Die Erfindung betrifft neuartige 7ß-Hydroxysteroid Dehydrogenase-Mutanten, die für diese Enzym-Mutanten kodierenden Sequenzen, Verfahren zur Herstellung der Enzym- Mutanten und deren Verwendung bei enzymatischen Umsetzungen von Cholsäureverbin- dungen, und insbesondere bei der Herstellung von Ursodesoxycholsäure (UDCS); Gegenstand der Erfindung sind auch neuartige Verfahren zur Synthese von UDCS unter Verwendung der Enzym-Mutanten; sowie die Herstellung von UDCS unter Verwendung rekombi- nanter, mehrfach modifizierter Mikroorganismen.

Hintergrund der Erfindung:

Gallensäuren sind Biomoleküle, die für die Verdauung und Absorption von Fetten, Fettsäuren und hydrophoben Vitaminen erforderlich sind. Eine Gallensäure, die beim Men- sehen nur in geringen Anteilen vorkommt, ist Ursodesoxycholsäure (UDCA). Sie hat mittlerweile große therapeutische Bedeutung bei der Auflösung von Cholesterin-haltigen Gallensteinen erlangt. Industriell wird diese Verbindung durch chemische oder enzymatische Schritte im Tonnenmaßstab hergestellt. Eine wichtige Vorstufe für die Synthese von UDCA ist 12-Ketoursodesoxycholsäure, die durch eine Wolff-Kishner-Reduktion in UDCA umge- wandelt werden kann. Eine literaturbeschriebene Route zur Synthese von 12- Ketoursodesoxycholsäure startet von Cholsäure (3a,7a,12a-Trihydroxy-5ß-cholansäure), die durch zwei oxidative Schritte, die durch 7a- und 12a-HSDHs katalysiert werden, und einen reduktiven Schritt, katalysiert durch eine 7ß-HSDH, hergestellt werden kann (Bovara R et al. (1996) A new enzymatic route to the synthesis of 12-ketoursodeoxycholic acid. Biotechnol. Lett. 18:305-308; Monti D et al. (2009) One-pot multienzymatic synthesis of 12- ketoursodeoxycholic acid: Subtle cofactor speeificities rule the reaction equilibria of five bio- catalysts working in a row. Adv. Synth. Catal. 351 :1303-131 1 ). Eine weitere Route startet von 7-Ketolithocholsäure, die durch stereoselektive Reduktion der 7-Keto-Gruppe zu UDCA umgesetzt werden kann, auch dieser Schritt wird vorteilhafterweise enzymatisch katalysiert durchgeführt, katalysiert durch eine 7ß-HSDH (Higashi S et al. (1979) Conversion of 7- ketolithocholic acid to ursodeoxyeholic acid by human intestinal anaerobic microorganisms: Interchangeability of chenodeoxyeholic acid and ursodeoxyeholic acid. Gastroenterologia Japonica 14:417-424; Liu L et al. (201 1 ) Identification, cloning, heterologous expression, and characterization of a NADPH-dependent 7 beta-hydroxysteroid dehydrogenase from Collin- sella aerofaciens. Appl. Microbiol. Biotechnol. 90:127-135.). Eine weitere günstige Syntheseroute geht von Dehydrocholsäure (DHCA) aus, die durch zwei reduktive Schritte zu 12- Ketoursodesoxycholsäure umgesetzt werden kann, diese beiden Schritte können durch zwei stereoselektive HSDHs (3a- and 7ß-HSDHs) katalysiert werden (Carrea G et al. (1992) En- zymatic synthesis of 12-ketoursodeoxycholic acid from dehydrocholic acid in a membrane reactor. Biotechnol. Lett. 14:1 131 -1 135; Liu L et al. (2013) One-step synthesis of 12- ketoursodeoxycholic acid from dehydrocholic acid using a multienzymatic System. Appl. Microbiol. Biotechnol. 97:633-639).

Als 7ß-HSDH hat sich das Enzym aus C. aerofaciens als gut geeignet erwiesen. Mittlerweile ist die Gensequenz dieses Enzyms aus C. aerofaciens bekannt, so dass zum einen das Enzym nach Klonierung rekombinant verfügbar gemacht werden kann, zum anderen besteht die Möglichkeit, mit Methoden des Proteinengineering Mutanten dieses Enzyms zu erzeugen und damit gegebenenfalls vorteilhaftere Enzymvarianten aufzufinden.

Zur medikamentösen Behandlung von Gallensteinleiden werden seit vielen Jahren u. a. die Wirkstoffe Ursodesoxycholsäure (UDCS oder UDCA) und das zugehörige Diastereo- mer Chenodesoxycholsäure (CDCS oder CDCA) eingesetzt. Beide Verbindungen unterscheiden sich lediglich durch die Konfiguration der Hydroxygruppe am C-Atom 7 (UDCS: ß - Konfiguration, CDCS: α-Konfiguration). Zur Herstellung von UDCS sind im Stand der Technik verschieden Verfahren beschreiben, welche rein chemisch durchgeführt werden oder aus einer Kombination chemischer und enzymatischer Verfahrensschritte bestehen. Ausgangspunkt ist jeweils Cholsäure (CS oder CA) oder die aus Cholsäure hergestellte CDCS.

So kann die klassisch chemische Methode zur UDCS Herstellung wie folgt schema- tisch dargestellt werden:

CS CS-Methylester 3 , 7-Diacetyl-C S -methy lester

12-Keto-3,7-Diacetyl- CS -methy lester

Ein gravierender Nachteil ist unter anderem folgender: da die chemische Oxidation nicht selektiv ist, müssen die Carboxy-Gruppe und die 3a und 7a-Hydroxy-Gruppe durch Veresterung geschützt werden.

Ein alternatives chemisch/enzymatische Verfahren basierend auf der Verwendung des Enzyms 12a-Hydroxysteroid Dehydrogenase (12a-HSDH) kann wie folgt dargestellt werden und ist z.B. beschrieben in der PCT/EP2009/002190 der vorliegenden Anmelderin. Die 12a-HSDH oxidiert dabei CS selektiv zu 12-Keto-CDCS. Die zwei nach der klassisch chemischen Methode erforderlichen Schützschritte entfallen dabei.

Weiterhin wird von Monti, D., et al., (One-Pot Multienzymatic Synthesis of 12- Ketoursodeoxycholic Acid: Subtle Cofactor Specificities Rule the Reaction Equilibria of Five Biocatalysts Working in a Row. Advanced Synthesis & Catalysis, 2009) ein alternatives en- zymatisch-chemisches Verfahren beschrieben, das wie folgt schematisch darstellbar ist:

CS 7,12-Diketo-LCS 12-Keto-UDCS UDCS Die CS wird zuerst von 7a-HSDH aus Bacteroides fragilis ATCC 25285 (Zhu, D., et al., Enzymatic enantioselective reduction of -ketoesters by a thermostable 7 -hydroxysteroid dehydrogenase from Bacteroides fragilis. Tetrahedron, 2006. 62(18): p. 4535-4539) und 12a-HSDH zu 7,12-Diketo-LCS oxidiert. Diese beiden Enzyme sind jeweils NADH abhängig. Nach der Reduktion durch 7ß-HSDH (NADPH abhängig) aus Clostridium absonum ATCC 27555 (DSM 599) (MacDonald, I.A. and P.D. Roach, Bile induction of 7 alpha- and 7 beta- hydroxysteroid dehydrogenases in Clostridium absonum. Biochim Biophys Acta, 1981. 665(2): p. 262-9) entsteht 12-Keto-UDCS. Durch Wolff-Kishner-Reduktion wird das Endprodukt erhalten. Nachteilig bei diesem Verfahren ist, dass wegen der Gleichgewichtslage der katalysieren Reaktion eine komplette Umsetzung nicht möglich ist, und dass für die erste Stufe der Umsetzung zwei unterschiedliche Enzyme eingesetzt werden müssen, was das Verfahren verteuert. Zur Kofaktor-Regenerierung werden Lactat Dehydrogenase (LDH; zur Regenerierung von NAD ⁺ ) und Glucose Dehydrogenase (GIcDH oder GDH, zur Regenerierung von NADPH) eingesetzt. Nachteilig bei der dort verwendeten Kofaktor-Regenerierung ist, dass das entstehende Ko-Produkt nur sehr schwer aus dem Reaktionsgemisch zu ent- fernen ist, so dass das Reaktionsgleichgewicht nicht positiv beeinflusst werden kann, was eine unvollständige Umsetzung des Edukts bedingt.

Eine 7ß-HSDH aus Stamm Collinsella aerofaciens ATCC 25986 (DSM 3979; ehemalige Eubacterium aerofaciens) wurde im Jahr 1982 von Hirano und Masuda beschrieben (Hirano, S. and N. Masuda, Characterization of NADP-dependent 7 beta-hydroxysteroid de- hydrogenases from Peptostreptococcus productus and Eubacterium aerofaciens. Appl Envi- ron Microbiol, 1982. 43(5): p. 1057-63). Sequenzinformationen wurden zu diesem Enzym nicht offenbart. Das durch Gelfiltration bestimmte Molekulargewicht betrug 45,000 Da (vgl. Hirano, Seite 1059, linke Spalte). Weiterhin konnte für das dortige Enzym die Reduktion der 7-Oxo-Gruppe zur 7ß-Hydroxygruppe nicht beobachtet werden (vgl. Hirano, Seite 1061 , Dis- kussion 1. Absatz), der Fachmann erkennt somit, dass das von Hirano et al beschriebene Enzym nicht zur Katalyse der Reduktion von Dehydrocholsäure (DHCS oder DHCA) in 7- Position zu 3,12-Diketo-7ß-CS geeignet ist. In der älteren internationalen Patentanmeldung PCT/EP2010/068576 der Anmelderin wird eine neuartige 7ß-HSDH aus Collinsella aerofaciens ATCC 25986 beschrieben, welche unter anderem ein Molekulargewicht (bei SDS-Gelelektrophorese) von etwa 28-32 kDa, ein Molekulargewicht (bei Gelfiltration, unter nicht denaturierenden Bedingungen, wie insbesondere ohne SDS): von etwa 53 bis 60 kDa, und die Befähigung zur stereoselektiven Reduktion der 7-Carbonyl-Gruppe von 7-Keto-LCS in eine 7ß-Hydroxy-Gruppe aufweist.

Außerdem wird in der PCT/EP2010/068576 ein Verfahren zur UDCS Herstellung bereitgestellt, welches schematisch wie folgt darstellbar ist:

CS DHCS 12-Keto-UDCS UDCS

Dabei erfolgt die Oxidation von CS auf klassisch chemischem Weg in einfacher Weise. Die DHCS wird von Enzympaar 7ß-HSDH und 3a-HSDH einzeln nacheinander oder in einem Topf zu 12-Keto-UDCS reduziert. Kombiniert mit der Wolff-Kishner-Reduktion kann UDCS somit in nur drei Schritte aus CS synthetisiert werden. Während die 7ß-HSDH vom Kofaktor NADPH abhängig ist, benötigt die 3a-HSDH den Kofaktor NADH. Die Verfügbarkeit von Enzympaaren mit Abhängigkeit vom gleichen Kofaktor oder erweiterter Anhängigkeit, (z.B. von den Kofaktoren NADH und NADPH) wäre von Vorteil, weil damit die Kofaktor- Regenerierung vereinfacht werden könnte.

Die WO 2012/080504 beschreibt neuartige Mutanten der 7ß-HSDH aus C. aerofaciens im Sequenzbereich der Aminosäurereste 36 bis 42 der C. aerofaciens Sequenz, sowie biokatalytische Verfahren zur Herstellung von UDCS, und insbesondere auch neuartige Ganzzell-Verfahren.

Die WO 201 1/147957 beschreibt neuartige knock-out Stämme, die zur Herstellung von UDCS besonders geeignet sind, da die unerwünschte 7alpha -HSDH Enzymaktivität gezielt ausgeschalten werden konnte.

Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung weiter verbesserter 7ß-HSDHs. Insbesondere sollten Enzym-Mutanten bereitgestellt werden, welche noch vorteilhafter zur en- zymatischen oder mikrobiellen Herstellung von UDCS über die stereospezifische Reduktion von DHCS in 7-Position zu 3,12-Diketo-7ß-CS eingesetzt werden können, und insbesondere eine verbesserte Aktivität für Substrat und/oder Kofaktor, und/oder eine geringere Substratinhibition und/oder veränderte Kofaktor-Nutzung (erhöhte, veränderte Spezifität oder erweiterte Abhängigkeit) aufweisen. Kurzfassung der Erfindung:

Obige Aufgaben konnten überraschenderweise gelöst werden durch die Erzeugung und Charakterisierung von verbesserten Mutanten der 7ß-HSDH aus aeroben Bakterien der Gattung Collinsella, insbesondere des Stammes Collinsella aerofaciens und deren Einsatz bei der Umsetzung von Cholsäureverbindungen, insbesondere bei der Herstellung von UDCS.

Mittlerweile ist die Gensequenz dieses Enzyms aus C. aerofaciens bekannt, so dass zum einen das Enzym nach Klonierung rekombinant verfügbar gemacht werden kann, und zum anderen die Möglichkeit besteht, mit Methoden des Proteinengineering Mutanten dieses Enzyms zu erzeugen und damit ggf. vorteilhaftere Enzymvarianten aufzufinden.

Auf Grund von Struktur- und Homologiebetrachtungen wurde erfindungsgemäß ver- sucht, Sequenzbereiche zu definieren, die für die Coenzymbindung oder auch die Substraterkennung verantwortlich sein könnten. Damit ergeben sich Möglichkeiten, in diesen Bereichen durch Mutagenese gezielt Aminosäuren zu verändern, um durch diese Struktur- Veränderungen Enzymeigenschaften zu verändern. So liegt bei der 7ß-HSDH aus C. aerofaciens im Bereich der Aminosäuren um ca. 10 bis 64 der sog.„Rossmann-Fold", der für die Coenzymbindung zuständig ist. Erfindungsgemäß wurde nun insbesondere versucht, Aminosäuren in diesem Bereich der Coenzymbindung derart zu verändern, dass das Enzym statt NADPH das kostengünstigere NADH akzeptiert. Beim Versuch, die Aminosäure Arginin in Position 64 durch Asparaginsäure zu ersetzen, wurde dabei überraschenderweise gefunden, dass diese 7ß-HSDH-Mutante eine deutlich höhere Aktivität aufweist. Das hat sich in der Folge auch bestätigt, als mehrere weitere Mutanten, die alle in Position 64 Mutationen aufwiesen, höhere Aktivitäten als das Wildtyp-Enzym zeigten. Auch Enzym-Mutanten, die bis zur Homogenität aufgereinigt und mit dem entsprechend gereinigten Wildtyp-Enzym verglichen wurden, zeigten überraschenderweise deutlich höhere spezifische Enzymaktivitäten.

Besonders eindeutig ist die Verbesserung der Aktivität an der Erhöhung der spezifi- sehen Aktivität, also der auf die Proteinmenge bezogene Aktivitätswert, bei den Mutanten 7ß-HSDH-R64E, sowie 7ß-HSDH-R64D und 7ß-HSDH-R64T zu erkennen. Die Schreibweise 7ß-HSDH-R64E bedeutet, dass bei der betrachteten 7ß-HSDH das Arginin (R) in Position 64 der Proteinsequenz durch Glutaminsäure (E) ersetzt wurde. Analog ist der Terminus 7ß- HSDH-R64D, wo Arginin in Position 64 gegen Asparaginsäure (D) ausgetauscht wurde, zu verstehen. Als Wildtyp-Enzym wird die 7ß-HSDH, die aus C. aerofaciens gewonnen werden kann, bezeichnet.

Weiterhin wurde obige Aufgabe gelöst durch Bereitstellung eines biokatalytischen (mikrobiellen bzw. enzymatischen) Prozesses, umfassend die enzymatische Umsetzung von DHCS über zwei durch die hierin beschriebenen 7ß-HSDH-Mutanten bzw. 3a-HSDH kataly- sierte reduktive Teilschritte, die gleichzeitig oder zeitlich versetzt in beliebiger Reihenfolge ablaufen können, zu 12-Keto-UDCS und Kofaktorregenerierung durch Verwendung von Dehydrogenasen, welche den verbrauchen Kofaktor aus beiden reduktiven Teilschritten regenerieren. Figurenbeschreibung:

Figur 1 a zeigt die Aminosäuresequenz der 7ß-HSDH aus Collinsella aerofaciens (SEQ ID NO:2) und Figur 1 b die kodierende Nukleinsäuresequenz zur Aminosäuresequenz von Figur 1 a; Figur 1 c zeigt die Aminosäuresequenz der 3a-HSDH aus Comanomonas tes- tosteroni und Figur 1 d die kodierende Nukleinsäuresequenz zur Aminosäuresequenz von Figur 1 c;

Figur 2a zeigt die Aminosäuresequenz der 7ß-HSDH aus Collinsella aerofaciens; C- terminal verlängert um die His-Tag Sequenz LEHHHHHH; Figur 2b die davon abgeleitete Mutante 7 ß-HSDH [R64E]; Figur 2c die davon abgeleitete Mutante 7 ß-HSDH [G39S]; Figur 2d die davon abgeleitete Mutante 7 ß-HSDH [G39S/R64E];

Figur 3 zeigt Auftragung der spezifischen Enzymaktivität der Glutaminsäuremutante

[R64E] für das Substrat DHCA (linkes Bild) und für das Coenzym NADPH (rechtes Bild).

