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Title:
5-AMINOLEVULINIC ACID HIGH-YIELD BACTERIAL STRAIN, PREPARATION METHOD AND USE THEREOF
Document Type and Number:
WIPO Patent Application WO/2014/121724
Kind Code:
A1
Abstract:
A method for constructing an ALA production bacterial strain, the method enhances the activity of related enzymes promoting the synthesis of oxaloacetate and in the 5-aminolevulinic acid (ALA) production bacterial strain, or introducing exogenous related enzymes promoting the synthesis of oxaloacetate, such as phosphoenolpyruvate carboxylase or pyruvate carboxylase, and/or reducing the activity of related enzymes in the downstream metabolic pathway of succinyl coenzyme A in the bacterial strain, such as succinyl coenzyme A synthetase or succinate dehydrogenase, and/or reducing the activity of phosphoenolpyruvate carboxylated kinase and/or malic enzyme. An ALA high-yield bacterial strain constructed by utilizing the method, and method for utilizing the bacterial strain to prepare ALA.

Inventors:
ZHENG PING (CN)
CHEN JIUZHOU (CN)
PU WEI (CN)
SUN JIBIN (CN)
WU XINYANG (CN)
MA YANHE (CN)
Application Number:
PCT/CN2014/071712
Publication Date:
August 14, 2014
Filing Date:
January 28, 2014
Export Citation:
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Assignee:
TIANJIN INST IND BIOTECHNOLOGY CAS (CN)
International Classes:
C12P7/50; C12N1/21; C12P13/00; C12R1/00; C12R1/19
Domestic Patent References:
WO2012177943A12012-12-27
Foreign References:
CN101278041A2008-10-01
CN102206606A2011-10-05
CN101063104A2007-10-31
JP2012518999A2012-08-23
Other References:
PU, WEI ET AL.: "Deficiency of succinic dehydrogenase or succinyl-CoA synthetase enhances the production of 5-aminolevulinic acid in recombinant Escherichia coli", CHINESE JOURNAL OF BIOTECHNOLOGY, vol. 29, no. 10, 25 October 2013 (2013-10-25), pages 1494 - 1503
FU, WEIQI;: "Study on optimization and fermentation process regulation in the production of 5-Aminolevulinate recombinant strains", CHINA DOCTORAL DISSERTATIONS FULL-TEXT DATABASE, 30 April 2010 (2010-04-30)
GARCIA, S.C. ET AL.: "The Role of ALA-S and ALA-D in Regulating Porphyrin Biosynthesis in a Normal and a HEM R+ Mutant Strain of Saccharomyces cerevisiae", YEAST, vol. 9, 31 December 1993 (1993-12-31), pages 165 - 173
Attorney, Agent or Firm:
XU & PARTNERS, LLC. (CN)
上海一平知识产权代理有限公司 (CN)
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Claims:
权 利 要 求

I . 5-氨基乙酰丙酸生产菌株的构建方法, 其特征在于, 所述方法包括: 增强所述 5-氨基乙酰丙酸生产菌株中促进草酰乙酸合成的相关酶的活性或导 入外源性的促进草酰乙酸合成的相关酶, 和 /或

减弱所述 5-氨基乙酰丙酸生产菌株中琥珀酰辅酶 A下游代谢途径相关酶的活 性。

2. 如权利要求 1所述的构建方法, 其特征在于, 所述促进草酰乙酸合成的相 关酶是磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶或丙酮酸羧化酶, 所述琥珀酰辅酶 A下游代谢途 径相关酶是琥珀酰辅酶 A合成酶或琥珀酸脱氢酶。

3. 如权利要求 1 所述的构建方法, 其特征在于, 所述方法还包括增强所述 5-氨基乙酰丙酸生产菌株中的 5-氨基乙酰丙酸合成途径或引入外源 5-氨基乙酰丙 酸合成途径。

4. 如权利要求 1或 3所述的构建方法, 其特征在于, 所述方法还包括减弱磷 酸烯醇式丙酮酸羧化激酶和 /或苹果酸酶的活性。

5. 5-氨基乙酰丙酸生产菌株的构建方法, 其特征在于, 所述方法包括: 减弱所述 5-氨基乙酰丙酸生产菌株中的磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶和 /或苹 果酸酶的活性; 和

增强所述 5-氨基乙酰丙酸生产菌株中的 5-氨基乙酰丙酸合成途径或引入外源 5-氨基乙酰丙酸合成途径。

6. 一种 5-氨基乙酰丙酸生产菌株, 其特征在于, 所述菌株中促进草酰乙酸合 成的相关酶的活性增强或包含外源性的促进草酰乙酸合成的相关酶, 和 /或

所述琥珀酰辅酶 A下游代谢途径相关酶的活性减弱。

7. 如权利要求 6所述的菌株, 其特征在于, 所述促进草酰乙酸合成的相关酶 是磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶或丙酮酸羧化酶, 所述琥珀酰辅酶 A下游代谢途径相 关酶是琥珀酰辅酶 A合成酶或琥珀酸脱氢酶。

8. 如权利要求 7所述的菌株, 其特征在于, 所述菌株中 5-氨基乙酰丙酸合成 途径增强或含有外源 5-氨基乙酰丙酸合成途径。

9. 如权利要求 6-8中任一项所述的菌株, 其特征在于, 所述菌株选自大肠杆 ¾ (Escherichia coif)、 # f ¾ (Corynebacterium glutamicum)、 球形红细菌

(Rhodobacter sphaeroides)、 沼 j|¾ -^- ffi ¾ Rhodopseudomonas palustris)等。

10. 如权利要求 6-8 中任一项所述的菌株, 其特征在于, 所述菌株中磷酸烯 醇式丙酮酸羧化激酶和 /或苹果酸酶的活性减弱。

I I . 一种 5-氨基乙酰丙酸生产菌株, 其特征在于, 所述菌株中磷酸烯醇式丙 酮酸羧化激酶和 /或苹果酸酶的活性减弱;和所述菌株中 5-氨基乙酰丙酸合成途径 增强或含有外源 5-氨基乙酰丙酸合成途径。

12. —种产生 5-氨基乙酰丙酸的大肠杆菌菌株, 所述菌株选自下组: 以 CGMCC No.6588 为保藏号保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中 心的菌株或以 CGMCC No.6589为保藏号保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会 普通微生物中心的菌株。

13. 一种产生 5-氨基乙酰丙酸的方法, 其特征在于, 所述方法包括:

1) 培养权利要求 6-12中任一项所述的菌株, 从而得到 5-氨基乙酰丙酸; 和

2) 从 1)的发酵培养体系中获得 5-氨基乙酰丙酸。

14. 权利要求 6-12中任一项所述菌株的用途, 其特征在于, 所述菌株用于产 生 5-氨基乙酰丙酸和 /或产生以 5-氨基乙酰丙酸为前体的下游产物。

Description:
5-氨基乙酰丙酸高产菌株及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及基因工程和微生物发酵技术领域。 具体地说, 本发明涉及 5-氨基乙 酰丙酸的高产菌株及其制备方法和应用。 背景技术

5-氨基乙酰丙酸 (5-aminolevulinic acid, ALA)是生物体合成血红素、 叶绿素、 维生素 B12等四吡咯化合物的前体, 四吡咯化合物则是细胞色素、 血红蛋白、 叶 绿体蛋白等的重要组成部分, 在生命活动中发挥着重要作用。 因具有可降解和无 毒无残留等特点, ALA在医药、 农业、 畜牧业、 日用化学品等领域应用前景广阔, 是一种重要的高附加值生物基化学品。 ALA作为新一代光动力学药物可用于癌症 治疗、肿瘤诊断和皮肤病的治疗等;作为植物 生长调节剂 ALA可以大幅促进花卉、 作物和蔬菜的生长, 提高作物、 果品、 蔬菜的品质; 作为动物饲料添加剂 ALA可 以增强动物的新陈代谢和免疫力。 近年来, ALA还作为主要添加成分用于化妆品 以及保健食品的开发, 相关产品已上市销售。

然而, 目前 ALA主要通过化学合成方法制备, 存在反应步骤多、 转化率低、 生产成本高、 能耗物耗高、 制备过程中使用有毒原料、 环境污染严重和价格居高 不下等缺点。 目前中国市场上, ALA盐酸盐的出厂价格大约为 1.7-1.9万元 /公斤, 而试剂级售价高达 2000元 /克。 制造成本居高不下, 已经成为限制 ALA推广应用 的瓶颈因素。

