FIBRINOLYTISCHEN ERKRANKUNGEN

Die Erfindung betrifft substituierte Phenylalanin-Derivate und Verfahren zu ihrer Herstellung sowie ihre Verwendung zur Herstellung von Arzneimitteln zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Krankheiten, insbesondere von Blutverlust bei hyperfibrinolytischen Zuständen, bei Organtransplantationen oder herzchirurgischen Eingriffen vor allem mit kardiopulmonalem Bypass oder als Bestandteil eines Fibrinklebers.

Die Blutgerinnung ist ein Schutzmechanismus des Organismus, mit dessen Hilfe Defekte in der Gefäßwand rasch und zuverlässig „abgedichtet" werden können. So kann ein Blutverlust vermieden beziehungsweise minimiert werden. Die Blutstillung nach Gefäßverletzung erfolgt im Wesentlichen durch das Gerinnungssystem, bei dem eine enzymatische Kaskade komplexer Reaktionen von Plasmaproteinen ausgelöst wird. Hierbei sind zahlreiche Blutgerinnungsfaktoren beteiligt, von denen jeder, sobald aktiviert, die jeweils nächste inaktive Vorstufe in ihre aktive Form überführt. Am Ende der Kaskade steht die Umwandlung des löslichen Fibrinogens in das unlösliche Fibrin, so dass es zu einem Blutgerinnsel kommt. Traditionell unterscheidet man bei der Blutgerinnung zwischen dem intrinsischen und dem extrinsischen System, die in einem abschließenden gemeinsamen Reaktionsweg münden. Hierbei kommen den Faktoren Xa und IIa (Thrombin) Schlüsselrollen zu: Faktor Xa bündelt die Signale der beiden Gerinnungswege, da er sowohl über Faktor VIIa/Tissue Factor (extrinsischer Weg) wie auch den Tenase Komplex (intrinsischer Weg) durch Umsetzung von Faktor X entsteht. Die aktivierte Serinprotease Xa spaltet Prothrombin zu Thrombin, das über eine Reihe von Umsetzungen die Impulse aus der Kaskade auf den Gerinnungsstatus des Blutes überträgt.

In der jüngeren Vergangenheit ist die traditionelle Theorie der zwei getrennten Bereiche der Koagulationkaskade (extrinsischer beziehungsweise intrinsischer Pfad) aufgrund neuer Erkenntnisse modifiziert worden: In diesen Modellen wird die Koagulation durch Bindung von aktiviertem Faktor Vlla an Tissue Faktor (TF) initiiert. Der entstandene Komplex aktiviert Faktor X, was wiederum zur Thrombin-Generierung mit anschließender Herstellung von Fibrin und Thrombozyten- Aktivierung (via PAR-1) als verletzungsverschließende Endprodukte der Hämostase führt. Im Vergleich zur anschließenden Amplifikations-/Propagationsphase ist die Geschwindigkeit der Thrombin-Herstellung klein und durch das Auftreten von TFPI als Hemmer des TF-FVIIa-FX-Komplexes zeitlich begrenzt.

Ein zentraler Bestandteil des Übergangs von der Initiation zur Amplifikation und Propagation der Koagulation ist Faktor XIa. Thrombin aktiviert in positiven Rückkopplungsschleifen neben Faktor V und Faktor VIII auch Faktor XI zu Faktor XIa, was Faktor IX zu Faktor IXa umsetzt und über den so generierten Faktor IXa/ Faktor VIIIa-Komplex schnell größere Mengen Faktor Xa produziert. Dies löst die Produktion großer Mengen Thrombin aus, die zu starkem Thrombuswachstum führt und den Thrombus stabilisiert.

Die Bildung eines Thrombus beziehungsweise eines Blutgerinnsels wird durch die Fibrinolyse gegenreguliert. Nach Aktivierung von Plasminogen durch Tissue-Plasminogenaktivator (tPA) entsteht die aktive Serinprotease, Plasmin, die das polymerisierte Fibrin spaltet und somit den Thrombus abbaut. Dieser Prozess wird als Fibrinolyse bezeichnet - mit Plasmin als Schlüsselenzym.

Eine weitere wichtige Protease des Gerinnungssystems ist das Plasmakallikrein (PK). PK ist eine multifunktionelle, trypsinartige Serinprotease, für die mehrere physiologische Substrate bekannt sind. Die PK- vermittelte Freisetzung von Bradykinin aus hochmolekularem Kininogen führt zur Freisetzung von t-PA, NO und Prostacyclin aus Endothelzellen und beeinflußt dadurch die Fibrinolyse, den Blutdruck und das Entzündungsgeschehen.

Bei hyperfibrinolytischen Zuständen kommt es nicht zu einem ausreichenden Wundverschluß was starke, zum Teil lebensbedrohliche Blutungen zur Folge hat. Zur Prophylaxe und Therapie solcher Blutungen stehen in der Klinik Antifibrinolytika zur Verfügung. Antifibrinolytika hemmen spezifische Schritte der Fibrinolyse. Indirekt wirkende Antifibrinolytika wie Tranexamsäure hemmen die Aktivierung von Plasminogen; direkt wirkende Antifibrinolytika blockieren Plasmin selbst. Entsprechende Wirkungen konnten mit dem Plasminogeninhibitor Tranexamsäure in verschiedenen klinischen Studien gezeigt werden. Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist daher die Bereitstellung neuer Verbindungen zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Krankheiten, insbesondere von Blutverlust bei hyperfibrinolytischen Zuständen, bei Organtransplantationen oder herzchirurgischen Eingriffen vor allem mit kardiopulmonalem Bypass oder als Bestandteil eines Fibrinklebers.

W089/11852 beschreibt unter anderem substituierte Phenylalanin-Derivate zur Behandlung von Pankreatitis, WO 2007/070816 beschreibt substituierte Thiophen-Derivate als Faktor XIa Inhibitoren und JP 2014227401 beschreibt substituierte Phenylalanin-Derivate als Faktor XIa Inhibitoren. Gegenstand der Erfindung sind Verbindungen der Formel

steht, wobei # die Anknüpfstelle an das Stickstoffatom ist, R ² für Fluor oder Chlor steht,

R ³ für Ci-C3-Alkylaminocarbonyl oder Ci-C3-Alkoxycarbonylamino steht, R ⁴ für Fluor oder Chlor steht, und ihre Salze, ihre Solvate und die Solvate ihrer Salze.

Erfindungsgemäße Verbindungen sind die Verbindungen der Formel (I) und deren Salze, Solvate und Solvate der Salze, sowie die von Formel (I) umfassten, nachfolgend als Ausführungs- beispiel(e) genannten Verbindungen und deren Salze, Solvate und Solvate der Salze, soweit es sich bei den von Formel (I) umfassten, nachfolgend genannten Verbindungen nicht bereits um Salze, Solvate und Solvate der Salze handelt. Die erfindungsgemäßen Verbindungen können in Abhängigkeit von ihrer Struktur in unterschiedlichen stereoisomeren Formen existieren, d.h. in Gestalt von Konfigurationsisomeren oder gegebenenfalls auch als Konformationsisomere (Enantiomere und/oder Diastereomere, einschließlich solcher bei Atropisomeren). Die vorliegende Erfindung umfasst deshalb die Enantiomere und Dia- stereomere und ihre jeweiligen Mischungen. Aus solchen Mischungen von Enantiomeren und/ oder Diastereomeren lassen sich die stereoisomer einheitlichen Bestandteile in bekannter Weise isolieren; vorzugsweise werden hierfür chromatographische Verfahren verwendet, insbesondere die HPLC-Chromatographie an achiraler beziehungsweise chiraler Phase.

Sofern die erfindungsgemäßen Verbindungen in tautomeren Formen vorkommen können, umfasst die vorliegende Erfindung sämtliche tautomere Formen.

Die vorliegende Erfindung umfasst auch alle geeigneten isotopischen Varianten der erfindungsgemäßen Verbindungen. Unter einer isotopischen Variante einer erfindungsgemäßen Verbindung wird hierbei eine Verbindung verstanden, in welcher mindestens ein Atom innerhalb der erfindungsgemäßen Verbindung gegen ein anderes Atom der gleichen Ordnungszahl, jedoch mit einer anderen Atommasse als der gewöhnlich oder überwiegend in der Natur vorkommenden Atommasse ausgetauscht ist. Beispiele für Isotope, die in eine erfindungsgemäße Verbindung inkorporiert werden können, sind solche von Wasserstoff, Kohlenstoff, Stickstoff, Sauerstoff, Phosphor, Schwefel, Fluor, Chlor, Brom und Iod, wie ² H (Deuterium), ³ H (Tritium), ¹³ C, ¹⁴ C, ¹⁵ N, O, ¹⁸ 0, ³² P, ³³ P, ³³ S, ³⁴ S, ³⁵ S, ³⁶ S, ¹⁸ F, ³⁶ C1, ⁸² Br, ¹²³ I, ¹²⁴ I, ¹²⁹ I und ¹³¹ I. Bestimmte isotopische Varianten einer erfindungsgemäßen Verbindung, wie insbesondere solche, bei denen ein oder mehrere radioaktive Isotope inkorporiert sind, können von Nutzen sein beispielsweise für die Untersuchung des Wirkmechanismus oder der Wirkstoff- Verteilung im Körper; aufgrund der vergleichsweise leichten Herstell- und Detektierbarkeit sind hierfür insbesondere mit ³ H- oder ¹⁴ C- Isotopen markierte Verbindungen geeignet. Darüber hinaus kann der Einbau von Isotopen, wie bei- spielsweise von Deuterium, zu bestimmten therapeutischen Vorteilen als Folge einer größeren metabolischen Stabilität der Verbindung führen, wie beispielsweise eine Verlängerung der Halbwertszeit im Körper oder eine Reduktion der erforderlichen Wirkdosis; solche Modifikationen der erfindungsgemäßen Verbindungen können daher gegebenenfalls auch eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung darstellen. Isotopische Varianten der erfindungsgemäßen Verbindungen können nach den dem Fachmann bekannten Verfahren hergestellt werden, so beispielsweise nach den weiter unten beschriebenen Methoden und den bei den Ausführungsbeispielen wiedergegebenen Vorschriften, indem entsprechende isotopische Modifikationen der jeweiligen Reagentien und/oder Ausgangsverbindungen eingesetzt werden. Als Salze sind im Rahmen der vorliegenden Erfindung physiologisch unbedenkliche Salze der erfindungsgemäßen Verbindungen bevorzugt. Umfasst sind aber auch Salze, die für pharmazeutische Anwendungen selbst nicht geeignet sind aber beispielsweise für die Isolierung oder Reinigung der erfindungsgemäßen Verbindungen verwendet werden können. Physiologisch unbedenkliche Salze der erfindungsgemäßen Verbindungen umfassen Säureadditionssalze von Mineralsäuren, Carbonsäuren und Sulfonsäuren, z.B. Salze der Chlorwasserstoffsäure, Bromwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure, Methansulfonsäure, Ethan- sulfonsäure, Toluolsulfonsäure, Benzolsulfonsäure, Naphthalindisulfonsäure, Essigsäure, Trifluor- essigsäure, Propionsäure, Milchsäure, Weinsäure, Äpfelsäure, Zitronensäure, Fumarsäure, Maleinsäure und Benzoesäure.

Physiologisch unbedenkliche Salze der erfindungsgemäßen Verbindungen umfassen auch Salze üblicher Basen, wie beispielhaft und vorzugsweise Alkalimetallsalze (z.B. Natrium- und Kaliumsalze), Erdalkalisalze (z.B. Calcium- und Magnesiumsalze) und Ammoniumsalze, abgeleitet von Ammoniak oder organischen Aminen mit 1 bis 16 C- Atomen, wie beispielhaft und vorzugsweise Ethylamin, Diethylamin, Triethylamin, Ethyldiisopropylamin, Monoethanolamin, Diethanolamin, Triethanolamin, Dicyclohexylamin, Dimethylaminoethanol, Prokain, Dibenzylamin, V-Methyl- morpholin, Arginin, Lysin, Ethylendiamin, V-Methylpiperidin und Cholin.

Als Solvate werden im Rahmen der Erfindung solche Formen der erfindungsgemäßen Verbindungen bezeichnet, welche in festem oder flüssigem Zustand durch Koordination mit Lösungs- mittelmolekülen einen Komplex bilden. Hydrate sind eine spezielle Form der Solvate, bei denen die Koordination mit Wasser erfolgt.

Außerdem umfasst die vorliegende Erfindung auch Prodrugs der erfindungsgemäßen Verbindungen. Der Begriff „Prodrugs" umfaßt Verbindungen, welche selbst biologisch aktiv oder inaktiv sein können, jedoch während ihrer Verweilzeit im Körper zu erfindungsgemäßen Verbindungen umgesetzt werden (beispielsweise metabolisch oder hydrolytisch).

Folgende zwei Darstellungsweisen (A) und (B) eines 1,4-disubstituierten Cyclohexylderivats sind äquivalent zueinander und gleichbedeutend und in beiden Fällen deskriptiv für ein trans-1,4- disubsituiertes Cyclohexylderivat.

(A) (B) Dies gilt insbesondere für das Strukturelement des Tranexamsäureamids, beispielsweise N-[(?ra«s- 4- {[(fert-Butoxycarbonyl)amino]methyl}cyclohexyl)carbonyl und ?ra«s-4-(Aminomethyl)- cyclohexyl]carbonyl} . In der vorliegenden Erfindung wird die Darstellung (A) verwendet.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen der Formel

sowie alle L-Phenylalanin-Intermediate sind an dem in der obigen Formel mit einem * markierten Stereozentrum als (S)-Konfiguration beschrieben, da L-Phenylalanin-Derivate als zentrale Bausteine in die Synthese eingebracht werden. Bei der Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen kann es bei der Kupplung der L-Phenylalanin-Intermediate mit dem Amin H ₂ N-R ¹ zur teilweisen Epimerisierung an dem mit einem * markierten Stereozentrum kommen. Damit kann ein Gemisch der erfindungsgemäßen Verbindungen aus (S)-Enantiomer und (R)-Enantiomer entstehen. Die Hauptkomponente ist das jeweils abgebildete (S)-Enantiomer. Die Gemische aus (S)-Enantiomer und (R)-Enantiomer können nach dem Fachmann bekannten Methoden, zum Beispiel durch Chromatograpie an chiraler Phase, in ihre Enantiomere getrennt werden.