Figur 4 zeigt die Auftragung der spezifischen Enzymaktivität der Serinmutante für das Substrat DHCA (linkes Bild) und für das Coenzym NADPH (rechtes Bild).

Figur 5 zeigt das: SDS-Gel der 7 ß-HSDH [G39S/R64E] Mutante nach Expression in Schüttelkolben-Fermentation in LB-Medium. Aufgetragen sind der zellfreie Rohextrakt und das Enzym nach Reinigung. Die 7ß-HSDH-Mutante hat eine Größe von ca. 29,9 kDa. Aufgetragen wurden ca. 10 μg Protein

Figur 6 zeigt die Auftragung der spezifischen Enzymaktivität der Doppelmutante [G39S/R64E] für das Substrat DHCA (linkes Bild) und für das Coenzym NADPH (rechtes Bild).

Figur 7 zeigt den Vergleich der Kinetiken einiger erfindungsgemäßer Mutanten (invertiertes Dreieck ( ^■ ): 7 ß-HSDH [R64E]; Quadrat (— ) 7 ß-HSDH [G39S]; Dreieck

( ) 7ß-HSDH [G39S /R64E]) mit dem Wildtyp (Punkt ( ). Spezielle Ausführungsformen der Erfindung

Die Erfindung betrifft insbesondere folgende spezielle Ausführungsformen:

1 . 7ß-Hydroxysteroiddehydrogenase (7ß-HSDH), 7ß-HSDH, welche wenigstens die stereospezifische enzymatische Reduktion eines 7-Ketosteroids zum korrespondierenden 7- Hydroxysteroid katalysiert, wobei das Enzym abgeleitet ist von einem Enzym mit der SEQ ID NO:2, oder einem diese Sequenz umfassenden Enzyms, wie z.B. einem Enzym umfassend die SEQ ID NO:3 (d.h. SEQ ID NO:2 N-terminal verlängert um einen Histidin-Tag oder Histi- din-Anker-Sequenz), und wobei das Enzym eine Mutation in Position 17 und/oder 64 von SEQ ID NO:2 (oder z.B. von SEQ ID NO:3) oder in den korrespondierenden Sequenzpositi- onen einer davon abgeleiteten Aminosäuresequenz mit wenigstens 80%, wie z. B. wenigstens wie z.B. 85, 90, 91 , 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 oder 99,5% Sequenzidentität, zu SEQ ID NO:2 (oder z.B. von SEQ ID NO:3) umfasst.

2. 7ß-HSDH die wenigstens die stereospezifische enzymatische Reduktion eines 7- Ketosteroids zum korrespondierenden 7-Hydroxysteroid katalysiert, und

eine durch Aminosäuremutation in SEQ ID NO:2 (oder z.B. in SEQ ID NO:3) veränderte Aminosäure-Sequenz aufweist, wobei die Aminosäuresequenz-Mutation ausgewählt ist unter Ein- oder Mehrfachmutationen umfassend:

b) T17X ₂

wobei Xi für einen von Arginin (R) verschiedenen, insbesondere proteinogenen Aminosäurerest, insbesondere eine beliebige, spezifische Aktivität erhöhende und/oder die Substratinhibition verringernde und/oder die Kofaktornutzung oder Kofaktor-Abhängigkeit modifizierende, insbesondere natürliche Aminosäure steht;

steht; und

und X ₂ für einen von Threonin (T) verschiedenen, proteinogenen Aminosäurerest insbesondere eine beliebige, spezifische Aktivität erhöhende und/oder die Substratinhibition verringernde und/oder die Kofaktornutzung oder Kofaktor-Abhängigkeit modifizierende, insbesondere natürliche Aminosäure steht;

wobei die mutierte, d.h. veränderte Aminosäuresequenz eine Sequenzidentität zu SEQ ID NO:2 (oder z.B. zu SEQ ID NO:3) von 80% bis weniger als 100%, wie z.B. 85, 90, 91 , 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 oder 99,5% Sequenzidentität, vorzugsweise von wenigstens 85% insbesondere von wenigstens 90 % aufweist. 3. 7ß-HSDH nach Ausführungsform 1 oder 2, die zusätzlich wenigstens eine Mutation im Sequenzmotiv VMVGRRE gemäß Position 36 bis 42, insbesondere Position 39 von SEQ ID NO:2 (oder z.B. von SEQ ID NO:3) oder in dem korrespondierenden Sequenzmotiv einer davon abgeleiteten Aminosäuresequenz mit wenigstens 80% Sequenzidentität, wie z.B. 85, 90, 91 , 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 oder 99,5% Sequenzidentität, zu SEQ ID NO:2 (oder z.B. zu SEQ ID NO:3) aufweist.

4. 7ß-HSDH nach Ausführungsform 3, die zusätzlich die Aminosäuresequenz- Mutation c) G39X ₃ aufweist,

wobei X ₃ für einen von Glycin (G) verschiedenen, insbesondere proteinogenen Aminosäure- rest, insbesondere eine beliebige, spezifische Aktivität erhöhende und/oder die Substratinhibition verringernde und/oder die Kofaktornutzung oder Kofaktor-Abhängigkeit modifizierende, insbesondere natürliche Aminosäure steht steht.

5. 7ß-HSDH nach einer der vorhergehenden Ausführungsformen, ausgewählt unter a) den Einfachmutanten T17X ₂ und den

b) den Doppelmutanten

R64X ₁ /G39X ₃

worin

Xi für E, D, T, L, S, P, V, K, C, A, G, Q, F, W, I, Y, H oder N, insbesondere E, D, T, L, S, P oder V steht;

X ₂ für F, A, I, oder S steht

X ₃ für S, A, V, I, L, C, K, Y F oder R, insbesondere S oder A, steht

Nichtlimitierende Beispiele geeigneter Einfachmutanten umfassen:

R64A, R64S, R64D, R64V, R64T, R64P, R64N, R64E, R64Q, R64H, R64RL, R64K, R64C, R64G, R64I, R64Y, R64F und R64W, und

T17F, T17A, T17I, T17S.

Nichtlimitierende Beispiele geeigneter Doppelmutanten umfassen:

(G39S/R64E); (G39S/R64D); (G39S/R64T); (G39S/R64L); (G39S/R64S); (G39S/R64P); (G39S/R64V); (G39A/R64E); (G39A/R64D); (G39A/R64T); (G39A/R64S); (G39A/R64L); (G39A/R64P); (G39A/R64V);

Obige Ausführungen zu Einfach- und Doppelmutanten gelten insbesondere für SEQ ID NO:2 und 3.

6. 7ß-HSDH nach einer der vorhergehenden Ausführungsformen, die im Vergleich zur nicht-mutierten 7ß-HSDH mit SEQ ID NO:2 (oder z.B. mit SEQ ID NO:3) wenigstens eine der folgenden Eigenschaften oder folgendes Eigenschaftsprofil zeigt:

a) eine erhöhte spezifische Aktivität (Vmax [U/mg]) für Dehydrocholsäure (DHCA) bei der enzymatischen Reduktion von DHCA mit NAD(P)H, insbesondere NADPH, als Kofaktor; wobei z.B. die spezifische Aktivität (U/mg) in Gegenwart des Kofaktors NAD(P)H, insbesondere NADPH, im Vergleich zum nichtmutierten Enzym um wenigsten 1 , 5, 10, 50 oder 100 % , insbesondere aber wenigstens um das 1 -fache, insbesondere um das 2- bis 100-fache oder 3- bis 20-fache oder 5- bis 10-fache erhöht ist.

b) eine erhöhte spezifische Aktivität (Vmax [U/mg]) für NAD(P)H, insbesondere NADPH, bei der enzymatischen Reduktion von DHCA mit NAD(P)H, insbesondere NADPH, als Kofaktor; wobei z.B. die spezifische Aktivität (U/mg) in Gegenwart des Kofaktors NAD(P)H, insbesondere NADPH, im Vergleich zum nichtmutierten Enzym um wenigsten 1 , 5 oder 10 % , insbesondere aber wenigstens um das 1 -fache, insbesonde- re um das 2- bis 10-fache erhöht ist

c) eine verringerte Substratinhibition durch DHCA, wie z.B. mit Ki-Werten im Bereich von >1 mM, wie z.B. bei 1 bis 200 mM, 2 bis 150 mM, 2,5 bis 100 mM;

d) eine veränderte Kofaktorspezifität bezüglich NADH und NADPH wie z.B. eine erweitere Spezifität, das heißt Nutzung eines zusätzlichen, bisher nicht genutzten Kofak- tors, insbesondere NADPH;

e) wobei diese Eigenschaften a) bis d) einzeln oder in beliebiger Kombination vorliegen können.

Weitere spezielle Ausführungsformen betreffen Mutanten der 7ß-HSDH mit SEQ ID NO:2 oder mit SEQ ID NO:3 oder einer davon abgeleiteten Sequenz mit einem Identitätsgrad von wenigsten 80% oder wenigstens 85%, insbesondere wenigstens 90% zur Wildtypsequenz mit wenigstens einer der obigen Eigenschaften a), b), c), d) oder e).

Als weitere Beispiele sind zu nennen:

(1 ) Beispielsweise sind zu nennen die Einfachmutanten R64X-I worin X-ι für E, D, T, L, S, P, V, K, C, A, G, Q, F, W, I, Y, H oder N, insbesondere E, D, T, L, S, P o- der V, besonders bevorzugt E steht, welche wenigstens obige Eigenschaft a) besitzen.

(2) Beispielsweise sind zu nennen die Einfachmutanten R64X-I worin X-ι für E, D, T,

L, S, P, V, K, C, A, G, Q, F, W, I, Y, H oder N, insbesondere E, D, T, L, S, P o- der V, besonders bevorzugt E steht, welche wenigstens obige Eigenschaft b) besitzen.

(3) Beispielsweise sind zu nennen die Einfachmutanten R64X-I worin X-ι für E, D, T, L, S, P, V, K, C, A, G, Q, F, W, I, Y, H oder N, insbesondere E, D, T, L, S, P o- der V, besonders bevorzugt E steht, welche wenigstens obige Eigenschaft c) besitzen. (4) Beispielsweise sind zu nennen die Einfachmutanten R64X-I worin X-ι für E, D, T, L, S, P, V, K, C, A, G, Q, F, W, I, Y, H oder N, insbesondere E, D, T, L, S, P o- der V, besonders bevorzugt E steht, welche wenigstens obige Eigenschaft d) besitzen

(5) Beispielsweise sind zu nennen die Einfachmutanten R64X-I worin X-ι für E, D, T,

L, S, P, V, K, C, A, G, Q, F, W, I, Y, H oder N, insbesondere E, D, T, L, S, P o- der V, besonders bevorzugt E steht, welche wenigstens obige Eigenschaften a) und b) besitzen.

(6) Beispielsweise sind zu nennen die Einfachmutanten R64X-I worin X-ι für E, D, T, L, S, P, V, K, C, A, G, Q, F, W, I, Y, H oder N, insbesondere E, D, T, L, S, P o- der V, besonders bevorzugt E steht, welche wenigstens obige Eigenschaften a) und c) besitzen.

(7) Beispielsweise sind zu nennen die Einfachmutanten R64X-I worin X-ι für E, D, T, L, S, P, V, K, C, A, G, Q, F, W, I, Y, H oder N, insbesondere E, D, T, L, S, P o- der V, besonders bevorzugt E steht, welche wenigstens obige Eigenschaften a) und d) besitzen.

(8) Beispielsweise sind zu nennen die Einfachmutanten R64X-I worin X-ι für E, D, T, L, S, P, V, K, C, A, G, Q, F, W, I, Y, H oder N, insbesondere E, D, T, L, S, P o- der V, besonders bevorzugt E steht, welche wenigstens obige Eigenschaften b) und c) besitzen.

(9) Beispielsweise sind zu nennen die Einfachmutanten R64X-I worin X-ι für E, D, T, L, S, P, V, K, C, A, G, Q, F, W, I, Y, H oder N, insbesondere E, D, T, L, S, P o- der V, besonders bevorzugt E steht, welche wenigstens obige Eigenschaften b) und d) besitzen.

(10) Beispielsweise sind zu nennen die Einfachmutanten R64X-I worin X-ι für E, D, T,

L, S, P, V, K, C, A, G, Q, F, W, I, Y, H oder N, insbesondere E, D, T, L, S, P o- der V, besonders bevorzugt E steht, welche wenigstens obige Eigenschaften a) bis d) besitzen.

(1 1 ) Beispielsweise sind zu nennen die Einfachmutanten T17X ₂ worin X ₂ für einen von T verschiedenen Aminosäurerest, insbesondere F, A, I, oder S steht, welche wenigstens obige Eigenschaft a) besitzen.

(12) Beispielsweise sind zu nennen die Einfachmutanten T17X ₂ worin X ₂ für einen von T verschiedenen Aminosäurerest, insbesondere F, A, I, oder S steht, welche wenigstens obige Eigenschaft b) besitzen.

(13) Beispielsweise sind zu nennen die Einfachmutanten T17X ₂ worin X ₂ für einen von T verschiedenen Aminosäurerest, insbesondere F, A, I, oder S steht, welche wenigstens obige Eigenschaft c) besitzen. (14) Beispielsweise sind zu nennen die Einfachmutanten T17X ₂ worin X ₂ für einen von T verschiedenen Aminosäurerest, insbesondere F, A, I, oder S steht, welche wenigstens obige Eigenschaft d) besitzen.

(15) Beispielsweise sind zu nennen die Einfachmutanten T17X ₂ worin X ₂ für einen von T verschiedenen Aminosäurerest, insbesondere F, A, I, oder S steht, welche wenigstens obige Eigenschaften a) und b) besitzen.

(16) Beispielsweise sind zu nennen die Einfachmutanten T17X ₂ worin X ₂ für einen von T verschiedenen Aminosäurerest, insbesondere F, A, I, oder S steht, welche wenigstens obige Eigenschaften a) und c) besitzen.

(17) Beispielsweise sind zu nennen die Einfachmutanten T17X ₂ worin X ₂ für einen von T verschiedenen Aminosäurerest, insbesondere F, A, I, oder S steht, welche wenigstens obige Eigenschaften a) und d) besitzen.

(18) Beispielsweise sind zu nennen die Einfachmutanten T17X ₂ worin X ₂ für einen von T verschiedenen Aminosäurerest, insbesondere F, A, I, oder S steht, welche wenigstens obige Eigenschaften b) und c) besitzen.

(19) Beispielsweise sind zu nennen die Einfachmutanten T17X ₂ worin X ₂ für einen von T verschiedenen Aminosäurerest, insbesondere F, A, I, oder S steht, welche wenigstens obige Eigenschaften b) und d) besitzen.

(20) Beispielsweise sind zu nennen die Einfachmutanten T17X ₂ worin X ₂ für einen von T verschiedenen Aminosäurerest, insbesondere F, A, I, oder S steht, welche wenigstens obige Eigenschaften a) bis d) besitzen.

(21 ) Beispielsweise sind zu nennen die Doppelmutanten R64X-|/G39X ₃ worin X-ι für E, D, T, L, S, P, V, K, C, A, G, Q, F, W, I, Y, H oder N, insbesondere E, D, T, L, S, P oder V, bevorzugt E steht, und X ₃ für S, A, V, I, L, C, K, Y, F oder R, bevor- zugt S oder A, steht, welche wenigstens obige Eigenschaft a) besitzen.

(22) Beispielsweise sind zu nennen die Doppelmutanten R64X-|/G39X ₃ worin X-ι für E, D, T, L, S, P, V, K, C, A, G, Q, F, W, I, Y, H oder N, insbesondere E, D, T, L, S, P oder V, bevorzugt E steht, und X ₃ für S, A, V, I, L, C, K, Y, F oder R, bevorzugt S oder A, steht, welche wenigstens obige Eigenschaft b) besitzen.

(23) Beispielsweise sind zu nennen die Doppelmutanten R64X-|/G39X ₃ worin X-ι für

E, D, T, L, S, P, V, K, C, A, G, Q, F, W, I, Y, H oder N, insbesondere E, D, T, L, S, P oder V, bevorzugt E steht, und X ₃ für S, A, V, I, L, C, K, Y, F oder R, bevorzugt S oder A, steht, welche wenigstens obige Eigenschaft c) besitzen.

