique, l'acide lactique, l'acide maléique, l'acide malique, l'acide mandélique, l'acide méthanesulfonique, l'acide muconique, l'acide 2-naphtalènesulfonique, l'acide propionique, l'acide salicylique, l'acide succinique, l'acide dibenzoyl-L-tartrique, l'acide tartrique, l'acide p-toluènesulfonique, l'acide triméthylacétique, l'acide trifluoroacétique et similaires, et

(2) les sels d'addition de base pharmaceutiquement acceptable formés lorsqu'un proton acide présent dans le composé parent est soit remplacé par un ion métallique, par exemple un ion de métal alcalin, un ion de métal alcalino-terreux ou un ion d'aluminium ; soit coordonné avec une base organique pharmaceutiquement acceptable telle que la diéthanolamine, l'éthanolamine, N-méthylglucamine, la triéthanolamine, la trométhamine et similaires ; ou avec une base inorganique pharmaceutiquement acceptable telle que l'hydroxyde d'aluminium, l'hydroxyde de calcium, l'hydroxyde de potassium, le carbonate de sodium, l'hydroxyde de sodium et similaires.

Par « atome d'halogène », on entend, au sens de la présente invention, les atomes de fluor, de chlore, de brome et d'iode.

Par « alkyle », on entend, au sens de la présente invention, une chaîne hydrocarbonée saturée, linéaire ou ramifiée. Il pourra s'agir notamment d'un groupe n-propyle, n-butyle ou n-pentyle.

Par « (d-C6)alkyle », on entend, au sens de la présente invention, une chaîne hydrocarbonée saturée, linéaire ou ramifiée, comportant 1 à 6, de préférence 1 à 4, atomes de carbone. A titre d'exemple, on peut citer les groupes méthyle, éthyle, propyle, isopropyle, butyle, isobutyle, sec-butyle, tert-butyle, pentyle ou encore hexyle.

Par « aryle », on entend, au sens de la présente invention, un groupement hydrocarboné aromatique, comportant de préférence de 6 à 10 atomes de carbone, et comprenant un ou plusieurs cycles accolés, comme par exemple un groupement phényle ou naphtyle. Avantageusement, il s'agit du phényle.

Par « aryl-(d-C6)alkyle », on entend, au sens de la présente invention, un groupe aryle tel que défini ci-dessus, lié au reste de la molécule par l'intermédiaire d'une chaîne (d-C6)alkyle telle que définie ci-dessus. A titre d'exemple, on peut citer le groupe benzyle. Par « (C C6)alkyl-aryle », on entend, au sens de la présente invention, un groupe (d-C6)alkyle tel que défini ci-dessus, lié au reste de la molécule par l'intermédiaire d'un groupe aryle tel que défini ci-dessus. A titre d'exemple, on peut citer le groupe tolyle (ChhPh).

Par « groupe partant », on entend, au sens de la présente invention, un groupement chimique qui peut être facilement déplacé par un nucléophile lors d'une réaction de substitution nucléophile, le nucléophile étant par exemple un thiol. Un tel groupe partant peut être plus particulièrement un atome d'halogène tel qu'un atome de chlore ou de brome ou un sulfonate. Le sulfonate peut être en particulier un groupe -OSO2-R0 avec Ro représentant un groupe (d-C6)alkyle, aryle, aryl-(d-C6)alkyle ou (d-C6)alkyl-aryle, ledit groupe étant éventuellement substitué par un ou plusieurs atomes de d'halogène tels que des atomes de fluor. Le sulfonate peut être en particulier un mésylate (-OS(02)-CH3), un triflate (-OS(0)2-CF3) ou encore un tosylate (-OS(0)2-(p-Me-C6H4)). De préférence le groupe partant sera un atome d'halogène, tel que Cl ou Br, en particulier Cl.

DESCRIPTION DETAILLEE

La présente invention a donc pour premier objet un composé de formule (I) ci- dessus ou un sel pharmaceutiquement acceptable de celui-ci.

Le groupe R représentera de préférence un groupe alkyle linéaire. Ce groupe alkyle comprend 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 atomes de carbone, en particulier 3 à 10 atomes de carbone, notamment 3 à 6 atomes de carbone, avantageusement 3, 4 ou 5 atomes de carbone.

Le composé selon l'invention pourra être plus particulièrement choisi parmi :

et leurs sels pharmaceutiquement acceptables.

La présente invention concerne comme deuxième objet une composition pharmaceutique comprenant au moins un composé selon la présente invention.

Avantageusement, la composition pharmaceutique comprendra également au moins un excipient pharmaceutiquement acceptable.

Les compositions pharmaceutiques selon l'invention peuvent être destinées à une administration par voie entérale (par exemple par voie orale) ou parentérale (par exemple intraveineuse), de préférence par voie orale ou intraveineuse. L'ingrédient actif peut être administré sous des formes unitaires pour l'administration, mélangé avec des supports pharmaceutiques classiques, à des animaux, de préférence des mammifères, incluant l'homme.

Pour l'administration orale, la composition pharmaceutique peut être sous une forme solide ou liquide (solution ou suspension).

Une composition solide peut se présenter sous les formes de comprimés, de gélules, de poudres, de granules et analogues. Dans les comprimés, l'ingrédient actif peut être mélangé avec un ou plusieurs véhicule(s) pharmaceutique(s) tel(s) que la gélatine, l'amidon, le lactose, le stéarate de magnésium, le talc, la gomme arabique et similaires, avant d'être comprimé. Les comprimés peuvent en outre être enrobés, notamment avec du saccharose ou avec d'autres matériaux appropriés, ou ils peuvent être traités de telle manière qu'ils aient une activité prolongée ou retardée. Dans les poudres ou les granules, l'ingrédient actif peut être mélangé ou granulé avec des agents dispersants, des agents mouillants ou des agents de mise en suspension et avec des correcteurs de saveur ou des édulcorants. Dans les gélules, l'ingrédient actif peut être introduit dans des gélules molles ou dures sous la forme d'une poudre ou de granules comme mentionné précédemment ou sous la forme d'une composition liquide comme mentionné ci-après.

Une composition liquide peut contenir l'ingrédient actif avec un édulcorant, un exhausteur de goût ou un colorant approprié dans un solvant tel que l'eau. La composition liquide peut également être obtenue en suspendant ou en dissolvant une poudre ou des granules, comme mentionné ci-dessus, dans un liquide tel que de l'eau, du jus, du lait, etc. Il peut s'agir par exemple d'un sirop ou d'un élixir.

Pour l'administration parentérale, la composition peut se présenter sous la forme d'une suspension aqueuse ou d'une solution qui peut contenir des agents de suspension et/ou des agents mouillants. La composition est avantageusement stérile. Elle peut se présenter sous la forme d'une solution isotonique (en particulier par rapport au sang).

Les composés selon l'invention peuvent être utilisés dans une composition pharmaceutique à une dose allant de 0,01 mg à 1 000 mg par jour, administrés en une seule dose une fois par jour ou en plusieurs doses durant la journée, par exemple deux fois par jour à des doses égales. La dose administrée quotidiennement est avantageusement comprise entre 5 mg et 500 mg, et plus avantageusement entre 10 mg et 200 mg. Cependant, il peut être nécessaire d'utiliser des doses en dehors de ces plages, ce dont pourra se rendre compte l'homme du métier.

La présente invention a également pour troisième objet les composés ou compositions pharmaceutiques selon l'invention pour leur utilisation comme médicament, notamment pour la prévention ou le traitement du cancer, incluant notamment la prévention des métastases.

L'invention concerne également l'utilisation d'un composé ou d'une composition pharmaceutique selon l'invention dans la prévention ou le traitement du cancer, incluant notamment la prévention des métastases. L'invention concerne également l'utilisation d 'un composé ou d 'une composition pharmaceutique selon l'invention pour la fabrication d 'un médicament destiné à la prévention ou au traitement du cancer, incluant notamment la prévention des métastases.

L'invention concerne également une méthode de prévention ou traitement du cancer, incluant notamment la prévention des métastases, comprenant l'administration à un patient en ayant besoin d'une quantité efficace d 'un composé ou d 'une composition pharmaceutique selon l'invention.