随着社会和科学技术的发展, 以高效清洁的生物发酵法代替化学合成法生产 ALA成为人们研究的重点。 目前利用微生物生产 ALA的方法主要有两类: 一是 对光合细菌进行诱变育种, 选育高产 ALA的突变株并在特定培养基上培养, 积累 较高浓度的 ALA, 但该方法发酵周期较长, 条件控制复杂, 底物和抑制剂的添加 也增加了生产成本。 二是利用代谢工程技术改造微生物的代谢途径 , 通过强化 ALA的合成实现 ALA的过量积累。 微生物合成 ALA的途径主要有两条, 一条是 在 ALA合成酶的作用下以琥珀酰 CoA和甘氨酸为前体合成 ALA, 称为 C4途径, 另一条是以谷氨酰 tRNA为前体通过两步反应合成 ALA,称为 C5途径。 Xie等 (Xie L, Hall D, Eiteman MA, Altman E, Appl Microbiol Biotechnol, 2003, 63(3): 267-273) 利用表达球形红细菌 ALA合成酶的野生型大肠杆菌 MG1655 ,经过发酵条件优化, ALA的产量达到 5.2 g/L。 林建平等 (CN200710068168.6, CN201210013562.0)将球 形红细菌的 ALA合成酶基因在大肠杆菌 Rosetta 2 (DE3)中表达, 经过发酵工艺优 化后 ALA产量达到 6.6 g/L, 进一步优化后在 15 L发酵罐中产量达到了 9.4 g/L, 为目前文献报道的最高产量。 以上研究都选用了比较简单的四碳途径, 主要是通 过在大肠杆菌中表达外源 ALA合成酶, 并在丰富的 LB培养基中添加底物琥珀酸 和甘氨酸以及下游代谢途径的抑制剂实现。虽 然上述方法的 ALA产量已经达到较 高的水平, 但 LB 培养基的使用以及底物和抑制剂的添加不但造 成发酵工艺控制 复杂, 而且导致生产成本增加, 限制了大规模工业化应用。 Shin等 (Shin JA, Kwon YD, Kwon OH, Lee HS, Kim P, J Microbiol Biotechnol, 2007, 17(9): 1579-1584)在表 达类球红细菌 ALA合成酶的大肠杆菌中共表达大肠杆菌自身的 NADP依赖型的 苹果酸酶,其在厌氧条件下,在不添加琥珀酸 的丰富培养基中可以提高 ALA产量, 但就 ALA 的提高程度而言, 其总体产量依然很低, 并不能达到生产要求。 Kang 等 (Kang Z, Wang Y, Gu P, Wang Q, Qi Q, Metab Eng, 2011, 13(5): 492-498)在大肠 杆菌中利用优化改造的 C5途径及 ALA运输蛋白的表达, 5 L发酵罐上 ALA的产 量达到 4.13 g/L,并实现了利用以葡萄糖为主要碳源的合成 培养基发酵生产 ALA, 但发酵周期较长, 且葡萄糖转化率比较低, 只有 0.168 g/g (摩尔比约为 0.23 ) 。 虽然上述研究对 ALA合成底物的胞内供应进行了部分尝试, 但总体效果不好, 因 此, 目前为止对于 ALA合成的底物供应普遍采用的还是直接外源添 加的方式, 尤 其是现在 ALA合成中最常用的 C4合成途径, 尚未见到有利用 C4途径的重组工 程菌在以廉价的葡萄糖为主要碳源的培养基中 发酵生产 ALA的报道。

综上所述, 本领域急需开发高效、 低成本、 低污染的 ALA制备方法。 发明内容

本发明的目的在于提供一种构建高水平的 5-氨基乙酰丙酸生产菌株的方法以 及相应获得的菌株。 在第一方面, 本发明提供 5-氨基乙酰丙酸生产菌株的构建方法, 所述方法: 增强所述 5-氨基乙酰丙酸生产菌株中促进草酰乙酸合成 相关酶的活性或导 入外源性的促进草酰乙酸合成的相关酶, 和 /或

减弱所述 5-氨基乙酰丙酸生产菌株中琥珀酰辅酶 A下游代谢途径相关酶的活 性。

在具体的实施方式中, 所述促进草酰乙酸合成的相关酶是磷酸烯醇式 丙酮酸 羧化酶或丙酮酸羧化酶, 所述琥珀酰辅酶 A下游代谢途径相关酶是琥珀酰辅酶 A 合成酶或琥珀酸脱氢酶。

在优选的实施方式中, 所述增强 5-氨基乙酰丙酸生产菌株中促进草酰乙酸合 成的相关酶的活性可通过以下方法之一或组合 实现: 增强磷酸烯醇式丙酮酸羧化 酶的活性, 和 /或增强丙酮酸羧化酶的活性。

在另一优选的实施方式中, 所述增强磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶或丙酮酸羧 化 酶的活性, 可通过以下方法之一或组合实现: 表达同源或异源磷酸烯醇式丙酮酸 羧化酶或丙酮酸羧化酶的编码基因, 和 /或增加所述菌株中所述编码基因的拷贝 数,和 /或改造所述编码基因的启动子以增强转录启 速度, 和 /或修改携带有所述 编码基因的信使 RNA的翻译调控区以增强翻译强度。

在优选的实施方式中, 所述减弱包括将所述琥珀酰辅酶 A下游代谢途径相关 酶缺失。

在另一优选的实施方式中, 所述琥珀酰辅酶 A下游代谢途径相关酶是琥珀酰 辅酶 A合成酶或琥珀酸脱氢酶。

在优选的实施方式中, 所述减弱所述 5-氨基乙酰丙酸生产菌株中琥珀酰辅酶 A下游代谢途径相关酶可通过以下方法之一或 合实现: 部分或全部敲除琥珀酰 辅酶 A合成酶或琥珀酸脱氢酶的编码基因、 基因突变失活、 基因启动子或翻译调 控区改变令其转录或翻译弱化、改变基因序列 使其 mRNA稳定性减弱或酶结构不 稳定等。

在另一优选的实施方式中, 所述方法还包括增强所述 5-氨基乙酰丙酸生产菌 株中的 5-氨基乙酰丙酸合成途径或导入外源性 5-氨基乙酰丙酸合成途径。

在优选的实施方式中, 增强所述 5-氨基乙酰丙酸生产菌株中的 5-氨基乙酰丙 酸合成途径是指增强所述 5-氨基乙酰丙酸生产菌株中 5-氨基乙酰丙酸合成酶的活 性或导入外源性 5-氨基乙酰丙酸合成酶。

在另一具体的实施方式中, 所述方法包括在所述 5-氨基乙酰丙酸生产菌株中 增强 5-氨基乙酰丙酸合成酶的活性或导入外源性 5-氨基乙酰丙酸合成酶、 增强磷 酸烯醇式丙酮酸羧化酶的活性并敲除琥珀酰脱 氢酶。

在另一优选的实施方式中, 所述方法还包括测定所得菌株的 5-氨基乙酰丙酸 产量。

在另一优选的实施方式中, 所述方法获得的 5-氨基乙酰丙酸生产菌株可以无 需添加外源琥珀酸而高水平地产生 5-氨基乙酰丙酸。

在另一优选的实施方式中, 所述方法获得的 5-氨基乙酰丙酸生产菌株可以在 好氧条件下, 无需添加外源琥珀酸而高水平地产生 5-氨基乙酰丙酸。

在另一具体的实施方式中, 所述菌株本身具有 5-氨基乙酰丙酸合成能力。 在另一具体的实施方式中, 本发明的方法还包括减弱磷酸烯醇式丙酮酸羧 化 激酶和 /或苹果酸酶的活性。

在优选的实施方式中,所述减弱磷酸烯醇式丙 酮酸羧化激酶和 /或苹果酸酶的 活性通过敲除磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶和 /或苹果酸酶的基因得以实现。