(24) Beispielsweise sind zu nennen die Doppelmutanten R64X-|/G39X ₃ worin X-ι für E, D, T, L, S, P, V, K, C, A, G, Q, F, W, I, Y, H oder N, insbesondere E, D, T, L,

S, P oder V, bevorzugt E steht, und X ₃ für S, A, V, I, L, C, K, Y, F oder R, bevorzugt S oder A, steht, welche wenigstens obige Eigenschaft d) besitzen. (25) Beispielsweise sind zu nennen die Doppelmutanten R64X-|/G39X ₃ worin X-ι für E, D, T, L, S, P, V, K, C, A, G, Q, F, W, I, Y, H oder N, insbesondere E, D, T, L, S, P oder V, bevorzugt E steht, und X ₃ für S, A, V, I, L, C, K, Y, F oder R, bevorzugt S oder A, steht, welche wenigstens obige Eigenschaften a) und b) besitzen. (26) Beispielsweise sind zu nennen die Doppelmutanten R64X-|/G39X ₃ worin X-ι für

E, D, T, L, S, P, V, K, C, A, G, Q, F, W, I, Y, H oder N, insbesondere E, D, T, L, S, P oder V, bevorzugt E steht, und X ₃ für S, A, V, I, L, C, K, Y, F oder R, bevorzugt S oder A, steht, welche wenigstens obige Eigenschaften a) und c) besitzen.

(27) Beispielsweise sind zu nennen die Doppelmutanten R64X-|/G39X ₃ worin X-ι für E, D, T, L, S, P, V, K, C, A, G, Q, F, W, I, Y, H oder N, insbesondere E, D, T, L,

S, P oder V, bevorzugt E steht, und X ₃ für S, A, V, I, L, C, K, Y, F oder R, bevorzugt S oder A, steht, welche wenigstens obige Eigenschaften a) und d) besitzen.

(28) Beispielsweise sind zu nennen die Doppelmutanten R64X-|/G39X ₃ worin X-ι für E, D, T, L, S, P, V, K, C, A, G, Q, F, W, I, Y, H oder N, insbesondere E, D, T, L, S, P oder V, bevorzugt E steht, und X ₃ für S, A, V, I, L, C, K, Y, F oder R, bevorzugt S oder A, steht, welche wenigstens obige Eigenschaften b) und c) besitzen.

(29) Beispielsweise sind zu nennen die Doppelmutanten R64X-|/G39X ₃ worin X-ι für E, D, T, L, S, P, V, K, C, A, G, Q, F, W, I, Y, H oder N, insbesondere E, D, T, L, S, P oder V, bevorzugt E steht, und X ₃ für S, A, V, I, L, C, K, Y, F oder R, bevor- zugt S oder A, steht, welche wenigstens obige Eigenschaften b) und d) besitzen.

(30) Beispielsweise sind zu nennen die Doppelmutanten R64X-|/G39X ₃ worin X-ι für E, D, T, L, S, P, V, K, C, A, G, Q, F, W, I, Y, H oder N, insbesondere E, D, T, L, S, P oder V, bevorzugt E steht, und X ₃ für S, A, V, I, L, C, K, Y, F oder R, bevorzugt S oder A, steht, welche wenigstens obige Eigenschaften a) bis d) besitzen.

Die oben aufgelisteten beispielhaften Ausführungsformen (1 ) bis (30) betreffen insbesondere Mutanten der 7 ß-HSDH mit SEQ ID NO:2 oder mit SEQ ID NO:3 und weisen dazu einen Identitätsgrad von wenigsten 80 % oder wenigstens 85%, insbesondere wenigstens 90% auf.

7. Nukleotidsequenz kodierend für eine 7ß-HSDH nach einem der vorhergehenden

Ausführungsformen.

Beispielhaft zu nennen sind Nukleinsäuresequenzen, ausgewählt unter Nukleinsäuresequenzen

a) gleichzeitig kodierend für eine GDH und eine 7ß-HSDH Mutante nach einer der Ausfüh- rungsformen 1 bis 6 und gegebenenfalls eine 3a-HSDH;

b) kodierend für ein Fusionsprotein umfassend eine GDH und eine 7ß-HSDH Mutante nach einer der Ausführungsformen 1 bis 6 und gegebenenfalls eine 3a-HSDH; wobei die kodierenden Sequenzen unabhängig voneinander ein- oder mehrfach in dem Konstrukt, wie z.B. in 2, 3, 4, 5, oder 6 bis 10 Kopien, enthalten sein können. Durch Wahl der geeigneten Kopienzahl können so eventuell gegebene Aktivitätsunterschiede in den einzelnen Expressionsprodukten kompensiert werden.

8. Expressionskassette, umfassend unter der Kontrolle wenigstens einer regulativer Sequenz wenigstens eine Nukleotidsequenz nach Ausführungsform 7. sowie ggf. kodierende Sequenzen für wenigstens ein (wie z.B. 1 ,2 oder 3) weiteres Enzym, ausgewählt unter Hydroxysteroiddehydrogenasen, insbesondere 3a-HSDH, und zur Kofaktorregenerierung geeignete Dehydrogenasen, wie z.B. FDH, GDH, ADH, G-6-PDH, PDH. Insbesondere können die in einer Expressions-Kassette enthaltenen Enzyme verschiedene, bevorzugt aber gleiche Kofaktoren paare nutzen, wie z.B. das Kofaktorenpaar NAD7NADH oder NADP7NADPH. 9. Expressionsvektor, umfassend wenigstens eine Expressionskassette nach Ausführungsform 8.

10. Rekombinanter Mikroorganismus, der wenigstens eine Nukleotidsequenz gemäß Ausführungsform 7 oder wenigstens eine Expressionskassette 8 oder wenigstens einen Ex- pressionsvektor nach Ausführungsform 9 trägt.

1 1 . Rekombinanter Mikroorganismus nach Ausführungsform 10, der zusätzlich gegebenenfalls die kodierende Sequenz für wenigstens ein weiteres Enzym, ausgewählt unter Hydroxysteroiddehydrogenasen (HSDH) und zur Kofaktorregenerierung geeignete Dehydro- genasen, trägt.

12. Rekombinanter Mikroorganismus nach Ausführungsform 1 1 , wobei

die weitere HSHD ausgewählt ist unter 3a-HSDHs; und

die Dehydrogenase ausgewählt ist unter NADPH-regenerierenden Enzymen, wie NADPH Dehydrogenasen, Alkoholdehydrogenasen (ADH), und NADPH regenerierenden Formiatde- hydrogenasen (FDH), sowie Glucosedehydrogenase (GDH)-, Glucose-6-Phosphat- Dehydrogenase (G-6-PDH), oder Phosphit-Dehydrogenasen (PtDH), oder

NADH-regenerierenden Enzymen, wie NADH Dehydrogenasen, NADH regenerierenden Formiatdehydrogenasen (FDH), NADH regenerierenden Alkoholdehydrogenasen (ADH), NADH regenerierenden Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenasen (G6PDH), NADH regenerierenden Phosphitdehydrogenasen (PtDH) sowie NADH regenerierenden Glucosedehydro- genasen (GDH). Beispielsweise ist zu nennen ein rekombinanter Mikroorganismus, welcher zur gleichzeitigen Expression einer erfindungsgemäßen 7ß-HSDH Mutante, einer hierin beschriebenen GDH und ggf. einer hierin beschriebenen 3a-HSDH befähigt ist.

Rekombinanter Mikroorganismus nach einer der Ausführungsformen 29 bis 33 wel- che die kodierenden Sequenzen für 7ß-HSDH Mutante, GDH bzw. Mutanten davon und 3a- HSDH auf einem oder mehreren (verschiedenen) Expressionskonstrukten trägt. Gegenstand der Erfindung sind somit rekombinante Mikroorganismen, welche mit einem Einplasmidsys- tem modifiziert (wie z.B. transformiert) sind, das die kodierenden Sequenzen für 7ß-HSDH Mutante, GDH bzw. Mutanten davon und 3a-HSDH bzw. Mutanten davon in einer oder meh- reren Kopien, wie z.B. in 2, 3, 4, 5, oder 6 bis 10 Kopien, tragen. Gegenstand der Erfindung sind somit auch rekombinante Mikroorganismen, welche mit einem Einplasmidsystem modifiziert (wie z.B. transformiert) sind, das die kodierenden Sequenzen für 7ß-HSDH bzw. Mutanten davon, GDH bzw. Mutanten davon und 3a-HSDH bzw. Mutanten davon in einer oder mehreren Kopien, wie z.B. in 2, 3, 4, 5 oder 6 bis 10 Kopien tragen. Die Enzyme (7ß-HSDH, GDH und 3a-HSDH bzw. deren Mutanten) können aber auch auf 2 oder 3 getrennten, miteinander kompatiblen Plasmiden in einer oder mehreren Kopien enthalten sein. Geeignete Basisvektoren zur Herstellung von Einplasmidsystemen und Multicopy-Plasmiden sind dem Fachmann bekannt. Als Beispiele können genannt werden für Einplasmidsystem, z.B. pET21 a und für Multicopyplasmide z.B. die von der Firma Novagen vertriebenen Duet- Vektoren, wie pACYCDuet-1 , pETDuet-1 , pCDFDuet-1 , pRSFDuet-1 und pCOLADuet-1. Derartige Vektoren, deren Kompatibilität mit anderen Vektoren und mikrobiellen Wirtsstämmen sind z.B. dem„User Protocol TB340 Rev. E0305 der Firma Novagen zu entnehmen.

Die optimale Kombination von Enzymen für die Generierung von Plasmidsystemen kann der Fachmann unter Berücksichtigung der Lehre der vorliegenden Erfindung ohne un- zumutbaren Aufwand vornehmen. So kann der Fachmann beispielsweise in Abhängigkeit von der Kofaktorspezifität des jeweils verwendeten 7ß-HSDH-Enzyms das zur Kofaktorre- generierung am besten geeignete Enzym, ausgewählt unter den oben genannten Dehydrogenasen, insbesondere GDH und den jeweiligen Mutanten davon, auswählen.

Weiterhin besteht die Möglichkeit, die zur Umsetzung gewählten Enzyme auf zwei oder mehrere Plasmide zu verteilen und mit den so hergestellten Plasmiden zwei oder mehrere verschiedene rekombinante Mikroorganismen herzustellen, die dann gemeinsam für die erfindungsgemäße biokatalytische Umsetzung eingesetzt werden. Die jeweilige zur Herstellung des Plasmids verwendete Enzymkombination kann dabei insbesondere auch unter der Vorgabe einer vergleichbaren Kofaktor-Nutzung erfolgen. So kann beispielsweise ein erster Mikroorganismus mit einem Plasmid modifiziert werden, welches die kodierende Sequenz für eine 7ß-HSDH-Mutante und eine GDH tragen. Ein zweiter Mikroorganismus kann dagegen mit einem Plasmid modifiziert sein, das die kodierende Sequenz für eine 3a-HSDH und die kodierende Sequenz für eine GDH trägt. Beide Enzympaare können so gewählt sein dass sie gleiche Kofaktoren-Paare regenerieren können. Beide Mikroorganismen können dann gleichzeitig zur erfindungsgemäßen biokatalytischen Umsetzung eingesetzt werden.

Die Verwendung von zwei getrennten Biokatalysatoren (rekombinanter Mikroorga- nismen) kann gegenüber der Verwendung nur eines Biokatalysators, in dem alle Syntheseenzyme exprimiert werden, zwei wesentliche Vorteile bieten:

a) Beide Biokatalysatoren können separat voneinander gentechnisch modifiziert und optimiert werden. Insbesondere ist der Einsatz von verschiedenen Kofaktorregenerierungs- enzymen möglich, die entweder auf NADH- oder auf NADPH-Regenerierung optimiert sind. b) Für die Biokatalyse können die Biokatalysatoren in unterschiedlichen Anteilen eingesetzt werden. Dies ermöglicht ein Eingreifen in die einzelnen Reaktionsgeschwindigkeiten des Multienzymprozesses während der Biokatalyse, selbst nachdem sämtliche Biokatalysatoren bereits hergestellt sind. 13. Rekombinanter Mikroorganismus nach einer der Ausführungsformen 10 bis 12 welcher ein 7a-HSDH knock-out Hydroxysteroiden, wobei man das Stamm, wie z.B. beschrieben in der WO201 1/147957 ist.

14. Verfahren zur enzymatischen oder mikrobiellen Synthese von 7ß- korrespondierende 7-Ketosteroid in Gegenwart einer 7ß-HSDH gemäß der Definition in einer der Ausführungsformen 1 bis 6 oder in Gegenwart eines diese 7ß-HSDH exprimierenden rekombinanten Mikroorganismus nach einer der Ausführungsformen 10 bis 13 reduziert, und gegebenenfalls wenigstens ein gebildetes Reduktionsprodukt aus dem Reaktionsansatz isoliert.

15. Verfahren nach Ausführungsform 14, wobei das 7- Ketosteroid ausgewählt ist unter

Dehydrocholsäure (DHCA),

7-Keto-lithocholsäure (7-Keto-LCS),

7,12-Diketo-lithocholsäure (7,12-Diketo-LCS) und

den Derivaten davon, wie insbesondere einem Salz, Amid oder Alkylester der Säure.

16. Verfahren nach Ausführungsform 14 oder 15, wobei die Reduktion in Gegenwart und insbesondere unter Verbrauch von NADPH und/oder NADH erfolgt.

17. Verfahren nach Ausführungsform 16, wobei verbrauchtes NADPH durch Kopp- lung mit einem NADPH-regenerierenden Enzym regeneriert wird, wobei dieses insbesondere ausgewählt ist unter NADPH Dehydrogenasen, Alkoholdehydrogenasen (ADH), und NADPH regenerierenden Formiatdehydrogenasen (FDH) und einer NADPH- regenerierenden Glucosedehydrogenase (GDH), wobei das NADPH-regenerierende Enzym gegebenenfalls von einem rekombinanten Mikroorganismus exprimiert wird; und/oder wobei verbrauchtes NADH durch Kopplung mit einem NADH-regenerierenden Enzym regeneriert wird, wobei dieses insbesondere ausgewählt ist unter NADH-Dehydrogenasen, NADH- regenerierenden Formiatdehydrogenasen (FDH), NADH-regenerierenden Alkoholdehydrogenasen (ADH), NADH-regenerierenden Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenasen (G6PDH), NADH-regenerierenden Phosphitdehydrogenasen (PtDH) sowie NADH-regenerierenden Glucosedehydrogenasen (GDH), wobei das NADH-regenerierende Enzym ggf. in einem rekombinanten Mikroorganismus exprimiert wird

18. Verfahren nach Ausführungsform 17, wobei das NADPH-regenerierende Enzym ausgewählt ist unter

a) FDHs, einschließlich Mutanten einer NAD ⁺ -abhängigen FDH, welche wenigstens die enzymatische Oxidation von Ameisensäure zu C0 ₂ katalysiert, wobei die Mutante im Vergleich zum nicht-mutierten Enzym zusätzlich NADP ⁺ als Kofaktor akzeptiert; und

b) GDHs.

19. Verfahren zur Herstellung von Ursodesoxycholsäure (UDCS) der Formel (1 )

worin

R für Alkyl, H, ein Alkalimetallion oder N(R ³ ) ₄ ⁺ steht, worin die Reste R ³ gleich oder verschieden sind und für H oder Alkyl stehen, oder die Gruppe -C0 ₂ R durch die Säureamid-Gruppe -CONR ¹ R ² , ersetzt ist, worin R ¹ und R ² unabhängig voneinander für einen Alkylrest stehen; wobei man a) gegebenenfalls eine Cholsäure (CS) der Formel (2)

worin R die oben angegebenen Bedeutungen besitzt oder die Gruppe -C0 ₂ R durch die Säu- reamid-Gruppe -CONR ¹ R ² , wie oben definiert ersetzt ist,

zur Dehydrocholsäure (DHCS) der Formel (3)

worin R die oben angegebenen Bedeutungen besitzt, oder die Gruppe -C0 ₂ R durch die Säureamid-Gruppe -CONR ¹ R ² , wie oben definiert ersetzt ist, chemisch oxidiert; b) DHCS in Gegenwart wenigstens einer 7ß-HSDH-Mutante gemäß der Definition in einer der Ausführungsformen 1 bis 6 (vorliegend als isoliertes Enzym oder exprimiert von einer entsprechenden rekombinanten Mikroorganismus) und in Gegenwart wenigstens einer 3a- HSDH (vorliegend als isoliertes Enzym oder exprimiert von einer entsprechenden rekombi- nanten Mikroorganismus) zur korrespondierenden 12-Keto-ursodesoxychiolsäure (12-Keto UDCS) der Formel (5)

worin R die oben angegebenen Bedeutungen besitzt, oder die Gruppe -C0 ₂ R durch die Säureamid-Gruppe -CONR ¹ R ² , wie oben definiert ersetzt ist, insbesondere in Gegenwart und unter Verbrauch von NADH und /oder NADPH

reduziert und anschließend c) 12-Keto-UDCS der Formel (5) chemisch zu UDCS reduziert; und d) das Reaktionsprodukt gegebenenfalls weiter aufreinigt.