Le cancer pouvant être traité par les composés et compositions pharmaceutiques selon l'invention pourra être tout cancer des cellules épithéliales, et plus particulièrement un cancer du sein, un cancer du poumon non à petites cellules, un cancer de la prostate, un cancer du pancréas, ou un cancer colorectal.

Les composés et compositions pharmaceutiques selon l'invention peuvent aussi être utilisés dans le traitement d 'autres pathologies liées à la surexpression ou dérégulation de EGFR et de voies de signalisation correspondantes, telles que les maladies cardiovasculaires telles que l'accident vasculaire cérébrale (AVC), l'ischémie, les maladies neurodégénératives telles que la maladie d 'Alzheimer ou le glaucome, ou encore pour favoriser la régénération de fibres nerveuses optiques blessées.

La présente invention a pour quatrième objet un procédé de préparation d 'un composé selon l'invention comprenant l'hydrolyse de la fonction ester d 'un composé de formule (I I) ci-dessous :

dans laquelle R est telle que définie ci-dessus et Ri représente un groupe alkyle comprenant 1 à 6 atomes de carbone, notamment un groupe méthyle ou éthyle. Une telle réaction d'hydrolyse peut être réalisée en milieu acide ou basique, notamment basique, selon des méthodes bien connues de l'homme du métier. La réaction peut ainsi être réalisée en présence d'une base telle que KOH ou NaOH. La réaction pourra être réalisée dans un solvant tel que le méthanol, l'eau ou un mélange de ceux-ci.

Cette étape d'hydrolyse peut être suivie d'une étape de salification en présence d'un acide ou d'une base pharmaceutiquement acceptable pour donner le sel correspondant.

Le composé ainsi obtenu pourra être séparé du milieu réactionnel par des méthodes bien connues de l'homme du métier, comme par exemple par extraction, évaporation du solvant ou encore par précipitation et filtration.

Le composé pourra être par ailleurs purifié si nécessaire par des techniques bien connues de l'homme du métier, comme par recristallisation si le composé est cristallin, par distillation, par chromatographie sur colonne sur gel de silice ou encore par chromatographie liquide haute performance (HPLC).

Les composés de formule (II) peuvent être préparés à partir des composés de formule (III) ci-dessous :

dans laquelle R est tel que défini précédemment,

par substitution de la fonction thiol avec un composé de formule (IV) ci-dessous :

dans laquelle Ri est tel que défini ci-dessus et GP représente un groupe partant tel qu'un atome d'halogène, par exemple Cl.

Une telle réaction est avantageusement réalisée en présence d'une base telle que KOH ou NaOH. Cette réaction peut être mise en œuvre dans un solvant tel que le méthanol, par exemple à température ambiante, c'est-à-dire une température comprise entre 15 et 30° C, notamment entre 20 et 25° C.

Les composés de formule (III) existent sous les deux formes tautomères (III) et (ΙΙ ) ci-dessous :

(III) (NI')

Les composés de formule (III) peuvent être préparés à partir des composés de formule (V) ci-dessous :

dans laquelle R est tel que défini précédemment,

par cyclisation en milieu basique.

Une telle réaction est avantageusement réalisée en présence d'une base telle que KOH ou NaOH. La réaction peut être mise en œuvre dans un solvant tel que l'eau, notamment à la température de reflux.

Les composés de formule (V) peuvent être préparés à partir des composés de formule (VI) ci-dessous :

dans laquelle R est tel que défini précédemment,

par réaction avec l'aUylisothiocyan ci-dessous

Une telle réaction peut être réalisée dans un solvant tel que l'éthanol.

Les composés de formule (VI) peuvent être préparés selon un protocole décrit dans Avetyan et al. , 1973.

La présente invention est illustrée par les exemples non limitatifs et figures détaillés ci-dessous.

FIGURES

Figure 1. Western blot de la phosphorylation de la tyrosine de l'EGFR et de l'expression des protéines dans les cellules de cancer du sein traité avec divers composés.

(A) Les cellules MDA MB468 privées de sérum ont été traitées avec des composés selon l'invention (100 μΜ) ou Cl -1033 (1 μΜ) pendant 90 min, lavées avec du PBS, puis incubées sans ou avec 200 ng/ml d'EGF pendant 15 min. La phosphorylation totale de la tyrosine de l'EGFR (pTyr) a été détectée avec un anticorps anti-pTyr-100 qui reconnaît un pan-épitope de la tyrosine phosphorylée dans les protéines (www.cellsignal.com).

(B) Les composés 25 et 26 présentent un effet dépendant de la dose sur la phosphorylation et l'expression de EGFR. Les cellules ont été traitées avec différentes concentrations de composés pendant 120 min, puis stimulées avec EGF comme dans

(A).

Figure 2. Test d'immunoprécipitation révélant une association d'EGFR avec Hsp90a dans des cellules cancéreuses traitées avec des composés selon l'invention.

Figure 3. Effets de composés selon l'invention sur l'expression de protéines dans des cellules cancéreuses transfectées avec de l'ARNsi EGFR. (A) Western blot de protéines extraites de cellules MDA MB468 après transfection avec un ARNsi EGFR ou ARNsi contrôle et exposition aux composés 25 et 26.

(B) Des quantités relatives de protéines ont été estimées comme des rapports EGFR/6-actine, Hsp90a/6-actine ou LC36/6-actine et ajusté aux valeurs correspondantes avec un véhicule référencé (DMSO 0,1 %) en tant que 100 %.

Figure 4. Preuve de concept de détachement de cellules cancéreuses après 18 h de croissance dans le milieu dépourvu de sérum et traitement avec des composés selon l'invention pendant 6 h.

Figure 5. Preuve de concept de détachement de cellules cancéreuses avec des composés selon l'invention après 48 h dans des cellules cancéreuses privées et non- privées de sérum.

Figure 6. Preuve de concept de la faible et réversible inhibition de l'autophosphorylation de l'EGFR dans les cellules cancéreuses avec le composé 26.

EXEMPLES

I - Synthèse des composés selon l'invention

Les spectres de résonnance magnétique nucléaire (RMN) ¹ H ont été enregistrés dans du DMSO-dô à température ambiante en utilisant un spectrophotomètre Varian Mercury-300 VX NMR et les déplacements chimiques ont été mesurés en ppm en utilisant le TMS comme référence. Les analyses de spectrométrie de masse avec ionisation par électronébulisation (ESI) et à hautre résolution (HRMS) ont été obtenues respectivement en utilisant un spectromètre Thermo Finnigan LCQ Advantage ou un spectromètre Thermo Scientific Exactive Orbitrap. Les points de fusion (pf ) sont définis en ° C et ont été mesurés sur une table de micro-chauffage Boecius. Les chromatographies sur couche mince (CCM) ont été réalisées sur des plaques Silufol UV-254 dans le système de solvants chloroforme-méthanol, 10:0,5 pour les composés 6-10 ; dans le système de solvants acétate d'éthyle-benzène 1 :3 pour les composés 1 1 -15 ; dans le système de solvants acétate d 'éthyle-benzène 2:1 pour les composés 17-21 ; et dans le système de solvants acétate d'éthyle-méthanol-eau 10:2: 1 pour les composés 22-26. La révélation des plaques a été effectuée aux UV (254 nm).

Les composés selon l'invention ont été synthétisés selon le schéma réactionnel ci- dessous :

avec R = CH ₃ , C ₂ H ₅ , C3H7, C ₄ H ₉ et C ₅ Hn.

Hydrazides d'acides 2-(4-alkoxyphényl)quinoléin-4-carboxyliques 1-5 :

Les produits de départ 1-5 ont été synthétisés selon le protocole décrit dans Avetyan et al., 1973.