在另一方面, 本发明提供了一种 5-氨基乙酰丙酸生产菌株的构建方法, 所述 方法包括:减弱所述 5-氨基乙酰丙酸生产菌株中的磷酸烯醇式丙酮 羧化激酶和 / 或苹果酸酶的活性; 并且增强所述 5-氨基乙酰丙酸生产菌株中的 5-氨基乙酰丙酸 合成途径或引入外源 5-氨基乙酰丙酸合成途径。 在第二方面, 本发明提供一种 5-氨基乙酰丙酸生产菌株, 所述菌株中促进草 酰乙酸合成的相关酶的活性增强或包含外源性 的促进草酰乙酸合成的相关酶, 和 / 或

所述琥珀酰辅酶 A下游代谢途径相关酶的活性减弱。

在具体的实施方式中, 所述促进草酰乙酸合成的相关酶是磷酸烯醇式 丙酮酸 羧化酶或丙酮酸羧化酶, 所述琥珀酰辅酶 A下游代谢途径相关酶是琥珀酰辅酶 A 合成酶或琥珀酸脱氢酶。

在另一具体的实施方式中,所述菌株中 5-氨基乙酰丙酸合成途径也得到增强。 在优选的实施方式中, 所述菌株的 5-氨基乙酰丙酸合成酶活性增强或包含外源性 的 5-氨基乙酰丙酸合成酶。

在另一具体的实施方式中, 所述菌株中 5-氨基乙酰丙酸合成酶的活性增强或 包含外源性 5-氨基乙酰丙酸合成酶、 磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性增强或包含外 源性的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶并敲除琥珀酸 脱氢酶。

在另一具体的实施方式中, 所述菌株选自大肠杆菌 (Escherichia coli), 谷氨 酸棒杆菌 {Corynebacterium glutamicum)^ 球形红细菌 (Rhodobacter sphaeroides)、 沼泽红叚单胞菌 (Rhodopseudomonas palustris、等。

在另一具体的实施方式中,所述菌株中磷酸烯 醇式丙酮酸羧化激酶和 /或苹果 酸酶的活性减弱。

在优选的实施方式中,所述菌株中磷酸烯醇式 丙酮酸羧化激酶和 /或苹果酸酶 的基因敲除。

在另一方面, 本发明提供一种 5-氨基乙酰丙酸生产菌株, 所述菌株中磷酸烯 醇式丙酮酸羧化激酶和 /或苹果酸酶的活性减弱; 并且所述菌株中 5-氨基乙酰丙酸 合成途径增强或含有外源 5-氨基乙酰丙酸合成途径。 在第三方面, 本发明提供一种产生 5-氨基乙酰丙酸的大肠埃希氏菌 {Escherichia coli) , 所述菌株选自下组: 以 CGMCC No.6588为保藏号保藏于中国 微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的 菌株或以 CGMCC No.6589为保藏 号保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通 微生物中心的菌株。

在具体的实施方式中, 所述菌株无需外源性添加琥珀酸即可产生 5-氨基乙酰 丙酸。

在另一优选的实施方式中, 所述菌株产生 5-氨基乙酰丙酸的产量高于 7 g/L o 在另一优选的实施方式中, 所述菌株产生 5-氨基乙酰丙酸的葡萄糖转化率高 于 0.35 (摩尔比), 优选高于 0.45 (摩尔比), 最优选高于 0.5 (摩尔比)。

在另一优选的实施方式中, 所述 5-氨基乙酰丙酸生产菌株无需添加外源琥珀 酸而高水平地产生 5-氨基乙酰丙酸。

在另一优选的实施方式中, 所述 5-氨基乙酰丙酸生产菌株在好氧条件下, 无 需添加外源琥珀酸而高水平地产生 5-氨基乙酰丙酸。 在第四方面, 本发明提供一种产生 5-氨基乙酰丙酸的方法, 所述方法包括:

1) 培养本发明第二或第三方面所述的菌株, 从而得到 5-氨基乙酰丙酸; 和

2) 从 1)的发酵培养体系中获得 5-氨基乙酰丙酸。

在优选的实施方式中, 所述方法获得的 5-氨基乙酰丙酸的产量高于 7 g/L。 在另一优选的实施方式中, 所述方法可以在不额外添加琥珀酸的情况下也 能 实现 5-氨基乙酰丙酸的高产。 在第五方面,本发明还提供一种产生 5-氨基乙酰丙酸的方法,所述方法包括:

1) 在含有琥珀酰辅酶 A下游代谢途径相关酶抑制剂的培养基中培养 5-氨基 乙酰丙酸的生产菌株, 从而得到 5-氨基乙酰丙酸; 和

2) 从 1)的培养体系中获得 5-氨基乙酰丙酸。

在优选的实施方式中, 所述琥珀酰辅酶 A下游代谢途径相关酶是琥珀酰辅酶 A合成酶或琥珀酸脱氢酶。 在第六方面, 本发明提供本发明第二或第三方面所述菌株的 用途, 所述菌株 用于产生 5-氨基乙酰丙酸和 /或产生以 5-氨基乙酰丙酸为前体下游产物。

在优选的实施方式中, 所述下游产物是以 ALA 为前体的血红素或维生素

B 12。 应理解, 在本发明范围内中, 本发明的上述各技术特征和在下文 (如实施例) 中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合 ,从而构成新的或优选的技术方案。 限于篇幅, 在此不再一一赘述。 附图说明

图 1显示了提高 ALA产量的本发明技术方案的示意图。

图 2显示了本发明所用表达载体的遗传图谱。

图 3显示了提高 ALA产量的本发明进一步的技术方案的示意图。

图 4显示了 pZWAl和 pZWA2重组载体的构建示意图。 具体实施方式

发明人经过广泛而深入的研究, 出乎意料地发现增强 5-氨基乙酰丙酸生产菌 株中促进草酰乙酸合成的相关酶的活性可以极 大提高所述生产菌株的 5-氨基乙酰 丙酸的产量; 发明人还发现减弱所述生产菌株中琥珀酰辅酶 A下游代谢途径相关 酶也能够提高所得生产菌株的 5-氨基乙酰丙酸的产量; 进一步地, 发明人发现减 弱磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶和苹果酸酶的活 性能够显著提高 5-氨基乙酰丙酸的 产量; 而将上述手段中的任意两种或三种结合起来能 够进一步提高所得生产菌株 的 5-氨基乙酰丙酸的产量。 在此基础上完成了本发明。 术语定义

本文所用的术语 "外源性" 是指某体系中包含了原来不存在的物质。 例如, 通过转化等方式在某菌株中引入该菌株中原本 不存在的酶的编码基因, 从而在该 菌株中表达该酶, 则该酶对于该菌株是 "外源性" 的。

本文所用的术语 "增强" 是指增加、 提高、 增大或升高某种蛋白, 例如酶的 活性。鉴于本发明的教导和现有技术,本领域 技术人员也不难理解本文所用的"增 强" 还应包括通过表达酶的异源编码基因而增强其 活性。 在具体的实施方式中, 增强酶的活性可以通过表达酶的内源或异源性 编码基因, 和 /或增加所述编码基因 的拷贝数,和 /或改造所述编码基因的启动子以增强转录启 速度,和 /或修改携带 有所述编码基因的信使 RNA的翻译调控区以增强翻译强度, 和 /或修改编码基因 本身以增强 mRNA稳定性、蛋白质稳定性、解除蛋白质的反 抑制等方法来实现。

类似地, 本文所用的术语 "减弱" 是指降低、 削弱、 减小或完全消除某种蛋 白, 例如酶的活性。 在具体的实施方式中, 减弱酶的活性可以通过部分或全部敲 除酶的编码基因、 基因突变失活或部分失活、 基因启动子或翻译调控区改变令其 转录或翻译弱化、改变基因序列使其 mRNA稳定性减弱或酶结构不稳定等方法或 其组合来实现。

本文所用的术语 "促进草酰乙酸合成的相关酶" 是指与草酰乙酸的合成相关, 但对于草酰乙酸的合成量起到促进、 提高、 增加等正面作用的酶。 在具体的实施 方式中, 本发明中促进草酰乙酸合成的相关酶包括但不 限于: 磷酸烯醇式丙酮酸羧 化酶 C 或丙酮酸羧化酶^ C 。 此外, 鉴于本发明的教导和现有技术, 本领域普通 技术人员不难理解, 本发明可利用各种来源的促进草酰乙酸合成的 相关酶, 只要所 述酶能在菌株中促进、 提高或增加草酰乙酸的合成量。 在具体的实施方式中, 本 发明所用的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶是大肠杆 菌来源的, 而丙酮酸羧化酶是根瘤 菌来源的。