20. Verfahren nach Ausführungsform 19, wobei zumindest Schritt b) in Gegenwart eines rekombinanten Mikroorganismus nach einem der Ausführungsformen 10 bis 13 durch- geführt werden.

21 . Verfahren nach Ausführungsform 19 oder 20, wobei Schritt b) mit gleichen oder verschiedenen Kofaktorregenerierungssystemen gekoppelt ist. 22. Verfahren zur Herstellung von UDCS der Formel (1 )

worin

R für Alkyl, NR ¹ R ² , H, ein Alkalimetallion oder N(R ³ ) ₄ ⁺ steht, worin die Reste R ³ gleich oder verschieden sind und für H oder Alkyl stehen oder die Gruppe -C0 ₂ R durch die Säureamid- Gruppe -CONR ¹ R ² , wie oben definiert ersetzt ist wobei man a) gegebenenfalls eine CS der Formel 2)

worin R die oben angegebenen Bedeutungen besitzt, oder die Gruppe -C0 ₂ R durch die Säureamid-Gruppe -CONR ¹ R ² , wie oben definiert ersetzt ist, zur DHCS der Formel (3)

worin R die oben angegebenen Bedeutungen besitzt, oder die Gruppe -C0 ₂ R durch die Säureamid-Gruppe -CONR ¹ R ² wie oben definiert ersetzt ist chemisch oxidiert; b) DHCS in Gegenwart wenigstens einer 7ß-HSDH und in Gegenwart wenigstens einer 3a- HSDH zur korrespondierenden 12-Keto UDCS der Formel 5)

worin R die oben angegebenen Bedeutungen besitzt, oder die Gruppe -C0 ₂ R durch die Säureamid-Gruppe -CONR ¹ R ² wie oben definiert ersetzt ist, insbesondere in Gegenwart und unter Verbrauch von NADH und/oder NADPH, reduziert und anschließend c) 12-Keto-UDCS der Formel (5) chemisch zu UDCS reduziert; und d) das Reaktionsprodukt gegebenenfalls weiter aufreinigt; wobei die Umsetzungen des Schritts b) in Gegenwart eines rekombinanten Mikroorganismus nach einer der Ausführungsformen 10 bis 13 erfolgen, wie z.B. in Gegenwart ganzer Zellen eines oder mehrer verschiedener rekombinanter Mikroorganismen nach einer der Ausführungsformen 10 bis 13 erfolgen, wobei der/die Mikroorganismen die zur Umsetzung und Kofaktorregnerierung erforderlichen Enzyme in einer hierin näher beschriebenen Weise tragen. Der Verfahrensschritt b) kann dabei unterschiedlich ausgestaltet sein. Entweder können beide Enzyme (7ß-HSDH-Mutante und 3a-HSDH) gleichzeitig zugegen sein (z.B. Ein-Topf- Reaktion mit beiden isolierten Enzymen oder ein oder mehrere entsprechende rekombinante Mikroorganismen sind zugegen, der beide Enzyme exprimiert), oder die Teilreaktionen können in beliebiger Reihenfolge (erst die 7ß-HSDH-Mutante-katalysierte Reduktion und dann die 3a-HSDH-katalysierte Reduktion; oder erst die 3a-HSDH -katalysierte Reduktion und dann die 7ß-HSDH-Mutante -katalysierte Reduktion) ablaufen. .Weiterhin kann Schritt b) mit einem Kofaktorregenerierungssystem gekoppelt sein, bei welchem NADPH durch eine NADPH regenerierende GDH unter Verbrauch von Glucose regeneriert wird; oder mit einem Kofaktorregenerierungssystem gekoppelt ist, bei welchem verbrauchtes NADH durch eine NADH regenerierende GDH, ADH oder FDH regeneriert wird. 23. Bioreaktor zur Durchführung eines Verfahrens nach einer der Ausführungsformen 14 bis 22, insbesondere enthaltend wenigstens eines der Enzyme 7ß-HSDH, FDH, und/oder 3a-HSDH bzw. deren Mutanten; oder 7 ß-HSDH, GDH und/oder 3a-HSDH bzw. deren Mutanten) Vorliegende Erfindung ist nicht auf die hierin beschriebenen konkreten Ausführungsformen beschränkt. Der Fachmann wird durch die Lehre der vorliegenden Erfindung vielmehr in die Lage versetzt, ohne unzumutbaren Aufwand weitere Ausgestaltungen der Erfindung bereitzustellen. So kann er beispielsweise auch weitere Enzymmutanten gezielt generieren und diese auf das gewünschte Eigenschaftsprofil (verbesserte Kofaktor-Abhängigkeit und /der Stabilität, verringerte Substratinhibition) screenen und optimieren; oder weitere geeignete Wildtypenzyme (7ß- und 3a-HSDHs, FDHs, GDHs ADHs usw.) isolieren und erfindungsgemäß verwenden. Weiterhin kann er beispielsweise je nach Eigenschaftsprofil (insbesondere Kofaktor-Abhängigkeit) der verwendeten HSDHs, wie insbesondere 7ß-HSDH und 3a-HSDH oder Mutanten davon, geeignete zur Kofaktorregenerierung brauchbare Dehydrogenasen (GDH, FHD, ADH usw.) und Mutanten davon auswählen, und die ausgewählten Enzyme auf einen oder mehrere Expressionskonstrukte oder Vektoren verteilen und damit erforderlichenfalls einen oder mehrere rekombinante Mikroorganismen erzeugen, die dann ein optimiertes ganzzellbasiertes Herstellungsverfahren ermöglichen. Weitere Ausgestaltungen der Erfindung

1 . Allgemeine Definitionen und verwendete Abkürzungen

Werden keine anderen Angaben gemacht, so bezeichnet der Begriff „7ß-HSDH" ein Dehydrogenase-Enzym, welches wenigstens die stereospezifische und/oder regiospezifi- sche Reduktion von DHCS oder 7,12-Diketo-3a-CS (7,12-Diketo-LCS) zu 3,12-Diketo-7ß-CS oder 12-Keto-UDCS insbesondere unter stöchiometrischem Verbrauch von NADPH, und gegebenenfalls die entsprechende Umkehrreaktion katalysiert. Das Enzym kann dabei ein natives bzw. rekombinant hergestelltes Enzym sein. Das Enzym kann grundsätzlich im Gemisch mit zellulären, wie z.B. Proteinverunreinigungen, vorzugsweise aber in Reinform vorliegen. Geeignete Nachweisverfahren sind z.B. im folgenden experimentellen Teil beschrieben oder aus der Literatur bekannt (z.B. Characterization of NADP-dependent 7 beta- hydroxysteroid dehydrogenases from Peptostreptococcus productus and Eubacterium aero- faciens. S Hirano and N Masuda. Appl Environ Microbiol. 1982). Enzyme dieser Aktivität sind unter der EC Nummer 1 .1.1.201 klassifiziert.

Werden keine anderen Angaben gemacht, so bezeichnet der Begriff „3a-HSDH" ein Dehydrogenase-Enzym, welches wenigstens die stereospezifische und/oder regiospezifi- sche Reduktion von 3,12-Diketo-7ß-CS oder DHCS zu 12-Keto-UDCS oder 7,12-Diketo-3a- CS (7,12-Diketo-LCS), insbesondere unter stöchiometrischem Verbrauch von NADH und/oder NADPH, und gegebenenfalls die entsprechende Umkehrreaktion katalysiert. Geeignete Nachweisverfahren sind z.B. im folgenden experimentellen Teil beschrieben oder aus der Literatur bekannt. Geeignete Enzyme sind z.B. aus Comanomonas testosteroni (z.B. ATCC1 1996) erhältlich. Eine NADPH abhängige 3a-HSDH ist z.B. aus der Nagern bekannt und ebenfalls einsetzbar. (Cloning and sequencing of the cDNA for rat liver 3 alpha- hydroxysteroid/dihydrodiol dehydrogenase, J E Pawlowski, M Huizinga and T M Penning, May 15, 1991 The Journal of Biological Chemistry, 266, 8820-8825). Enzyme dieser Aktivität sind unter der EC Nummer 1 .1.1.50 klassifiziert.

Werden keine anderen Angaben gemacht, so bezeichnet der Begriff „GDH" ein De- hydrogenase-Enzym, welches wenigstens die Oxidation von ß-D-Glucose zu D-Glucono-1 ,5- Lacton unter stöchiometrischem Verbrauch von NAD ⁺ und/oder NADP ⁺ sowie ggf. die entsprechende Umkehrreaktion katalysiert. Geeignete Enzyme sind z.B. aus Bacillus subtili oder Bacillus megaterium erhältlich. Enzyme dieser Aktivität sind unter der EC Nummer 1 .1.1.47 klassifiziert.

Werden keine anderen Angaben gemacht, so bezeichnet der Begriff „FDH" ein Dehydrogenase-Enzym, welches wenigstens die Oxidation von Ameisensäure (oder korrespondierenden Formiat-Salzen) zu Kohlendioxid unter stöchiometrischem Verbrauch von NAD ⁺ und/oder NADP ⁺ , und gegebenenfalls die entsprechende Umkehrreaktion katalysiert. Geeignete Nachweisverfahren sind z.B. im folgenden experimentellen Teil beschrieben oder aus der Literatur bekannt. Geeignete Enzyme sind z.B. aus Candida boidinii, Pseudomonas sp, oder Mycobacterium vaccae erhältlich. Enzyme dieser Aktivität sind unter der EC Nummer 1.2.1 .2 klassifiziert. Unter einer„Reinform" oder einem „reinen" oder„im wesentlichen reinen" Enzym versteht man erfindungsgemäß ein Enzym mit einem Reinheitsgrad von mehr als 80, vorzugsweise mehr als 90, insbesondere mehr als 95, und vor allem mehr als 99 Gew.-%, bezogen auf den Gesamtproteingehalt, bestimmt mit Hilfe üblicher Proteinnachweismethoden, wie .z.B. der Biuret- Methode oder dem Proteinnachweis nach Lowry.et al.(vgl Beschreibung in R.K. Scopes, Protein Purification, Springer Verlag, New York, Heidelberg, Berlin (1982)).

Unter einem„Redoxäquivalent" versteht man eine als Elektronendonor bzw. Elektronenakzeptor brauchbare, niedermolekulare organische Verbindung, wie beispielsweise Niko- tinamidderivate wie NAD ⁺ und NADH ⁺ bzw. deren reduzierte Formen NADH bzw. NADPH. „Redoxäquivalent" und„Kofaktor" werden im Kontext der vorliegenden Erfindung als Synonym verwendet. So kann ein „Kofaktor" im Sinne der Erfindung auch als „redoxfähiger Kofaktor", d.h. als Kofaktor, der in reduzierter und einer oxidierter Form vorliegen kann, umschrieben werden.

Unter einem„verbrauchten" Kofaktor versteht man diejenige reduzierte bzw. oxidierte Form des Kofaktors, die im Verlauf einer vorgegebene Reduktions- bzw. Oxidationsreaktion eines Substrats in die korrespondierende oxidierte bzw. reduzierte Form überführt wird. Durch Regenerierung wird die bei der Reaktion gebildete oxidierte bzw. reduzierte Kofaktor- Form wieder in die reduzierte bzw. oxidierte Ausgangsform zurück überführt, so dass diese für die Umsetzung des Substrats wieder zur Verfügung steht.

Unter einer„veränderten Kofaktor-Nutzung versteht man im Rahmen der vorliegenden Erfindung eine qualitative oder quantitative Veränderung im Vergleich zu einer Referenz. Insbesondere ist eine veränderte Kofaktor-Nutzung durch Vornahme von Aminosäuresequenzmutationen zu beobachten. Diese Veränderung ist dann im Vergleich zum nicht- mutierten Ausgangsenzym feststellbar. Dabei kann die Aktivität in Bezug auf einen bestimm- ten Kofaktor durch Vornahme einer Mutation erhöht oder erniedrigt werden oder vollständig unterbunden werden. Eine veränderte Kofaktor-Nutzung umfasst aber auch Änderungen dergestalt, dass anstelle einer Spezifität für einen einzelnen Kofaktor nunmehr wenigstens ein weiterer, vom ersten Kofaktor verschiedener, zweiter Kofaktor nutzbar ist (d.h. es liegt eine erweiterte Kofaktor-Nutzung vor) Umgekehrt kann aber auch eine ursprünglich vorhan- dene Befähigung zur Nutzung zweier verschiedener Kofaktoren so abgeändert werden, dass Spezifität nur für einen dieser Kofaktoren erhöht bzw. für einen dieser Kofaktoren verringert oder vollständig aufgehoben wird. So kann beispielsweise ein Enzym, das vom Kofaktor NAD (NADH) abhängig ist, aufgrund einer Veränderung der Kofaktor-Nutzung nunmehr sowohl von NAD (NADH) als auch vom Kofaktor NADP (NADPH) abhängig sein oder die ur- sprüngliche Abhängigkeit von NAD (NADH) kann vollständig in eine Abhängigkeit von NADP (NADPH) überführt werden und umgekehrt.

Die Begriffe „NADVNADH-Abhängigkeit" bzw. „NADPVNADPH-Abhängigkeit" sind erfindungsgemäß, wenn nicht anders definiert, weit auszulegen. Diese Begriffe umfassen sowohl „spezifische" Abhängigkeiten, d.h. ausschließlich Abhängigkeit von NAD7NADH bzw. NADP7NADPH, als auch die Abhängigkeit der erfindungsgemäß verwendeten Enzyme von beiden Kofaktoren, d.h. Abhängigkeit von NAD7NADH und NADP7NADPH.

Entsprechendes gilt für die verwendeten Begriffe„NAD7NADH-akzeptierend" bzw.

„NADPVNADPH-akzeptierend".

Die Begriffe„NAD7NADH-regenerierend" bzw.„NADP7NADPH-regenerierend" sind erfindungsgemäß, wenn nicht anders definiert, weit auszulegen. Diese Begriffe umfassen sowohl „spezifische" d.h. ausschließliche Befähigung verbrauchten Kofaktor NAD7NADH bzw. NADP7NADPH zu regenerieren, als auch die Befähigung beide Kofaktoren, d.h. NAD7NADH und NADP7NADPH, zu regenerieren.

„Proteinogene" Aminosäuren umfassen insbesondere (Einbuchstabencode): G, A, V, L, I, F, P, M, W, S, T, C, Y, N, Q, D, E, K, R und H.

Unter einer „Immobilisierung" versteht man erfindungsgemäß die kovalente oder nicht-kovalente Bindung eines erfindungsgemäß verwendeten Biokatalysators, wie z.B. einer 7ß-HSDH an einem festen, d.h. in dem umgebenden flüssigen Medium im Wesentlichen unlöslichen, Trägermaterial. Erfindungsgemäß können entsprechend auch ganze Zellen, wie die erfindungsgemäß verwendeten, rekombinanten Mikroorganismen, mit Hilfe derartiger Träger immobilisiert sein.

Eine„im Vergleich zum nicht-mutierten Enzym verringerte Substratinhibition" bedeutet, dass das die beim nicht-mutierten Enzym für ein bestimmtes Substrat beobachtete Substratinhibition nicht mehr zu beobachten ist, d.h. im Wesentlichen nicht mehr messbar ist, oder erst bei höherer Substratkonzentration einsetzt, d.h. der KrWert erhöht ist.

Unter einer„Cholsäure-Verbindung" versteht man erfindungsgemäß Verbindungen mit dem Kohenstoffgrundgerüst, insbesondere der Steroidstruktur der Cholsäure und dem Vorhandensein von Keto- und/oder Hydroxy- oder Acyloxy-Gruppen in der Ringposition 7 und gegebenenfalls den Ringpositionen 3 und/oder 12.

Unter einer Verbindung eines speziellen Typs, wie z.B. einer„Cholsäure-Verbindung" oder einer„Ursodesoxycholsäure-Verbindung" versteht man insbesondere auch Derivate der zugrunde liegenden Ausgangsverbindung (wie z.B. Cholsäure oder Ursodesoxycholsäure).

Derartige Derivate umfassen„Salze", wie z.B. Alkalimetallsalze wie Lithium-, Natrium- und Kaliumsalze der Verbindungen; sowie Ammoniumsalze, wobei man unter einem Ammoniumsalz das NH ₄ ⁺ -Salz bzw. solche Ammoniumsalze umfasst, worin wenigstens ein Wasserstoffatom durch einen CrC ₆ -Alkylrest ersetzt sein kann. Typische Alkylreste sind insbesondere CrC ₄ -Alkylreste, wie Methyl, Ethyl, n- oder i-Propyl-, n-, sec- oder tert-Butyl, sowie n-Pentyl und n-Hexyl und die ein- oder mehrfach verzweigten Analoga davon

„Alkylester" erfindungsgemäßer Verbindungen sind insbesondere Niedrigalkyl-Ester, wie z.B. CrC ₆ -Alkylester. Als nicht limitierende Beispiele sind zu nennen Methyl-, Ethyl-, n- oder i-Propyl-, n-, sec- oder tert-Butylester, oder längerkettige Ester, wie z.B. n-Pentyl- und n-Hexylester sowie die ein- oder mehrfach verzweigten Analoga davon.