Die Enantiomere können entweder direkt nach der Kupplung der L-Phenylalanin-Intermediate mit dem Amin H2N-R ¹ oder auf einer späteren Zwischenstufe der Synthese oder aber die erfindungsgemäßen Verbindungen an sich können getrennt werden. Bevorzugt ist die Trennung der Enantiomere direkt nach der Kupplung der L-Phenylalanin-Intermediate mit dem Amin H ₂ N-R ¹ .

Im Sinne der vorliegenden Erfindung umfasst der Begriff "Behandlung" oder "behandeln" ein Hemmen, Verzögern, Aufhalten, Lindern, Abschwächen, Einschränken, Verringern, Unterdrücken, Zurückdrängen oder Heilen einer Krankheit, eines Leidens, einer Erkrankung, einer Verletzung oder einer gesundheitlichen Störung, der Entfaltung, des Verlaufs oder des Fortschreitens solcher Zustände und/oder der Symptome solcher Zustände. Der Begriff "Therapie" wird hierbei als synonym mit dem Begriff "Behandlung" verstanden.

Die Begriffe "Prävention", "Prophylaxe" oder "Vorbeugung" werden im Rahmen der vorliegenden Erfindung synonym verwendet und bezeichnen das Vermeiden oder Vermindern des Risikos, eine Krankheit, ein Leiden, eine Erkrankung, eine Verletzung oder eine gesundheitliche Störung, eine Entfaltung oder ein Fortschreiten solcher Zustände und/oder die Symptome solcher Zustände zu bekommen, zu erfahren, zu erleiden oder zu haben.

Die Behandlung oder die Prävention einer Krankheit, eines Leidens, einer Erkrankung, einer Verletzung oder einer gesundheitlichen Störung können teilweise oder vollständig erfolgen. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung haben die Substituenten, soweit nicht anders spezifiziert, die folgende Bedeutung:

Alkyl steht für einen linearen oder verzweigten Alkylrest mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen, beispielhaft und vorzugsweise für Methyl, Ethyl, n-Propyl und iso-Propyl.

Alkoxy steht für einen linearen oder verzweigten Alkoxyrest mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen, bei- spielhaft und vorzugsweise für Methoxy, Ethoxy, n-Propoxy und iso-Propoxy.

Alkylaminocarbonyl steht für eine Amino-Gruppe mit einem oder zwei unabhängig voneinander gewählten gleichen oder verschiedenen geradkettigen oder verzweigten Alkylsubstituenten, die jeweils 1 bis 3 Kohlenstoffatome aufweisen, und die über eine Carbonylgruppe gebunden ist, beispielhaft und vorzugsweise für Methylaminocarbonyl, Ethylaminocarbonyl, n- Propylaminocarbonyl, iso-Propylaminocarbonyl, V, V-Dimethylaminocarbonyl, N,N- Diethylaminocarbonyl, V-Ethyl- V-methylaminocarbonyl, V-Methyl- V-n-propylaminocarbonyl, N- iso-Propyl-A -n-propylaminocarbonyl und V, V-Diisopropylaminocarbonyl. Ci-C3-Alkylamino- carbonyl steht beispielsweise für einen Monoalkylaminocarbonylrest mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen oder für einen Dialkylaminocarbonylrest mit jeweils 1 bis 3 Kohlenstoffatomen pro Alkylsubstituent. Alkoxycarbonylamino steht für einen linearen oder verzweigten Alkoxyrest, der über eine Carbonylamino-Gruppe gebunden ist, mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen, beispielhaft und vorzugsweise für Methoxycarbonylamino, Ethoxycarbonylamino, n-Propoxycarbonylamino und iso- Propoxycarbonylamino.

In den Formeln der Gruppe, die für R ¹ stehen kann, steht der Endpunkt der Linie, neben der jeweils ein # steht, nicht für ein Kohlenstoffatom beziehungsweise eine CEL-Gruppe sondern ist Bestandteil der Bindung zu dem Atom, an das R ¹ gebunden ist. Bevorzugt sind Verbindungen der Formel (I), in welcher

R ¹ für eine Gruppe der Formel steht,

wobei # die Anknüpfstelle an das Stickstoffatom ist,

R ² für Fluor oder Chlor steht,

R ³ für Methylammocarbonyl oder Methoxycarbonylammo steht,

R ⁴ für Chlor steht,

und ihre Salze, ihre Solvate und die Solvate ihrer Salze.

Bevorzugt sind auch Verbindungen der Formel (I), in welcher

R ¹ für eine Gruppe der Formel

steht,

wobei # die Anknüpfstelle an das Stickstoffatom ist,

R ² für Fluor oder Chlor steht,

R ³ für Methylammocarbonyl oder Methoxycarbonylammo steht, und ihre Salze, ihre Solvate und die Solvate ihrer Salze. Besonders bevorzugt ist auch 7- {4-[(2iS)-2-({[?ra«5-4-(Aminomethyl)cyclohexyl]carbonyl}arn ino)- 3- {[3-chlor-4-(methyl-carbamoyl)phenyl]amino} -3-oxopropyl]phenyl} -6-methyl-4-oxo- 1 ,4- dihydrochinolin-3-carbonsäure mit der folgenden Formel

oder eines ihrer Salze, ihrer Solvate oder der Solvate ihrer Salze.

Besonders bevorzugt ist auch 7- {4-[(2iS)-2-({[?ra«5-4-(Aminomethyl)cyclohexyl]carbonyl}ami no)- 3- {[3-chlor-4-(methyl-carbamoyl)phenyl]amino} -3-oxopropyl]phenyl} -6-methyl-4-oxo- 1 ,4- dihydrochinolin-3-carbonsäure-Hydrochlorid mit der folgenden Formel

Besonders bevorzugt ist auch 7-(4- {(2iS)-2-({[?ra«5-4-(Aminomethyl)cyclohexyl]carbonyl}amino) - 3-[(7-chlor-2-oxo-2,3-dihydro-l/ -benzimidazol-5-yl)amino]-3-oxopropyl}phenyl)-6-methyl-4- oxo-l,4-dihydrochinolin-3-carbonsäure mit der folgenden Formel oder eines ihrer Salze, ihrer Solvate oder der Solvate ihrer Salze.

Besonders bevorzugt ist auch 7-(4- {(2iS)-2-({[?ra«5-4-(Aminomethyl)cyclohexyl]carbonyl}amino) - 3-[(7-chlor-2-oxo-2,3-dihydro-l/ -benzimidazol-5-yl)amino]-3-oxopropyl}phenyl)-6-methyl-4- oxo- 1 ,4-dihydrochinolin-3-carbonsäure-Hydrochlorid mit der folgenden Formel

Besonders bevorzugt ist auch 7- {4-[(2iS)-2-({[?ra«5-4-(Aminomethyl)cyclohexyl]carbonyl}ami no)- 3-( {3-fluor-4-[(methoxycarbonyl)amino]phenyl} amino)-3-oxopropyl]phenyl} -6-methyl-4-oxo- 1 ,4- dihydrochinolin-3-carbonsäure mit der folgenden Formel

OH oder eines ihrer Salze, ihrer Solvate oder der Solvate ihrer Salze.

Besonders bevorzugt ist auch 7- {4-[(2iS)-2-({[?ra«5-4-(Aminomethyl)cyclohexyl]carbonyl}ami no)- 3-( {3-fluor-4-[(methoxycarbonyl)amino]phenyl} amino)-3-oxopropyl]phenyl} -6-methyl-4-oxo- 1 ,4- dihydrochinolin-3-carbonsäure-Hydrochlorid mit der folgenden Formel

Die in den jeweiligen Kombinationen bzw. bevorzugten Kombinationen von Resten im einzelnen angegebenen Reste-Definitionen werden unabhängig von den jeweiligen angegebenen Kombinationen der Reste beliebig auch durch Reste-Definitionen anderer Kombinationen ersetzt. Ganz besonders bevorzugt sind Kombinationen von zwei oder mehreren der oben genannten Vorzugsbereiche. Gegenstand der Erfindung ist weiterhin ein Verfahren zur Herstellung der Verbindungen der Formel (I), oder ihrer Salze, ihrer Solvate oder der Solvate ihrer Salze, wobei die Verbindungen der Formel

in welcher

R ¹ die oben angegebene Bedeutung hat, mit einer Säure umgesetzt werden.

Die Umsetzung erfolgt im Allgemeinen in inerten Lösungsmitteln, bevorzugt in einem Temperaturbereich von Raumtemperatur bis 60°C bei Normaldruck. Inerte Lösungsmittel sind beispielsweise Halogenkohlenwasserstoffe wie Dichlormethan, Trichlormethan, Tetrachlormethan oder 1,2-Dichlorethan, oder Ether wie Tetrahydrofuran oder Dioxan, bevorzugt ist Dioxan.

Säuren sind beispielsweise Trifluoressigsäure oder Chlorwasserstoff in Dioxan, bevorzugt ist Chlorwasserstoff in Dioxan. Die Verbindungen der Formel (II) sind bekannt oder können hergestellt werden, indem

[A] Verbindungen der Formel

in welcher

oben angegebene Bedeutung hat,

mit der Verbindung der Formel

in Gegenwart von Dehydratisierangsreagenzien umgesetzt werden, oder

[B] Verbindungen der Formel

in welcher R ¹ die oben angegebene Bedeutung hat, und X ¹ für Brom oder Iod steht, mit Verbindungen der Formel

Q ¹ für -B(OH) ₂ , einen Boronsäure-Ester, bevorzugt Boronsäurepmakolester, oder steht, unter Suzuki-Kupplungsbedingungen umgesetzt werden, oder

[C] die Verbindung der Formel

mit Verbindungen der Formel

H ₂ N— R (VIII), in welcher

R ¹ die oben angegebene Bedeutung hat, in Gegenwart von Dehydratisierungsreagenzien umgesetzt werden.

Die Umsetzung nach Verfahren [A] erfolgt im Allgemeinen in inerten Lösungsmitteln, gegebenenfalls in Gegenwart einer Base, bevorzugt in einem Temperaturbereich von 0°C bis zum Rückfluss der Lösungsmittel bei Normaldruck.

Als Dehydratisierungsreagenzien eignen sich hierbei beispielsweise Carbodiimide wie z.B. JV,JV- Diethyl-, V, V'-Dipropyl-, V, V'-Diisopropyl-, V, V'-Dicyclohexylcarbodiimid, V-(3-Dimethylamino- isopropyl)- V'-ethylcarbodiimid-Hydrochlorid (EDC) (gegebenenfalls in Gegenwart von Penta- fluorphenol (PFP)), V-Cyclohexylcarbodiimid- V'-propyloxymethyl-Polystyrol (PS-Carbodiimid) oder Carbonylverbindungen wie Carbonyldiimidazol, oder 1,2-Oxazoliumverbindungen wie 2-Ethyl-5-phenyl-l,2-oxazolium-3-sulfat oder 2-tert.-Butyl-5-methyl-isoxazolium-perchlorat, oder Acylaminoverbindungen wie 2-Ethoxy-l-ethoxycarbonyl-l,2-dihydrochinolin, oder Propanphos- phonsäureanhydrid, oder Isobutylchloroformat, oder Bis-(2-oxo-3-oxazolidinyl)-phosphorylchlorid oder Benzotriazolyloxy-tri(dimethylamino)phosphoniumhexafluoropho sphat, oder 0-(Benzotria- zol- 1 -yl)-N,N,N', TV'-tetra-methyluronium-hexafluorophosphat (HBTU), 2-(2-Oxo- 1 -(2H)-pyridyl)- 1 , 1 ,3,3-tetramethyluroniumtetrafluoroborat (TPTU), (Benzotriazol- 1 -yloxy)bisdimethylamino- methyliumfluoroborat (TBTU) oder 0-(7-Azabenzotriazol-l-yl)- V, V, V', V'-tetramethyl-uronium- hexafluorophosphat (HATU), oder 1 -Hydroxybenztriazol (HOBt), oder Benzotriazol- 1-yloxy- tris(dimethylamino)-phosphoniumhexafluorophosphat (BOP), oder Ethyl-cyan(hydroxy- imino)acetat (Oxyma), oder (l-Cyano-2-ethoxy-2-oxoethylidenaminooxy)dimethylamino- mo holino-carbenium hexafluorophosphat (COMU), oder N-[(Dimethylamino)(3_f/- [ l,2,3]triazolo[4,5-b]pyridin-3-yloxy)methyliden]-N-methylmet hanaminium-hexafluorophosphat, oder 2,4,6-Tripropyl-l,3,5,2,4,6-trioxatriphosphinan-2,4,6-trioxi d (T3P), oder Mischungen aus diesen, bevorzugt ist N-[(Dimethylamino)(3/ -[l,2,3]triazolo[4,5-b]pyridin-3-yloxy)methyliden]- N-methylmethan-aminium-hexafluorophosphat oder 2,4,6-Tripropyl- 1 ,3,5,2,4,6-trioxatri- phosphinan-2,4,6-trioxid (T3P).

Basen sind beispielsweise Alkalicarbonate, wie z.B. Natrium- oder Kaliumcarbonat, oder -hy- drogencarbonat, oder organische Basen wie Trialkylamine, z.B. Triethylamin, V-Methylmorpholin,V-Methylpiperidin, 4-Dimethylaminopyridin oder Diisopropylethylamin, bevorzugt ist Diisopro- pylethylamin.

Inerte Lösungsmittel sind beispielsweise Halogenkohlenwasserstoffe wie Dichlormethan oder Tri- chlormethan, Kohlenwasserstoffe wie Benzol, oder andere Lösungsmittel wie Nitromethan, Tetrahydrofuran, Dioxan, Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid, Acetonitril oder Pyridin, oder Gemische der Lösungsmittel, bevorzugt ist Tetrahydrofuran oder Dimethylformamid oder ein Gemisch aus Dimethylformamid und Pyridin. Die Verbindung der Formel (IV) ist bekannt oder läßt sich nach bekannten Verfahren aus den entsprechenden Ausgangsverbindungen synthetisieren.