本文所用的术语 "琥珀酰辅酶 A下游代谢途径相关酶"是指利用琥珀酰辅酶 A作为底物合成其它物质, 从而消耗琥珀酰辅酶 A的酶。 在具体的实施方式中, 所述琥珀酰辅酶 A下游代谢途径相关酶包括但不限于:琥珀酰 酶 A合成酶或琥 珀酸脱氢酶。

本文所用的术语" 5-氨基乙酰丙酸合成途径"是指微生物中产生 5-氨基乙酰丙酸 的具体途径, 其中包括各种酶, 例如 5-氨基乙酰丙酸合成酶、 谷氨酰 -tRNA合成酶、 谷氨酰 -tRNA还原酶或谷氨酸 -1-半醛氨基转移酶,等等。类似地,本文所用 的术语" 5- 氨基乙酰丙酸合成途径增强"是指涉及 5-氨基乙酰丙酸合成途径的相关酶, 例如 5- 氨基乙酰丙酸合成酶、谷氨酰 -tRNA合成酶、谷氨酰 -tRNA还原酶或谷氨酸 -1-半醛氨 基转移酶的活性增强。 在优选的实施方式中, 所述酶是来源于沼泽红假单胞菌的 5- 氨基乙酰丙酸合成酶。 本发明的 5-氨基乙酰丙酸生产菌株

本发明提供了一种 5-氨基乙酰丙酸生产菌株, 所述菌株中促进草酰乙酸合成的 相关酶的活性增强或包含外源性的促进草酰乙 酸合成的相关酶, 和 /或所述琥珀酰辅 酶 A下游代谢途径相关酶的活性减弱。 在优选的实施方式中, 所述促进草酰乙酸合 成的相关酶包括但不限于: 磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶或丙酮酸羧化酶; 所述琥珀酰 辅酶 A下游代谢途径相关酶包括但不限于:琥珀酰 酶 A合成酶或琥珀酸脱氢酶。

在其它实施方式中, 所述菌株中 5-氨基乙酰丙酸合成途径也得到增强或含有外 源 5-氨基乙酰丙酸合成途径。 因此, 在具体的实施方式中, 本发明菌株中 5-氨基乙酰 丙酸合成途径增强或含有外源 5-氨基乙酰丙酸合成途径、促进草酰乙酸合成 相关酶 的活性增强或包含外源性的促进草酰乙酸合成 的相关酶,和 /或所述琥珀酰辅酶 A下 游代谢途径相关酶的活性减弱。 在优选的实施方式中, 本发明菌株中 5-氨基乙酰 丙酸合成酶的活性增强或包含外源性 5-氨基乙酰丙酸合成酶、 磷酸烯醇式丙酮酸羧 化酶活性增强或包含外源性的丙酮酸羧化酶并 敲除琥珀酸脱氢酶。

在另一具体的实施方式中, 本发明的菌株中磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶和 / 或苹果酸酶的活性减弱。

在优选的实施方式中,本发明的菌株中磷酸烯 醇式丙酮酸羧化激酶和 /或苹果 酸酶的基因敲除。 本领域技术人员知道许多菌株可以用于产生 5-氨基乙酰丙酸。 这些菌株虽然 不同, 但它们合成 5-氨基乙酰丙酸的合成体系、 途径却是类似的。 因此, 本领域 普通技术人员鉴于本发明的教导和现有技术可 以明白, 本发明的菌株可以是任何 可用于产生 5-氨基乙酰丙酸的菌株, 包括但不限于: 大肠杆菌 C¾ C /z e n' C /»'a c 0 / )、 谷氨酸棒杆菌 (Cory neb acterium glutamicum)、 球形红细菌 (Rhodobacter sphaeroides)^ ¾ j|¾ -^- ffi ¾ {Rhodopseudomonas palustris、等。

在具体的实施方式中, 本发明提供以 CGMCC No.6588为保藏号保藏于中国 微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的 大肠埃希氏菌 C&c/zen'c/z coli)。 在 另一具体的实施方式中, 本发明提供以 CGMCC No.6589为保藏号保藏于中国微 生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的大 肠埃希氏菌 C&c/zen'c/z^ co/ )。

本发明菌株无需外源性添加前体琥珀酸即可产 生 5-氨基乙酰丙酸, 5-氨基乙 酰丙酸的产量高于 7 g/L。 此外, 利用本发明的菌株产生 5-氨基乙酰丙酸, 葡萄糖转 化率高于 0.35 (摩尔比), 优选高于 0.45 (摩尔比), 最优选高于 0.5 (摩尔比)。 在优选 的实施方式中, 本发明的菌株可以高水平地生产 5-氨基乙酰丙酸。在另一优选的实施 方式中, 本发明的菌株可以在好氧条件下高水平地生产 5-氨基乙酰丙酸, 从而无需对 现有技术水平的发酵罐等设备进行改造, 便于在工业化水平放大。 因此, 本发明的菌株可以更低的成本、 方便地制备 5-氨基乙酰丙酸。

本领域技术人员还应明白, 本发明的菌株不仅可用于产生 5-氨基乙酰丙酸, 还 能产生以 5-氨基乙酰丙酸为前体的各种下游产物。 在具体的实施方式中, 所述下游 产物是以 ALA为前体的血红素或维生素 B 12。 本发明还提供一种 5-氨基乙酰丙酸生产菌株的构建方法, 所述方法包括: 增强 所述 5-氨基乙酰丙酸生产菌株中促进草酰乙酸合成 相关酶的活性或导入外源性的 促进草酰乙酸合成的相关酶, 和 /或减弱所述 5-氨基乙酰丙酸生产菌株中琥珀酰辅酶 A 下游代谢途径相关酶。 在优选的实施方式中, 所述促进草酰乙酸合成的相关酶是 磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶或丙酮酸羧化酶, 所述琥珀酰辅酶 A下游代谢途径相关 酶是琥珀酰辅酶 A合成酶或琥珀酸脱氢酶。

在优选的实施方式中, 所述增强 5-氨基乙酰丙酸生产菌株中促进草酰乙酸合成 的相关酶的活性可通过以下方法之一或组合实 现: 增强磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 的活性, 和 /或增强丙酮酸羧化酶的活性。

在进一步优选的实施方式中, 所述增强磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶或丙酮酸羧 化酶的活性, 可通过以下方法之一或组合实现: 表达异源磷酸烯醇式丙酮酸羧化 酶或丙酮酸羧化酶的编码基因, 和 /或增加所述菌株中所述编码基因的拷贝数, 和 /或改造所述编码基因的启动子以增强转录启 速度,和 /或修改携带有所述编码基 因的信使 RNA的翻译调控区以增强翻译强度。

在另一优选的实施方式中,所述减弱包括将所 述琥珀酰辅酶 A下游代谢途径相 关酶缺失。 在进一步优选的实施方式中, 所述琥珀酰辅酶 A下游代谢途径相关酶 是琥珀酰辅酶 A合成酶或琥珀酸脱氢酶。

在优选的实施方式中,所述减弱所述 5-氨基乙酰丙酸生产菌株中琥珀酰辅酶 A 下游代谢途径相关酶可通过以下方法之一或组 合实现: 部分或全部敲除琥珀酰辅 酶 A合成酶或琥珀酸脱氢酶的编码基因、 基因突变失活或部分失活、 基因启动子 或翻译调控区改变令其转录或翻译弱化、改变 基因序列使其 mRNA稳定性减弱或 酶结构不稳定等方法。

在另一优选的实施方式中, 所述方法还包括增强所述 5-氨基乙酰丙酸生产菌株 中 5-氨基乙酰丙酸合成途径或引入外源 5-氨基乙酰丙酸合成途径。因此,在具体的实 施方式中, 所述方法包括: 增强所述 5-氨基乙酰丙酸生产菌株中 5-氨基乙酰丙酸合 成途径或引入外源 5-氨基乙酰丙酸合成途径、增强促进草酰乙酸 成的相关酶的活性 或包含外源性的促进草酰乙酸合成的相关酶, 和 /或减弱所述琥珀酰辅酶 A下游代谢 途径相关酶的活性。 在优选的实施方式中, 所述方法包括: 增强所述 5-氨基乙酰 丙酸生产菌株中 5-氨基乙酰丙酸合成酶的活性或导入外源性 5-氨基乙酰丙酸合成酶、 增强磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶并敲除琥珀酰脱 氢酶。