„Amide" sind insbesondere Umsetzungsprodukte erfindungsgemäßer Säuren mit Ammoniak oder primären oder sekundären Monoaminen. Derartige Amine sind beispielsweise Mono- oder Di-Ci-C ₆ -Alkyl-monoamine, wobei die Alkylreste unabhängig voneinander gegebenenfalls weiter substituiert sein können, wie z.B. durch Carboxy-, Hydroxy-, Halogen (wie F, Cl, Br, J)-, Nitro- und Sulfonatgruppen.

Erfindungsgemäße„Acylgruppen" sind insbesondere nichtaromatische Gruppen mit 2 bis 4 Kohlenstoffatomen, wie z.B. Acetyl, Propionyl und Butyryl, sowie aromatische Gruppen mit gegebenenfalls substituiertem einkernigen aromatischem Ring, wobei geeignete Substituenten z.B. ausgewählt sind unter Hydroxy-, Halogen (wie F, Cl, Br, J)-, Nitro- und CrC ₆ -Alkylgruppen, wie z.B. Benzoyl oder Toluoyl.

Die erfindungsgemäß eingesetzten bzw. hergestellten Hydroxysteroidverbindungen, wie z.B. Cholsäure, Ursodesoxycholsäure, 12-Keto-Chenodesoxycholsäure, Chenodesoxycholsäure und 7-Keto-Lithocholsäure können in stereoisomerenreiner Reinform oder im Gemisch mit anderen Stereoisomeren im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt oder daraus erhalten werden. Vorzugsweise werden jedoch die eingesetzten bzw. die hergestellten Verbindungen in im Wesentlichen stereoisomerenreiner Form eingesetzt bzw. isoliert.

In folgender Tabelle sind die Strukturformeln, deren chemischen Namen und die verwendeten Abkürzungen wesentlicher chemischer Verbindungen tabellarisch zusammen- gefasst:

2. Proteine

Die vorliegende Erfindung ist nicht auf die konkret offenbarten Proteine bzw. Enzyme mit 7ß-HSDH-, FDH-, GDH- oder 3a-HSDH Aktivität bzw. deren Mutanten beschränkt, sondern erstreckt sich vielmehr auch auf funktionale Äquivalente davon.

„Funktionale Äquivalente" oder Analoga der konkret offenbarten Enzyme sind im Rahmen der vorliegenden Erfindung davon verschiedene Polypeptide, welche weiterhin die gewünschte biologische Aktivität, wie z.B. 7ß HSDH-Aktivität, besitzen.

So versteht man beispielsweise unter„funktionalen Äquivalenten" Enzyme, die im verwendeten Test auf 7ß-HSDH-, FDH-, GDH- oder 3a-HSDH -Aktivität eine um mindestens 1 % , wie z.B. mindestens 10% oder 20 %, wie z.B. mindestens 50 % oder 75% oder 90 % höhere oder niedrigere Aktivität eines Ausgangs-Enzyms, umfassend eine hierin definierte Aminosäuresequenz aufweisen.

Funktionale Äquivalente sind außerdem vorzugsweise zwischen pH 4 bis 1 1 stabil und besitzen vorteilhaft ein pH-Optimum in einem Bereich von pH 6 bis 10, wie insbesondere 8,5 bis 9,5, sowie ein Temperaturoptimum im Bereich von 15°C bis 80°C oder 20°C bis 70°C, wie z.B. etwa 45 bis 60°C oder etwa 50 bis 55°C.

Die 7ß-HSDH-Aktivität kann mit Hilfe verschiedener bekannter Tests nachgewiesen werden. Ohne darauf beschränkt zu sein, sei ein Test unter Verwendung eines Referenzsubstrates, wie z. B. CS oder DHCS, unter standardisierten Bedingungen wie im experimentellen Teil definiert, zu nennen.

Tests zur Bestimmung der FDH-, GDH- oder 3a-HSDH -Aktivität sind ebenfalls an sich bekannt. Unter„funktionalen Äquivalenten" versteht man erfindungsgemäß insbesondere auch „Mutanten", welche in wenigstens einer Sequenzposition der oben genannten Aminosäuresequenzen eine andere als die konkret genannte Aminosäure aufweisen aber trotzdem eine der oben genannten biologischen Aktivitäten besitzen. „Funktionale Äquivalente" um- fassen somit die durch eine oder mehrere, wie z.B. 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 , 12, 13, 14 oder 15, Aminosäure-Additionen, -Substitutionen, -Deletionen und/oder -Inversionen erhältlichen Mutanten, wobei die genannten Veränderungen in jeglicher Sequenzposition auftreten können, solange sie zu einer Mutante mit dem erfindungsgemäßen Eigenschaftsprofil führen. Funktionale Äquivalenz ist insbesondere auch dann gegeben, wenn die Reaktivitäts- muster zwischen Mutante und unverändertem Polypeptid qualitativ übereinstimmen, d.h. beispielsweise gleiche Substrate mit unterschiedlicher Geschwindigkeit umgesetzt werden. Beispiele für geeignete Aminosäuresubstitutionen sind in folgender Tabelle zusammenge- fasst:

Ursprünglicher Rest Beispiele der Substitution

Ala Ser

Arg Lys

Asn Gin; His

Asp Glu

Cys Ser

Gin Asn

Glu Asp

Gly Pro

His Asn ; Gin

lle Leu; Val

Leu lle; Val

Lys Arg ; Gin ; Glu

Met Leu ; lle

Phe Met ; Leu ; Tyr

Ser Thr

Thr Ser

Trp Tyr

Tyr Trp ; Phe

Val lle; Leu

„Funktionale Äquivalente" im obigen Sinne sind auch„Präkursoren" der beschriebenen Polypeptide sowie„funktionale Derivate" und„Salze" der Polypeptide.

„Präkursoren" sind dabei natürliche oder synthetische Vorstufen der Polypeptide mit oder ohne der gewünschten biologischen Aktivität.

Unter dem Ausdruck„Salze" versteht man sowohl Salze von Carboxylgruppen als auch Säureadditionssalze von Aminogruppen der erfindungsgemäßen Proteinmoleküle. Salze von Carboxylgruppen können in an sich bekannter Weise hergestellt werden und umfas- sen anorganische Salze, wie zum Beispiel Natrium-, Calcium-, Ammonium-, Eisen- und Zinksalze, sowie Salze mit organischen Basen, wie zum Beispiel Aminen, wie Triethanola- min, Arginin, Lysin, Piperidin und dergleichen. Säureadditionssalze, wie zum Beispiel Salze mit Mineralsäuren, wie Salzsäure oder Schwefelsäure und Salze mit organischen Säuren, wie Essigsäure und Oxalsäure sind ebenfalls Gegenstand der Erfindung.

„Funktionale Derivate" erfindungsgemäßer Polypeptide können an funktionellen Aminosäure-Seitengruppen oder an deren N- oder C-terminalen Ende mit Hilfe bekannter Techniken ebenfalls hergestellt werden. Derartige Derivate umfassen beispielsweise aliphatische Ester von Carbonsäuregruppen, Amide von Carbonsäuregruppen, erhältlich durch Umset- zung mit Ammoniak oder mit einem primären oder sekundären Amin; N-Acylderivate freier Aminogruppen, hergestellt durch Umsetzung mit Acylgruppen; oder O-Acylderivate freier Hydroxylgruppen, hergestellt durch Umsetzung mit Acylgruppen.

"Funktionale Äquivalente" umfassen natürlich auch Polypeptide welche aus anderen Organismen zugänglich sind, sowie natürlich vorkommende Varianten. Beispielsweise las- sen sich durch Sequenzvergleich Bereiche homologer Sequenzregionen festlegen und in Anlehnung an die konkreten Vorgaben der Erfindung äquivalente Enzyme ermitteln.

„Funktionale Äquivalente" umfassen ebenfalls Fragmente, vorzugsweise einzelne Domänen oder Sequenzmotive, der erfindungsgemäßen Polypeptide, welche z.B. die gewünschte biologische Funktion aufweisen.

„Funktionale Äquivalente" sind außerdem Fusionsproteine, welche eine der oben genannten Polypeptidsequenzen oder davon abgeleitete funktionale Äquivalente und wenigstens eine weitere, davon funktionell verschiedene, heterologe Sequenz in funktioneller Nieder C-terminaler Verknüpfung (d.h. ohne gegenseitigen wesentliche funktionelle Beeinträchtigung der Fusionsproteinteile) aufweisen. Nichtlimitierende Beispiele für derartige hete- rologe Sequenzen sind z.B. Signalpeptide, Histidin-Anker, wie z.B. eines Hexahistidin-Anker umfassendes Peptid, wie z.B.„LEHHHHHH", oder Enzyme.

Erfindungsgemäß mit umfasste„funktionale Äquivalente" sind Homologe zu den konkret offenbarten Proteinen. Diese besitzen wenigstens 60 %, vorzugsweise wenigstens 75% ins besondere wenigsten 85 %, wie z.B. 90, 91 , 92, 93, 94, 95, 96, 97,98 oder 99%, Homo- logie (bzw. Identität) zu einer der konkret offenbarten Aminosäuresequenzen, berechnet nach dem Algorithmus von Pearson und Lipman, Proc. Natl. Acad, Sei. (USA) 85(8), 1988, 2444-2448. Eine prozentuale Homologie bzw. Identität eines erfindungsgemäßen homologen Polypeptids bedeutet insbesondere prozentuale Identität der Aminosäurereste bezogen auf die Gesamtlänge einer der hierin konkret beschriebenen Aminosäuresequenzen.

Die prozentualen Identitätswerte können auch anhand von BLAST Alignments, Algorithmus blastp (protein-protein BLAST), oder durch Anwendung der unten angegebenen Clustal Einstellungen ermittelt werden. Im Falle einer möglichen Proteinglykosylierung umfassen erfindungsgemäße„funktionale Äquivalente" Proteine des oben bezeichneten Typs in deglykosylierter bzw. glykosy- lierter Form sowie durch Veränderung des Glykosylierungsmusters erhältliche abgewandelte Formen.

Homologe der erfindungsgemäßen Proteine oder Polypeptide können durch Mutagenese erzeugt werden, z.B. durch Punktmutation, Verlängerung oder Verkürzung des Proteins.

Homologe der erfindungsgemäßen Proteine können durch Screening kombinatorischer Banken von Mutanten, wie z.B. Verkürzungsmutanten, identifiziert werden. Beispiels- weise kann eine variegierte Bank von Protein-Varianten durch kombinatorische Mutagenese auf Nukleinsäureebene erzeugt werden, wie z.B. durch enzymatisches Ligieren eines Gemisches synthetischer Oligonukleotide. Es gibt eine Vielzahl von Verfahren, die zur Herstellung von Banken potentieller Homologer aus einer degenerierten Oligonukleotidsequenz verwendet werden können. Die chemische Synthese einer degenerierten Gensequenz kann in ei- nem DNA-Syntheseautomaten durchgeführt werden, und das synthetische Gen kann dann in einen geeigneten Expressionsvektor ligiert werden. Die Verwendung eines degenerierten Gensatzes ermöglicht die Bereitstellung sämtlicher Sequenzen in einem Gemisch, die den gewünschten Satz an potentiellen Proteinsequenzen kodieren. Verfahren zur Synthese degenerierter Oligonukleotide sind dem Fachmann bekannt (z.B. Narang, S.A. (1983) Tet- rahedron 39:3; Itakura et al. (1984) Annu. Rev. Biochem. 53:323; Itakura et al., (1984) Science 198:1056; Ike et al. (1983) Nucleic Acids Res. 1 1 :477).

Im Stand der Technik sind mehrere Techniken zum Screening von Genprodukten kombinatorischer Banken, die durch Punktmutationen oder Verkürzung hergestellt worden sind, und zum Screening von cDNA-Banken auf Genprodukte mit einer ausgewählten Ei- genschaft bekannt. Diese Techniken lassen sich an das schnelle Screening der Genbanken anpassen, die durch kombinatorische Mutagenese erfindungsgemäßer Homologer erzeugt worden sind. Die am häufigsten verwendeten Techniken zum Screening großer Genbanken, die einer Analyse mit hohem Durchsatz unterliegen, umfassen das Klonieren der Genbank in replizierbare Expressionsvektoren, Transformieren der geeigneten Zellen mit der resultie- renden Vektorenbank und Exprimieren der kombinatorischen Gene unter Bedingungen, unter denen der Nachweis der gewünschten Aktivität die Isolation des Vektors, der das Gen kodiert, dessen Produkt nachgewiesen wurde, erleichtert. Recursive-Ensemble-Mutagenese (REM), eine Technik, die die Häufigkeit funktioneller Mutanten in den Banken vergrößert, kann in Kombination mit den Screeningtests verwendet werden, um Homologe zu identifizie- ren (Arkin und Yourvan (1992) PNAS 89:781 1 -7815; Delgrave et al. (1993) Protein Engineering 6(3):327-331 ).

Die Erfindung umfasst weiterhin die Anwendung des 7ß-HSDH-Wildtyps aus Collin- sella aerofaciens ATCC 25986, wie er in der WO201 1/064404der Anmelderin beschrieben ist, worauf hiermit ausdrücklich Bezug genommen wird.

Dieser aus Collinsella aerofaciens DSM 3979 erhältliche 7ß-HSDH ist insbesondere durch wenigstens eine weitere der folgenden Eigenschaften, wie z.B. 2, 3, 4, 5, 6 oder 7 oder aller solcher Eigenschaften, gekennzeichnet:

a) Molekulargewicht (SDS-Gelelektrophorese): etwa 28-32 kDa, insbesondere etwa 29 bis 31 kDa oder etwa 30 kDa;

b) Molekulargewicht (Gelfiltration, unter nicht denaturierenden Bedingungen, wie insbesondere ohne SDS): etwa 53 bis 60 kDa, insbesondere etwa 55 bis 57 kDa , wie 56.1 kDa. Dies belegt die dimere Beschaffenheit der 7ß-HSDH aus Collinsella aerofaciens DSM 3979;

c) Stereoselektiven Reduktion der 7-Carbonyl-Gruppe von 7-Keto-LCS in eine 7ß- Hydroxy-Gruppe;

d) pH Optimum für die Oxidation von UDCS im Bereich von pH 8,5 bis 10,5, insbe- sondere 9 bis 10;

e) pH Optimum für die Reduktion von DHCS und 7-Keto-LCS im Bereich von pH 3,5 bis 6,5, insbesondere bei pH 4 bis 6;

f) wenigstens einen kinetischen Parameter aus folgender Tabelle für wenigstens eines der dort genannten Substrate/Kofaktoren; im Bereich von ±20%, insbesondere ±10%, ±5%, ±3% ±2% oder ±1 % um den in der folgenden Tabelle jeweils konkret genannten Wert.

konnten aufgrund der sehr geringen Aktivität nicht bestimmt werden

1 U = 1 μη"ΐοΙ/η"ΐίη g) Phylogenetische Sequenzverwandtschaft der prokaryotischen 7ß-HSDH aus Collinsella aerofaciens DSM 3979 mit der tierischen 1 1 ß-HSDH-Untergruppe, umfassend Cavia porcellus, Homo sapiens und Mus musulus, verwandt.

Beispielsweise zeigt diese 7ß-HSDH folgende Eigenschaften oder Kombinationen von Eigenschaften; a); b); a) und b); a) und/oder b) und c); a) und/oder b) und c) und d); a) und/oder b) und c) und d) und e); a) und/oder b) und c) und d) und e) und f).

Eine derartige 7ß-HSDH oder davon abgeleitetes funktionales Äquivalentist zudem gekennzeichnet durch

a) die stereospezifische Reduktion eines 7-Ketosteroids zum korrespondierenden 7ß- Hydroxysteroid, und/oder

b) die regiospezifische Hydroxylierung eines Ketosteroids umfassend eine Ketogruppe in 7-Position und wenigstens eine weitere Ketogruppe am Steroidgerüst zum korrespondierenden 7ß-Hydroxysteroid, wie insbesondere von Dehydrocholsäure (DHCS) in 7-Position zur korrespondierenden 3,12-Diketo-7ß-Cholansäure, katalysiert, und z.B. NADPH abhängig ist.

Eine derartige 7ß-HSDH hat insbesondere eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO:2 (Accession NO: ZP_01773061 ) oder eine davon abgeleiteten Sequenz mit einem Identitätsgrad von wenigstens 60%, wie z.B. wenigstens 65, 70, 75, 80, 85, oder 90, wie z.B. wenigstens 91 , 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 oder 99,5% zu dieser Sequenz; gegebenenfalls zusätzlich gekennzeichnet durch eine der folgende Eigenschaften oder Kombinationen von Eigenschaften; a); b); a) und b); a) und/oder b) und c); a) und/oder b) und c) und d); a) und/oder b) und c) und d) und e); a) und/oder b) und c) und d) und e) und f) gemäß obiger Definition.