Die Umsetzung nach Verfahren [B] erfolgt im Allgemeinen in inerten Lösungsmitteln, in Gegenwart eines Katalysators, gegebenenfalls in Gegenwart eines Zusatzreagenzes, gegebenenfalls in einer Mikrowelle, bevorzugt in einem Temperaturbereich von Raumtemperatur bis 150°C bei Normaldruck bis 3 bar.

Katalysatoren sind beispielsweise für Suzuki-Reaktionsbedingungen übliche Palladium- Katalysatoren, bevorzugt sind Katalysatoren wie z.B. Dichlorbis(triphenylphosphin)-palladium, Tetrakistriphenylphosphinpalladium(O), Palladium(II)acetat/Triscyclohexylphosphin, Tris(dibenzylidenaceton)dipalladium, Bis-(diphenylphosphanferrocenyl)-palladium-(II)-chlorid, l,3-Bis(2,6-diisopropylphenyl)imidazol-2-yliden(l,4-napthtoc hinon)palladiumdimer, Allyl(chlor)- (l,3-dimesityl-l,3-dihydro-2H-imidazol-2-yliden)palladium, Palladium(II)acetat/Dicyclohexyl- (2',4',6'-triisopropyl-biphenyl-2-yl)-phosphin, [1,1 -Bis-(diphenylphosphino)-ferrocen]- palladium(II)chlorid-Monodichlormethan-addukt oder XPhos Prekatalysator [(2'-Aminobiphenyl- 2-yl)(chlor)palladium-Dicyclohexyl(2',4',6'-triisopropylbiph enyl-2-yl)phosphan (1 : 1)], bevorzugt ist Tetrakistriphenylphosphin-palladium(O), [l,l-Bis-(diphenylphosphino)-ferrocen]- palladium(II)chlorid-Monodichlormethan-addukt oder XPhos Prekatalysator [(2'-Aminobiphenyl- 2-yl)(chlor)palladium-Dicyclohexyl(2',4',6'-triisopropylbiph enyl-2-yl)phosphan (1 : 1)].

Zusatzreagenzien sind beispielsweise Kaliumacetat, Cäsium-, Kalium- oder Natriumcarbonat, Kalium-tert.-butylat, Cäsiumfluorid oder Kaliumphosphat, wobei diese in wässriger Lösung vorliegen können, bevorzugt sind Zusatzreagenzien wie Kaliumacetat oder eine Mischung aus Kaliumacetat und Natriumcarbonat.

Inerte Lösungsmittel sind beispielsweise Ether wie Dioxan, Tetrahydrofuran oder 1,2- Dimethoxyethan, Kohlenwasserstoffe wie Benzol, Xylol oder Toluol, oder Carbonsäureamide wie Dimethylformamid oder Dimethylacetamid, Alkylsulfoxide wie Dimethylsulfoxid, oder N- Methylpyrrolidon oder Acetonitril, oder Gemische der Lösungsmittel mit Alkoholen wie Methanol oder Ethanol und/oder Wasser, bevorzugt ist Toluol, Dimethylformamid oder Dimethylsulfoxid. Die Verbindungen der Formel (VI) sind bekannt, lassen sich nach bekannten Verfahren aus den entsprechenden Ausgangsverbindungen synthetisieren oder können analog den im Beispielteil beschriebenen Verfahren hergestellt werden.

Die Umsetzung nach Verfahren [C] erfolgt wie für Verfahren [A] beschrieben. Die Verbindungen der Formeln (VII) und (VIII) sind bekannt, lassen sich nach bekannten Verfahren aus den entsprechenden Ausgangsverbindungen synthetisieren oder können analog den im Beispielteil beschriebenen Verfahren hergestellt werden.

Die Verbindungen der Formel (III) sind bekannt oder können hergestellt werden, indem Verbindungen der Formel

in welcher

R ¹ die oben angegebene Bedeutung hat, mit einer Säure umgesetzt werden.

Die Umsetzung erfolgt im Allgemeinen in inerten Lösungsmitteln, bevorzugt in einem Temperaturbereich von Raumtemperatur bis 60°C bei Normaldruck.

Inerte Lösungsmittel sind beispielsweise Halogenkohlenwasserstoffe wie Dichlormethan, Trichlormethan, Tetrachlormethan oder 1,2-Dichlorethan, oder Ether wie Tetrahydrofuran oder Dioxan, bevorzugt ist Dioxan.

Säuren sind beispielsweise Trifluoressigsäure oder Chlorwasserstoff in Dioxan, bevorzugt ist Chlorwasserstoff in Dioxan. Die Verbindungen der Formel (IX) sind bekannt oder können hergestellt werden, indem die Verbindung der Formel

mit Verbindungen der Formel (VIII) umgesetzt werden. Die Umsetzung erfolgt wie für Verfahren [C] beschrieben.

Die Verbindung der Formel (X) ist bekannt, läßt sich nach bekannten Verfahren aus den entsprechenden Ausgangsverbindungen synthetisieren oder kann analog den im Beispielteil beschriebenen Verfahren hergestellt werden.

Die Verbindungen der Formel (V) sind bekannt oder können hergestellt werden, indem Verbindungen der Formel

in welcher

R ¹ die oben angegebene Bedeutung hat, und

X ¹ für Brom oder Iod steht, mit der Verbindung der Formel (IV) in Gegenwart von Dehydratisierungsreagenzien umgesetzt werden. Die Umsetzung erfolgt wie für Verfahren [A] beschrieben.

Die Verbindungen der Formel (XI) sind bekannt oder können hergestellt werden, indem Verbindungen der Formel

in welcher

R ¹ die oben angegebene Bedeutung hat, und X ¹ für Brom oder Iod steht, mit einer Säure umgesetzt werden.

Die Umsetzung erfolgt im Allgemeinen in inerten Lösungsmitteln, bevorzugt in einem Temperaturbereich von Raumtemperatur bis 60°C bei Normaldruck.

Inerte Lösungsmittel sind beispielsweise Halogenkohlenwasserstoffe wie Dichlormethan, Trichlormethan, Tetrachlormethan oder 1,2-Dichlorethan, oder Ether wie Tetrahydrofuran oder Dioxan, bevorzugt ist Dioxan.

Säuren sind beispielsweise Trifluoressigsäure oder Chlorwasserstoff in Dioxan, bevorzugt ist Chlorwasserstoff in Dioxan.

Die Verbindungen der Formel (XII) sind bekannt oder können hergestellt werden, indem Verbindungen der Formel

in welcher X ¹ für Brom oder Iod steht, mit Verbindungen der Formel (VIII) umgesetzt werden. Die Umsetzung erfolgt wie für Verfahren [C] beschrieben.

Die Verbindungen der Formel (XIII) sind bekannt, lassen sich nach bekannten Verfahren aus den entsprechenden Ausgangsverbindungen synthetisieren oder können analog den im Beispielteil beschriebenen Verfahren hergestellt werden.

Die Herstellung der Ausgangsverbindungen und der Verbindungen der Formel (I) kann durch das folgende Syntheseschema verdeutlicht werden.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen zeigen ein nicht vorhersehbares, wertvolles pharmakologisches Wirkspektrum und ein gutes pharmakokinetisches Verhalten. Es handelt sich dabei um Verbindungen, die die proteolytische Aktivität der Serinproteasen Plasmin, Plasmakallikrem und Faktor XIa beeinflussen. Die erfindungsgemäßen Verbindungen hemmen die enzymatische Spaltung von Substraten, die eine wesentliche Rolle bei der Aktivierung der Blutgerinnungskaskade und bei der Fibrinolyse einnehmen.

Sie eigenen sich daher zur Verwendung als Arzneimittel zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Krankheiten bei Menschen und Tieren.

Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist der Einsatz der erfindungsgemäßen Verbindungen zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Erkrankungen, insbesondere von Blutverlust bei hyperfibrinolytischen Zuständen, bei Organtransplantationen oder herzchirurgischen Eingriffen vor allem mit kardiopulmonalem Bypass oder als Bestandteil eines Fibrinklebers. Durch die Prophylaxe und/oder Behandlung kann ein starker perioperativer Blutverlust reduziert oder aufgehoben werden. Starke Blutungen treten bei schweren Operationen, wie z. B. Koronararterien-Bypass-Chirurgie, Organtransplantationen oder Hysterektomie, sowie bei Trauma, bei haemorrhagischem Schock oder bei postpartaler Hämorrhagie auf. In den zuvor genannten Indikationen kann es perioperativ zum Einsatz von extrakorporalen Kreislaufsytemen oder Filtersystemen, wie z.B. Herzlungenmaschine, Hemofiltration, Hämodialyse, extrakorporale Membranoxygenierung oder ventrikuläres Unterstützungssystem, wie z.B. Kunstherz, kommen. Mögliche thrombotische Komplikationen, induziert durch die Aktivierung des intrinsischen Gerinnungssystems in den extrakorporalen Kreislaufsystemen, sollen mit den erfindungsgemäßen Verbindungen reduziert werden. Die erfindungsgemäßen Verbindungen können darüber hinaus auch als Bestandteil eines Fibrinklebers eingesetzt werden. Fibrinkleber finden Einsatz bei der Verklebung von Wundrändern anstelle einer klassischen chirurgischen Naht und zum Verschluss von verletztem Gewebe, bei der Blutstillung sowie der Unterstützung und Beschleunigung der Wundheilung.

Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindungen zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Erkrankungen, insbesondere der zuvor genannten Erkrankungen.

Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindungen zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Erkrankungen, insbesondere der zuvor genannten Erkrankungen. Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Erkrankungen, insbesondere der zuvor genannten Erkrankungen, unter Verwendung einer therapeutisch wirksamen Menge einer erfindungsgemäßen Verbindung. Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind die erfindungsgemäßen Verbindungen zur Verwendung in einem Verfahren zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Erkrankungen, insbesondere der zuvor genannten Erkrankungen, unter Verwendung einer therapeutisch wirksamen Menge einer erfindungsgemäßen Verbindung.

Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind Arzneimittel, enthaltend eine erfindungsgemäße Verbindung und einen oder mehrere weitere Wirkstoffe.

Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind Arzneimittel, enthaltend eine erfindungsgemäße Verbindung und einen oder mehrere weitere Wirkstoffe, insbesondere zur Behandlung und/oder Prophylaxe der zuvor genannten Erkrankungen. Als geeignete Kombinationswirkstoffe seien beispielhaft und vorzugsweise genannt:

• Lipidsenker, insbesondere HMG-CoA-(3-Hydroxy-3-methylglutaryl-Coenzym A)-Reduktase- Inhibitoren wie beispielsweise Lovastatin (Mevacor), Simvastatin (Zocor), Pravastatin (Pravachol), Fluvastatin (Lescol) und Atorvastatin (Lipitor);

• Koronartherapeutika/V asodilatatoren, insbesondere ACE-(Angiotensin-Converting-Enzyme)- Inhibitoren wie beispielsweise Captopril, Lisinopril, Enalapril, Ramipril, Cilazapril, Benazepril, Fosinopril, Quinapril und Perindopril, oder AII-(Angiotensin II)-Rezeptor- Antagonisten wie beispielsweise Embusartan, Losartan, Valsartan, Irbesartan, Candesartan, Eprosartan und Temisarta, oder ß-Adrenozeptor- Antagonisten wie beispielsweise Carvedilol, Alprenolol, Bisoprolol, Acebutolol, Atenolol, Betaxolol, Carteolol, Metoprolol, Nadolol, Penbutolol, Pindolol, Propanolol und Timolol, oder alpha- 1 - Adrenozeptor- Antagonisten wie beispielsweise Prazosin, Bunazosin, Doxazosin und Terazosin, oder Diuretika wie beispielsweise Hydrochlorothiazid, Furosemid, Bumetanid, Piretanid, Torasemid, Amilorid und Dihydralazin, oder Calciumkanal-Blocker wie beispielsweise Verapamil und Diltiazem, oder Dihydropyridin-Derivate wie beispielsweise Nifedipin (Adalat) und Nitrendipin (Bayotensin), oder Nitropräparate wie beispielsweise Isosorbid-5-mononitrat, Isosorbid- dinitrat und Glyceroltrinitrat, oder Substanzen, die eine Erhöhung von cyclischem Guanosin- monophosphat (cGMP) bewirken, wie beispielsweise Stimulatoren der löslichen Guanylatcyclase, wie beispielsweise Riociguat;

• antikoagulatorisch wirksame Substanzen (Antikoagulantien) wie beispielsweise Heparin (UFH), niedermolekulare Heparine (NMH) wie beispielsweise Tinzaparin, Certoparin, Parnaparin, Nadroparin, Ardeparin, Enoxaparin, Reviparin, Dalteparin, Danaparoid, Semuloparin (AVE 5026), Adomiparin (Ml 18) und EP-42675/ORG42675; • sowie Antiarrhythmika;

• verschiedene Antibiotika oder antifungale Medikamenten, entweder als kalkulierte Therapie (vor Vorliegen des mikrobiellen Befundes) oder als spezifische Therapie;

• Vasopressoren wie beispielsweise Norepinephrine, Dopamine und Vasopressin; · Inotrope Therapie wie beispielsweise Dobutamin;

• Kortikosteroide wie beispielsweise Hydrokortison und Fludrokortison;

• rekombinantes humanes aktivierte Protein C wie beispielsweise Xigris;

• Blutprodukte wie beispielsweise Erythrozytenkonzentrate, Thrombozytenkonzentrate,

Erythropietin und Fresh Frozen Plasma. Unter„Kombinationen" im Sinne der Erfindung werden nicht nur Darreichungsformen, die alle Komponenten enthalten (sog. Fixkombinationen) und Kombinationspackungen, die die Komponenten voneinander getrennt enthalten, verstanden, sondern auch gleichzeitig oder zeitlich versetzt applizierte Komponenten, sofern sie zur Prophylaxe und/oder Behandlung derselben Krankheit eingesetzt werden. Ebenso ist es möglich, zwei oder mehr Wirkstoffe miteinander zu kombinieren, es handelt sich dabei also jeweils um zwei- oder mehrfach-Kombinationen.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen können systemisch und/oder lokal wirken. Zu diesem Zweck können sie auf geeignete Weise appliziert werden, wie z.B. oral, parenteral, pulmonal, nasal, sublingual, lingual, buccal, rectal, dermal, transdermal, conjunctival, otisch oder als Implantat beziehungsweise Stent. Für diese Applikationswege können die erfindungsgemäßen Verbindungen in geeigneten Applikationsformen verabreicht werden.