在另一具体的实施方式中, 本发明的方法还包括减弱 5-氨基乙酰丙酸生产菌 株中磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶和 /或苹果酸酶的活性。

在优选的实施方式中,所述减弱磷酸烯醇式丙 酮酸羧化激酶和 /或苹果酸酶的 活性通过敲除磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶和 /或苹果酸酶的基因得以实现。

在进一步的优选实施方式中, 所述方法还包括测定所得菌株的 5-氨基乙酰丙 酸产量。

在另一优选实施方式中, 所述方法获得的 5-氨基乙酰丙酸生产菌株可以在好氧 条件下, 无需添加外源琥珀酸而高水平地产生 5-氨基乙酰丙酸。

鉴于本发明的教导和现有技术,本领域技术人 员还应明白本发明是通过增强起始 菌株中促进草酰乙酸合成的相关酶的活性或导 入外源性的促进草酰乙酸合成的相关 酶, 和 /或减弱起始该菌株中琥珀酰辅酶 A下游代谢途径相关酶的活性, 和 /或减弱 磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶和 /或苹果酸酶的活性来提高所述菌株产生 5-氨基乙 酰丙酸的能力。 因此, 只要通过以上手段或它们中任意二者或三者的 组合来构建或 改造菌株,进而提高 5-氨基乙酰丙酸产量的方法或由此得到的菌株 应落在本发明的 保护范围内, 本发明的保护范围并不限于实施例中采用的具 体方法和得到的菌株。 在本发明方法以及获得的菌株的基础上, 本发明进一步提供了产生 5-氨基乙 酰丙酸的方法, 所述方法包括: 1) 培养本发明的菌株, 从而得到 5-氨基乙酰丙酸; 和 2) 从 1)的发酵培养体系中获得 5-氨基乙酰丙酸。 在优选的实施方式中, 所述方法 获得的 5-氨基乙酰丙酸的产量高于 7 g/L。 在另一优选的实施方式中, 所述方法不额 外添加琥珀酸和 /或仅仅利用葡萄糖作为碳源。

鉴于本发明的提示和教导, 本领域普通技术人员还可知道, 在 5-氨基乙酰丙 酸的生产菌株的培养体系中添加琥珀酰辅酶 A下游代谢途径相关酶抑制剂也可以 提高 5-氨基乙酰丙酸的产量。 在具体的实施方式中, 所述琥珀酰辅酶 A下游代谢 途径相关酶是琥珀酰辅酶 A合成酶或琥珀酸脱氢酶。 本发明的优点:

1. 本发明的菌株提高糖的转化率, 增加了 ALA合成必需底物之一琥珀酰辅 酶 A的合成, 从而提高了 ALA的产量;

2. 利用本发明菌株制备 ALA无需外源性添加前体琥珀酸, 使得生产过程摆 脱了对底物琥珀酸添加的依赖和昂贵培养基, 例如 LB 的使用, 大大降低了生产 成本。 下面结合具体实施例, 进一步阐述本发明。 应理解, 这些实施例仅用于说明 本发明而不用于限制本发明的范围。 下列实施例中未注明具体条件的实验方法, 通常按照常规条件如 Sambrook 等人, 分子克隆: 实验室手册 (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件, 或按照制造厂商所建议的条 件。 材料与方法

本发明实施例所用的 DNA聚合酶购自北京全式金公司的 Fastpfu; 限制性内 切酶及 DNA连接酶等均购自 Fermentas公司;

酵母粉和蛋白胨购自英国 Oxoid公司产品; 甘氨酸和 IPTG购自 Promega公 司; 5-ALA和对二甲氨基苯甲醛等购自 Sigma公司; 琼脂粉和抗生素购自北京索 来宝; 葡萄糖、 冰醋酸、 高氯酸、 三氯乙酸、 乙酰丙酮、 氯仿以及其他常用化学 试剂均购自国药。

质粒提取试剂盒和琼脂糖凝胶电泳回收试剂盒 均购自上海生工, 相关操作均 严格按照说明书执行;

质粒构建测序验证由华大基因完成;

DH5a感受态细胞购自北京全式金公司。

LB培养基成分: 酵母粉 5 g/L, 蛋白胨 10 g/L, NaCl 10 g/L, 固体培养基中 添加 2%的琼脂粉。

抗生素浓度为: 氨苄青霉素 100 g/mL, 卡那霉素 30 g/mL。

ALA的检测方法: 200 μL稀释的发酵液加入 100 μL pH 4.6乙酸钠缓冲液, 然后加入 5 μL 乙酰丙酮, 100°C水浴温育 15 min, 冷却至室温后加入等体积的 Ehrlish's试剂 (42 mL冰醋酸, 8 mL 70%高氯酸, 1 g二甲氨基苯甲醛)混匀, 显色 10 min后测 553 nm波长下的吸光度。

葡萄糖分析方法采用山东科学院生产的 SBA-40D生物传感分析仪进行检测。 实施例 1. 琥珀酰辅酶 A合成酶缺失突变株和琥珀酸脱氢酶缺失突变 的构 建

大肠杆菌基因敲除采用经典的 Red重组方法, 参考相关文献进行, 具体操作 如下: 对于琥珀酰辅酶 A合成酶结构基因 cO)基因的敲除, 首先根据 NCBI公 布的大肠杆菌 MG1655的基因组序列及辅助载体 pKD13的序列设计引物 cC -l 和 具体序列见引物序列表, 以 pKD13为模板扩增得到带有 cC 基因 上下游同源臂的 Kan抗性基因片段。 PCR扩增参数为 94°C 2 min; 94 °C 20 s, 64 °C 20 s , 72 °C 1 min, 循环 30 次; 72°C延伸 5 min。 PCR 产物胶回收后电转化 MG1655/pKD46 菌株, 感受态细胞制备和转化过程参考 J.萨姆布鲁克 (Sambrook) 等编写的 《分子克隆实验指南》 。 转化子利用 和 引物进行 PCR 验证, 野生型菌株片段大小为 2267 bp , 而 cO)基因缺失的菌株中目的条带大 小为 1558 bp , 根据条带大小挑选 cC 缺失突变株并命名为 ZPEcAl。

对于 sdhAB的敲除, 首先根据 NCBI公布的大肠杆菌 MG1655的基因组序列 及辅助载体 pKD13的序列设计引物^ 和 sdhAB-2,以 pKD 13为模板扩增得 到带有 sdhAB基因上下游同源臂的 Kan抗性基因片段。 PCR扩增参数为 94°C 2 min; 94 °C 20 s, 64 °C 20 s, 72 V 1 min, 循环 30次; 72°C延伸 5 min。 PCR产物 胶回收后电转化 MG1655/pKD46菌株, 感受态细胞制备和转化过程参考 J.萨姆布 鲁克 (Sambrook)等编写的《分子克隆实验指南》 。 转化子利用^ 和^ 引物进行 PCR验证, 野生型菌株片段大小为 2553 bp , 而 sucCD基因缺失的菌株 中目的条带大小为 1408 bp , 根据条带大小挑选 sdhAB 缺失突变株并命名为 ZPEcA2。 实施例 2. 磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 ppc和 ALA合成酶共表达质粒的构建 根据 NCBI公布的大肠杆菌 MG1655的基因组序列设计引物/^ c-F和 ppc-R, 以大肠杆菌 MG1655基因组为模板 PCR扩增得到带有自身启动子的 p P c基因片 段, PCR扩增参数为 94°C 2 min; 94 °C 20 s, 60V 20 s, 72V 1.5 min, 循环 30 次; 72 °C延伸 5 min。 c基因片段回收后用 H dlll处理, 同时将携带有 ALA合 成酶的质粒 pZGA24 ( pZGA24构建参见参考文献: 郭小飞等, 利用 5-氨基乙酰 丙酸脱水酶缺失的重组大肠杆菌合成 5-氨基乙酰丙酸, 天津科技大学学报, 2012, 27(4): 1-6 ) 也用该酶处理, 载体和片段回收后用 T4连接酶连接, 转化 DH5( 感 受态细胞, 涂布含有 Amp的 LB平板, 挑取阳性克隆提取质粒并进行酶切验证, 测序正确的重组质粒命名为 pZPA6。 实施例 3. 丙酮酸羧化酶 pyc和 ALA合成酶共表达质粒的构建