3. Nukleinsäuren und Konstrukte

3. 1 Nukleinsäuren

Gegenstand der Erfindung sind auch Nukleinsäuresequenzen, die für ein Enzym mit 7ß-HSDH-, FDH-, GDH- und/oder 3a-HSDH Aktivität und deren Mutanten kodieren.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch Nukleinsäuren mit einem bestimmten Identitätsgrad zu den hierin beschriebenen konkreten Sequenzen.

Unter„Identität" zwischen zwei Nukleinsäuren wird die Identität der Nukleotide über die jeweils gesamte Nukleinsäurelänge verstanden, insbesondere die Identität, die durch Vergleich mit Hilfe der Vector NTI Suite 7.1 Software der Firma Informax (USA) unter An- wendung der Clustal Methode (Higgins DG, Sharp PM. Fast and sensitive multiple sequence alignments on a microcomputer. Comput Appl. Biosci. 1989 Apr;5(2): 151 -1 ) unter Einstellung folgender Parameter berechnet wird:

Multiple alignment parameters

Gap opening penalty

Gap extension penalty

Gap Separation penalty ränge Gap Separation penalty off

% identity for alignment delay 40

Residue specific gaps off

Hydrophilic residue gap off

Transition weighing 0

Pairwise alignment parameter:

FAST algorithm on

K-tuplesize 1

Gap penalty 3

Window size 5

Number of best diagonals 5

Alternativ dazu kann die Identität auch nach Chenna, Ramu, Sugawara, Hideaki, Koike,Tadashi, Lopez, Rodrigo, Gibson, Toby J, Higgins, Desmond G, Thompson, Julie D. Multiple sequence alignment with the Clustal series of programs. (2003) Nucleic Acids Res 31 (13):3497-500, gemäß Internetadresse: http://www.ebi.ac.Uk/Tools/clustalw/index.html# und mit den folgenden Parametern bestimmt werden:

DNA Gap Open Penalty 15.0

DNA Gap Extension Penalty 6.66

DNA Matrix Identity

Protein Gap Open Penalty 10.0

Protein Gap Extension Penalty 0.2

Protein matrix Gönnet

Protein/DNA ENDGAP -1

Protein/DNA GAPDIST 4

Alle hierin erwähnten Nukleinsäuresequenzen (einzel- und doppelsträngige DNA- und RNA-Sequenzen, wie z.B. cDNA und mRNA) sind in an sich bekannter Weise durch chemische Synthese aus den Nukleotidbausteinen, wie beispielsweise durch Fragmentkondensation einzelner überlappender, komplementärer Nukleinsäurebausteine der Doppelhelix herstellbar. Die chemische Synthese von Oligonukleotiden kann beispielsweise, in bekannter Weise, nach der Phosphoamiditmethode (Voet, Voet, 2. Auflage, Wiley Press New York, Seiten 896-897) erfolgen. Die Anlagerung synthetischer Oligonukleotide und Auffüllen von Lücken mit Hilfe des Klenow-Fragmentes der DNA-Polymerase und Ligationsreaktionen sowie allgemeine Klonierungsverfahren werden in Sambrook et al. (1989), Molecular Clon- ing: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, beschrieben.

Gegenstand der Erfindung sind auch Nukleinsäuresequenzen (einzel- und doppel- strängige DNA- und RNA-Sequenzen, wie z.B. cDNA und mRNA), kodierend für eines der obigen Polypeptide und deren funktionalen Äquivalente, welche z.B. unter Verwendung künstlicher Nukleotidanaloga zugänglich sind.

Die Erfindung betrifft sowohl isolierte Nukleinsäuremoleküle, welche für erfindungsgemäße Polypeptide bzw. Proteine oder biologisch aktive Abschnitte davon kodieren, als auch Nukleinsäurefragmente, die z.B. zur Verwendung als Hybridisierungssonden oder Primer zur Identifizierung oder Amplifizierung von erfindungsgemäßer kodierenden Nukleinsäu- ren verwendet werden können.

Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle können zudem untranslatierte Sequenzen vom 3'- und/oder 5'-Ende des kodierenden Genbereichs enthalten

Die Erfindung umfasst weiterhin die zu den konkret beschriebenen Nukleotidsequen- zen komplementären Nukleinsäuremoleküle oder einen Abschnitt davon.

Die erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen ermöglichen die Erzeugung von Sonden und Primern, die zur Identifizierung und/oder Klonierung von homologen Sequenzen in anderen Zelltypen und Organismen verwendbar sind. Solche Sonden bzw. Primer umfassen gewöhnlich einen Nukleotidsequenzbereich, der unter „stringenten" Bedingungen (siehe unten) an mindestens etwa 12, vorzugsweise mindestens etwa 25, wie z.B. etwa 40, 50 oder 75 aufeinanderfolgende Nukleotide eines Sense-Stranges einer erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz oder eines entsprechenden Antisense-Stranges hybridisiert.

Ein "isoliertes" Nukleinsäuremolekül wird von anderen Nukleinsäuremolekülen abgetrennt, die in der natürlichen Quelle der Nukleinsäure zugegen sind und kann überdies im wesentlichen frei von anderem zellulären Material oder Kulturmedium sein, wenn es durch rekombinante Techniken hergestellt wird, oder frei von chemischen Vorstufen oder anderen Chemikalien sein, wenn es chemisch synthetisiert wird.

Ein erfindungsgemäßes Nukleinsäuremolekül kann mittels molekularbiologischer Standard-Techniken und der erfindungsgemäß bereitgestellten Sequenzinformation isoliert werden. Beispielsweise kann cDNA aus einer geeigneten cDNA-Bank isoliert werden, indem eine der konkret offenbarten vollständigen Sequenzen oder ein Abschnitt davon als Hybridi- sierungssonde und Standard-Hybridisierungstechniken (wie z.B. beschrieben in Sambrook, J., Fritsch, E.F. und Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) verwendet werden. Überdies lässt sich ein Nukleinsäuremolekül, umfassend eine der offenbarten Sequenzen oder ein Abschnitt davon, durch Polymerasekettenreaktion isolieren, wobei die Oligonukleotidprimer, die auf der Basis dieser Sequenz erstellt wurden, verwendet werden. Die so amplifizierte Nukleinsäure kann in einen geeigneten Vektor kloniert werden und durch DNA-Sequenzanalyse charakterisiert werden. Die erfindungsgemäßen Oligonuk- leotide können ferner durch Standard-Syntheseverfahren, z.B. mit einem automatischen DNA-Synthesegerät, hergestellt werden.

Erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenzen oder Derivate davon, Homologe oder Teile dieser Sequenzen, lassen sich beispielsweise mit üblichen Hybridisierungsverfahren oder der PCR-Technik aus anderen Bakterien, z.B. über genomische oder cDNA-Banken, isolieren. Diese DNA-Sequenzen hybridisieren unter Standardbedingungen mit den erfindungsgemäßen Sequenzen.

Unter "hybridisieren" versteht man die Fähigkeit eines Poly- oder Oligonukleotids an eine nahezu komplementäre Sequenz unter Standardbedingungen zu binden, während unter diesen Bedingungen unspezifische Bindungen zwischen nicht-komplementären Partnern unterbleiben. Dazu können die Sequenzen zu 90-100% komplementär sein. Die Eigenschaft komplementärer Sequenzen, spezifisch aneinander binden zu können, macht man sich beispielsweise in der Northern- oder Southern-Blot-Technik oder bei der Primerbindung in PCR oder RT-PCR zunutze.

Zur Hybridisierung werden vorteilhaft kurze Oligonukleotide der konservierten Bereiche verwendet. Es können aber auch längere Fragmente der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren oder die vollständigen Sequenzen für die Hybridisierung verwendet werden. Je nach der verwendeten Nukleinsäure (Oligonukleotid, längeres Fragment oder vollständige Se- quenz) oder je nachdem welche Nukleinsäureart DNA oder RNA für die Hybridisierung verwendet werden, variieren diese Standardbedingungen. So liegen beispielsweise die Schmelztemperaturen für DNA:DNA-Hybride ca. 10 °C niedriger als die von DNA:RNA- Hybriden gleicher Länge.

Unter Standardbedingungen sind beispielsweise je nach Nukleinsäure Temperaturen zwischen 42 und 58 °C in einer wässrigen Pufferlösung mit einer Konzentration zwischen 0,1 bis 5 x SSC (1 X SSC = 0,15 M NaCI, 15 mM Natriumeitrat, pH 7,2) oder zusätzlich in Gegenwart von 50% Formamid wie beispielsweise 42 °C in 5 x SSC, 50% Formamid zu verstehen. Vorteilhafterweise liegen die Hybridisierungsbedingungen für DNA:DNA-Hybride bei 0,1 x SSC und Temperaturen zwischen etwa 20 °C bis 45 °C, bevorzugt zwischen etwa 30 °C bis 45 °C. Für DNA:RNA-Hybride liegen die Hybridisierungsbedingungen vorteilhaft bei 0,1 x SSC und Temperaturen zwischen etwa 30 °C bis 55 °C, bevorzugt zwischen etwa 45 °C bis 55 °C. Diese angegebenen Temperaturen für die Hybridisierung sind beispielhaft kalkulierte Schmelztemperaturwerte für eine Nukleinsäure mit einer Länge von ca. 100 Nukleotiden und einem G + C-Gehalt von 50 % in Abwesenheit von Formamid. Die experimentel- len Bedingungen für die DNA-Hybridisierung sind in einschlägigen Lehrbüchern der Genetik, wie beispielsweise Sambrook et al., "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory, 1989, beschrieben und lassen sich nach dem Fachmann bekannten Formeln beispielsweise abhängig von der Länge der Nukleinsäuren, der Art der Hybride oder dem G + C-Gehalt berechnen. Weitere Informationen zur Hybridisierung kann der Fachmann folgenden Lehrbüchern entnehmen: Ausubel et al. (eds), 1985, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York; Harnes and Higgins (eds), 1985, Nucleic Acids Hybridization: A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford; Brown (ed), 1991 , Es- sential Molecular Biology: A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford.

Die „Hybridisierung" kann insbesondere unter stringenten Bedingungen erfolgen. Solche Hybridisierungsbedingungen sind beispielsweise bei Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T., in: Molecular Cloning (A Laboratory Manual), 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, Seiten 9.31 -9.57 oder in Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1 -6.3.6 beschrieben.

Unter„stringenten" Hybridisierungs-Bedingungen werden insbesondere verstanden: Die Inkubation bei 42°C über Nacht in einer Lösung bestehend aus 50 % Formamid, 5 x SSC (750 mM NaCI, 75 mM Tri-Natrium-citrat), 50 mM Natrium Phosphat (pH7,6), 5x Den- hardt Lösung, 10% Dextransulfat und 20 g/ml denaturierte, gescheerte Lachsspermien-DNA, gefolgt von einem Waschschritt der Filter mit 0,1 x SSC bei 65°C.

Gegenstand der Erfindung sind auch Derivate der konkret offenbarten oder ableitbaren Nukleinsäuresequenzen.

So können weitere erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenzen z.B. von SEQ ID

NO:1 , 7, oder 9 (oder von den für die Aminosäuresequenzen 2 bis 6, 8, 10 oder 1 1 kodierenden Nukleinsäuresequenzen) abgeleitet sein und sich davon durch Addition, Substitution, Insertion oder Deletion einzelner oder mehrerer Nukleotide unterscheiden, aber weiterhin für Polypeptide mit dem gewünschten Eigenschaftsprofil kodieren.

Erfindungsgemäß umfasst sind auch solche Nukleinsäuresequenzen, die sogenannte stumme Mutationen umfassen oder entsprechend der Codon-Nutzung eins speziellen Ursprungs- oder Wirtsorganismus, im Vergleich zu einer konkret genannten Sequenz verändert sind, ebenso wie natürlich vorkommende Varianten, wie z.B. Spleißvarianten oder Allel- varianten, davon.

Gegenstand sind ebenso durch konservative Nukleotidsubstitutionen (d.h. die betreffende Aminosäure wird durch eine Aminosäure gleicher Ladung, Größe, Polarität und/oder Löslichkeit ersetzt) erhältliche Sequenzen.

Gegenstand der Erfindung sind auch die durch Sequenzpolymorphismen von den konkret offenbarten Nukleinsäuren abgeleiteten Moleküle. Diese genetischen Polymorphis- men können zwischen Individuen innerhalb einer Population aufgrund der natürlichen Varia- tion existieren. Diese natürlichen Variationen bewirken üblicherweise eine Varianz von 1 bis 5 % in der Nukleotidsequenz eines Gens.

Unter Derivaten der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz mit der Sequenz SEQ ID NO:1 , 7, oder 9 (oder von den für die Aminosäuresequenzen 2 bis 6, 8, 10 oder 1 1 kodie- renden Nukleinsäuresequenzen) sind beispielsweise Allelvarianten zu verstehen, die mindestens 60 % Homologie auf der abgeleiteten Aminosäureebene, bevorzugt mindestens 80 % Homologie, ganz besonders bevorzugt mindestens 90 % Homologie über den gesamten Sequenzbereich aufweisen (bezüglich Homologie auf Aminosäureebene sei auf obige Ausführungen zu den Polypeptiden verwiesen auf). Über Teilbereiche der Sequenzen können die Homologien vorteilhaft höher liegen.

Weiterhin sind unter Derivaten auch Homologe der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen, insbesondere der SEQ ID NO:1 , 7, oder 9 (oder von den für die Aminosäuresequenzen 2 bis 6, 8, 10 oder 1 1 kodierenden Nukleinsäuresequenzen) beispielsweise pilzliche oder bakterielle Homologe, verkürzte Sequenzen, Einzelstrang-DNA oder RNA der kodierenden und nichtkodierenden DNA-Sequenz, zu verstehen. So besitzen z.B. Homologe zur der SEQ ID NO:1 , 7, oder 9 (oder von den für die Aminosäuresequenzen 2 bis 6, 8, 10 oder 1 1 kodierenden Nukleinsäuresequenzen) auf DNA-Ebene eine Homologie von mindestens 40 %, bevorzugt von mindestens 60 %, besonders bevorzugt von mindestens 70 %, ganz besonders bevorzugt von mindestens 80 % über den gesamten SEQ ID NO:1 , 7, oder 9 (oder von den für die Aminosäuresequenzen 2 bis 6, 8, 10 oder 1 1 kodierenden Nukleinsäuresequenzen) angegebenen DNA-Bereich.

Außerdem sind unter Derivaten beispielsweise Fusionen mit Promotoren zu verstehen. Die Promotoren, die den angegebenen Nukleotidsequenzen vorgeschalten sind, können durch wenigstens einen Nukleotidaustausch, wenigstens eine Insertionen, Inversionen und/oder Deletionen verändert sein, ohne dass aber die Funktionalität bzw. Wirksamkeit der Promotoren beeinträchtigt sind. Des weiteren können die Promotoren durch Veränderung ihrer Sequenz in ihrer Wirksamkeit erhöht oder komplett durch wirksamere Promotoren auch artfremder Organismen ausgetauscht werden.

Dem Fachmann sind darüber hinaus Verfahren zur Erzeugung funktionaler Mutanten bekannt.

Je nach verwendeter Technik kann der Fachmann völlig zufällige oder auch gezieltere Mutationen in Gene oder auch nicht codierende Nukleinsäurebereiche (die beispielsweise für die Regulation der Expression wichtig sind) einbringen und anschließend Genbanken erstellen. Die dazu erforderlichen molekularbiologischen Methoden sind dem Fachmann bekannt und beispielsweise beschrieben in Sambrook und Russell, Molecular Cloning. 3. Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press 2001.

Methoden zur Veränderung von Genen und somit zur Veränderung der durch diese codierten Protein sind dem Fachmann seit langem geläufig, wie beispielsweise

- die ortsspezifische Mutagenese, bei der gezielt einzelne oder mehrere Nukleotide eines Gens ausgetauscht werden (Trower MK (Hrsg.) 1996; In vitro mutagenesis protocols. Humana Press, New Jersey),

- die Sättigungsmutagenese, bei der an jeder beliebigen Stelle eines Gens ein Codon für eine beliebige Aminosäure ausgetauscht oder hinzugefügt werden kann (Kegler-Ebo DM, Docktor CM, DiMaio D (1994) Nucleic Acids Res 22:1593; Barettino D, Feigenbutz M, Val- cärel R, Stunnenberg HG (1994) Nucleic Acids Res 22:541 ; Barik S (1995) Mol Biotechnol 3:1 ),

- die fehleranfällige Polymerase-Kettenreaktion (error-prone PCR), bei der Nukleotidsequenzen durch fehlerhaft arbeitende DNA-Polymerasen mutiert werden (Eckert KA, Kunkel TA (1990) Nucleic Acids Res 18:3739);

- das Passagieren von Genen in Mutator-Stämmen, in denen beispielsweise aufgrund defekter DNA-Reperaturmechanismen eine erhöhte Mutationsrate von Nukleotidsequenzen auftritt (Greener A, Callahan M, Jerpseth B (1996) An efficient random mutagenesis technique u- sing an E.coli mutator strain. In: Trower MK (Hrsg.) In vitro mutagenesis protocols. Humana Press, New Jersey), oder

- das DNA-Shuffling, bei dem ein Pool aus nahe verwandten Genen gebildet und verdaut wird und die Bruchstücke als Templates für eine Polymerase-Kettenreaktion verwendet wer- den, bei der durch wiederholte Strangtrennung und Wiederannäherung letztendlich Mosaikgene voller Länge erzeugt werden (Stemmer WPC (1994) Nature 370:389; Stemmer WPC (1994) Proc Natl Acad Sei USA 91 :10747).