N ⁴ -allylthiosemicarbazides d'acides 2-(4-alkoxyphényl)quinoléin-4-carboxyliques 6-10 :

Les composés 6-10 ont été synthétisés par réaction des composés 1-5 avec l'aUylisothiocyanate dans l'éthanol. Un mélange de 0,3 g (0,003 mole) d'allylisothiocyanate, 0,003 mole d'hydrazide (composés 1 -5) (Avetyan et al., 1973) et 12 ml d'éthanol a été chauffé au reflux pendant 3-4 h et laissé pendant une nuit à 18°C. Le précipité a été filtré et lavé sur filtre avec de l'éther.

4-Allyl-5-[2-(4-alkoxyphényl)quinoléin-4-yl]-4H-1 ,2,4-triazol-3-thiols 1 1-15 :

Les composés 6-10 ont été cyclisés en présence de KOH pour donner les composés 1 1- 15. Un mélange de 0,01 mole d'acide 2-(4-alcoxyphényl)-quinoléin-4-carboxylique de N4-allylthiosemicarbazide (composés 6 à 10), 0,84 g (0,015 mole) de KOH et 35 ml d'eau a été chauffé au reflux pendant 2-3 h, et la solution a été filtrée et acidifiée avec de l'acide acétique. Le précipité a été filtré et recristallisé dans l'éthanol absolu. Les triazole-3-thiols peuvent exister sous des formes tautomères de type thiolthione (Cretu et al., 2010). Dérivés S-substitués 17-21 :

Les composés 17-21 ont été synthétisés par réaction des composés 11-15 avec l'ester méthylique de l'acide 5-chlorométhylfuran-2-carboxylique (préparé selon Mndzhoyan et Grigoryan, 1956) en présence d'une quantité équimolaire de KOH. Dissoudre 0,56 g (0,01 mole) de KOH dans 25 ml de méthanol, puis dissoudre 0,01 mole du triazole 11- 15 correspondant sous chauffage. Après refroidissement de la solution à température ambiante, on a ajouté 1,76 g (0,01 mole) d'ester méthylique d'acide 5- chlorométhylfurane-2-carboxylique (16) dissous dans 6 ml d'éthanol et laissé pendant une nuit. Le mélange a été chauffé au reflux pendant 4 h, le méthanol a été éliminé par distillation et le précipité a été filtré et recristallisé dans du méthanol.

Acides 5-{4-allyl-5-[2-(4-alcoxyphényl)quinoléin-4-yl]-4H-1,2,4-t riazole-3- ylsulphanylméthyl}furan-2-carboxyliques (22-26).

0,001 mol de l'ester correspondant 17-21 et 0,11 g (0,002 mol) de KOH ont été dilués dans 16 ml de méthanol à 50% en volume dans l'eau. Le mélange a été porté au reflux pendant 3-4 h. La solution obtenue a été acidifiée avec de l'acide acétique à 18° C et le précipité résultant a été filtré et recristallisé dans le méthanol. Les produits ci- dessous ont été obtenus.

Acide 5-{4-allyl-5-[2-(4-méthoxyphényl)quinoléin-4-yl]-4H-1,2,4 -triazole-3- ylsulphanylméthyl}-furan-2-carboxylique (22). 0,51 g (0,001 mole) de 5-{4-allyl-5- [2-(4-méthoxyphényl)quinoléin-4-yl]-4H-1 ,2,4-triazole-3-ylsulfanylméthyl}-2-furoate et 0,11 g (0,002 mole) de KOH ont été dilués dans 16 ml de mélange 50/50 d'eau et de méthanol. Le mélange a été chauffé au reflux pendant 3-4 h. La solution a été acidifiée avec l'acide acétique (pH 4) et le précipité a été filtré et recristallisé dans l'éthanol. Rendement 0,4 g (82%), point de fusion 150-152°C. Rf 0,65. IR-spectra, γ, cm ¹ : 1602, 1519, 837, 770 (CH = CH, aromatique), 1711 (C = O), 2500-3100 (OH). RMN ¹ H, ô(ppm): 3,88 (s, 3H, O (s, 2H, SCH ₂ ), 4,80 (dq, 1H, Hz, J ₂ =1,5 Hz, 6,51 (d, 1H, J=3,3 Hz, H-fur.), 7,00-7,06 (m, 3H, C ₆ H ₄ OCH ₃ ), 7,05(d, 1H, J=3,3 Hz, H-fur.), 7,51- 7,57 (m, 1H, C ₆ H ₄ ), 7,72-7,79 (m, 2H, C ₆ H ₄ ), 8,09 (s, 1H, =CH, pyr.), 8,11 (dd, 1H, Hz, J ₂ =1,0 Hz, C ₆ H ₄ ), 8,21-8,26 (m, 2H, C ₆ H ₄ OCH ₃ ), 12,50 (br, 1H, COOH). HRMS [ESI ⁺ , MeOH] : calculé pour C ₂₇ H ₂₃ 0 ₄ N ₄ S [M+H] ⁺ 499,1435, trouvé 499,1441. Anal. él. calculée pour : C ₂₇ H ₂₂ N ₄ 0 ₄ S : C 65,04; H 4,45; N 11,24; S 6,43; trouvée : C 65,17; H 4,39; N 11,13; S 6,27. Acide 5-{4-allyl-5-[2-(4-éthoxyphényl)quinoléin-4-yl]-4H-1,2,4- triazole-3- ylsulphanylméthyl}-furan-2-carboxylique (23) - composé de référence. 0,51 g (0,001 mole) de la 5-{4-allyl-5-[2-(4-éthoxyphényl)quinoléin-4-yl]-4H-1 ,2,4-triazole-3- ylsulfanylméthyl}-2-furoate et 0,11 g (0,002 mole) de KOH ont été dilués dans 16 ml de mélange 50/50 d'eau et de méthanol. Le mélange a été chauffé au reflux pendant 3-4 h. La solution a été acidifiée avec de l'acide acétique (pH 4) et le précipité a été filtré et recristallisé dans l'éthanol. Rendement 0,41 g (80%), pf 156-157° C. Rf 0,68. IR-spectra, γ, cm ¹ : 1599, 1455, 847, 766 (CH = CH, aromatique), 1693 (C = 0), 2500- 3100 (OH). RMN ¹ H, ô(ppm): 1,45 (t, 3H, J=7,0 Hz, CH ₃ ), 4,13 (q, 2H, J=7,0 Hz, OCH ₂ ), 4,48 (dt, 2H, 4,60 (s, 2H, SCH ₂ ), 4,80 (dq, 1H,

5,72 (ddt, 1H, 6,51 (d, 1H, J=3,4 Hz, H-fur.), 6,98-7,03 (m, 2H, C ₆ H ₄ OC ₂ H ₅ ), 7,05 (d, 1H, J=3,4 Hz, H-fur.), 7,50-7,57 (m, 1H, C ₆ H ₄ ), 7,72-7,79 (m, 2H, C ₆ H ₄ ), 8,08 (s, 1H, =CH, pyr.), 8,11 (dd, 1H, Hz, J ₂ =1,0 Hz, C ₆ H ₄ ), 8,19-8,25 (m, 2H, C ₆ H ₄ OC ₂ H ₅ ), 12,50 (br, 1H, COOH). HRMS [ESI ⁺ , MeOH] : calculé pour C ₂₈ H ₂₅ 0 ₄ N ₄ S [M+H] ⁺ 513,1591, trouvé 513,1590. Anal. él. calculée pour C ₂₈ H ₂₄ N ₄ 0 ₄ S : C 65,61; H 4,72; N 10,93; S 6,26; trouvée : C 65,54; H 4,66; N 10,85; S 6,07.