Für die orale Applikation eignen sich nach dem Stand der Technik funktionierende schnell und/oder modifiziert die erfindungsgemäßen Verbindungen abgebende Applikationsformen, die die erfindungsgemäßen Verbindungen in kristalliner und/ oder amorphisierter und/oder gelöster Form enthalten, wie z.B. Tabletten (nicht überzogene oder überzogene Tabletten, beispielsweise mit magensaftresistenten oder sich verzögert auflösenden oder unlöslichen Überzügen, die die Freisetzung der erfindungsgemäßen Verbindung kontrollieren), in der Mundhöhle schnell zerfallende Tabletten oder Filme/Oblaten, Filme/Lyophylisate, Kapseln (beispielsweise Hart- oder Weichgelatinekapseln), Dragees, Granulate, Pellets, Pulver, Emulsionen, Suspensionen, Aerosole oder Lösungen. Die parenterale Applikation kann unter Umgehung eines Resorptionsschrittes geschehen (z.B. intravenös, intraarteriell, intrakardial, intraspinal oder intralumbal) oder unter Einschaltung einer Resorption (z.B. intramuskulär, subcutan, intracutan, percutan oder intraperitoneal). Für die parenterale Applikation eignen sich als Applikationsformen u.a. Injektions- und Infusionszu- bereitungen in Form von Lösungen, Suspensionen, Emulsionen, Lyophilisaten oder sterilen Pulvern.

Bevorzugt ist die parenterale Applikation.

Für die sonstigen Applikationswege eignen sich z.B. Inhalationsarzneiformen (u.a. Pulverinhalatoren, Nebulizer), Nasentropfen, -lösungen, -sprays; lingual, sublingual oder buccal zu applizie- rende Tabletten, Filme/Oblaten oder Kapseln, Suppositorien, Ohren- oder Augenpräparationen, Vaginalkapseln, wässrige Suspensionen (Lotionen, Schüttelmixturen), lipophile Suspensionen, Salben, Cremes, transdermale therapeutische Systeme (wie beispielsweise Pflaster), Milch, Pasten, Schäume, Streupuder, Implantate oder Stents.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen können in die angeführten Applikationsformen überführt werden. Dies kann in an sich bekannter Weise durch Mischen mit inerten, nichttoxischen, pharmazeutisch geeigneten Hilfsstoffen geschehen. Zu diesen Hilfsstoffen zählen u.a. Trägerstoffe (beispielsweise mikrokristalline Cellulose, Laktose, Mannitol), Lösungsmittel (z.B. flüssige Poly- ethylenglycole), Emulgatoren und Dispergier- oder Netzmittel (beispielsweise Natrium- dodecylsulfat, Polyoxysorbitanoleat), Bindemittel (beispielsweise Polyvinylpyrrolidon), synthe- tische und natürliche Polymere (beispielsweise Albumin), Stabilisatoren (z.B. Antioxidantien wie beispielsweise Ascorbinsäure), Farbstoffe (z.B. anorganische Pigmente wie beispielsweise Eisenoxide) und Geschmacks- und / oder Geruchskorrigentien.

Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind Arzneimittel, die mindestens eine erfindungsgemäße Verbindung, vorzugsweise zusammen mit einem oder mehreren inerten nicht- toxischen, pharmazeutisch geeigneten Hilfsstoff enthalten, sowie deren Verwendung zu den zuvor genannten Zwecken.

Im Allgemeinen hat es sich als vorteilhaft erwiesen, bei parenteraler Applikation Mengen von etwa 5 bis 250 mg je 24 Stunden zur Erzielung wirksamer Ergebnisse zu verabreichen. Bei oraler Applikation beträgt die Menge etwa 5 bis 500 mg je 24 Stunden. Trotzdem kann es gegebenenfalls erforderlich sein, von den genannten Mengen abzuweichen, und zwar in Abhängigkeit von Körpergewicht, Applikationsweg, individuellem Verhalten gegenüber dem Wirkstoff, Art der Zubereitung und Zeitpunkt beziehungsweise Intervall, zu welchem die Applikation erfolgt.

Die Prozentangaben in den folgenden Tests und Beispielen sind, sofern nicht anders angegeben, Gewichtsprozente; Teile sind Gewichtsteile. Lösungsmittelverhältnisse, Verdünnungsverhältnisse und Konzentrationsangaben von flüssig/flüssig-Lösungen beziehen sich jeweils auf das Volumen. Die Angabe "w/v" bedeutet "weight/volume" (Gewicht/Volumen). So bedeutet beispielsweise " 10% w/v": 100 ml Lösung oder Suspension enthalten 10 g Substanz.

A) Beispiele Abkürzungen: bs / br. s. breites Singulett (bei NMR)

bd breites Duplett (bei NMR)

cat. katalytisch

CI chemische Ionisation (bei MS)

dd Dublett vom Dublett (bei NMR)

DMF Dimethylformamid

DMSO Dimethylsulfoxid

dt Dublett vom Triplett (bei NMR)

d. Th. der Theorie (bei Ausbeute)

EI Elektronenstoß-Ionisation (bei MS)

eq. Äquivalent(e)

ESI Elektrospray-Ionisation (bei MS)

h Stunde (n)

HATU 0-(7-Azabenzotriazol- 1 -yl)-NNN',N -tetramethyl-uronium- hexafluorophosphat

HPLC Hochdruck-, Hochleistungsflüssigchromatographie

LC-MS Flüssigchromatographie-gekoppelte Massenspektrometrie m Multiplett (bei NMR)

M molar

min Minute(n)

MS Massenspektrometrie

N normal

NMR Kernresonanzspektrometrie

q Quartett (bei NMR)

quant. quantitativ

quint Quintett (bei NMR)

RT Raumtemperatur

R _t Retentionszeit (bei HPLC)

s Singulett (bei NMR)

TFA Trifluoressigsäure

THF Tetrahydrofuran

UV Ultraviolett-Spektrometrie HPLC- und LC/MS-Methoden:

Methode 1 (LC-MS): Instrument: Waters Acquity UPLCMS SingleQuad; Säule: Acquity UPLC BEH C18 1.7 μηι, 50 mm x 2.1 mm; Eluent A: Wasser + 0.1% Ameisensäure (99%), Eluent B: Acetonitril; Gradient: 0-1.6 min 1-99% B, 1.6-2.0 min 99%o B; Fluss 0.8 ml/min; Temperatur: 60°C; DAD scan: 210-400 nm.

Methode 2 (LC-MS): Instrument: Waters Acquity UPLCMS SingleQuad; Säule: Acquity UPLC BEH C18 1.7 μηι, 50 mm x 2.1 mm; Eluent A: Wasser + 0.2%o wässriger Ammoniak (32%), Eluent B: Acetonitril; Gradient: 0-1.6 min 1-99% B, 1.6-2.0 min 99%o B; Fluss 0.8 ml/min; Temperatur: 60°C; DAD scan: 210-400 nm. Methode 3 (HPLC): System: Labomatic HD-3000 HPLC gradient pump, Labomatic Labocol Vario-2000 fraction collector; Säule: Chromatorex C-18 125 mm x 30 mm, Eluent A: 0.1%> Ameisensäure in Wasser, Eluent B: Acetonitril, Gradient: A 95% / B 5% — > A 55% / B 45%; Fluss: 150 ml/min; UV-Detektion: 254 nm.

Methode 4 (HPLC): System: Labomatic HD-3000 HPLC gradient pump, Labomatic Labocol Vario-2000 fraction collector; Säule: Chromatorex C-18 125 mm x 30 mm, Eluent A: 0.1%> Ameisensäure in Wasser, Eluent B: Acetonitril; Gradient: A 90% / B 10% -> A 50% / B 50%; Fluss: 150 ml/min; UV-Detektion: 254 nm.

Methode 5 (HPLC): System: Labomatic HD-3000 HPLC gradient pump, Labomatic Labocol Vario-2000 fraction collector; Säule: Chromatorex C-18 125 mm x 30 mm, Eluent A: 0.1%> Ameisensäure in Wasser, Eluent B: Acetonitril; Gradient: A 85% / B 15% -> A 45% / B 55%; Fluss: 150 ml/min; UV-Detektion: 254 nm.

Methode 6 (HPLC): System: Labomatic HD-3000 HPLC gradient pump, Labomatic Labocol Vario-2000 fraction collector; Säule: Chromatorex C-18 125 mm x 30 mm, Eluent A: 0.1%> Ameisensäure in Wasser, Eluent B: Acetonitril; Gradient: A 80% / B 20% -> A 40% / B 60%; Fluss: 150 ml/min; UV-Detektion: 254 nm.

Methode 7 (HPLC): System: Labomatic HD-3000 HPLC gradient pump, Labomatic Labocol Vario-2000 fraction collector; Säule: Chromatorex C-18 125 mm x 30 mm, Eluent A: 0.1% Ameisensäure in Wasser, Eluent B: Acetonitril; Gradient: A 70% / B 30% -> A 30% / B 70%; Fluss: 150 ml/min; UV-Detektion: 254 nm. Methode 8 (HPLC): System: Labomatic HD-3000 HPLC gradient pump, Labomatic Labocol Vario-2000 fraction collector; Säule: Chromatorex C-18 125 mm x 30 mm, Eluent A: 0.1% Ameisensäure in Wasser, Eluent B: Acetonitril; Gradient: A 60% / B 40%

Fluss: 150 ml/min; UV-Detektion: 254 nm.

Mikrowelle: Als Mikrowellenreaktor wurde ein Gerät vom Typ Biotage Initiator verwendet.

Bei Aufreinigungen von erfindungsgemäßen Verbindungen per präparativer HPLC nach den oben beschriebenen Methoden, in denen die Elutionsmittel Zusatzstoffe wie beispielsweise Trifluoressigsäure, Ameisensäure oder Ammoniak enthalten, können die erfindungsgemäßen Verbindungen in Salz-Form, beispielsweise als Trifluoracetat, Formiat oder Ammonium-Salz anfallen, sofern die erfindungsgemäßen Verbindungen eine ausreichend basische beziehungsweise saure Funktionalität enthalten. Ein solches Salz kann durch verschiedene dem Fachmann bekannte Methoden in die entsprechende freie Base beziehungsweise Säure überführt werden. Schwächere Salze können durch Zugabe von etwas Hydrochlorid in die entsprechenden Chloride überführt werden. Wenn bei den im Folgenden beschriebenen Synthese-Intermediaten und Ausführungsbeispielen der Erfindung eine Verbindung in der Form eines Salzes der korrespondierenden Base beziehungseise Säure aufgeführt ist, so ist die exakte stöchiometrische Zusammensetzung eines solchen Salzes, wie es nach dem jeweiligen Herstell- und/oder Reinigungsverfahren erhalten wurde, in der Regel nicht bekannt. Sofern nicht genauer spezifiziert, sind daher Namens- und Strukturformel-Zusätze wie beispielsweise "Hydrochlorid", "Trifluoracetat", "Natrium-Salz" bzw. "x HCl", "x CF3COOH", "x Na ⁺ " bei solchen Salzen nicht stöchiometrisch zu verstehen, sondern haben allein deskriptiven Charakter bezüglich der enthaltenen salzbildenden Komponenten.

Sinngemäß gleiches gilt für den Fall, dass Synthese-Intermediate oder Ausführungsbeispiele oder Salze hiervon nach den beschriebenen Herstell- und/oder Reinigungsverfahren in Form von Solvaten, wie beispielsweise Hydraten, erhalten wurden, deren stöchiometrische Zusammensetzung (sofern definierter Art) nicht bekannt ist.

Wenn die Ausgangsverbindungen und Beispiele als zentralen Baustein ein L-Phenylalanin-Derivat enthalten, ist das entsprechende Stereozentrum als (S)-Konfiguration beschrieben. Wenn nicht weiter angegeben, wurde nicht überprüft, ob in Einzelfällen bei der Kupplung der L-Phenylalanin- Intermediate mit dem Amin H2N-R ¹ eine teilweise Epimerisierung des Stereozentrums stattfand. Damit kann ein Gemisch der erfindungsgemäßen Verbindungen aus (S)-Enantiomer und (R)- Enantiomer vorliegen. Die Hauptkomponente ist das jeweils abgebildete (S)-Enantiomer. Ausgangsverbindungen

Beispiel 1A

Dimethyl- {[(3-brom-4-methylphenyl)amino]methylen}malonat

Eine Lösung von 9.44 g (49.2 mmol) 3-Brom-4-methylanilin und 11.14 g (63.98 mmol) Dimethylmethoxymethylenmalonat in 37 ml Xylen wurde 4 h bei 130°C gerührt und dann auf RT abgekühlt. Der Niederschlag wurde abgesaugt, mit Xylen gewaschen und getrocknet. Das Filtrat wurde eingeengt, der Rückstand in Methanol aufgeschlemmt, abgesaugt und getrocknet. Man erhielt 12.5 g (78% d. Th.) der Titelverbindung. Ή NMR (400 MHz, DMSO-rf ₆ ): δ = ppm 2.30 (s, 3 H), 3.66 (m, 3 H), 3.72 (br. s., 3 H), 7.32 (m, 2 H), 7.69 (d, 1 H), 8.35 (d, 1 H), 10.59 (m, 1 H).

LC-MS (Methode 1): R _t = 1.29 min; MS (ESIpos): m/z = 328.1 [M+H] ⁺ .

Beispiel 2A

Methyl-7-brom-6-methyl-4-oxo- 1 ,4-dihydrochinolin-3-carboxylat

Eine Suspension von 12.8 g (39.1 mmol) Dimethyl- {[(3-brom-4-methylphenyl)amino]methylen}- malonat in 75 ml Diphenylether wurde 2 h auf 250°C erhitzt und anschließend auf RT abgekühlt. Die Reaktionsmischung wurde mit Toluol versetzt und der Niederschlag abgesaugt. Der Niederschlag wurde mit wenig Toluol gewaschen und getrocknet. Filtrat und Waschlösung wurden vereint und ein Teil des Toluols wurde abdestilliert. Die verbliebene Lösung wurde erneut 2 h bei 250°C gerührt. Nach Abkühlen auf RT wurde mit Hexan versetzt und der entstandene Niederschlag abgesaugt, mit Hexan gewaschen und getrocknet. Man erhielt 6.9 g (60% d. Th.) der Titelverbindung.