根据 BioBrick中启动子 BBa— J23 105的序列和 NCBi公布的根瘤菌 CFN42的 基因组序列设计引物 /^c- l和 py C -2, 以根瘤菌 CFN42基因组为模板 PCR扩增得 到带有组成型启动子序列的 基因片段, PCR扩增参数为 94 °C 2 min; 94°C 20 s , 60°C 20 s , 72°C 2 min, 循环 30次; 72°C延伸 5 min。 目的片段回收后用磷酸化酶 处理, 同时将 pWSK29载体用限制性内切酶 PvuII处理后再用去磷酸化酶处理, 将得到的载体片段与磷酸化的^ c基因片段用 T4连接酶连接,转化 DH5( 感受态 细胞, 涂布含有 Amp的 LB平板, 挑取阳性克隆提取质粒并进行酶切验证, 测序 正确的重组质粒命名为 pSLS33。

根据上述 pSLS33的序列设计引物/^ c-F和/^ c-R, 具体序列见引物序列表, 以 pSLS33为模版扩增得到带有组成型启动子的 pyc基因片段, PCR扩增参数为 94 °C 2 min; 94 °C 20 s, 60V 20 s, 72V 2 min, 循环 30次; 72°C延伸 5 min。 同 时根据 pZGA24载体的序列设计引物 pA- 1和 pA-2, 以 pZGA24为模板反向 PCR 扩增含有 ALA合成酶基因的 pTrc-/ze 载体, PCR扩增参数为 94 °C 2 min; 94 °C 20 s, 60 °C 20 s, 72 °C 3 min, 循环 30次; 72°C延伸 5 min。 /^c基因片段回收后 用核酸内切酶 Smal消化处理并用 T4连接酶连接到反向扩增并纯化的 pZGA24载 体上, 连接产物转化 DH5a感受态细胞, 涂布含有 Amp的 LB平板, 挑取阳性克 隆提取质粒并进行酶切验证, 测序正确的重组质粒命名为 pZPA7

表 1 引物序列表

物名称 引物序列

sucCD-l

CCGTCGACC(SEQ ID NO: 1)

sue CD -2 CGGCGA GGGCTA TTTC

CTGCTTCG(SEQ ID NO: 2)

sucCD- GTTTAACGTGTCTTATCAGGCCT(SEQ ID NO: 3)

sucCD CGAAAATCATCGCGATAAGCACA(SEQ ID NO: 4)

sdhAB-l CTGGTGGTTTA CGTGA TTTA

CCGTCGACC(SEQ ID NO: 5)

sdhAB-2 A CGGTTTA CGCA TTA CGI

GCTGCTTCG(SEQ ID NO: 6)

sdhAB- TTATGGATTCGTTGTGGTGTGGGGT(SEQ ID NO: 7)

sdhAB-4 TGCGCGTCTTATCAGGCCTA(SEQ ID NO: 8)

ppc-¥ CCGCAAGCTTTATCCGACCTACACCTTTGGT(SEQ ID NO: 9)

ppc-R CCGCAAGC1TGGACTTCTGTGGAATGCATAGT(SEQ ID NO: 10)

pyc- l

ATGCCCATATCCAAGATACTC(SEQ ID NO: 1 1)

pyc-2 AACAGCCTGACTTTACACAATCGG(SEQ ID NO: 12)

pyc-¥ GATACCCGGGTTTACGGCTAGCTCAGTCCTAGG(SEQ ID NO: 13)

pyc-R CAAGCCCGGGAACAGCCTGACTTTACACAATCGG(SEQ ID NO: 14)

pA- 1 GCGGATGAGAGAAGATTTTCAG(SEQ ID NO: 15)

pA-2 CAAAACAGCCAAGCTTTCAGT(SEQ ID NO: 16)

注: 斜体加粗部分为同源臂序列, 下划线部分为酶切位点 实施例 4. 重组菌株的构建及 ALA产量的比较

分别将上述构建的重组质粒 pZGA24、 ρΖΡΑό和 ρΖΡΑ7转化野生型大肠杆菌 MG1655及 sucCD缺失突变株 ZPEcAl和 sdhAB缺失突变株 ZPEcA2, 涂布 Amp 抗性 LB 平板, 过夜培养后挑取阳性克隆提取质粒验证, 分别获得重组菌株 MG1655/pZGA24、 ZPEcAl /pZGA24、 ZPEcA2/pZGA24、 MG 1655/pZPA6、 ZPEcAl/pZPA6 、 ZPEcA2/pZPA6 、 MG1655/pZPA7 、 ZPEcAl /pZPA7 禾口 ZPEcA2/pZPA7。

将上述重组菌单菌落分别接种 5 mL含有 100 g/mL氨苄青霉素的 LB液体培 养基, 37°C, 220 rpm培养 12 h。 按照初始 OD为 0.05转接装有 50 mL发酵培养 基的 250 mL三角瓶, 37 °C, 220 rpm培养 2.5 h后加入终浓度为 25 μΜ的 IPTG, 诱导培养 19 h后收集发酵液, 检测 ALA的浓度。 其中发酵培养基为添加了少量 酵母粉的 M9培养基, 主要成分为: Na 2 HP0 4 ' 12H 2 0 12.8 g/L, KH 2 P0 4 3.0 g/L, NaCl 0.5 g/L , NH 4 C1 1.0 g/L, MgS0 4 2 mM, CaCl 2 O. lmM, 葡萄糖 10 g/L, 酵母 粉 2 g/L, 甘氨酸 4 g/L, 氨苄青霉素浓度为 100 g/mL。 ALA的检测和葡萄糖分 析方法如 "材料与方法" 部分所述。

各重组菌 ALA产量结果见表 2, 对照菌株 MG1655/pZGA24中 ALA的产量 仅为 1.06 g/L, sucCD或 sdhAB缺失的 ZPEcAl/pZGA24和 ZPEcA2/pZGA24菌株 中 ALA的产量分别为 1.33 g/L和 1.45 g/L , 分别比出发菌株提高了 25%和 37%, 表明在大肠杆菌中部分或全部缺失琥珀酰辅酶 A合成酶或琥珀酸脱氢酶的活性能 够提高 ALA的产量。表达/?/ ^的 MG 1655/pZPA6菌株和表达/ 的 MG1655/pZPA7 菌株中 ALA的产量分别达到 2.52 g/L和 2 g/L, 分别是出发菌株的 2.38倍和 1.89 倍,结果表明增强促进草酰乙酸合成的相关酶 能够显著提高 ALA的产量。而 SU cCD 或 sdhAB 缺失且 ppc 或 pyc 过量表达的 ZPEcAl/pZPA6、 ZPEcA2/pZPA6 , ZPEcAl/pZPA7和 ZPEcA2/pZPA7菌株中 ALA的产量分别达到 2.43 g/L, 3.08 g/L, 2.12 g/L和 2.66 g/L, 均高于相应的对照菌株, 表明 sucCD或 sdhAB缺失与 ppc 或^ c过量表达有一定的叠加效果, 能够促进 ALA的生物合成。 其中, sdhAB缺 失且表达 ppc 的 ZPEcA2/pZPA6 菌株 ALA 的产量最高, 是对照菌株 MG1655/pZGA24的 2.91倍, 葡萄糖转化率也达到最高的 0.47 (摩尔比), 是出发 菌株的 2.57倍。 而利用本发明的菌株进行发酵罐发酵时, ALA的产量可以达到 7 g/L以上,达到了国内的较好水平。上述实验结 果表明在大肠杆菌中表达外源 ALA 合成酶的基础上, 部分或全部缺失琥珀酰辅酶 A合成酶或琥珀酸脱氢酶的活性, 同时增强促进草酰乙酸合成的相关酶的表达可 以大大提高 ALA的产量。