Acide 5-{4-allyl-5-[2-(4-propoxyphényl)quinoléin-4-yl]-4H-1,2,4- triazole-3- ylsulphanylméthyl}-furan-2-carboxylique (24). 0,53 g (0,001 mole) de la 5-{4-allyl- 5-[2-(4-propoxyphényl)quinoléin-4-yl]-4H-1 ,2,4-triazole-3-ylsulfanylméthyl}-2-furoate et 0,11 g (0,002 mole) de KOH ont été dilués dans 16 ml de mélange 50/50 d'eau et de méthanol. Le mélange a été chauffé au reflux pendant 3-4 h. La solution a été acidifiée avec de l'acide acétique (pH 4) et le précipité a été filtré et recristallisé dans l'éthanol. Rendement 0,45 g (86%), pf 149-150° C. Rf 0,62. IR-spectra, γ, cm ¹ : 1598, 1456, 840, 766 (CH = CH, aromatique), 1694 (C = 0), 2500-3100 (OH). RMN ¹ H, ô(ppm): 1,09 (t, 3H, J=7,4 Hz, CH ₃ ), 1 ,78-1 ,90 (m, 2H, ÇJH ₂ CH ₃ ), 4,02 (t, 2H, J=6,4 Hz, OCH ₂ ), 4,48 (br,d, 2H, J=5,0 Hz, ÇJH ₂ CH=CH ₂ ), 4,60 (s, 2H, SCH ₂ ), 4,80 (br,d, 1H, J=17,2 Hz, CH ₂ CH=ÇJH ₂ ), 5,08 (br,d, 1H, J=10,4 Hz,

Hz, CH ₂ ÇJH=CH ₂ ), 6,51 (d, 1H, J=3,4 Hz, H-fur.), 6,98-7,03 (m, 2H, C ₆ H ₄ OC H ₇ ), 7,04 (d, 1H, J=3,4 Hz, H-fur.), 7,53 (ddd, 1H, Hz, C ₆ H ₄ ), 7,73-7,79 (m, 2H, C ₆ H ₄ ), 8,08 (s, 1H, =CH, pyr.), 8,11 (br,d, 1H, J=8,3 Hz, C ₆ H ₄ ), 8,19-8,24 (m, 2H, C ₆ H ₄ OC H ₇ ), 12,50 (br, 1H, COOH). HRMS [ESI ⁺ , MeOH] : calculé pour C ₂₉ H ₂₇ 0 ₄ N ₄ S [M+H] ⁺ 527,1748, trouvé 527,1753. Anal. él. calculée pour C ₂₉ H ₂₆ N ₄ 0 ₄ S : C 66,14; H 4,98; N 10,64; S 6,09; trouvée : C 66,03; H 4,75; N 10,90; S 6,17. Acide 5-{4-allyl-5-[2-(4-butoxyphényl)quinoléin-4-yl]-4H-1,2,4-t riazole-3- ylsulphanylméthyl}-furan-2-carboxylique (25).0,54 g (0,001 mole) de la 5-{4-allyl-5- [2-(4-butoxyphényl)quinoléin-4-yl]-4H-1 ,2,4-triazole-3-ylsulfanylméthyl}-2-furoate et 0,11 g (0,002 mole) de KOH ont été dilués dans 16 ml de mélange 50/50 d'eau et de méthanol. Le mélange a été chauffé au reflux pendant 3-4 h. La solution a été acidifiée avec de l'acide acétique (pH 4) et le précipité a été filtré et recristallisé dans l'éthanol. Rendement 0,44 g (81%), pf 158-159° C. Rf 0,70. IR-spectra, γ, cm ¹ : 1599, 1455, 840, 766 (CH = CH, aromatique), 1693 (C = 0), 2500-3100 (OH). RMN ¹ H, ô(ppm): 1,02 (t, 3H, J=7,3 Hz, CH ₃ ), 1,48-1,61 (m, 2H, ÇH2CH3), 1,75-1,85 (m, 2H, ÇH2CH2O), 4,05 (t, 2H, J=6,4 Hz, OCH ₂ ), 4,48 (dt, 2H, J=1,7 Hz, aH ₂ CH=CH ₂ ), 4,60 (s, 2H, SCH ₂ ), 4,80 (dq,

, J ₂ =1,7 Hz, 6,52 (d, 1H, J=3,4 Hz, H-fur.), 6,97-7,03 (m, 2H, C6H4OC4H9), 7,05 (d, 1H, J=3,4 Hz, H-fur.), 7,53 (ddd, 1H, Hz, C ₆ H ₄ ), 7,73-7,79 (m, 2H, C ₆ H ₄ ), 8,08 (s, 1H, =CH, pyr.), 8,11 (dd, 1H, Hz, J ₂ =1,2 Hz, C ₆ H ₄ ), 8,19-8,24 (m, 2H, C6H4OC4H9), 12,70 (br, 1H, COOH). HRMS [ESI ⁺ , MeOH] : calculé pour C30H29O4N4S [M+H] ⁺ 541,1904, trouvé 541,1915. Anal. él. calculée pour: C30H28N4O4S : C 66,65; H 5,22; N 10,36; S 5,93; trouvée : C 66,52; H 5,10; N 10,23; S 6,07.

Acide 5-{4-allyl-5-[2-(4-pentyloxyphényl)quinoléin-4-yl]-4H-1,2, 4-triazole-3- ylsulphanylméthyl}-furan-2-carboxylique (26). 0,55 g (0,001 mole) de la 5-{4-allyl- 5-[2-(4-pentyloxyphényl)quinoléin-4-yl]-4H-1 ,2,4-triazole-3-ylsulfanylméthyl}-2- furoate et 0,11 g (0,002 mole) de KOH ont été dilués dans 16 ml de mélange 50/50 d'eau et de méthanol. Le mélange a été chauffé au reflux pendant 3-4 h. La solution a été acidifiée avec de l'acide acétique (pH 4) et le précipité a été filtré et recristallisé dans l'éthanol. Rendement 0,47 g (85%), pf 165-166 °C. Rf 0,69. IR-spectra, γ, cm ^"1 : 1600, 1455, 841, 766 (CH = CH, aromatique), 1693 (C = 0), 2500-3100 (OH). RMN ¹ H, ô(ppm): 0,97 (t, 3H, J=7,1 Hz, CH ₃ ), 1,36-1,55 (m, 4H, ÇJH2ÇJH ₂ CH ₃ ), 1,76-1,86 (m, 2H, OCH2ÇH2), 4,04 (t, 2H, J=6,5 Hz, OCH ₂ ), 4,48 (dt, 2H,

4,60 (s, 2H, SCH ₂ ), 4,80 (dq, 1H, 5,08 (dq, 1H, Hz, J ₂ =10,4 Hz, J ₃ =5,1 Hz, CH ₂ ÇJH=CH ₂ ), 6,52 (d, 1H, J=3,4 Hz, H-fur.), 6,97-7,03 (m, 2H, C6H4OC5H11), 7,05 (d, 1H, J=3,4 Hz, H-fur.), 7,53 (ddd, 1H, Hz, C ₆ H ₄ ), 7,73-7,79 (m, 2H, C ₆ H ₄ ), 8,08 (s, 1H, =CH, pyr.), 8,11 (dd, 1H, Hz, J ₂ =1,2 Hz, C ₆ H ₄ ), 8,19- 8,24 (m, 2H, C6H4OC5H11), 12,66 (br, 1H, COOH). HRMS [ESI ⁺ , MeOH] : calculé pour C31 H31O4N4S [M+H] ⁺ 555,2061 , trouvé 555,2057. Anal. él. calculée pour C31 H30N4O4S : C 67,13; H 5,45; N 10,10; S 5,78; trouvée : C 66,95; H 5,37; N 10,18; S 5,66.

Il - Résultats biologiques

Matériel et méthode :

Produits et réactifs chimiques. Les composés Carnetinib (CI-1033) et Gefitinib (ZD1839) ont été achetés respectivement chez Sigma-Aldrich et Santa Cruz Biotechnology. Des solutions mères de 25 mM des composés chimiques synthétisés et commerciaux ont été préparées dans du DMSO (99,9% de pureté, OriGen Biomédical) et des aliquotes ont été stockées à -80° C. Les tampons de lyse Pierce® IP et RIPA, des comprimés de cocktail inhibiteur de protéase/phosphatase, des anticorps primaires humains anti-EGFR, anti-ErbB2 et anti-6-actine proviennent de Thermo Fisher. Les anticorps primaires humains anti-phospho-EGFR (Tyr1068), anti-Hsp90a, anti-HDAC2 et les anticorps secondaires de lapin et de souris proviennent de R & D Systems. Les anticorps monoclonaux humains anti-EGFR (A-10), LC3a/6 et Hsp70 bovins proviennent de Santa Cruz Biotechnology. L'anticorps monoclonal de souris anti-pTyr (pTyr-100) conjugué à la biotine provient de Cell Signaling Technology. La protéine G provient de Bio-Rad. Le substrat chimioluminescent WesternSure a été fourni gracieusement par Li-Cor.