Ή NMR (300 MHz, DMSO-rf ₆ ): δ = ppm 2.45 (s, 3 H), 3.74 (s, 3 H), 7.87 (s, 1 H), 8.07 (s, 1 H), 8.59 (s, 1 H). LC-MS (Methode 1): R _t = 0.82 min; MS (ESIpos): m/z = 296.0 [M+H] ⁺ . Beispiel 3A

Methyl-7-brom-6-methyl-4-oxo- 1 - { [2-(trimethylsilyl)ethoxy]methyl} - 1 ,4-dihydrochinolin-3- carboxylat

Eine Lösung von 3.92 g (13.24 mmol) Methyl-7-brom-6-methyl-4-oxo-l,4-dihydrochinolin-3- carboxylat in 135 ml THF wurde mittels Eisbad auf 0°C gekühlt und mit 1.06 g (26.5 mmol, 60%oig) Natriumhydrid versetzt und 30 min bei RT gerührt. Anschließend wurden 3.31 g (19.9 mmol) Trimethylsilylethoxymethylchlorid zugesetzt und die Reaktionsmischung über Nacht bei RT gerührt. Dann wurde eingeengt und der Rückstand chromatographisch via Kieselgel (Laufmittel Hexan/Essigsäureethylester Gradient) gereinigt. Man erhielt 1.05 g (18% d. Th.) der Titelverbindung.

Ή NMR (300 MHz, DMSO-rf ₆ ): δ = ppm -0.10 (s, 9 H), 0.68 - 0.94 (m, 2 H), 2.48 (s, 3 H), 3.50 - 3.63 (m, 2 H), 3.77 (s, 3 H), 5.74 (s, 2 H), 8.06 (s, 1 H), 8.09 - 8.24 (m, 1 H), 8.81 (s, 1 H).

LC-MS (Methode 1): R _t = 1.40 min; MS (ESIpos): m/z = 428.1 [M+H] ⁺ . Beispiel 4A

Methyl-6-methyl-4-oxo-7-(4,4,5,5-tetramethyl-l ,3,2-dioxaborolan-2-yl)- 1 - { [2-(trimethylsilyl)- ethoxy]methyl} - 1 ,4-dihydrochinolin-3-carboxylat

Eine Lösung von 500 mg (1.05 mmol) Methyl-7-brom-6-methyl-4-oxo-l- {[2-(trimethylsilyl)- ethoxy]methyl}-l,4-dihydrochinolin-3-carboxylat und 402 mg (1.6 mmol) 4,4,4',4',5,5,5',5'- Octamethyl-2,2'-bi-l,3,2-dioxaborolan in 10 ml Dimethylformamid wurde mit 259 mg (3.15 mmol) Kaliumacetat und 82 mg (0.1 mmol) l,r-Bis(diphenylphosphin)ferrocendichloropalladium(II) versetzt. Die Reaktionsmischung wurde 2 h bei 110°C gerührt, zur Trockne eingeengt und der Rückstand chromatographisch via Biotage (Gradient: Hexan/Essigsäureethylester) gereinigt. Man erhielt 102 mg (21 % d. Th.) der Titelverbindung.

Ή NMR (300 MHz, DMSO-i ): δ = ppm -0.1 1 (s, 9 H), 0.80 - 0.89 (m, 2 H), 1.34 (s, 12 H), 2.56 - 2.61 (m, 3 H), 3.57 - 3.64 (m, 2 H), 3.78 (s, 3 H), 5.72 (s, 2 H), 7.99 (s, 1 H), 8.05 (s, 1 H), 8.82 (s, 1 H).

LC-MS (Methode 1): R _t = 1.60 min; MS (ESIpos): m/z = 474.3 [M+H] ⁺ Beispiel 5A

7-(4- {(2iS)-2-[(fer?-Butoxycarbonyl)amino]-2-carboxyethyl}phenyl) -6-methyl-4-oxo-l-{[2- (trimethylsilyl)ethoxy]methyl} - 1 ,4-dihydrochinolin-3-carbonsäure

Eine Lösung von lg (2.9 mmol) 4-Brom-N-(tert-butoxycarbonyl)-L-phenylalanin und 1.51 g (3.2 mmol) Methyl-6-methyl-4-oxo-7-(4,4,5,5-tetramethyl-l,3,2-dioxaboro lan-2-yl)-l- {[2-(trimethyl- silyl)ethoxy]methyl}-l,4-dihydrochinolin-3-carboxylat in 30 ml Dimethylsulfoxid wurde mit 212 mg (0.29 mmol) [(Di(l-adamantyl)-butylphosphin)-2-(2'-amino-l, -biphenyl)]palladium(II) methanesulfonat (cataCXium-A-Pd-G3), 1.9 g (8.7 mmol) Kaliumphosphat und 4.4 ml (243 mmol) Wasser versetzt und 1 h bei 90°C gerührt. Anschließend wurde die Reaktionsmischung mit 5.8 ml 2 N Lithiumhydroxid Lösung versetzt und 16 h bei RT gerührt. Zur Aufarbeitung wurde mit Wasser versetzt, mit 2 N Salzsäure auf pH 3 eingestellt und der Niederschlag abgesaugt. Der Rückstand wurde mit Wasser gewaschen und im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 1.1 g (64% d. Th.) der Titelverbindung.

'H NMR (300 MHz, DMSO-i ): δ = ppm -0.12 (s, 9 H), 0.75 - 0.90 (m, 2 H), 1.35 (s, 9 H), 2.31 - 2.40 (m, 3 H), 2.95 - 3.03 (m, 1 H), 3.09 - 3.18 (m, 1 H), 3.52 - 3.60 (m, 2 H), 3.71 - 3.78 (m, 1 H), 5.71 - 5.81 (m, 2 H), 5.85 - 5.92 (m, 1 H), 7.20 - 7.31 (m, 4 H), 7.58 - 7.65 (m, 1 H), 8.20 (s, 1 H), 8.88 - 8.98 (m, 1 H).

LC-MS (Methode 2): R _t = 0.64 min; MS (ESIpos): m/z = 597.2 [M+H] ⁺ .

Beispiel 6A

7- {4-[(2iS)-2-[(fert-Butoxycarbonyl)amino]-3- {[3-chlor-4-(methylcarbamoyl)phenyl]amino}-3- oxopropyl]phenyl} -6-methyl-4-oxo- 1 - {[2-(trimethylsilyl)ethoxy]methyl} - 1 ,4-dihydrochinolin-3- carbonsäure

Eine Lösung von 864 mg (1.45 mmol) 7-(4- {(2iS)-2-[(fert-Butoxycarbonyl)amino]-2- carboxyethyl}phenyl)-6-methyl-4-oxo- 1 - {[2-(trimethylsilyl)ethoxy]methyl} - 1 ,4-dihydrochinolin-3- carbonsäure und 294 mg (1.6 mmol) 4-Amino-2-chlor-N-methylbenzamid in 13 ml Dimethylformamid wurde mit 0.76 ml (4.3 mmol) Ν,Ν-Diisopropylethylamin und 3.45 ml (5.8 mmol, 50%ig in Essigsäureethylester) 2,4,6-Tripropyl-l,3,5,2,4,6-trioxatriphosphorinan-2,4,6- trioxid versetzt. Die Reaktionsmischung rührte 16 h bei RT und wurde anschließend mit Wasser versetzt. Der Niederschlag wurde abgesaugt, mit Wasser gewaschen, getrocknet und chromatographisch via HPLC (Methode 5) gereinigt. Man erhielt 110 mg (10% d. Th.) der Titelverbindung.

Ή NMR (300 MHz, DMSO-rfe): δ = ppm -0.12 (s, 9 H), 0.76 - 0.94 (m, 2 H), 1.34 (s, 9 H), 2.38 (s, 3 H), 2.75 (d, 3 H), 2.89 - 2.99 (m, 1 H), 3.04 - 3.14 (m, 1 H), 3.61 (s, 2 H), 4.32 - 4.48 (m, 1 H), 5.94 (s, 2 H), 7.25 - 7.58 (m, 7 H), 7.80 (s, 2 H), 8.28 (s, 2 H), 9.19 (s, 1 H), 10.28 - 10.49 (m, 1 H). LC-MS (Methode 1): R _t = 1.39 min; MS (ESIpos): m/z = 763.2 [M+H] ⁺ . Beispiel 7A

7- {4-[(2iS)-2-Amino-3-{[3-chlor-4-(methylcarbamoyl)phenyl]amin o}-3-oxopropyl]phenyl}-6- methyl-4-οχο- 1 ,4-dihydrochinolin-3-carbonsäure-Hydrochlorid

Eine Suspension von 34.7 mg (0.045 mmol) 7- {4-[(2S)-2-[(tert-Butoxycarbonyl)amino]-3- {[3- chlor-4-(methylcarbamoyl)phenyl]amino} -3-oxopropyl]phenyl} -6-methyl-4-oxo- 1 - {[2- (trimethylsilyl)ethoxy]methyl}-l,4-dihydrochinolin-3-carbons äure in 1 ml Dichlormethan wurde mit 0.02 ml (0.09 mmol) einer 4M Hydrochlorid-Lösung in 1,4-Dioxan versetzt und 48 h bei RT gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde mit 5 ml Acetonitril versetzt, der entstandene Niederschlag abgesaugt und im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 17 mg (67% d. Th.) der Titelverbindung.

Ή NMR (300 MHz, DMSO-rfe): δ = ppm 2.33 (s, 3 H), 2.75 (d, 3 H), 3.14 - 3.32 (m, 2 H), 4.25 4.40 (m, 1 H), 7.44 (m, 7 H), 7.57 - 7.66 (m, 1 H), 7.73 - 7.82 (m, 1 H), 8.15 - 8.25 (m, 1 H), 8.24 8.36 (m, 1 H), 8.39 - 8.56 (m, 3 H), 8.81 - 8.95 (m, 1 H), 11.02 - 11.14 (m, 1 H).

LC-MS (Methode 1): R _t = 0.72 min; MS (ESIpos): m/z = 533.1 [M+H-HC1] ⁺ .

Beispiel 8A

7- {4-[(2iS)-2- {[(?ra«5-4-{[(fer?-Butoxycarbonyl)amino]methyl}cyclohexyl)c arbonyl]amino} chlor-4-(methylcarbamoyl)phenyl]amino} -3-oxopropyl]phenyl} -6-methyl-4-oxo- 1 ,4- dihydrochinolin-3-carbonsäure

Eine Suspension von 17 mg (0.031 mmol) 7-{4-[(2iS)-2-Amino-3- {[3-chlor-4-(methylcarbamoyl)- phenyljamino} -3-oxopropyl]phenyl} -6-methyl-4-oxo- 1 ,4-dihydrochinolin-3-carbonsäure- Hydrochlorid, 24 mg (0.092 mmol) ?ra«5-4-{[(fert-Butoxycarbonyl)amino]methyl}- cyclohexancarbonsäure und 22 μΐ (0.12 mmol) Ν,Ν-Diisopropylethylamin in 10 ml Essigsäureethylester wurde mit 49 mg (0.077 mmol, 50%ig in Essigsäureethylester) 2,4,6- Tripropyl-l,3,5,2,4,6-trioxatriphosphorinan-2,4,6-trioxid versetzt und 16 h bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit Wasser versetzt und der Feststoff abgesaugt und mit wenig Wasser gewaschen und getrocknet. Man erhielt 9.5 mg (40% d. Th.) der Titelverbindung. Ή NMR (300 MHz, DMSO-rf ₆ ): δ = ppm 0.76 - 0.99 (m, 4 H), 1.37 (s, 9 H), 1.44 - 1.60 (m, 3 H), 1.61 - 1.74 (m, 4 H), 1.81 - 1.90 (m, 1 H), 2.06 - 2.17 (m, 1 H), 2.27 - 2.36 (m, 6 H), 2.64 - 2.70 (m, 2 H), 2.71 - 2.80 (m, 6 H), 2.91 - 3.01 (m, 2 H), 3.08 - 3.15 (m, 2 H), 4.65 - 4.77 (m, 1 H), 6.63 - 6.86 (m, 1 H), 7.27 - 7.35 (m, 2 H), 7.38 - 7.43 (m, 3 H), 7.47 - 7.57 (m, 2 H), 7.79 - 7.85 (m, 1 H), 8.09 - 8.16 (m, 1 H), 8.17 - 8.22 (m, 1 H), 8.24 - 8.32 (m, 1 H), 8.77 - 8.89 (m, 1 H), 10.27 - 10.41 (m, 1 H).

LC-MS (Methode 1): R _t = 1.14 min; MS (ESIpos): m/z = 772.2 [M+H] ⁺ .

Beispiel 9A

6-Amino-4-chlor-l,3-dihydro-2_f/-benzimidazol-2-on

5 g (22.9 mmol) 4-Chlor-6-nitro-2,3-dihydro-lH-l,3-benzodiazol-2-on wurden in 350 ml Methanol/THF 6: 1 gelöst und mit 1 g Palladium/Kohle (10%ig, ca. 50% wasserfeucht) versetzt. Anschließend wurde bei RT 1 h Wasserstoff eingeleitet. Der Katalysator wurde abfiltriert und der Rückstand mit jeweils 150 ml Methanol und THF nachgewaschen. Das Filtrat wurde einrotiert. Man erhielt 4.2 g (quant.) der Titelverbindung.

Ή NMR (300 MHz, DMSO-rf ₆ ): δ = ppm 4.90 (br. s., 2 H), 6.18 (d, 1 H), 6.22 (d, 1 H), 10.46 (s, 1 H), 10.51 (s, 1 H).