上述重组菌株 MG1655/pZPA6和 ZPEcA2/pZPA6菌株已于 2012年 9月 19日 保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微 生物中心, 北京市朝阳区北辰西路 1号院 3号, 保藏号分别为: CGMCC No.6588和 CGMCC No.6589。

表 2 不同菌株摇瓶发酵数据

菌株 ALA(g/L) ALA/ODgoo 葡萄糖摩尔转化率

MG 1655/pZGA24 1.06 0.30 0.18

ZPEcA l/pZGA24 1.33 0.35 0.23

ZPEcA2/pZGA24 1.45 0.41 0.24

MG 1655/pZPA6 2.52 0.56 0.39

ZPEcA l/pZPA6 2.43 0.65 0.37

ZPEcA2/pZPA6 3.08 0.76 0.47

MG 1655/pZPA7 2.00 0.47 0.35

ZPEcA l/pZPA7 2.12 0.40 0.36

ZPEcA2/pZPA7 2.66 0.48 0.41 实施例 5. 在 BW25113菌株中重复验证

重组菌株的构建: 分别将上述质粒 pZGA24、 pZPA6和 pZPA7转化大肠杆菌 BW25 1 13(作为对照的菌株 BW251 13来源于 CGSC (美国耶鲁大学大肠杆菌保藏中 心))及相应的 cC缺失突变株 JW0717 (缺失了琥珀酰辅酶 A合成酶 β亚基 ( cC) 的 JW0717 菌株和 sdhA 缺失突变株 JW0713 (JW0717 和 JW0713 均来自 Keio Collection 大肠杆菌单基因缺失菌株库, National BioResource Project E. coli, Microbial Genetics Laboratory, National Institute of Genetics 1 1 1 1 Yata, Mishima, Shizuoka, 41 1 -8540 Japan) , 涂布 Amp抗性 LB平板, 过夜培养后挑取阳性克隆提 取质粒验证, 分别获得重组菌株 BW251 13/pZGA24、 JW0717/pZGA24、 JW0713/pZGA24 、 BW251 13/pZPA6 、 JW0717/pZPA6 、 JW0713/pZPA6 、 BW25 1 13/pZPA7、 JW0717/pZPA7和 JW0713/pZPA7。

各重组菌摇瓶发酵及 ALA和葡萄糖检测方法同上, 结果见表 3, 从表中可以 看出各重组菌与相应的 MG1655重组菌产量及变化基本一致,产量最高的 是 ^ A 缺失且表达 c的 JW0713/pZPA7菌株, ALA产量达到 3.21 g/L , 葡萄糖转化率 更是达到 0.56 (摩尔比), 表明本发明提供的方法同样适用于大肠杆菌其 他菌株。

表 3. 不同菌株摇瓶发酵数据

菌株 ALA (g/L) ALA/ODgoo 葡萄糖摩尔转化率

BW251 13/pZGA24 1.59 0.39 0.27

JW0717/pZGA24 1.21 0.32 0.23

JW0713/pZGA24 2.23 0.49 0.38

BW251 13/pZPA6 3. 1 1 0.55 0.43

JW0717/pZPA6 1.88 0.53 0.32

JW0713/pZPA6 3.08 0.74 0.52

BW251 13/pZPA7 2.61 0.58 0.44

JW0717/pZPA7 2.25 0.50 0.39

JW0713/pZPA7 3.21 0.72 0.56

实验结果表明, 利用本发明提供的方法, 在以葡萄糖为主要碳源的培养基中 摇瓶发酵, 重组菌中 ALA产量达到 3.08 g/L , 单位菌体 ALA 的产量达到 0.76 g/L/OD,分别为出发菌株的 2.91倍和 2.59倍,葡萄糖的转化率达到 0.47 (mol/mol) , 是出发菌株的 2.57倍。利用本发明提供的方法构建的重组菌 及利用其产生 ALA 的方法摆脱了对琥珀酸添加的依赖和昂贵 LB 培养基的使用, 具有很好工业应用 前景和经济价值。 实施例 6. 磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶和苹果酸酶活性增 强的重组菌株的构 建及 ALA产量的比较

发明人采用与实施例 1-5所述类似的方法构建了磷酸烯醇式丙酮酸羧 化激酶 (编码基因/ 和苹果酸酶 (编码基因 ae ) 的活性增强的重组菌株并检测了 它们的 ALA产量。

首先, 采用与实施例 2 类似的方法, 利用下表 4 所示引物克隆大肠杆菌 MG1655的磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶的编码基因 pck, 并连接到 pZGA24载体上, 获得的重组质粒命名为 pZPA12。

其次, 根据 NCBI公布的大肠杆菌 MG1655的基因组序列设计下表 4所示引 物 maeB-F和 maeB-R, 以大肠杆菌 MG 1655基因组为模板, 作 PCR扩增得到苹 果酸脱氢酶编码基因 maeB。 目的片段用 T4多核苷酸激酶进行磷酸化处理后与上 述反向扩增得到的 pZGA24载体片段进行连接。 经转化、 酶切及测序验证正确的 重组载体命名为 pZPA14。

表 4 引物序列表二 引物名称 引物序列

pck-V CCGCAAGCTTGCGTGGTGAATCGATACTTT(SEQ ID NO: 17)

pck-R CCGCAAGCTTTGCCTCCCGTTTTGCTTTCT(SEQ ID NO: 18)

maeB-K CAATGGATCCCTAAACTGCTTACCCTGAAT(SEQ ID NO: 20)

注: 下划线部分为酶切位点

采用与实施例 4类似的方法,分别将上述构建的重组质粒 pZPA12和 pZPA14 转化野生型大肠杆菌 MG 1655, 获得重组菌株 MG1655/pZPA12 和 MG1655/pZPA14。 然后利用与实施例 4类似的方法, 检测各重组菌 ALA产量, 结果见下表 6。

表 6. 摇瓶发酵数据

菌株 ALA (g/L) OD 600 葡萄糖摩尔转化率

MG1655/pZGA24 1.06 0.30 0.18

MG1655/pZPA12 0.57 4.20 0.10

MG1655/pZPA14 0.88 3.90 0.16

由上表可见, 表达 PCK 和 MaeB 的工程菌株 MG1655/pZPA12 和 MG1655/pZPA14 的 ALA产量分别比对照菌株 MG 1655/pZGA24 下降了 46%和 17%。 磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶 pck的活性增强并没有产生提高菌株 ALA产量 的技术效果。 实施例 7. 敲除 pck或 maeB基因对 ALA产量的影响

鉴于实施例 9的结果, 本发明人进一步研究 或 ae 基因缺失对 ALA合 成的影响。

将 ALAS 和 PPC 的共表达载体 pZPA6 分别导入来源于 Kelio Collection

( National BioResource Project E. coli, Microbial Genetics Laboratory, National Institute of Genetics 1 1 1 1 Yata, Mishima, Shizuoka, 41 1 -8540 Japan) 的单基因缺失 的菌株 JW3366 (^ 基因缺失菌株)和 JW2447 ( ae 基因缺失菌株)中, 经验证得 到正确的工程菌株 JW3366/pZPA6 和 JW2447/pZPA6。 以实施例 5 获得的 BW25 1 13/pZPA6为对照, 在初始添加 15 g/L葡萄糖和 4 g/L甘氨酸的发酵培养基 中发酵验证上述重组菌株产 ALA的能力。 发酵过程中在培养 12 h之后补加 5 g/L 葡萄糖和 2 g/L甘氨酸。 发酵结果如下表 7所示, 发酵 25 h之后 JW3366/pZPA6 的 ALA产量达到了 4.84 g/L, 同时糖转化率达到了 0.51 mol/mol, 分别比对照菌 株 BW25 1 13/pZPA6提高了 29%和 20.8% ; 而 JW2447/pZPA6的 ALA产量略微下 降, 但转化率提高 7.8%。

该结果表明 pck或 maeB基因的缺失有助于 ALA积累, 尤其是敲除 基因 更有利于 ALA积累和糖转化率的提高。

表 7. 或 maeB基因缺失对 ALA积累的影响

菌株 ALA (g/L) ΟΡβοο 葡萄糖摩尔转化率

BW251 13/pZPA6 3.75 8.37 0.42 JW3366/pZPA6 4.84 8.71 0.50

JW2447/pZPA6 3.60 7.9 0.45 实施例 8. 谷氨酸棒杆菌表达载体构建及发酵验证

根据 NCBI公布的沼泽红假单胞菌 (R/zo6fo/weM6fo oM£w palustris) ATCC 17001 ALA合成酶编码基因的序列 (GenBank: JQ048720.1) , 设计引物/ ze ^-F (引物序 列 :