Culture de cellules. Des cellules du cancer du sein triple négatif MDA MB468 ont été cultivées dans le milieu DMEM (Dulbecco's modified Eagle's médium) supplémenté avec 10% de sérum de veau fœtal (SVF), de pénicilline (100 unités/ml), et de streptomycine (100 μg/ml). Pour évaluer l'action des composés, les cellules ont été lavées avec du PBS et privées de nutriments dans un milieu DMEM exempt de SVF pendant 18 heures. Pour stimuler la phosphorylation de l'EGFR, les cellules traitées ou non par les composés ont été lavées avec du TBS et incubées dans un milieu exempt de SVF contenant le ligand naturel EGF (200 ng/ml). Les cellules ont été lavées deux fois avec du TBS froid, puis lysées dans des tampons de lyse IP ou RIPA en présence de cocktails d'inhibiteurs de protéase et de phosphatase, collectées par raclage, transférées dans des tubes et centrifugées à 14 000 g pendant 10 min. Les fractions surnageantes des lysats de cellules ont été stockées à -80°C. Les niveaux relatifs de protéines ont été mesurés en tant que ratio de protéines individuelles sur β-actine dans le même échantillon et normalisés avec les valeurs correspondantes des échantillons non traités (véhicule) étant considérées comme 100%. Sauf indication contraire, des concentrations de 25 μΜ et 50 μΜ de composés ont été utilisées dans les essais dans le milieu DMEM exempt de SVF ou dans le milieu DMEM supplémenté avec 10% (v / v) de SVF.

Test de viabilité cellulaire. Les solutions mères de composés ont été diluées aux concentrations appropriées dans des milieux frais avant chaque essai. La concentration finale de DMSO était inférieure à 0,1%. Les cellules MDA MB468 de cancer du sein ont été cultivées dans du milieu DMEM non supplémenté ou supplémenté avec du SVF en présence des composés pendant 72 h. La viabilité cellulaire a été déterminée par une méthode colorimétrique (Vindelov, 1977). Les essais ont été réalisés trois fois et les valeurs calculées d'ICso représentent une moyenne.

Test de détachement de cellules. Le milieu de culture et une suspension lavée une fois avec du PBS de cellules MDA MB468 cultivées après traitements aux temps indiqués ont été recueillis par pipetage et combinés dans un tube (appelé cellules détachées). Les cellules détachées collectées ont été recueillies par centrifugation à 14 000 g pendant 10 min, et après avoir éliminé le surnageant, le culot a été incubé dans 100 μΐ ou 40 μΐ de solution de lyse RIPA. Le reste des cellules attachées à une surface ont été lysées dans 400 μΐ de solution de lyse RIPA et collectées par raclage. L'efficacité du détachement cellulaire par les composés a été estimée comme le rapport des niveaux de protéines dans la fraction de cellules détachées aux cellules attachées en utilisant une analyse Western Blot. Cette approche a permis de simplifier l'évaluation de l'efficacité de détachement des cellules et de la mort des cellules, l'anoïkose. Immunoprécipitation. Les fractions surnageantes d'extraits obtenus par lyse de cellules dans un tampon de lyse IP de force modérée ont été incubées avec un anticorps monoclonal anti-EGFR (A-10) pendant 2 h, lavées avec du PBS et les protéines immunoprécipitées ont été recueillies sur la protéine G conjuguée à des billes magnétiques selon le protocole du Bio-Rad.

Interférence ARN pour knockdown de l'EGFR. Les cellules MDA MB468 ont été incubées dans du milieu DMEM supplémenté avec 10% de SVF pendant 18 h. La transfection des ARNsi a été effectuée avec 60 pmol de ARNsi duplex spécifique de l'EGFR humain ou de ARNsi contrôle selon les recommandations du fabricant Santa Cruz Biotechnology. Les cellules transfectées ont été autorisées à se rétablir dans du milieu DMEM supplémenté avec du SVF pendant 48 h puis ont été privées de nutriments dans du milieu DMEM sans SVF pendant 18 h avant exposition au composé 25 ou 26 pendant 2 h. Le knockdown du récepteur était d'environ 40% avec le ARNsi de l'EGFR par rapport aux cellules transfectées avec un ARNsi contrôle dans deux expériences indépendantes. Un effet de diminution modéré peut s'expliquer par une surexpression de l'EGFR dans les cellules MDA MB468.

Western blot. Des quantités égales d'échantillons ont été utilisées pour l'électrophorèse des protéines par SDS-PAGE, puis transférés sur membrane de nitrocellulose avec un système Trans-Blot Turbo (Bio-Rad). La détection chimioluminescente des protéines transférées et la quantification ont été réalisées avec le scanner C-Digit (Li-COR). Le niveau d'une protéine témoin chargée, la 6-actine, était généralement inchangé dans les cellules traitées avec différents composés aux concentrations utilisées. Cependant, il a été remarqué que les composés à des concentrations supérieures à 25 μΜ et une exposition plus longue pouvaient conduire au détachement des cellules dans la plaque. Afin d'exclure l'interférence du détachement cellulaire sur la diminution de la quantité de protéines à tester, le rapport de l'intensité du signal de chaque protéine individuelle à la β-actine a été estimé dans le même échantillon traité et des valeurs normalisées ont été obtenues avec le rapport de la même protéine à la β-actine dans les échantillons incubés avec un véhicule considéré comme 100%.

Résultats :

Evaluation de la diminution du niveau d'EGFR par les composés dans les cellules cancéreuses.

Pour évaluer la capacité des composés 22 à 26 de moduler la phosphorylation de la tyrosine EGFR, une lignée cellulaire de cancer du sein triple négative MDA MB468, dans laquelle le récepteur est surexprimé par rapport à la faible expression de son homologue ErbB2 (Filmus et al., 1985), a été utilisée. Les cellules ont été cultivées dans du milieu DMEM dépourvu de sérum pendant 18 h, et les cellules ont été traitées avec 100 μΜ des composés pendant 90 min, ce traitement étant suivi de l'induction d'EGFR avec un ligand parent EGF. L'analyse par Western blot a révélé que les composés 25 et 26 suppriment remarquablement la phosphorylation de la tyrosine et diminuent le niveau d'expression du récepteur (Figure 1A). Par ailleurs, les cellules sont incubées avec le composé 25 ou 26 sans addition ultérieure d'EGF, le niveau d'expression de l'EGFR diminue à nouveau par rapport aux cellules incubées avec un véhicule (DMSO). Un inhibiteur covalent de l'EGFR, à savoir CI-1033 utilisé comme contrôle, supprime la phosphorylation de la tyrosine sans réduction du niveau d'expression du récepteur. Une évaluation comparative de l'action des composés a montré que la phosphorylation de Tyr1068 et l'expression de l'EGFR diminuent de manière dose-dépendante dans les cellules MDA MB468 privées de sérum et traitées avec des composés 25 et 26 pendant 2 h puis incubées avec EGF (Figure 1 B). Les cellules ont montré une suppression progressive de la phosphorylation de la tyrosine d'autres protéines kinases détectée par l'anticorps anti-pTyr. Ces données montrent que les composés selon l'invention sont capables d'atténuer la transduction du signal dans les voies de signalisation en aval de l'EGFR.

La diminution du niveau d'EGFR s'accompagne de la diminution de la quantité de Hsp90a, ce qui est bien visible à la concentration de 25 μΜ de composés. En outre, une diminution des niveaux de protéines fonctionnellement indépendantes, telles que ErbB2, HDAC2 et β-actine, a également été détectée dans des cellules avec des concentrations plus élevées de composés.