LC-MS (Methode 2): R _t = 0.48 min; MS (ESIpos): m/z = 183.9 [M+H] ⁺ . Beispiel 10A

4-Brom-N-a/ ?Äa-(fer?-butoxycarbonyl)-N-(7-chlor-2-oxo-2,3-dihydro-l/ -benzimidazol-5-yl)-L- phenylalaninamid

Eine Lösung von 1.22 g (3.5 mmol) 4-Brom-N-(ter?-butoxycarbonyl)-L-phenylalanin , 714 mg (3.9 mmol) 6-Amino-4-chlor-l,3-dihydro-2_f/-benzimidazol-2-on und 1.85 ml (10.6 mmol) N,N- Diisopropylethylamin in 15 ml Essigsäureethylester wurde mit 5.2 ml (8.8 mmol, 50%ig in Essigsäureethylester) 2,4,6-Tripropyl- 1 ,3,5,2,4,6-trioxatriphosphorinan-2,4,6-trioxid versetzt und 2 h bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit Wasser versetzt, der Niederschlag abgesaugt, mit Wasser gewaschen und getrocknet. Man erhielt 1.35 g (67% d. Th.) der Titelverbindung.

Ή NMR (300 MHz, DMSO-ok): δ = ppm 1.31 (s, 9 H), 2.72 - 2.87 (m, 1 H), 2.88 - 2.98 (m, 1 H), 4.16 - 4.32 (m, 1 H), 7.05 - 7.32 (m, 5 H), 7.47 (d, 2 H), 9.80 - 10.14 (m, 1 H), 10.84 (s, 1 H), 11.03 (s, 1 H).

LC-MS (Methode 1): R _t = 1.15 min; MS (ESIpos): m/z = 511.1 [M+H] ⁺ . Beispiel IIA 4-Brom-A^-(7-chlor-2-oxo-2,3-dihydro-l/ -benzimidazol-5-yl)-L-phenylalaninamid-Hydrochlorid

Eine Suspension von 1.35 g (2.66 mmol) 4-Brom-N-alpha-(tert-butoxycarbonyl)-N-(7-chlor-2-oxo- 2,3-dihydro-lH-benzimidazol-5-yl)-L-phenylalaninamid in 30 ml Dichlormethan wurde mit 3.3 ml (13.3 mmol) einer 4M Hydrochlorid-Lösung in 1,4-Dioxan versetzt und 2 h bei RT gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde mit Acetonitril versetzt, der entstandene Niederschlag abgesaugt und im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 1.08 g (94% d. Th.) der Titelverbindung.

^: H NMR (300 MHz, DMSO-rf ₆ ): 5 = ppm 3.03 - 3.11 (m, 1 H), 3.16 - 3.24 (m, 1 H), 3.57 (s, 1 H), 3.85 (br. s., 3 H), 4.20 - 4.29 (m, 1 H), 7.26 - 7.32 (m, 4 H), 7.53 (d, 2 H), 8.38 (d, 3 H), 10.94 (d, 1 H), 11.01 (s, 1 H), 11.13 (s, 1 H). LC-MS (Methode 1): R _t = 0.69 min; MS (ESIpos): m/z = 411.1 [M+H-HC1] ⁺ .

Beispiel 12A

4-Brom- V-a/ 7Äa-[(?ra«5-4-{[(fer?-butoxycarbonyl)amino]methyl}cyclohex yl)carbonyl]- V-(7-chlor- 2-oxo-2,3-dihydro-l/ -benzimidazol-5-yl)-L-phenylalaninamid

Eine Suspension von 1.08 g (2.63 mmol) 4-Brom- V-(7-chlor-2-oxo-2,3-dihydro-l/ -benzimidazol- 5-yl)-L-phenylalaninamid-Hydrochlorid, 800 mg (3.1 mmol) ?ra«s-4-{[(fert-Butoxycarbonyl)- amino]methyl}cyclohexancarbonsäure und 2.7 ml (15.5 mmol) Ν,Ν-Diisopropylethylamin in 15 ml Essigsäureethylester wurde mit 4.9 ml (8.4 mmol, 50%ig in Essigsäureethylester) 2,4,6- Tripropyl-l,3,5,2,4,6-trioxatriphosphorinan-2,4,6-trioxid versetzt, 16 h bei RT und 1 h unter Rückfluß gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit Wasser versetzt und der Niederschlag abgesaugt, mit Wasser gewaschen und getrocknet. Man erhielt 1.71 g (69% d. Th.) der Titelverbindung. LC-MS (Methode 1): R _t = 1.20 min; MS (ESIpos): m/z = 650.5 [M+H] ⁺ . Beispiel 13A

Methyl-7-(4- {(2iS)-2- {[(?ra«5-4-{[(fert-butoxycarbonyl)amino]methyl}cyclohexyl)c arbonyl]- amino}-3-[(7-chlor-2-oxo-2,3-dihydro-l/ -benzimidazol-5-yl)amino]-3-oxopropyl}phenyl)-6- methyl-4-οχο- 1 - { [2-(trimethylsilyl)ethoxy]methyl} - 1 ,4-dihydrochinolin-3-carboxylat

Eine Lösung von 500 mg (0.77 mmol) 4-Brom- V-a/ ?Äa-[(?ra«5-4-{[(fert-butoxycarbonyl)- amino]methyl}cyclohexyl)carbonyl]- V-(7-chlor-2-oxo-2,3-dihydro-l/ -benzimidazol-5-yl)-L- phenylalaninamid und 401 mg (0.85 mmol) Methyl-6-methyl-4-oxo-7-(4,4,5,5-tetramethyl-l,3,2- dioxaborolan-2-yl)- 1 - {[2-(trimethylsilyl)ethoxy]methyl} - 1 ,4-dihydrochinolin-3-carboxylat in 5 ml Dimethylsulfoxid wurde mit 63 mg (0.077 mmol) l,r-Bis(diphenylphosphin)ferrocen- dichlo alladium(II), 245 mg (2.3 mmol) Natriumcarbonat und 1.16 ml (64 mmol) Wasser versetzt und 90 min bei 90°C gerührt. Zur Aufarbeitung wurde mit Wasser versetzt und der Niederschlag abgesaugt. Der Rückstand wurde mit Wasser gewaschen, getrocknet und chromatographisch via HPLC (Methode 7) gereinigt. Man erhielt 286 mg (41% d. Th.) der Titelverbindung. Ή NMR (300 MHz, DMSO-i ): δ = ppm -0.15 (s, 9 H), 0.73 - 0.89 (m, 4 H), 1.07 - 1.31 (m, 4 H), 1.37 (s, 9 H), 1.50 - 1.75 (m, 5 H), 2.06 - 2.16 (m, 1 H), 2.30 (s, 3 H), 2.71 - 2.80 (m, 2 H), 2.88 - 2.99 (m, 1 H), 3.05 - 3.16 (m, 1 H), 3.52 - 3.63 (m, 2 H), 3.77 (s, 3 H), 4.65 - 4.72 (m, 1 H), 5.68 - 5.81 (m, 2 H), 6.74 - 6.85 (m, 1 H), 7.23 (s, 1 H), 7.29 - 7.44 (m, 6 H), 7.60 (s, 1 H), 8.08 (s, 1 H), 8.14 - 8.20 (m, 1 H), 8.83 (s, 1 H), 10.11 (s, 1 H), 10.89 (s, 1 H), 11.02 - 11.17 (m, 1 H). LC-MS (Methode 1): R _t = 1.28 min; MS (ESIpos): m/z = 915.3 [M+H] ⁺ .

Beispiel 14A

7-(4- {(2iS)-2- {[(?ra«5-4-{[(fert-Butoxycarbonyl)amino]methyl}cyclohexyl)c arbonyl]amino}-3-[(7- chlor-2-oxo-2,3-dihydro-l/ -benzimidazol-5-yl)amino]-3-oxopropyl}phenyl)-6-methyl-4-oxo -l- {[2-(trimethylsilyl)ethoxy]methyl} - 1 ,4-dihydrochinolin-3-carbonsäure

CH, O Cl

Eine Lösung von 156 mg (0.17 mmol) Methyl-7-(4- {(2iS)-2- {[(?ra«5-4-{[(fer?-butoxycarbonyl)- amino]methyl} cyclohexyl)carbonyl]amino} -3-[(7-chlor-2-oxo-2,3-dihydro- l/ -benzimidazol-5- yl)amino]-3-oxopropyl}phenyl)-6-methyl-4-oxo-l- {[2-(trimethylsilyl)ethoxy]methyl} -l,4- dihydrochinolin-3-carboxylat in 3 ml DMSO wurde mit 0.25 ml (0.51 mmol) 2 N Natriumhydroxid Lösung versetzt und 16 h bei RT sowie 3 h bei 40°C gerührt. Die Suspension wurde mit Essigsäureethylester versetzt, der Feststoff abgesaugt, mit Essigsäureethylester gewaschen und getrocknet. Der Rückstand wurde chromatographisch via HPLC (Methode 8) gereinigt. Man erhielt 21.1 mg (14% d. Th.) der Titelverbindung.

LC-MS (Methode 1): R _t = 1.33 min; MS (ESIpos): m/z = 901.5 [M+H] ⁺ . Beispiel 15A

4-Brom-N-a/ ?Äa-(fer?-butoxycarbonyl)-N- {3-fluor-4-[(methoxycarbonyl)amino]phenyl}-L- phenylalaninamid

Eine Lösung von 1.34 g (3.9 mmol) 4-Brom-N-(ter?-butoxycarbonyl)-L-phenylalanin , 790 mg (3.9 mmol) Methyl-N-(4-amino-2-fluor-phenyl)carbamat und 2.0 ml (11.7 mmol) N,N- Diisopropylethylamin in 15 ml Essigsäureethylester wurde mit 5.7 ml (9.75 mmol, 50%ig in Essigsäureethylester) 2,4,6-Tripropyl- 1 ,3,5,2,4,6-trioxatriphosphorinan-2,4,6-trioxid versetzt und 2 h bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit Wasser versetzt, der Niederschlag abgesaugt, mit Wasser gewaschen und getrocknet. Man erhielt 1.79 g (85% d. Th.) der Titelverbindung.

Ή NMR (300 MHz, DMSO-i ): δ = ppm 1.30 (s, 9 H), 2.75 - 2.85 (m, 1 H), 2.90 - 2.99 (m, 1 H), 3.63 (s, 3 H), 4.21 - 4.31 (m, 1 H), 7.15 (d, 1 H), 7.19 - 7.32 (m, 3 H), 7.47 (m, 3 H), 7.60 (dd, 1 H), 9.16 (br. s., 1 H), 10.19 (s, 1 H).

LC-MS (Methode 1): R _t = 1.27 min; MS (ESIpos): m/z = 510.2 [M+H] ⁺ . Beispiel 16A

4-Brom-N- { 3 -fluor-4- [(methoxycarbon^

Eine Suspension von 1.79 g (3.5 mmol) 4-Brom-N-a/ ?Äa-(fert-butoxycarbonyl)-N- {3-fluor-4- [(methoxycarbonyl)amino]phenyl}-L-phenylalaninamid in 30 ml Dichlormethan wurde mit 4.4 ml (17.5 mmol) einer 4M Hydrochlorid-Lösung in 1,4-Dioxan versetzt und 6 h bei RT sowie 4 h bei 40°C gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde mit Acetonitril versetzt, der entstandene Niederschlag abgesaugt und im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 1.37 g (95% d. Th.) der Titelverbindung.

'H NMR (300 MHz, DMSO-rf ₆ ): 5 = ppm 3.01 - 3.11 (m, 1 H), 3.15 - 3.24 (m, 1 H), 3.64 (s, 3 H), 4.16 - 4.30 (m, 1 H), 7.22 - 7.30 (m, 3 H), 7.47 - 7.54 (m, 3 H), 7.55 - 7.62 (m, 1 H), 8.37 (br. s., 3 H), 9.18 - 9.29 (m, 1 H), 11.05 (s, 1 H).

LC-MS (Methode 1): R _t = 0.81 min; MS (ESIpos): m/z = 410.2 [M+H-HC1] ⁺ . Beispiel 17A

4-Brom-N-a/ ?Äa-[(?ra«5-4-{[(fert-butoxycarbonyl)amino]methyl}cyclohex yl)carbonyl]-N- {3- fluor-4-[(methoxycarbonyl)amino]phenyl} -L-phenylalaninamid

Eine Suspension von 1.37 g (3.3 mmol) 4-Brom-N- {3-fluor-4-[(methoxycarbonyl)amino]phenyl}- L-phenylalaninamid-Hydrochlorid, 1.17 g (4.55 mmol) ?ra«5-4-{[(fert-Butoxycarbonyl)amino]- methyl}cyclohexancarbonsäure und 2.6 ml (15.2 mmol) Ν,Ν-Diisopropylethylamin in 18 ml Essigsäureethylester wurde mit 6.3 ml (10.6 mmol, 50%ig in Essigsäureethylester) 2,4,6- Tripropyl-l,3,5,2,4,6-trioxatriphosphorinan-2,4,6-trioxid versetzt, 16 h bei RT und 2 h unter Rückfluß gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit Wasser versetzt und der Niederschlag abgesaugt, mit Wasser sowie etwas Essigsäureethylester gewaschen und getrocknet. Man erhielt 3.13 g (87% d. Th., Reinheit: 83%) der Titelverbindung.

LC-MS (Methode 1): R _t = 1.35 min; MS (ESIpos): m/z = 651.3 [M+H] ⁺ .