Unter Anwendung der sogenannten gerichteten Evolution („directed evolution"; beschrieben unter anderem in Reetz MT und Jaeger K-E (1999), Topics Curr Chem 200:31 ; Zhao H, Moore JC, Volkov AA, Arnold FH (1999), Methods for optimizing industrial enzymes by directed evolution, In: Demain AL, Davies JE (Hrsg.) Manual of industrial microbiology and biotechnology. American Society for Microbiology) kann der Fachmann auch in gezielter Weise und auch in großem Maßstab funktionale Mutanten erzeugen. Dabei werden in einem ersten Schritt zunächst Genbanken der jeweiligen Proteine erzeugt, wobei beispielsweise die oben angegebenen Methoden zur Anwendung kommen können. Die Genbanken werden auf geeignete Weise exprimiert, beispielsweise durch Bakterien oder durch Phagen-Display- Systeme.

Die betreffenden Gene von Wirtsorganismen, die funktionale Mutanten mit Eigenschaften exprimieren, welche den gewünschten Eigenschaften weitgehend entsprechen, können einer weiteren Mutationsrunde unterworfen werden. Die Schritte der Mutation und der Selektion oder des Screening können iterativ solange wiederholt werden, bis die vorliegenden funktionalen Mutanten die gewünschten Eigenschaften in ausreichendem Maße aufweisen. Durch diese iterative Arbeitsweise können stufenweise eine begrenzte Anzahl von Mutationen , wie z.B. 1 bis 5 Mutationen, vorgenommen und auf deren Einfluss auf die betreffende Enzymeigenschaft bewertet und selektiert werden. Die selektierte Mutante kann dann in gleicher Weise einem weiteren Mutationsschritt unterworfen werden. Dadurch lässt sich die Anzahl der zu untersuchenden Einzelmutanten signifikant verringern.

Die erfindungsgemäßen Ergebnisse liefern wichtige Informationen in bezug auf Struktur und Sequenz der betreffenden Enzyme, die erforderlich sind, um gezielt weitere Enzyme mit gewünschten modifizierten Eigenschaften zu generieren. Insbesondere können sogenannte„hot spots" definiert werden, d.h. Sequenzabschnitte, die sich potentiell eig- nen, um über die Einführung gezielter Mutationen eine Enzymeigenschaft zu modifizieren.

3.2 Konstrukte

Gegenstand der Erfindung sind außerdem Expressionskonstrukte, enthaltend unter der genetischen Kontrolle regulativer Nukleinsäuresequenzen eine für wenigstens ein erfin- dungsgemäßes Polypeptid kodierende Nukleinsäuresequenz; sowie Vektoren, umfassend wenigstens eines dieser Expressionskonstrukte.

Unter einer„Expressionseinheit" wird erfindungsgemäß eine Nukleinsäure mit Expressionsaktivität verstanden, die einen Promotor, wie hierein definiert umfasst, und nach funktioneller Verknüpfung mit einer zu exprimierenden Nukleinsäure oder einem Gen, die Expression, also die Transkription und die Translation dieser Nukleinsäure oder dieses Gens reguliert. Man spricht deshalb auch in diesem Zusammenhang von einer„regulativen Nukleinsäuresequenz". Zusätzlich zum Promotor können weitere, regulative Elemente, wie z.B. Enhancer, enthalten sein.

Unter einer„Expressionskassette" oder„Expressionskonstrukt" wird erfindungsge- mäß eine Expressionseinheit verstanden, die mit der zu exprimierenden Nukleinsäure oder dem zu exprimierenden Gen funktionell verknüpft ist. Im Gegensatz zu einer Expressionseinheit umfasst eine Expressionskassette somit nicht nur Nukleinsäuresequenzen, welche Transkription und Translation regulieren, sondern auch die Nukleinsäuresequenzen, welche als Folge der Transkription und Translation als Protein exprimiert werden sollen.

Die Begriffe "Expression" oder„Überexpression" beschreiben im Kontext der Erfindung die Produktion bzw. Erhöhung der intrazellulären Aktivität eines oder mehrerer Enzyme in einem Mikroorganismus, die durch die entsprechende DNA kodiert werden. Dazu kann man beispielsweise ein Gen in einen Organismus einbringen, ein vorhandenes Gen durch ein anderes Gen ersetzen, die Kopienzahl des Gens bzw. der Gene erhöhen, einen starken Promotor verwenden oder ein Gen verwenden, das für ein entsprechendes Enzym mit einer hohen Aktivität kodiert und man kann gegebenenfalls diese Maßnahmen kombinieren. Vorzugsweise umfassen solche erfindungsgemäßen Konstrukte 5'-stromaufwärts von der jeweiligen kodierenden Sequenz einen Promotor und 3'-stromabwärts eine Terminatorsequenz sowie gegebenenfalls weitere übliche regulative Elemente, und zwar jeweils operativ verknüpft mit der kodierenden Sequenz.

Unter einem„Promotor", einer„Nukleinsäure mit Promotoraktivität" oder einer„Promotorsequenz" wird erfindungsgemäß eine Nukleinsäure verstanden, die in funktioneller Verknüpfung mit einer zu transkribierenden Nukleinsäure die Transkription dieser Nukleinsäure reguliert.

Unter einer„funktionellen" oder„operativen" Verknüpfung versteht man in diesem Zusammenhang beispielsweise die sequentielle Anordnung einer der Nukleinsäuren mit Promotoraktivität und einer zu transkribierenden Nukleinsäuresequenz und gegebenenfalls weiterer regulativer Elemente, wie zum Beispiel Nukleinsäuresequenzen, die die Transkription von Nukleinsäuren gewährleisten, sowie zum Beispiel einen Terminator, derart, dass jedes der regulativen Elemente seine Funktion bei der Transkription der Nukleinsäurese- quenz erfüllen kann. Dazu ist nicht unbedingt eine direkte Verknüpfung im chemischen Sinne erforderlich. Genetische Kontrollsequenzen, wie zum Beispiel Enhancer-Sequenzen, können ihre Funktion auch von weiter entfernten Positionen oder gar von anderen DNA- Molekülen aus auf die Zielsequenz ausüben. Bevorzugt sind Anordnungen, in denen die zu transkribierende Nukleinsäuresequenz hinter (d.h. am 3'-Ende) der Promotorsequenz positi- oniert wird, so dass beide Sequenzen kovalent miteinander verbunden sind. Dabei kann der Abstand zwischen der Promotorsequenz und der transgen zu exprimierende Nukleinsäuresequenz geringer als 200 Basenpaare, oder kleiner als 100 Basenpaare oder kleiner als 50 Basenpaare sein.

Neben Promotoren und Terminator sind als Beispiele weiterer regulativer Elemente zu nennen Targeting-Sequenzen, Enhancer, Polyadenylierungssignale, selektierbare Marker, Amplifikationssignale, Replikationsursprünge und dergleichen. Geeignete regulatorische Sequenzen sind z.B. beschrieben in Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990).

Erfindungsgemäße Nukleinsäurekonstrukte umfassen insbesondere Sequenz SEQ ID NO:1 , 7, oder 9 (oder von den für die Aminosäuresequenzen 2 bis 6, 8, 10 oder 1 1 kodierenden Nukleinsäuresequenzen) oder Derivate und Homologe davon, sowie die davon ableitbaren Nukleinsäuresequenzen, die mit einem oder mehreren Regulationssignalen vorteilhafterweise zur Steuerung, z.B. Erhöhung, der Genexpression operativ oder funktionell verknüpft wurden.

Zusätzlich zu diesen Regulationssequenzen kann die natürliche Regulation dieser

Sequenzen vor den eigentlichen Strukturgenen noch vorhanden sein und gegebenenfalls genetisch verändert worden sein, so dass die natürliche Regulation ausgeschaltet und die Expression der Gene erhöht wurde. Das Nukleinsäurekonstrukt kann aber auch einfacher aufgebaut sein, das heißt es wurden keine zusätzlichen Regulationssignale vor die kodierende Sequenz insertiert und der natürliche Promotor mit seiner Regulation wurde nicht entfernt. Stattdessen wird die natürliche Regulationssequenz so mutiert, dass keine Regulation mehr erfolgt und die Genexpression gesteigert wird.

Ein bevorzugtes Nukleinsäurekonstrukt enthält vorteilhafterweise auch eine oder mehrere der schon erwähnten "Enhancer" Sequenzen, funktionell verknüpft mit dem Promotor, die eine erhöhte Expression der Nukleinsäuresequenz ermöglichen. Auch am 3'-Ende der DNA-Sequenzen können zusätzliche vorteilhafte Sequenzen inseriert werden, wie weite- re regulatorische Elemente oder Terminatoren. Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren können in einer oder mehreren Kopien im Konstrukt enthalten sein. Im Konstrukt können noch weitere Marker, wie Antibiotikaresistenzen oder Auxotrophien komplementierende Gene, gegebenenfalls zur Selektion auf das Konstrukt enthalten sein.

Beispiele geeigneter Regulationssequenzen sind in Promotoren wie cos-, tac-, trp-, tet-, trp-tet-, Ipp-, lac-, Ipp-lac-, lacl ^q" T7-, T5-, T3-, gal-, trc-, ara-, rhaP (rhaP _B AD)SP6-, lambda-P _R - oder im lambda-P _L -Promotor enthalten, die vorteilhafterweise in gram-negativen Bakterien Anwendung finden. Weitere vorteilhafte Regulationssequenzen sind beispielsweise in den gram-positiven Promotoren amy und SP02, in den Hefe- oder Pilzpromotoren ADC1 , MFalpha , AC, P-60, CYC1 , GAPDH, TEF, rp28, ADH enthalten. Es können auch künstliche Promotoren für die Regulation verwendet werden.

Das Nukleinsäurekonstrukt wird zur Expression in einem Wirtsorganismus vorteilhafterweise in einen Vektor, wie beispielsweise einem Plasmid oder einem Phagen inseriert, der eine optimale Expression der Gene im Wirt ermöglicht. Unter Vektoren sind außer Plasmiden und Phagen auch alle anderen dem Fachmann bekannten Vektoren, also z.B. Viren, wie SV40, CMV, Baculovirus und Adenovirus, Transposons, IS-Elemente, Phasmide, Cos- mide, und lineare oder zirkuläre DNA zu verstehen. Diese Vektoren können autonom im Wirtsorganismus repliziert oder chromosomal repliziert werden. Diese Vektoren stellen eine weitere Ausgestaltung der Erfindung dar.

Geeignete Plasmide sind beispielsweise in E. coli pLG338, pACYC184, pBR322, pUC18, pUC19, pKC30, pRep4, pHS1 , pKK223-3, pDHE19.2, pHS2, pPLc236, pMBL24, pLG200, pUR290, plN-lll ¹¹³ -B1 , Agt1 1 oder pBdCI, in Streptomyces plJ101 , plJ364, plJ702 oder plJ361 , in Bacillus pUB1 10, pC194 oder pBD214, in Corynebacterium pSA77 oder pAJ667, in Pilzen pALS1 , plL2 oder pBB1 16, in Hefen 2alphaM, pAG-1 , YEp6, YEp13 oder pEMBLYe23 oder in Pflanzen pLGV23, pGHIac ⁺ , pBIN19, pAK2004 oder pDH51. Die ge- nannten Plasmide stellen eine kleine Auswahl der möglichen Plasmide dar. Weitere Plasmide sind dem Fachmann wohl bekannt und können beispielsweise aus dem Buch Cloning Vectors (Eds. Pouwels P. H. et al. Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985 , ISBN 0 444 904018) entnommen werden.

In einer weiteren Ausgestaltungsform des Vektors kann der das erfindungsgemäße Nukleinsäurekonstrukt oder die erfindungsgemäße Nukleinsäure enthaltende Vektor auch vorteilhafterweise in Form einer linearen DNA in die Mikroorganismen eingeführt werden und über heterologe oder homologe Rekombination in das Genom des Wirtsorganismus integriert werden. Diese lineare DNA kann aus einem linearisierten Vektor wie einem Plasmid oder nur aus dem Nukleinsäurekonstrukt oder der erfindungsgemäßen Nukleinsäure bestehen.

Für eine optimale Expression heterologer Gene in Organismen ist es vorteilhaft die

Nukleinsäuresequenzen entsprechend des im Organismus verwendeten spezifischen "Co- donnutzung" zu verändern. Der "Codonnutzung" lässt sich anhand von Computerauswertungen anderer, bekannter Gene des betreffenden Organismus leicht ermitteln.

Die Herstellung einer erfindungsgemäßen Expressionskassette erfolgt durch Fusion eines geeigneten Promotors mit einer geeigneten kodierenden Nukleotidsequenz sowie einem Terminator- oder Polyadenylierungssignal. Dazu verwendet man gängige Rekombina- tions- und Klonierungstechniken, wie sie beispielsweise in T. Maniatis, E.F. Fritsch und J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) sowie in T.J. Silhavy, M.L. Berman und L.W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984) und in Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience (1987) beschrieben sind.

Das rekombinante Nukleinsäurekonstrukt bzw. Genkonstrukt wird zur Expression in einem geeigneten Wirtsorganismus vorteilhafterweise in einen wirtsspezifischen Vektor inse- rtiert, der eine optimale Expression der Gene im Wirt ermöglicht. Vektoren sind dem Fachmann wohl bekannt und können beispielsweise aus "Cloning Vectors" (Pouwels P. H. et al., Hrsg, Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985) entnommen werden.

4. Mikroorganismen

Je nach Zusammenhang kann unter dem Begriff „Mikroorganismus" der Ausgangsmikroorganismus (Wildtyp) oder ein genetisch veränderter, rekombinanter Mikroorganismus oder beides verstanden werden.

Mit Hilfe der erfindungsgemäßen Vektoren sind rekombinante Mikroorganismen herstellbar, welche beispielsweise mit wenigstens einem erfindungsgemäßen Vektor transfor- miert sind und zur Produktion der erfindungsgemäßen Polypeptide eingesetzt werden können. Vorteilhafterweise werden die oben beschriebenen erfindungsgemäßen rekombinanten Konstrukte in ein geeignetes Wirtssystem eingebracht und exprimiert. Dabei werden vor- zugsweise dem Fachmann bekannte geläufige Klonierungs- und Transfektionsmethoden, wie beispielsweise Co-Präzipitation, Protoplastenfusion, Elektroporation, retrovirale Trans- fektion und dergleichen, verwendet, um die genannten Nukleinsäuren im jeweiligen Expressionssystem zur Expression zu bringen. Geeignete Systeme werden beispielsweise in Cur- rent Protocols in Molecular Biology, F. Ausubel et al., Hrsg., Wiley Interscience, New York 1997, oder Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989 beschrieben. Einen Überblick über bakterielle Expressionssysteme für die heterologe Expression von Proteinen liefertz.B. auch Terpe, K. Appl. Microbiol. Biotechnol. (2006) 72: 21 1 - 222.

Als rekombinante Wirtsorganismen für die erfindungsgemäße Nukleinsäure oder dem Nukleinsäurekonstrukt kommen prinzipiell alle prokaryontischen oder eukaryontischen Organismen in Frage. Vorteilhafterweise werden als Wirtsorganismen Mikroorganismen wie Bakterien, Pilze oder Hefen verwendet. Vorteilhaft werden gram-positive oder gram- negative Bakterien, bevorzugt Bakterien der Familien Enterobacteriaceae, Pseudomonad- aceae, Rhizobiaceae, Streptomycetaceae oder Nocardiaceae, besonders bevorzugt Bakterien der Gattungen Escherichia, Pseudomonas, Streptomyces, Nocardia, Burkholderia, Salmonella, Agrobacterium, Clostridium oder Rhodococcus verwendet. Ganz besonders bevorzugt ist die Gattung und Art Escherichia coli. Weitere vorteilhafte Bakterien sind darüber hinaus in der Gruppe der alpha-Proteobacterien, beta-Proteobacterien oder gamma- Proteobacterien zu finden

Der Wirtsorganismus oder die Wirtsorganismen gemäß der Erfindung enthalten dabei vorzugsweise mindestens eine der in dieser Erfindung beschriebenen Nukleinsäuresequenzen, Nukleinsäurekonstrukte oder Vektoren, die für ein Enzym mit 7ß-HSDH-Aktivität gemäß obiger Definition kodieren.