La capacité des composés 25 et 26 à supprimer la phosphorylation de la tyrosine et à réduire le taux d'EGFR, entraînant une diminution des niveaux de Hsp90a et d'autres protéines fonctionnellement indépendantes, montre que les composés selon l'invention induisent une dégradation des protéines dans les cellules cancéreuses du sein.

Les composés selon l'invention conduisent à la dégradation simultanée de l'EGFR et du Hsp90a.

L'action des composés sur les interactions de l'EGFR avec Hsp90a a été étudiée à l'aide des tests d'immunoprécipitation. Les cellules MDA MB468 cultivées dans du milieu DMEM dépourvu de sérum ont été traitées avec les composés 23, 25 et 26, puis ont été lysées dans un tampon IP à force modérée. Les complexes putatifs formés entre l'EGFR et d'autres protéines ont été capturés avec un anticorps anti-EGFR à partir d'extraits et caractérisés par un Western Blot. Une faible quantité d'EGFR a été détectée dans l'extrait immunoprécipité à partir de cellules exposées au composé 26 ce qui est en accord avec le faible niveau de récepteur détecté dans les échantillons du contrôle « in-put » (Figure 2). L'analyse a révélé une bande diffuse à 90 kDa correspondant à Hsp90a co-immunoprécipité avec EGFR à partir d'extraits de cellules traitées avec les composés, avec le rendement le plus élevé du chaperon dans l'échantillon pour le traitement avec le composé 23 et le plus bas avec le composé 26 (Figure 2A). Aucune bande correspondant à Hsp70 n'a été détectée dans des extraits immunoprécipités, tandis que ce chaperon de 70 kDa a été détecté avec des échantillons « in-put » et à des niveaux inférieurs dans les cellules exposées au composé 25 ou 26 (Figure 2B).

Ainsi, les composés 25 et 26 ne nuisent pas aux interactions protéiques entre EGFR et Hsp90a. La co-immunoprécipitation de Hsp90a avec EGFR, même à partir d'extraits avec une faible abondance du récepteur, met en évidence la dégradation d'un complexe EGFR/Hsp90a plutôt par endocytose induite par les composés dans les cellules MDA MB468.

Les profils de protéines ont également été évalués dans les cellules dans lesquelles le niveau d'expression de l'EGFR a été réduit par le knockdown avec ARNsi spécifique. Les cellules MDA MB468 transfectées avec du ARNsi spécifique de l'EGFR ont été cultivées dans du milieu DMEM dépourvu de sérum, puis traitées avec les composés. Les cellules ont affiché une remarquable diminution des niveaux de protéines EGFR et Hsp90a lorsqu'elles ont été exposées au composé 26 (et de manière moins visible au composé 25) par rapport au véhicule (Figure 3). L'effet a été plus faible dans les cellules transfectées avec un ARNsi brouillé. Ainsi, la diminution de la quantité de l'EGFR réduit simultanément les quantités du récepteur et du chaperon Hsp90a soulignant de cette façon le rôle de l'EGFR liée aux composés 25 et 26 dans la perte éventuelle des protéines.

Les biomarqueurs autophagiques LC3a/LC36 ont également été évalués dans les cellules transfectées par ARNsi en tenant compte du fait que l'accumulation de LC36 est corrélée à l'augmentation du nombre d'autophagosomes, ce qui provoque une dégradation des protéines privées de nutriments (Kabeya et al. , 2000). Une bande à 16 kDa correspondant à LC36 a été détectée dans des cellules transfectées avec un ARNsi spécifique de l'EGFR ou un ARNsi brouillé comme indication de la dégradation autophagique des protéines pendant la croissance en milieu dépourvu de sérum. Cependant, la quantification du rapport LC36 à une β-actine de contrôle chargée a révélé que le niveau relatif de ce biomarqueur autophagique est plus élevé d'environ 50% après exposition aux composés 26 et 25 par rapport au véhicule. Par conséquent, les composés 26 et 25 permettent d'améliorer la dégradation des protéines favorables à la nutrition dans les cellules cancéreuses.

Deux méthodes différentes ont démontré que les composés 25 et 26 entraînent une diminution du taux d'EGFR qui est associé à la réduction de la quantité de Hsp90a dans les cellules privées de sérum pendant deux heures. Il peut être conclu que les composés selon l'invention, liés à la protéine réceptrice, induisent une endocytose du complexe EGFR/Hsp90a, qui subit une dégradation accrue avec des protéases lysosomales. Par conséquent, cela conduit à la déplétion de Hsp90a et ainsi à la défaillance de la capacité fonctionnelle de la machinerie chaperon à corriger les mauvais repliements dans les protéines clientes, ce qui affecterait la viabilité des cellules cancéreuses. Les composés selon l'invention causent le détachement de cellules cancéreuses conduisant à une anoïkose.

Le sérum de veau fœtal (SVF) fournit un large éventail de facteurs de croissance, incluant les EGF requis pour la croissance des cellules humaines dans un milieu de culture (Brunner et al. , 2010). En l'absence de facteurs de croissance, les cellules saines subissent un détachement de la MEC suivi d 'anoïkose, tandis que les cellules cancéreuses apparaissent tolérantes au détachement pendant la privation de nutriments (Bucheit et al. , 2015). Il a été remarqué que l'incubation de cellules MDA MB468 avec les composés 25 et 26 dans un milieu dépourvu de sérum pendant plus d'une heure entraînait une diminution du niveau de β-actine, utilisé comme contrôle chargé pendant SDS-PAGE. Étant donné que la β-actine est l'une des protéines clés du cytosquelette, il a été supposé que la liaison du composé à l'EGFR affectait l'attachement des cellules à la surface des plaques, imitant la MEC, entraînant la perte de cellules cancéreuses qui sont typiquement les cellules adhérentes.

Pour vérifier cette hypothèse, les cellules MDA MB468 ont été cultivées dans du milieu DMEM dépourvu de sérum pendant 18 h, puis traitées avec les composés 23, 25 et 26 pendant 6 heures. Le milieu de culture sur les cellules attachées à la surface de la plaque a été soigneusement recueilli et transféré dans des tubes Falcon. Les puits ont été lavés délicatement avec du PBS chaud, et les solutions de lavage ont été transférées dans les tubes. Les échantillons collectés ont été centrifugés et le culot contenant les cellules probablement détachées a été traité avec une solution de lyse RIPA. Les cellules attachées à la surface de la plaque ont également été collectées et lysées avec RIPA. Les protéines dans les lysats de cellules attachées et putatives détachées ont été séparées par électrophorèse sur le même gel et analysées par Western Blot.

Cette approche méthodologique a révélé la présence de quantités élevées de protéines de cytosquelette β-actine et α-tubuline, ainsi que Hsp90a, mais seules des traces d'EGFR dans le milieu de culture recueilli sur les cellules attachées, ce qui prouve le détachement de cellules traitées avec les composés 25 et 26 (Figure 4A). Bien que le détachement des cellules soit plus prononcé avec le composé 26 qu'avec le composé 25, les niveaux relatifs de protéines dans les cellules détachées étaient proches pour les deux molécules, ce qui suggère que les protéines se dégradent par les mêmes voies de dégradation (Figure 4B).