Beispiel 18A

Methyl-7- {4-[(2iS)-2- {[(?ra«5-4-{[(fer?-butoxycarbonyl)amino]methyl}cyclohexyl)c arbonyl]- amino} -3-( {3-fluor-4-[(methoxycarbonyl)amino]phenyl} amino)-3-oxopropyl]phenyl} -6-methyl-4- oxo- 1 - { [2-(trimethylsilyl)ethoxy]methyl} - 1 ,4-dihydrochinolin-3-carboxylat

Eine Lösung von 245 mg (0.38 mmol) 4-Brom-N-a/ ?Äa-[(?ra«5-4-{[(fer?-butoxycarbonyl)amino]- methyl}cyclohexyl)carbonyl]-N-{3-fluor-4-[(methoxycarbonyl)a mino]phenyl}-L-phenyl- alaninamid und 196.5 mg (0.42 mmol) Methyl-6-methyl-4-oxo-7-(4,4,5,5-tetramethyl-l,3,2- dioxaborolan-2-yl)- 1 - { [2-(trimethylsilyl)ethoxy]methyl} - 1 ,4-dihydrochinolin-3-carboxylat in 3.5 ml Dimethylsulfoxid wurde mit 31 mg (0.038 mmol) l,l'-Bis(diphenylphosphin)ferrocen- dichlo alladium(II), 120 mg (1.1 mmol) Natriumcarbonat und 0.5 ml (27.7 mmol) Wasser versetzt und 2 h bei 90°C gerührt. Zur Aufarbeitung wurde filtriert und chromatographisch via HPLC (Methode 7) gereinigt. Man erhielt 138 mg (28%o d. Th.) der Titelverbindung. LC-MS (Methode 1): R _t = 1.42 min; MS (ESIpos): m/z = 916.6 [M+H] ⁺ . Beispiel 19A

7- {4-[(2iS)-2- {[(?ra«5-4-{[(fer?-Butoxycarbonyl)amino]methyl}cyclohexyl)c arbonyl]amino}-3-({3- fluor-4-[(methoxycarbonyl)amino]phenyl}amino)-3-oxopropyl]ph enyl}-6-methyl-4-oxo-l- {[2- (trimethylsilyl)ethoxy]methyl} - 1 ,4-dihydrochinolin-3-carbonsäure

Eine Lösung von 138 mg (0.15 mmol) Methyl-7- {4-[(2iS)-2- {[(?ra«5-4-{[(fer?-butoxycarbonyl)- amino]methyl} cyclohexyl)carbonyl]amino} -3-( {3-fluor-4-[(methoxycarbonyl)amino]phenyl} - amino)-3-oxopropyl]phenyl} -6-methyl-4-oxo- 1 - {[2-(trimethylsilyl)ethoxy]methyl} - 1 ,4- dihydrochinolin-3-carboxylat in 3 ml DMSO wurde mit 0.1 ml (0.3 mmol) 2 N Natriumhydroxid Lösung versetzt und 16 h bei RT gerührt. Die Suspension wurde mit Essigsäureethylester versetzt, der Feststoff abgesaugt, mit wenig Essigsäureethylester gewaschen und getrocknet. Die Dimethylsulfoxid/Wasser und Essigsäureethylester Phasen wurden getrennt und die wässerige Phase mit Essigsäureethylester extrahiert. Die vereinten organischen Phasen wurden über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und eingeengt. Man erhielt in Summe 74 mg (41 % d. Th.) der Titelverbindung.

LC-MS (Methode 1): Rt = 1.41 min; MS (ESIpos): m/z = 903.1 [M+H] ⁺ . Ausführungsbeispiele

Beispiel 1

7- {4-[(2iS)-2-({[?ra«5-4-(Aminomethyl)cyclohexyl]carbonyl}ami no)-3- {[3-chlor-4-(m

carbamoyl)phenyl]amino} -3-oxopropyl]phenyl} -6-methyl-4-oxo- 1 ,4-dihydrochinolin-3- carbonsäure-Hydrochlorid

Eine Suspension von 9.5 mg (0.012 mmol) 7- {4-[(2S)-2- {[(trans-4- {[(tert-Butoxycarbonyl)amino]- methyl}cyclohexyl)carbonyl]ammo}-3- {[3-chlor-4-(methylcarbamoyl)phenyl]amino}-3- oxopropyl]phenyl}-6-methyl-4-oxo-l,4-dihydrochinolin-3-carbo nsäure in 0.5 ml Dichlormethan wurde mit 0.015 ml (0.063 mmol) einer 4M Hydrochlorid-Lösung in 1 ,4-Dioxan versetzt, 16 h bei RT und 1 h bei 40°C gerührt. Die Suspension wurde zur Trockene eingeengt und im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 4.5 mg (52% d. Th.) der Titelverbindung.

Ή NMR (300 MHz, DMSO-rf ₆ ): δ = ppm 0.86 - 0.99 (m, 2 H), 1.11 - 1.22 (m, 1 H), 1.23 - 1.34 (m, 1 H), 1.43 - 1.53 (m, 1 H), 1.55 - 1.63 (m, 1 H), 1.69 - 1.82 (m, 3 H), 2.11 - 2.21 (m, 1 H), 2.33 (s, 3 H), 2.61 - 2.67 (m, 2 H), 2.75 (d, 3 H), 2.93 - 3.01 (m, 1 H), 3.12 - 3.19 (m, 1 H), 4.70 - 4.78 (m, 1 H), 7.32 - 7.38 (m, 2 H), 7.39 - 7.46 (m, 3 H), 7.50 - 7.54 (m, 1 H), 7.60 (s, 1 H), 7.72 - 7.80 (m, 3 H), 7.83 - 7.86 (m, 1 H), 8.20 (s, 1 H), 8.24 - 8.31 (m, 2 H), 8.89 (d, 1 H), 10.47 - 10.52 (m, 1 H), 13.47 - 13.55 (m, 1 H).

LC-MS (Methode 1): R _t = 0.79 min; MS (ESIpos): m/z = 672.2 [M+H-HC1] ⁺ . Beispiel 2

7-(4- {(2iS)-2-({[?ra«5-4-(Aminomethyl)cyclohexyl]carbonyl}amino) -3-[(7-chlor-2-oxo-2,^ dihydro- l/ -benzimidazol-5-yl)arnino]-3-oxopropyl}phenyl)-6-methyl-4-ox o- 1 ,4-dihydrochinolin- 3 - c arbons äure -Hydrochlorid

Eine Suspension von 26.5 mg (0.03 mmol) 7-(4- {(2iS)-2- {[(?ra«5-4-{[(fert-Butoxycarbonyl)amino]- methyl}cyclohexyl)carbonyl]amino}-3-[(7-chlor-2-oxo-2,3-dihy dro-l/ -benzimidazol-5-yl)amino]- 3-oxopropyl}phenyl)-6-methyl-4-oxo- 1 - {[2-(trimethylsilyl)ethoxy]methyl} - 1 ,4-dihydrochinolin-3- carbonsäure in 1.5 ml Dichlormethan wurde mit 0.022 ml (0.09 mmol) einer 4M Hydrochlorid- Lösung in 1,4-Dioxan versetzt, 16 h bei RT und anschließend 1 h bei 40°C gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde mit 5 ml Acetonitril versetzt, der entstandene Niederschlag abgesaugt und chromatographisch via HPLC (Methode 4) gereinigt. Man erhielt 14 mg (70% d. Th.) der Titelverbindung.

Ή NMR (300 MHz, DMSO-i ): δ = ppm 0.86 - 1.00 (m, 2 H), 1.1 1 - 1.23 (m, 1 H), 1.23 - 1.35 (m, 1 H), 1.42 - 1.53 (m, 1 H), 1.53 - 1.62 (m, 1 H), 1.69 - 1.81 (m, 3 H), 2.1 1 - 2.20 (m, 1 H), 2.30 - 2.38 (m, 3 H), 2.62 - 2.67 (m, 2 H), 2.91 - 3.00 (m, 1 H), 3.09 - 3.16 (m, 1 H), 4.66 - 4.74 (m, 1 H), 7.25 - 7.27 (m, 1 H), 7.29 - 7.32 (m, 1 H), 7.35 (d, 2 H), 7.43 (d, 2 H), 7.58 - 7.63 (m, 1 H), 7.66 - 7.82 (m, 3 H), 8.15 - 8.29 (m, 2 H), 8.88 - 8.96 (m, 1 H), 10.16 (s, 1 H), 10.90 (s, 1 H), 1 1.08 (s, 1 H), 13.37 - 13.53 (m, 1 H). LC-MS (Methode 1): R _t = 0.74 min; MS (ESIpos): m/z = 671.4 [M+H-HC1] ⁺ . Beispiel 3

7- {4-[(2iS)-2-({[?ra«5-4-(Aminomethyl)cyclohexyl]carbonyl}ami no)-3-({3-fluor-4- [(methoxycarbonyl)amino]phenyl} amino)-3-oxopropyl]phenyl} -6-methyl-4-oxo- 1 ,4- dihydrochinolin-3-carbonsäure-Hydrochlorid

Eine Suspension von 72 mg (0.082 mmol 7- {4-[(2iS)-2- {[(?ra«5-4-{[(fert-Butoxycarbonyl)amino]- methyl} cyclohexyl)carbonyl]amino} -3-( {3-fluor-4-[(methoxycarbonyl)amino]phenyl} amino)-3- oxopropyl]phenyl} -6-methyl-4-oxo- 1 - {[2-(trimethylsilyl)ethoxy]methyl} - 1 ,4-dihydrochinolin-3- carbonsäure in 2 ml Dichlormethan wurde mit 0.28 ml (1.1 mmol) einer 4M Hydrochlorid-Lösung in 1,4-Dioxan versetzt, 16 h bei RT und weitere 6 h bei 40°C gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde mit 5 ml Acetonitril versetzt, der entstandene Niederschlag abgesaugt und chromatographisch via HPLC (Methode 4) gereinigt. Man erhielt 12 mg (19% d. Th.) der Titelverbindung.

Ή NMR (300 MHz, DMSO-i ): δ = ppm 0.82 - 0.98 (m, 2 H), 1.08 - 1.18 (m, 1 H), 1.21 - 1.32 (m, 1 H), 1.41 - 1.51 (m, 1 H), 1.51 - 1.61 (m, 1 H), 1.67 - 1.81 (m, 3 H), 2.08 - 2.20 (m, 1 H), 2.31 (s, 3 H), 2.59 - 2.67 (m, 2 H), 2.90 - 2.99 (m, 1 H), 3.08 - 3.18 (m, 1 H), 3.63 (s, 3 H), 4.63 - 4.78 (m, 1 H), 7.21 - 7.29 (m, 1 H), 7.34 (d, 2 H), 7.41 (d, 2 H), 7.44 - 7.53 (m, 1 H), 7.60 (s, 2 H), 7.67 - 7.81 (m, 3 H), 8.13 - 8.27 (m, 2 H), 8.83 - 8.91 (m, 1 H), 9.12 - 9.21 (m, 1 H), 10.33 (s, 1 H), 13.38 - 13.53 (m, 1 H). LC-MS (Methode 1): R _t = 0.87 min; MS (ESIpos): m/z = 671.5 [M+H-HC1] B) Bewertung der physiologischen Wirksamkeit

Die Eignung der erfindungsgemäßen Verbindungen zur Behandlung von thromboembolischen oder hyperfibrinolytischen Erkrankungen kann in folgenden Assaysystemen gezeigt werden: a) Testbeschreibungen (in vitro) a.l) Messung der FXIa-Hemmung

Zur Bestimmung der Faktor XIa-Hemmung der erfindungsgemäßen Substanzen wird ein biochemisches Testsystem verwendet, in dem die Umsetzung eines peptidischen Faktor Xla- Substrates zur Ermittlung der enzymatischen Aktivität von humanem Faktor XIa benutzt wird. Dabei spaltet Faktor XIa von dem peptischen Faktor XIa-Substrat das C-terminale Aminomethylcoumarin (AMC) ab, dessen Fluoreszenz gemessen wird. Die Bestimmungen werden in Mikrotiterplatten durchgeführt.

Prüfsubstanzen werden in Dimethylsulfoxid aufgelöst und seriell in Dimethylsulfoxid verdünnt (3000 μΜ bis 0.0078 μΜ; resultierende Endkonzentrationen im Test: 50 μΜ bis 0.00013 μΜ). Jeweils 1 μΐ der verdünnten Substanzlösungen werden in die Vertiefungen von weißen Mikrotiterplatten der Firma Greiner (384 Vertiefungen) vorgelegt. Anschließend werden nacheinander 20 μΐ Assaypuffer (50 mmol/1 Tris-Puffer pH 7.4; 100 mmol/1 Natriumchlorid; 5 mmol/1 Calciumchlorid; 0.1% bovines Serumalbumin) und 20 μΐ Faktor XIa der Firma Kordia (0.45 nM in Assaypuffer) hinzugefügt. Nach 15 min Inkubation wird die Enzymreaktion durch Zugabe von 20 μΐ des in Assaypuffer gelösten Faktor XIa Substrates Boc-Glu(OBzl)-Ala-Arg- AMC (10 μΜ in Assaypuffer) der Firma Bachem gestartet, für 30 min bei Raumtemperatur (22°C) inkubiert und anschließend eine Fluoreszensmessung durchgeführt (Anregung: 360 nM, Emission: 460 nM). Die gemessenen Emissionen der Testansätze mit Prüfsubstanz werden mit denen von Kontrollansätzen ohne Prüfsubstanz (ausschließlich Dimethylsulfoxid anstatt Prüfsubstanz in Dimethylsulfoxid) verglichen und aus den Konzentrations-Wirkungs-Beziehungen ICso-Werte berechnet. Wirkdaten aus diesem Test sind in der folgenden Tabelle A aufgeführt:

Tabelle A

Beispiel-Nr. ICso [nM] Beispiel-Nr, ICse |n.Mj

1 21.5 2 6.5

3 41 a.2) Messung der Plasmin-Hemmung

Zur Bestimmung der Plasmin-Hemmung der erfindungsgemäßen Substanzen wird ein biochemisches Testsystem verwendet, in dem die Umsetzung eines peptidischen Plasmin- Substrates zur Ermittlung der enzymatischen Aktivität von humanem Plasmin benutzt wird. Dabei spaltet Plasmin von dem peptischen Plasmin-Substrat das C-terminale Aminomethylcoumarin (AMC) ab, dessen Fluoreszenz gemessen wird. Die Bestimmungen werden in Mikrotiterplatten durchgeführt.