SEQ ID NO: 21) 和 fwmA-R ( 引 物 序 列 : TATACCCCGGGTCAGGCCGCCTTGGCGAGAC; SEQ ID NO: 22)。 以 pZGA24 载体 (pZGA24构建参见参考文献: 郭小飞等, 天津科技大学学报, 2012, 27(4) : 1 -6)为模板通过 PCR扩增得到目的基因 / ze ^ , PCR扩增体系如下: PCR扩增参 数为: 94 °C 10 min, 94 °C 20 s , 65 °C 30 s , 72V 40 s, 循环 30次, 72°C延伸 5 min。 目的片段用 coRI和 S al双酶切处理, 然后在 DNA连接酶作用下将获得 片段与同样酶切处理的质粒 pEC-XK99E连接,并将连接产物转化到 DH5a感受态 细胞, 涂布卡那霉素抗性平板过夜培养, 挑阳性克隆进行菌落 PCR验证, 验证正 确的转化子进行测序验证, 将正确的重组载体命名为 pZWAl (图 4)。

其次, 根据 NCBI公布的谷氨酸棒杆菌 (Coryfiebacterium glutamicum) ATCC 13032的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶编码基因 ppc的序列 (GenBank: BA000036.3) , 设 计 引 物 Cg,c-F ID NO: 23)和 Cg-/^c-R : GCTCTAGACTAGCCGGAGTTGCGCAGCGCAGT; SEQ ID NO: 24。 以 ATCC 13032基因组为模板通过 PCR扩增得到目的基因, PCR扩 增体系如下: PCR扩增参数为: 94 °C 10 min, 94 °C 20 s , 65 °C 30 s , 72 °C 2 min, 循环 30次, 72°C延伸 5 min。 目的片段用 S al和 双酶切处理, 然后在 DNA 连接酶作用下将获得片段与同样酶切处理的 pZWAl 载体连接, 并将连接产物转 化到 DH5( 感受态细胞, 涂布卡那霉素抗性平板过夜培养, 挑阳性克隆进行菌落 PCR验证,验证正确的转化子进行测序验证,将 正确的重组载体命名为 pZWA2 (图 4)。

将上述重组载体 pZWAl和 pZWA2及对照空载体 pEC-XK99E分别转化谷氨 酸棒杆菌 ATCC 13032 , 获得重组菌株 ATCC 13032/pEC-XK99E、 ATCC 13032/ pZWAl和 ATCC 13032/pZWA2。

将上述重组菌单菌落分别接种 10 mL含有 25 g/mL卡那霉素和 24 g/L葡萄 糖的 LB液体培养基, 30°C, 200 rpm培养 12 h。 按照初始 OD为 0.3转接装有 50 mL发酵培养基的 500 1^三角瓶,30 °〇,200卬111培养3 11后加入终浓度为 100 μΜ 的 IPTG , 诱导培养 32 h后收集发酵液, 检测 ALA的浓度。 其中摇瓶发酵培养基 配方为: Glu 50 g/L , (NH 4 ) 2 SO 4 10 g/L, MnSO 4 1 g/L, K 2 HPO 4 1.5 g/L , MgSO 4 0.6 g/L , 玉米浆 l g/L, 甘氨酸 4 g/L, MOPS 31.395 g/L, 调 pH至 7.0。 卡那霉素终 浓度为 25 g/mL。 ALA的检测和葡萄糖分析方法如 "材料与方法" 部分所述。

摇瓶发酵结果见表 8,单独表达外源 ALA合成酶的 ATCC 13032/pZWAl菌株 中 ALA产量为 1.3 1 g/L,葡萄糖摩尔转化率为 0.052。而菌株 ATCC 13032/pZWA2 中 ALA 产量和葡萄糖摩尔转化率分别达到 1.95 g/L 和 0.077, 均比 ATCC 13032/pZWAl菌株提高了 48%, 效果明显。 因此, 本发明提供的 ALA生产 菌株的改造方法同样适用于谷氨酸棒杆菌等发 酵工业常用微生物。

表 8 谷氨酸棒杆菌不同菌株摇瓶发酵数据

菌株 A1A (g/L) OD 600 葡萄糖摩尔转化率

ATCC13032/pEC-XK99E 0.02 18.05 0.0008

ATCC13032/pZWAl 1.31 20.35 0.052

ATCC13032/pZWA2 1.95 23.18 0.077 讨论

本发明人基于 5-氨基乙酰丙酸的合成途径, 以产 ALA的重组微生物为目标, 通过理性设计改造宿主菌的糖代谢途径,结果 表明促进草酰乙酸合成的相关酶的活 性能够显著提高葡萄糖的转化率和 ALA的产量。具体地说, 本发明通过表达磷酸 烯醇式丙酮酸羧化酶或丙酮酸羧化酶增强草酰 乙酸的回补,大幅提高了 ALA的产 量和葡萄糖的转化率。

本发明人还发现降低琥珀酰辅酶 A下游代谢途径相关酶, SP , 琥珀酰辅酶 A 合成酶和琥珀酸脱氢酶的活性也能提高起到类 似的技术效果。 而生物学常识告诉 我们, 多亚基酶需要各亚基密切配合才能完成完整的 生物学功能, 任何一个亚基 序列或结构变化、 表达水平变化都可能影响酶的整体活性。 琥珀酰辅酶 A合成酶 和琥珀酸脱氢酶均是多亚基酶,琥珀酰辅酶 A合成酶包括两个亚基,分别由 sucC、 sucD编码, 琥珀酸脱氢酶含有四个亚基, 分别由 ^ /^、 sdhB、 和 sdhD编码。 通过实施例 4禾卩 5, 发明人证实了 cC和 sucD、 sucC、 sdhA和 sdhB、 sdhA基因 缺失造成相应酶失活, 进而有利于 ALA合成。 根据生物学常识可以推理, 其他能 够引起这两个酶活性弱化的遗传修饰或者通过 其它方法, 例如添加外源性琥珀酰 辅酶 A 合成酶或琥珀酸脱氢酶的抑制剂来抑制或降低 二者的活性, 都会有利于 ALA的生物合成。

而将以上两种改造策略整合更是极大提高了葡 萄糖的转化率和 ALA的产量, 与仅表达 ALA合成酶的对照菌株相比, 改造后的菌株 ALA的产量和葡萄糖的转 化率分别提高了 1.91倍和 1.57倍, 而利用本发明的菌株进行发酵罐发酵时, ALA 的产量可以达到 7 g/L以上, 达到了较好水平。 此外, 本发明的改造方法还适用 于谷氨酸棒杆菌等发酵工业常用的微生物, 具有相当好的普遍性。 因此, 本发明提供的菌株和方法能够显著提高 ALA 的产量和葡萄糖的转化 率, 摆脱了以往合成 ALA 时对琥珀酸添加的依赖和昂贵复杂培养基的使 用, 如 LB培养基, 大幅度降低了生产成本, 具有很好的工业化前景。

发明人最初还预计增强磷酸烯醇式丙酮酸羧化 激酶的活性也可以起到增加草 酰乙酸合成, 从而增加 ALA合成所需的前体量, 进而提高 ALA的产量的作用。 然而, 具体实验证明增强磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶 的活性并未起到预计的技术 效果。 同样, 发明人还发现增强苹果酸酶的活性也不能实现 ALA产量的提高。 发 明人通过进一步研究, 出乎意料地发现减弱磷酸烯醇式丙酮酸羧化激 酶和苹果酸 酶的活性反而能够显著提高 ALA的产量。具体地说, 磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶 的缺失可以大幅提高 ALA的产量和葡萄糖转化率,而苹果酸酶的缺失 也有利于提 高葡萄糖的转化率。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作 为参考, 就如同每一篇文献被 单独引用作为参考那样。 此外应理解, 在阅读了本发明的上述讲授内容之后, 本 领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改 , 这些等价形式同样落于本申请所 附权利要求书所限定的范围。