Ensuite, la capacité de tous les composés selon l'invention de détacher les cellules cancéreuses à la concentration de 25 μΜ après un traitement de 48 h dans un milieu dépourvu de sérum a été évaluée. Il a été constaté qu'une plus longue incubation avec le véhicule entraîne un détachement cellulaire tel que démontré par la détection de β-actine, α-tubuline et Hsp90a, mais pas d'EGFR (Figure 5A). Une longue incubation des cellules MDA MB468 avec un véhicule ou avec les composés 22 et 23 dans un milieu dépourvu de sérum a entraîné l'accumulation de protéines favorables à la nutrition conduisant à un taux faible de détachement des cellules cancéreuses. Au contraire, des différences importantes ont été observées dans les cellules traitées avec les composés 24, 25 et 26. Les cellules détachées ont affiché un niveau inférieur de 6- actine par rapport au véhicule et n'avaient plus Hsp90a ou d'a-tubuline. De même, les cellules attachées après traitement avec les composés 25 et 26 ont affiché un niveau inférieur de β-actine et des traces d'a-tubuline par rapport au véhicule. De plus, les cellules ne contiennent pas d'EGFR et de Hsp90a. Ainsi, les composés actifs 26, 25 et 24 non seulement ont augmenté la dégradation des protéines dans les cellules cancéreuses privées de nutriments, mais ont probablement altéré une transduction du signal au cytosquelette conduisant à la mort par détachement cellulaire, l'anoïkose. Dans des essais parallèles, les profils de protéines ont été évalués dans les cellules MDA MB468 traitées avec des composés à la concentration de 50 μΜ après une croissance de 48 h dans un milieu DMEM supplémenté avec du SVF. Si aucune différence significative n'a été détectée dans les profils de protéines dans les cellules attachées après traitement avec le véhicule ou les composés 22 et 23, des niveaux faibles de 6- actine et α-tubuline ont été détectés dans des cellules détachées (Figure 5C). Cette observation suggère que, pendant une longue culture, les cellules consomment des facteurs de croissance, incluant l'EGF à partir d'un milieu supplémenté avec SVF et une croissance cellulaire devient sensible dans une certaine mesure à la privation de nutriments conduisant au détachement des cellules. En effet, les trois autres composés actifs 26, 25 et 24 ont montré une forte capacité à dégrader les protéines, comme démontré par les niveaux inférieurs de EGFR et Hsp90a dans les cellules attachées et des quantités plus élevées de protéines de cytosquelette dans des cellules détachées. Comme dans le cas des cellules privées de sérum, l'action du composé 24 était plus visible dans les cellules détachées. Pour estimer l'efficacité du détachement cellulaire induit par les composés selon l'invention, le ratio de β-actine a été utilisé car cette protéine a été détectée dans tous les échantillons. L'efficacité du détachement cellulaire était de près de 4% et de 11% de cellules après exposition des cellules au véhicule et au composé 26 dans le milieu avec SVF, respectivement, et il a augmenté de près de 21% et 29% après exposition au véhicule et au composé 25 dans le milieu privé de sérum, respectivement (Figures 5B et 5D).

Ainsi, les composés selon l'invention 24, 25 et 26 se sont révélées être actifs pour induire une dégradation de l'EGFR et d'autres protéines conduisant à un détachement des cellules cancéreuses privées de nutriments et non privées de nutriments.

Inhibition de l'EGFR réversible et faible

Étant donné que le composé 26 entraîne une dégradation visible à 60 minutes de traitement, la question était de savoir si ce composé pouvait inhiber la phosphorylation de l'EGFR pendant un temps d'exposition plus court. Pour exclure la dégradation de la protéine réceptrice, les cellules MDA MB468 ont été incubées avec 26 ou Gefitinib (comme témoin de référence) pendant 10 et 25 minutes, puis EGFR a été induit dans des cellules avec EGF pendant 5 min. En comparaison de la forte inhibition de la phosphorylation de la tyrosine EGFR avec le Gefitinib approuvé par la FDA aux deux durées de traitement, la diminution de l'intensité de la bande de récepteur avec le composé 26 n'a été détectée qu'à une exposition de 10 min, alors que le récepteur était parfaitement phosphorylé à plus longue exposition (Figure 6). La capacité du composé 26 à empêcher la phosphorylation de la tyrosine induite par EGF a démontré sa capacité d'inhibition dans un très court laps de temps.

Inhibition de la croissance tumorale chez la souris.

Les composés 22 à 26 ont présenté une toxicité modérée à faible dans les cellules MDA MB468, avec une IC50 comme suit : > 120 μΜ pour le composé 22, 116 μΜ pour 23, 114 μΜ pour 24, 31 ,6 μΜ pour 25 et 35,7 μΜ pour 26.

Le niveau d'expression de l'EGFR est élevé dans de nombreux types de cancer épithélial, y compris dans le sarcome de souris S180 (Sun et al., 2011 ). Ainsi, des cellules de sarcome S180 ont été implantées chez des souris pour examiner l'aptitude antitumorale des composés selon l'invention. Les animaux ont été soumis à un traitement avec les composés 22 à 26 à des doses de 150-200 mg/kg pendant 6 jours et l'inhibition de la croissance tumorale a été déterminée sur un groupe de 7-8 animaux pour chaque composé testé après implantation du sarcome 180. Tous les composés ont inhibé la croissance de la tumeur avec une efficacité comme suit : 43,3 % pour le composé 22, 24,4% pour 23, 25,0% pour 24, 39,0% pour 25 et 36,7% pour 26. La différence relative de l'inhibition de tumeur de souris et de l'efficacité de la dégradation entre les composés testés suggère que le métabolisme des composés dans l'organisme animal se déroule différemment de celui dans les cellules cultivées. Néanmoins, ces données sont en concordance avec la dégradation des protéines conduisant à l'anoïkose des cellules cancéreuses à travers une cascade d 'événements induits par les composés ciblant EGFR.

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES

Akiyama T. , Dass C. R., Choong P. F. Bim-targeted cancer therapy: a link between drug action and underlying molecular changes. Mol. Cancer Ther. 8; 3173-3180. doi: 10.1 158/1535-7163. MCT-09-0685 (2009).

Allen L. F. , Eiseman I. A., Fry D. W. , Lenehan P. F. CI-1033, an irréversible pan-erbB receptor inhibitor and its potential application for the treatment of breast cancer. Semin. Oncol. 5 Suppl 16, 65-78 (2003).

Avetyan S. A. , Azaryan A. S, Aroyan A. A. Arm. Chem. J 1973, 26(9), 763-767.

Bae, Y. S. et al. Epidermal growth factor (EGF)-induced génération of hydrogen peroxide. Rôle in EGF receptor-mediated tyrosine phosphorylation. J. Biol. Chem. 272, 217-221 (1997).

Brunner D. , Frank J. , Appl H., Schôffl H. , Pfaller W., Gstraunthaler G. Serum-free cell culture: the serum-free média interactive online database. ALTEX 27, 53-62 (2010). Buchheit C. L. , Angarola B. L. , Steiner A. , Weigel K. J., Schafer Z. T. Anoikis évasion in inflammatory breast cancer cells is mediated by Bim-EL séquestration. Cell Death Differ. 22,1275-86. doi: 10.1038/cdd.2014.209 (2015).

Campbell P. J., Pleasance E. D. , Stephens P. J. , et al. Subclonal phylogenetic structures in cancer revealed by ultra-deep sequencing. Proc Natl Acad Sci U.S. A. 105, 13081 -13086 (2008).

Cheng H., Nair S. K., Murray B. W. Récent progress on third génération covalent EGFR inhibitors. Bioorç. Med. Chem. Lett. 26, 1861 -1868; doi: 10.1016/j.bmcl.2016.02.067 (2016).

Citri A. , Harari D. , Shohat G. , Ramakrishnan P. , Gan J. , Lavi S. , Eisenstein M. , Kimchi A. , Wallach D. , Pietrokovski S., Yarden Y. Hsp90 recognizes a common surface on client kinases. J. Biol. Chem. 1281 (20), 14361 -14369 (2006). Cretu, 0. D., Barbuceanu, S. F., Saramet, G., Draghici, C. Synthesis and characterization of some 1 ,2,4-triazole-3(4h)-thiones obtained from intramolecular cyclization of new 1 -(4-(4-x-phenylsulfonyl)benzoyl)-4-(4-iodophenyl)- thiosemicarbazides. J. Serb. Chem. Soc.75, 1463-1471 (2010).

Echeverria P.C., Bernthaler A., Dupuis P., Mayer B., Picard D. An interaction network predicted from public data as a discovery tool: application to the Hsp90 molecular chaperone machine. PloS One 6(10):e26044 (2011).

Filmus, J., Pollak, M. N., Cailleau, R., Buick, R. N. MDA-468, a human breast cancer cell line with a high number of epidermal growth factor (EGF) receptors, has an amplified EGF receptor gene and is growth inhibited by EGF. Biochem Biophys Res Commun 128, 898-905 (1985).