Prüfsubstanzen werden in Dimethylsulfoxid aufgelöst und seriell in Dimethylsulfoxid verdünnt (3000 μΜ bis 0.0078 μΜ; resultierende Endkonzentrationen im Test: 50 μΜ bis 0.00013 μΜ). Jeweils 1 μΐ der verdünnten Substanzlösungen werden in die Vertiefungen von weißen Mikrotiterplatten der Firma Greiner (384 Vertiefungen) vorgelegt. Anschließend werden nacheinander 20 μΐ Assaypuffer (50 mmol/1 Tris-Puffer pH 7.4; 100 mmol/1 Natriumchlorid; 5 mmol/1 Calciumchlorid; 0.1% bovines Serumalbumin) und 20 μΐ Plasmin der Firma Kordia (0.3 μg/ml in Assaypuffer) hinzugefügt. Nach 15 min Inkubation wird die Enzymreaktion durch Zugabe von 20 μΐ des in Assaypuffer gelösten Plasmin Substrates MeOSuc-Ala-Phe-Lys-AMC (150 μΜ in Assaypuffer) der Firma Bachem gestartet, für 30 min bei Raumtemperatur (22°C) inkubiert und anschließend eine Fluoreszensmessung durchgeführt (Anregung: 360 nM, Emission: 460 nM). Die gemessenen Emissionen der Testansätze mit Prüfsubstanz werden mit denen von Kontrollansätzen ohne Prüfsubstanz (ausschließlich Dimethylsulfoxid anstatt Prüfsubstanz in Dimethylsulfoxid) verglichen und aus den Konzentrations-Wirkungs-Beziehungen IC50- Werte berechnet. Wirkdaten aus diesem Test sind in der folgenden Tabelle B aufgeführt:

Tabelle B (Plasmin Hemmung)

a.3) Messung der Kallikrein-Hemmung

Zur Bestimmung der Plasma-Kallikrein-Hemmung der erfindungsgemäßen Substanzen wird ein biochemisches Testsystem verwendet, in dem die Umsetzung eines peptidischen Plasma- Kallikrein-Substrates zur Ermittlung der enzymatischen Aktivität von humanem Plasma- Kallikrein benutzt wird. Dabei spaltet Plasma-Kallikrein von dem peptischen Plasma-Kallikrein Substrat das C-terminale Aminomethylcoumarin (AMC) ab, dessen Fluoreszenz gemessen wird. Die Bestimmungen werden in Mikrotiterplatten durchgeführt.

Prüfsubstanzen werden in Dimethylsulfoxid aufgelöst und seriell in Dimethylsulfoxid verdünnt (3000 μΜ bis 0.0078 μΜ; resultierende Endkonzentrationen im Test: 50 μΜ bis 0.00013 μΜ). Jeweils 1 μΐ der verdünnten Substanzlösungen werden in die Vertiefungen von weißen Mikrotiterplatten der Firma Greiner (384 Vertiefungen) vorgelegt. Anschließend werden nacheinander 20 μΐ Assaypuffer (50 mmol/1 Tris-Puffer pH 7.4; 100 mmol/1 Natriumchlorid; 5 mmol/1 Calciumchlorid; 0.1% bovines Serumalbumin) und 20 μΐ humanes Plasma- Kallikrein der Firma Kordia (0.6 nM in Assaypuffer) hinzugefügt. Nach 15 min Inkubation wird die Enzymreaktion durch Zugabe von 20 μΐ des in Assaypuffer gelösten Plasma-Kallikrein-Substrates H-Pro-Phe-Arg-AMC (15 μΜ in Assaypuffer) der Firma Bachem gestartet, für 30 min bei Raumtemperatur (22°C) inkubiert und anschließend eine Fluoreszensmessung durchgeführt (Anregung: 360 nM, Emission: 460 nM). Die gemessenen Emissionen der Testansätze mit Prüfsubstanz werden mit denen von Kontrollansätzen ohne Prüfsubstanz (ausschließlich Dimethylsulfoxid anstatt Prüfsubstanz in Dimethylsulfoxid) verglichen und aus den Konzentrations-Wirkungs-Beziehungen IC50- Werte berechnet. Wirkdaten aus diesem Test sind in der folgenden Tabelle C aufgeführt:

Tabelle C (Kallikrein Hemmung)

a.4) Bestimmung der Selektivität

Zum Nachweis der Selektivität der Substanzen bezüglich FXIa-Hemmung werden die Prüfsubstanzen auf ihre Hemmung anderer humaner Serinproteasen wie Faktor Xa und Trypsin hin untersucht. Zur Bestimmung der enzymatischen Aktivität von Faktor Xa (1.3 nmol/1 von Kordia) und Trypsin (83 mU/ml von Sigma) werden diese Enzyme gelöst (50 mmol/1 Tris-Puffer [C,C,C- Tris(hydroxymethyl)-aminomethan], 100 mmol/1 Natriumchlorid, 0.1 %> BSA [bovines Serumalbumin], 5 mmol/1 Calciumchlorid, pH 7.4) und für 15 min mit Prüfsubstanz in verschiedenen Konzentrationen in Dimethylsulfoxid sowie mit Dimethylsulfoxid ohne Prüfsubstanz inkubiert. Anschließend wird die enzymatische Reaktion durch Zugabe der entsprechenden Substrate gestartet (5 μηιο1/1 Boc-Ile-Glu-Gly-Arg-AMC von Bachem für Faktor Xa und Trypsin). Nach einer Inkubationszeit von 30 min bei 22°C wird die Fluoreszenz gemessen (Anregung: 360 nm, Emission: 460 nm). Die gemessenen Emissionen der Testansätze mit Prüfsubstanz werden mit den Kontrollansätzen ohne Prüfsubstanz (ausschließlich Dimethylsulfoxid anstatt Prüfsubstanz in Dimethylsulfoxid) verglichen und aus den Konzentrations- Wirkungs-Beziehungen IC ₅₀ - Werte berechnet. a.5) Bestimmung der antikoagulatorischen Wirkung

Die antikoagulatorische Wirkung der Prüfsubstanzen wird in vitro in Human- und Tierplasma (z. B. Maus-, Ratten-, Kaninchen- , Schwein- und Hundeplasma) bestimmt. Dazu wird Blut unter Verwendung einer 0.11 molaren Natriumcitrat-Lösung als Vorlage in einem Mischungsverhältnis Natriumcitrat/Blut 1/9 abgenommen. Das Blut wird unmittelbar nach der Abnahme gut gemischt und 15 Minuten bei ca. 4000 g zentrifugiert. Der Überstand wird abpipettiert.

Die Prothrombinzeit (PT, Synonyme: Thromboplastinzeit, Quick-Test) wird in Gegenwart variierender Konzentrationen an Prüfsubstanz oder dem entsprechenden Lösungsmittel mit einem handelsüblichen Testkit (Neoplastin® von der Firma Boehringer Mannheim oder Hemoliance® RecombiPlastin von der Firma Instrumentation Laboratory) bestimmt. Die Testverbindungen werden 3 Minuten bei 37°C mit dem Plasma inkubiert. Anschließend wird durch Zugabe von Thromboplastin die Gerinnung ausgelöst und der Zeitpunkt des Gerinnungseintritts bestimmt. Es wird die Konzentration an Prüfsubstanz ermittelt, die eine Verdoppelung der Prothrombinzeit bewirkt. Die aktivierte partielle Thromboplastinzeit (aPTT) wird in Gegenwart variierender Konzentrationen an Prüfsubstanz oder dem entsprechenden Lösungsmittel mit einem handelsüblichen Testkit (C.K. Prest von der Firma Diagnostica Stago) bestimmt. Die Testverbindungen werden 3 Minuten bei 37°C mit dem Plasma und dem PTT Reagenz (Cephalin, Kaolin) inkubiert. Anschließend wird durch Zugabe von einer 25 mM wässrigen Calciumchlorid- Lösung die Gerinnung ausgelöst und der Zeitpunkt des Gerinnungseintritts bestimmt. Es wird die Konzentration an Prüfsubstanz ermittelt, die eine 1.5 fache Verlängerung der aPTT bewirken. Wirkdaten aus diesem Test sind in der folgenden Tabelle D aufgeführt: Tabelle D

a.6) Bestimmung der fibrinolytischen Wirkung

Die anti-fibrinolytische Wirkung in vitro wird in humanem, Plättchen-freien Plasma bewertet. Tissue Faktor (TF) (1 pM) und Tissue Plasminogenaktivator (tPA) (40 nM) werden zusammen mit 12.5 mM wässriger Calciumchlorid-Lösung und Substanz in Plasma pipettiert. Nach erfolgter Clot- Bildung wird die sich anschließende Clot-Lyse über einen Zeitraum von 30 Minuten photometrisch bestimmt. Wirkdaten aus diesem Test sind in der folgenden Tabelle E aufgeführt:

Tabelle E

b) Bestimmung der antithrombotischen Wirkung (in vivo) b. l) Arterielles Thrombose-Modell (Eisen(II)chlorid- induzierte Thrombose) in Kombination mit Ohrblutungszeit im Kaninchen

Die antithrombotische Aktivität der FXIa-Inhibitoren wird in einem arteriellen Thrombose-Modell getestet. Dabei wird die Thrombusbildung durch chemische Beschädigung eines Bereichs der Arteria carotis im Kaninchen ausgelöst. Simultan wird die Ohrblutungszeit bestimmt.

Männliche Kaninchen (CrhKBL (NZW)BR, Charles River) unter normaler Diät mit einem Gewicht von 2.2 - 2.5 kg Körpergewicht werden durch intramuskuläre Applikation von Xylazin und Ketamin (Rompun, Bayer, 5 mg/kg und Ketavet, Pharmacia & Upjohn GmbH, 40 mg/kg Körpergewicht) anästhesiert. Die Anästhesie wird weiterhin durch intravenöse Gabe derselben Präparate (bolus: Dauerinfusion) über die rechte Ohrvene unterstützt. Nach Freipräparation der rechten Arteria carotis wird der Gefäßschaden dadurch erzeugt, dass ein Stück Filterpapier (10 mm x 10 mm) auf einem Streifen Parafilm® (25 mm x 12 mm) um die A. carotis gewickelt wird, ohne den Blutfluß dadurch zu beeinträchtigen. Das Filterpapier enthält 100 μΐ. einer 13%igen Lösung von Eisen(II)chlorid (Sigma) in Wasser. Nach 5 min wird das Filterpapier entfernt und das Gefäß zweimal mit wässriger 0.9%iger Natriumchlorid-Lösung gespült. 30 min nach der Verletzung wird die Arteria carotis im Bereich der Schädigung herauspräpariert und eventuell vorhandenes thrombotisches Material entnommen und gewogen.

Die Prüfsubstanzen werden entweder intravenös über die Vena femoralis den anästhesierten oder oral mittels Schlundsonde den wachen Tieren jeweils 5 min beziehungsweise 2 h vor Schädigung verabreicht.

Die Ohrblutungszeit wird 2 min nach der Schädigung der Arteria carotis bestimmt. Hierzu wird das linke Ohr rasiert und ein definierter Schnitt von 3 mm Länge (Klinge Art.Nummer 10-150-10, Martin, Tuttlingen, Germany) parallel zur Ohrlängsachse gesetzt. Dabei wird darauf geachtet, kein sichtbares Gefäß zu verletzen. Eventuell austretendes Blut wird in 15 Sekunden-Intervallen mit genau gewogenen Filterpapierstücken aufgenommen, ohne die Wunde direkt zu berühren. Die Blutungszeit wird berechnet als die Zeitspanne vom Setzen des Schnitts bis zu dem Zeitpunkt, an dem am Filterpapier kein Blut mehr nachweisbar ist. Das ausgetretene Blutvolumen wird nach Wiegen der Filterpapierstücke berechnet. c] Bestimmung der fibrinolytischen Wirkung (in vivo) c.l) hvper-fibrinolvtische Ratten

Die Bestimmung der antifibrinolytischen Wirkung in vivo wird in hyper-fibrinolytischen Ratten durchgeführt. Nach Narkotisierung und Kathetrisierung der Tiere wird die Hyper-Fibinolyse durch Infusion von Tissue Plasminogenaktivator (tPA) (8 mg/kg/h) ausgelöst. 10 Minuten nach Beginn der tPA-Infusion wird die Substanzen als i.V. Bolus appliziert. Nach weiteren 15 Minuten wird die tPA-Infusion beendet und eine Transsektion des Schwanzes durchgeführt. Die subaquale Blutung (in 37°C temperierter physiologischer Natriumchlorid-Lösung) wird über 30 Minuten beobachtet und die Blutungszeit bestimmt. C) Ausführungsbeispiele für pharmazeutische Zubereitungen

Die erfindungsgemäßen Substanzen können beispielsweise folgendermaßen in pharmazeutische Zubereitungen überführt werden:

Tablette: Zusammensetzung:

100 mg der Verbindung des Beispiels 1, 50 mg Lactose (Monohydrat), 50 mg Maisstärke, 10 mg Polyvinylpyrolidon (PVP) und 2 mg Magnesiumstearat.

Tablettengewicht 212 mg. Durchmesser 8 mm, Wölbungsradius 12 mm.

Herstellung: Die Mischung aus der Verbindung des Beispiels 1, Lactose und Stärke wird mit einer 5%-igen Lösung (m/m) des PVPs in Wasser granuliert. Das Granulat wird nach dem Trocknen mit dem Magnesiumstearat für 5 min. gemischt. Diese Mischung wird mit einer üblichen Tablettenpresse verpresst (Format der Tablette siehe oben).

Orale Suspension: Zusammensetzung:

1000 mg der Verbindung des Beispiels 1, 1000 mg Ethanol (96%), 400 mg Rhodigel und 99 g Wasser.

Einer Einzeldosis von 100 mg der erfindungsgemäßen Verbindung entsprechen 10 ml orale Suspension. Herstellung:

Das Rhodigel wird in Ethanol suspendiert, die Verbindung des Beispiels 1 wird der Suspension zugefügt. Unter Rühren erfolgt die Zugabe des Wassers. Bis zum Abschluss der Quellung des Rhodigels wird ca. 6 h gerührt. Oral applizierbare Lösung:

Zusammensetzung:

500 mg der erfindungsgemäßen Verbindung, 2.5 g Polysorbat und 97 g Polyethylenglycol 400. Einer Einzeldosis von 100 mg der erfindungsgemäßen Verbindung entsprechen 20 g orale Lösung. Herstellung:

Die erfindungsgemäße Verbindung wird in der Mischung aus Polyethylenglycol und Polysorbat unter Rühren suspendiert. Der Rührvorgang wird bis zur vollständigen Auflösung der erfindungsgemäßen Verbindung fortgesetzt. i.v.-Lösung: Die erfindungsgemäße Verbindung wird in einer Konzentration unterhalb der Sättigungslöslichkeit in einem physiologisch verträglichen Lösungsmittel (z.B. isotonische Natriumchloridlösung, Glucoselösung 5% und/oder Polyethylenglykol 400 / Wasser 30% m/m) gelöst. Die Lösung wird steril filtriert und in sterile und pyrogenfreie Injektionsbehältnisse abgefüllt.