Frish S. M., and Francis H. Disruption of epithelial cell-matrix interactions induces apoptosis. J. Cell. Biol. 124, 619-626 (1994).

Fung C, Lock R., Gao S., Salas E., Debnath J. Induction of autophagy during extracellular matrix detachment promûtes cell survival. Mol. Biol. Cell 19, 797-806 (2008).

Goh, L.K., Sorkin, A. Endocytosis of receptor tyrosine kinases. Cold Spring Harb Perspect Biol 5, a017459 (2013).

Hao, J-J., Lin DC, Dinh HQ, Mayakonda A, Jiang YY, Chang C, Jiang Y, Lu CC, Shi ZZ, Xu X, Zhang Y, Cai Y, Wang JW, Zhan QM, Wei WQ, Berman BP, Wang MR, Koeffler, H. P. Spatial intratumoral heterogeneity and temporal clonal évolution in esophageal squamous cell carcinoma. Nature Genetics 48, 1500-1507, doi:10.1038/ng.3683 (2016).

Han, W., Pan, H., Chen, Y., Sun, J., Wang, Y., Li, J., Ge, W., Feng, L., Lin, X., Wang, X., et al. EGFR tyrosine kinase inhibitors activate autophagy as a cytoprotective response in human lung cancer cells. PLoS ONE 6, e18691 (2011).

Herbst RS, Fukuoka M and Baselga J: Gefitinib - a novel targeted approach to treating cancer. Nat. Rev. Cancer 4, 956-965 (2004).

Jia, Y., Yun, C. H., Park, E., Ercan, D., Manuia M., Juarez J., Xu C, Rhee K., Chen T., Zhang H., Palakurthi S., Jang J., Lelais G., DiDonato M., Bursulaya B., Michellys P. Y., Epple R., Marsilje T. H., McNeill M., Lu W., Harris J., Bender S., Wong K. K., Janne P. A., Eck M. J. Overcoming EGFR(T790M) and EGFR(C797S) résistance with mutant- sélective allosteric inhibitors. Nature https://www.ncbi. nlm.nih.gov/pubmed/27251290534(7605), 129-32. doi: 10.1038/nature17960 (2016). Kabeya Y., Mizushima N., Ueno T., Yamamoto A., Kirisako T., et al. LC3, a mammalian homologue of yeast Apg8p, is localized in autophagosome membranes after processing. EMBOJ.19, 5720-5728 (2000).

Kawakita Y., Seto M., Ohashi T., Tamura T., Yusa T., Miki H., Iwata H., Kamiguchi H., Tanaka T., Sogabe S., Ohta Y., Ishikawa T. Design and synthesis of novel pyrimido[4,5- b]azepine derivatives as HER2/EGFR dual inhibitors. Bioorg. Med. Chem.21(8), 2250- 2261; doi: 10.1016/j.bmc.2013.02.014 (2013).

Klionsky, D. J., Abdelmohsen, K., Abe, A., Avedin, M. J., Abeliovich, H., Arozena, A. A. et al. Guidelines for the use and interprétation of assays for monitoring autophagy (3rd édition). Autophagy 12(2), 443 (2016).

Li S., Guo C, Sun X., Li Y., Zhao H., Zhan D., Lan M., Tang Y. Synthesis and biological évaluation of quinazoline and quinoline bearing 2,2,6,6- tetramethylpiperidine-N-oxyl as potential epidermal growth factor receptor (EGFR) tyrosine kinase inhibitors and EPR bio-probe agents, fur. J. Med. Chem.49, 271-278. doi: 10.1016/j.ejmech.2012.01.021. (2012).

Mendelsohn, J., and Baselga, J. Epidermal growth factor receptor targeting in cancer. Semin. Oncol.33, 369-385 (2006).

Miyata Y., Nakamoto H., Neckers L. The therapeutic target Hsp90 and cancer hallmarks. Current Pharma.19, 347-365 (2013).

Mndzhoyan A. L., Grigoryan. M. T. In: The synthesis of heterocyclic compounds, Yerevan, 1, 36-38 (1956).

Nisimura, Y., Bereczky, B., Ono, M. The EGFR inhibitor gefitinib suppresses ligand- stimulated endocytosis of EGFR via the early/late endocytic pathway in non-small cell lung cancer cell Unes. Histochem. Cell. Biol. 127(5), 541-553 (2007).

Paulsen, CE., Truong, T., Garcia, F., Homann, A., Gupta, V., Léonard, S. and Carroll, K. Peroxide-dependant sulfenylation of the EGFR catalytic site enhances kinase activity. Nat. Chem. Biol.8, 57-64 (2012).

Pick E., Kluger Y., Giltnane J. M., Moeder C, Camp R. L., Ri m m D. L., Kluger H. M. High HSP90 expression is associated with decreased survival in breast cancer. Cancer Res.67, 2932-2937 (2007).

Sakanyan, V., Hulin, P., de Sousa, R., Silva, V., Hambardsumyan, A., Nedellec, S., Tomasoni, C, Loge, C, Pineau, C, Roussakis, C. et al. Activation of EGFR by small compounds through coupling the génération of hydrogen peroxide to stable dimerization of Cu/Zn SOD1. Sci. Rep.6 (2016). Schlessinger, J. Receptor Tyrosine Kinases: Legacy of the first two décades. Cold Spring Harb Perspect. Biol. 6, a008912 (201 ).

Sigismund S. , Woelk T. , Puri C , Maspero E. , Tacchetti C , Transidico P. , Di Fiore P. P. , Polo S. Clathrin-independent endocytosis of ubiquitinated cargos. Proc Natl Acad Sci 102, 2760-2765 (2005).

Sigismund S, Argenzio E, Tosoni D, Cavallaro E, Polo S, Di Fiore PP. Clathrin-mediated internalization is essential for sustained EGFR signaling but dispensable for dégradation. Dev Cell 15, 209-219, (2008).

Smail JB, Gonzales AJ, Spicer JA, Lee H, Reed J E, Sexton K, Althaus IW, Zhu T, Black SL, Blaser A, Denny WA, Ellis PA, Fakhoury S, Harvey PJ, Hook K, McCarthy FO, Palmer BD, Rivault F, Schlosser K, Ellis T, Thompson AM, Trachet E, Winters RT, Tecle H, Bridges A. Tyrosine Kinase Inhibitors: 20. Optimization of substituted quinazoline and pyrido[3,4-d]pyrimidine derivatives as orally active, irréversible inhibitors of the Epidermal Growth Factor Receptor family. J. Med. Chem. 59(17), 8103-8124. doi: 10.1021 /acs. jmedchem.6b00883, (2016).

Stoscheck C. M. , Carpenter G. Characterization of the metabolic turnover of epidermal growth factor receptor protein in A-431 cells. J. Cell. Physiol. 120, 296-302 (1984). Sun, J. ; Zhao, L. ; Teng, L. ; Lin, F. ; Zhang, H. ; Li, Z. ; Gao, Q. Solid tumor-targeted infiltrating cytotoxic T lymphocytes retained by a superantigen fusion protein. PLoS One 6, e16642 (201 1 ).

Taipale, M. , Jarosz, D. F. , Lindquist, S. HSP90 at the hub of protein homeostasis: emerging mechanistic insights. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 1 1 , 51 5-528 (2010).

Vindelov, L. L. Flow microfluorometric analysis of nuclear DNA in cells from solid tumors and cell suspensions. A new method for rapid isolation and straining of nuclei. Virchows Arch. B Cell. Pathol. 24, 227-242 (1977).

Vlahakis A. , Debnath J. The interconnections between autophagy and integrin- mediated cell adhésion. J. Mol. Biol. 429, 51 5-530 (2017).

Wang, M. , Shen, A. , Zhang, C , Song, Z. , Ai, J. , Liu, H. , Sun, L. , Ding, J. , Geng, M. , Zhang, A. Development of Heat Shock Protein (Hsp90) inhibitors to combat résistance to tyrosine kinase inhibitors through Hsp90-kinase interactions. J. Med. Chem. 59, 5563-5586. doi: 10.1021 /acs.jmedchem.5b01 106 (2016).