Die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Organismen werden je nach Wirtsorganismus in dem Fachmann bekannter Weise angezogen bzw. gezüchtet. Mikroorganismen werden in der Regel in einem flüssigen Medium, das eine Kohlenstoffquelle meist in Form von Zuckern, eine Stickstoffquelle meist in Form von organischen Stickstoffquellen wie Hefeextrakt oder Salzen wie Ammoniumsulfat, Spurenelemente wie Eisen-, Mangan-, Magnesiumsalze und gegebenenfalls Vitamine enthält, bei Temperaturen zwischen 0 °C und 100 °C, bevorzugt zwischen 10 °C bis 60 °C unter Sauerstoffbegasung angezogen. Dabei kann der pH der Nährflüssigkeit auf einen festen Wert gehalten werden, das heißt während der Anzucht reguliert werden oder nicht. Die Anzucht kann „batch"-weise, „semi batch"- weise oder kontinuierlich erfolgen. Nährstoffe können zu Beginn der Fermentation vorgelegt oder semikontinuierlich oder kontinuierlich nachgefüttert werden. 5. Herstellung der UDCS

1. Schritt: Chemische Umsetzung von CS zu DHCS

Die Hydroxygruppen von CS werden mit Chromsäure bzw. Chromaten in saurer Lösung (z.B. H ₂ S0 ₄ ) zu Carbonylgruppe in an sich bekannter Weise auf klassisch- chemischem Weg oxidiert. Dadurch entsteht DHCS.

2. Schritt: Enzymatische oder mikrobielle Umsetzung von DHCS zu 12-Keto-UDCS

In wässriger Lösung wird DHCS durch 3a-HSDH und 7ß-HSDH bzw. Mutanten davon spezifisch zu 12-Keto-UDCS in Anwesenheit von NADPH bzw. NADH reduziert. Der Kofaktor NADPH bzw. NADH kann durch eine ADH bzw. FDH bzw. GDH bzw. Mutanten davon von Isopropanol bzw. Natium-formiat bzw. Glucose regeneriert werden. Die Reaktion läuft unter milder Bedingung. Beispielsweise kann die Reaktion bei pH = 6 bis 9, insbesondere etwa pH = 8 und bei etwa 10 bis 30, 15 bis 25 oder etwa 23°C durchgeführt werden. Im falle eines mikrobiellen Umsetzungsschrittes können rekombinante Mikroorganismen, welche die erforderliche(n) Enzymaktivität(en) exprimieren in Gegenwart des umzusetzenden Substrates (DHCS) anaerob oder aerob in geeigneten Flüssigmedien kultiviert werden. Geeignete Kultivierungsbedingungen sind dem Fachmann an sich bekannt. Sie umfassen Umsetzungen im pH bereich von beispielsweise 5 bis 10 oder 6 bis 9, bei Temperaturen im Bereich von 10 bis 60 oder 15 bis 45 oder 25 bis 40 oder 37 °C. Geeignete Medien umfas- sen z,B, die unten beschriebenen LB und TB Medien. Die Umsetzungsdauer kann dabei z,B, batchweise oder kontinuierlich oder in sonstigen üblichen Verfahrensvarianten erfolgen (wie oben beschrieben). Die Unsetzungsdauer kann dabei z.B. im Bereich von Minuten bis mehreren Stunden oder tagen Liegen, und z.B. 1 h bis 48 h betragen. Gegebenenfalls kann, wenn Enzymaktivität nicht kontinuierlich exprimiert wird, diese durch Zugabe eines geeigne- ten Induktors, nach Erreichen einer Zielzelldichte , z,B, von etwa OD ₆ oo = 0,5 bis 1 ,0, eingeleitet werden.

Weitere mögliche geeignete Abwandlungen des mikrobiellen Herstellungsverfahrens hinsichtlich Fahrweise der Fermentation, Zusätze zum Medium, Enzymimmobilisierung und Isolierung der Wertstoffe sind auch dem folgenden Abschnitt betreffend „Herstellung der Enzyme bzw. Mutanten" zu entnehmen

3. Schritt Chemische Umsetzung von 12-Keto-UDCS zu UDCS

Die 12-Carbonylgruppe von 12-Keto-UDCS wird mittels Wolff-Kishner-Reduktion in an sich bekannter Weise entfernt, dadurch entsteht UDCS aus 12-Keto-UDCS. In der Reak- tion wird zuerst die Carbonylgruppe mit Hydrazin zum Hydrazon umgesetzt. Anschließend wird das Hydrazon in Gegenwart einer Base (z.B. KOH) auf 200 °C erhitzt, hierbei wird Stickstoff abgespaltet und UDCS entsteht. 6. Rekombinante Herstellung der Enzyme und Mutanten

Gegenstand der Erfindung sind weiterhin Verfahren zur rekombinanten Herstellung erfindungsgemäßer Polypeptide oder funktioneller, biologisch aktiver Fragmente davon, wo- bei man einen Polypeptide-produzierenden Mikroorganismus kultiviert, gegebenenfalls die Expression der Polypeptide induziert und diese aus der Kultur isoliert. Die Polypeptide können so auch in großtechnischem Maßstab produziert werden, falls dies erwünscht ist.

Die erfindungsgemäß hergestellten Mikroorganismen können kontinuierlich oder diskontinuierlich im batch- Verfahren (Satzkultivierung) oder im fed batch (Zulaufverfahren) oder repeated fed batch Verfahren (repetitives Zulaufverfahren) kultiviert werden. Eine Zusammenfassung über bekannte Kultivierungsmethoden ist im Lehrbuch von Chmiel (Bioprozeßtechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991 )) oder im Lehrbuch von Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)) zu finden.

Das zu verwendende Kulturmedium hat in geeigneter Weise den Ansprüchen der jeweiligen Stämme zu genügen. Beschreibungen von Kulturmedien verschiedener Mikroorganismen sind im Handbuch "Manual of Methods für General Bacteriology" der American Society für Bacteriology (Washington D. C, USA, 1981 ) enthalten.

Diese erfindungsgemäß einsetzbaren Medien umfassen gewöhnlich eine oder meh- rere Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen, anorganische Salze, Vitamine und/oder Spurenelemente.

Bevorzugte Kohlenstoffquellen sind Zucker, wie Mono-, Di- oder Polysaccharide. Sehr gute Kohlenstoffquellen sind beispielsweise Glucose, Fructose, Mannose, Galactose, Ribose, Sorbose, Ribulose, Lactose, Maltose, Saccharose, Raffinose, Stärke oder Cellulose. Man kann Zucker auch über komplexe Verbindungen, wie Melassen, oder andere Nebenprodukte der Zucker-Raffinierung zu den Medien geben. Es kann auch vorteilhaft sein, Gemische verschiedener Kohlenstoffquellen zuzugeben. Andere mögliche Kohlenstoffquellen sind Öle und Fette wie z. B. Sojaöl. Sonnenblumenöl. Erdnußöl und Kokosfett, Fettsäuren wie z. B. Palmitinsäure, Stearinsäure oder Linolsäure, Alkohole wie z. B. Glycerin, Methanol oder Ethanol und organische Säuren wie z. B. Essigsäure oder Milchsäure.

Stickstoffquellen sind gewöhnlich organische oder anorganische Stickstoffverbindungen oder Materialien, die diese Verbindungen enthalten. Beispielhafte Stickstoffquellen umfassen Ammoniak-Gas oder Ammoniumsalze, wie Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat, Ammoniumcarbonat oder Ammoniumnitrat, Nitrate, Harnstoff, Amino- säuren oder komplexe Stickstoffquellen, wie Maisquellwasser, Sojamehl, Sojaprotein, Hefeextrakt, Fleischextrakt und andere. Die Stickstoffquellen können einzeln oder als Mischung verwendet werden. Anorganische Salzverbindungen, die in den Medien enthalten sein können, umfassen die Chlorid-, Phosphor- oder Sulfatsalze von Calcium, Magnesium, Natrium, Kobalt, Molybdän, Kalium, Mangan, Zink, Kupfer und Eisen.

Als Schwefelquelle können anorganische schwefelhaltige Verbindungen wie bei- spielsweise Sulfate, Sulfite, Dithionite, Tetrathionate, Thiosulfate, Sulfide aber auch organische Schwefelverbindungen, wie Mercaptane und Thiole, verwendet werden.

Als Phosphorquelle können Phosphorsäure, Kaliumdihydrogenphosphat oder Dikali- umhydrogenphosphat oder die entsprechenden Natrium-haltigen Salze verwendet werden.

Chelatbildner können zum Medium gegeben werden, um die Metallionen in Lösung zu halten. Besonders geeignete Chelatbildner umfassen Dihydroxyphenole, wie Catechol oder Protocatechuat, oder organische Säuren, wie Citronensäure.

Die erfindungsgemäß eingesetzten Fermentationsmedien enthalten üblicherweise auch andere Wachstumsfaktoren, wie Vitamine oder Wachstumsförderer, zu denen beispielsweise Biotin, Riboflavin, Thiamin, Folsäure, Nikotinsäure, Panthothenat und Pyridoxin gehören. Wachstumsfaktoren und Salze stammen häufig von komplexen Medienkomponenten, wie Hefeextrakt, Melassen, Maisquellwasser und dergleichen. Dem Kulturmedium können überdies geeignete Vorstufen zugesetzt werden. Die genaue Zusammensetzung der Medienverbindungen hängt stark vom jeweiligen Experiment ab und wird für jeden spezifischen Fall individuell entschieden. Information über die Medienoptimierung ist erhältlich aus dem Lehrbuch "Applied Microbiol. Physiology, A Practical Approach" (Hrsg. P.M. Rhodes, P.F. Stanbury, IRL Press (1997) S. 53-73, ISBN 0 19 963577 3). Wachstumsmedien lassen sich auch von kommerziellen Anbietern beziehen, wie Standard 1 (Merck) oder BHI (Brain heart infusion, DIFCO) und dergleichen.

Sämtliche Medienkomponenten werden, entweder durch Hitze (20 min bei 1 ,5 bar und 121 °C) oder durch Sterilfiltration, sterilisiert. Die Komponenten können entweder zusammen oder nötigenfalls getrennt sterilisiert werden. Sämtliche Medienkomponenten können zu Beginn der Anzucht zugegen sein oder wahlfrei kontinuierlich oder chargenweise hinzugegeben werden.

Die Temperatur der Kultur liegt normalerweise zwischen 15°C und 45°C, vorzugs- weise bei 25°C bis 40°C und kann während des Experimentes konstant gehalten oder verändert werden. Der pH-Wert des Mediums sollte im Bereich von 5 bis 8,5, vorzugsweise um 7,0 liegen. Der pH-Wert für die Anzucht lässt sich während der Anzucht durch Zugabe von basische Verbindungen wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Ammoniak bzw. Ammoniakwasser oder saure Verbindungen wie Phosphorsäure oder Schwefelsäure kontrollieren. Zur Kontrolle der Schaumentwicklung können Antischaummittel, wie z. B. Fettsäurepolyglykoles- ter, eingesetzt werden. Zur Aufrechterhaltung der Stabilität von Plasmiden können dem Medium geeignete selektiv wirkende Stoffe, wie z. B. Antibiotika, hinzugefügt werden. Um ae- robe Bedingungen aufrechtzuerhalten, werden Sauerstoff oder Sauerstoff-haltige Gasmischungen, wie z. B. Umgebungsluft, in die Kultur eingetragen. Die Temperatur der Kultur liegt normalerweise bei 20°C bis 45°C und. Die Kultur wird so lange fortgesetzt, bis sich ein Maximum des gewünschten Produktes gebildet hat. Dieses Ziel wird normalerweise inner- halb von 10 Stunden bis 160 Stunden erreicht.

Die Fermentationsbrühe wird anschließend weiterverarbeitet. Je nach Anforderung kann die Biomasse ganz oder teilweise durch Separationsmethoden, wie z. B. Zentrifugati- on, Filtration, Dekantieren oder einer Kombination dieser Methoden aus der Fermentationsbrühe entfernt oder vollständig in ihr belassen werden.

Die Zellen können auch, falls die Polypeptide nicht in das Kulturmedium sezerniert werden, aufgeschlossen und das Produkt nach bekannten Proteinisolierungsverfahren aus dem Lysat gewonnen. Die Zellen können wahlweise durch hochfrequenten Ultraschall, durch hohen Druck, wie z.B. in einer French-Druckzelle, durch Osmolyse, durch Einwirkung von Detergenzien, lytischen Enzymen oder organischen Lösungsmitteln, durch Homogenisato- ren oder durch Kombination mehrerer der aufgeführten Verfahren aufgeschlossen werden.

Eine Aufreinigung der Polypeptide kann mit bekannten, chromatographischen Verfahren erzielt werden, wie Molekularsieb-Chromatographie (Gelfiltration), wie Q-Sepharose- Chromatographie, lonenaustausch-Chromatographie und hydrophobe Chromatographie, sowie mit anderen üblichen Verfahren wie Ultrafiltration, Kristallisation, Aussalzen, Dialyse und nativer Gelelektrophorese. Geeignete Verfahren werden beispielsweise in Cooper, F. G., Biochemische Arbeitsmethoden, Verlag Walter de Gruyter, Berlin, New York oder in Scopes, R., Protein Purification, Springer Verlag, New York, Heidelberg, Berlin beschrieben.

Vorteilhaft kann es sein, zur Isolierung des rekombinanten Proteins Vektorsysteme oder Oligonukleotide zu verwenden, die die cDNA um bestimmte Nukleotidsequenzen ver- längern und damit für veränderte Polypeptide oder Fusionsproteine kodieren, die z.B. einer einfacheren Reinigung dienen. Derartige geeignete Modifikationen sind beispielsweise als Anker fungierende sogenannte "Tags", wie z.B. die als Hexa-Histidin-Anker bekannte Modifikation oder Epitope, die als Antigene von Antikörpern erkannt werden können (beschrieben zum Beispiel in Harlow, E. and Lane, D., 1988, Antibodies: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor (N.Y.) Press). Diese Anker können zur Anheftung der Proteine an einen festen Träger, wie z.B. einer Polymermatrix, dienen, die beispielsweise in einer Chromatographiesäule eingefüllt sein kann, oder an einer Mikrotiterplatte oder an einem sonstigen Träger verwendet werden kann.

Gleichzeitig können diese Anker auch zur Erkennung der Proteine verwendet wer- den. Zur Erkennung der Proteine können außerdem übliche Marker, wie Fluoreszenzfarbstoffe, Enzymmarker, die nach Reaktion mit einem Substrat ein detektierbares Reaktionsprodukt bilden, oder radioaktive Marker, allein oder in Kombination mit den Ankern zur Deri- vatisierung der Proteine verwendet werden.

7. Enzymimmobilisierung

Die erfindungsgemäßen Enzyme können in den hierin beschriebenen Verfahren frei oder immobilisiert eingesetzt werden. Unter einem immobilisierten Enzym versteht man ein Enzym, das an einen inerten Träger fixiert ist. Geeignete Trägermaterialien sowie die darauf immobilisierten Enzyme sind aus der EP-A-1 149849, EP-A-1 069 183 und der DE-OS 100193773 sowie aus den darin zitierten Literaturstellen bekannt. Auf die Offenbarung dieser Schriften wird diesbezüglich in vollem Umfang Bezug genommen. Zu den geeigneten Trägermaterialien gehören beispielsweise Tone, Tonmineralien, wie Kaolinit, Diatomeenerde, Perlit, Siliciumdioxid, Aluminiumoxid, Natriumcarbonat, Calciumcarbonat, Cellulosepul- ver, Anionenaustauschermaterialien, synthetische Polymere, wie Polystyrol, Acrylharze, Phenolformaldehydharze, Polyurethane und Polyolefine, wie Polyethylen und Polypropylen. Die Trägermaterialien werden zur Herstellung der geträgerten Enzyme üblicherweise in ei- ner feinteiligen, partikelförmigen Form eingesetzt, wobei poröse Formen bevorzugt sind. Die Partikelgröße des Trägermaterials beträgt üblicherweise nicht mehr als 5 mm, insbesondere nicht mehr als 2 mm (Sieblinie). Analog kann bei Einsatz der Dehydrogenase als Ganzzell- Katalysator eine freie oder immobiliserte Form gewählt werden. Trägermaterialien sind z.B. Ca-Alginat, und Carrageenan. Enzyme wie auch Zellen können auch direkt mit Glutaralde- hyd vernetzt werden (Cross-Iinking zu CLEAs). Entsprechende und weitere Immobilisierungsverfahren sind beispielsweise in J. Lalonde und A. Margolin„Immobilization of Enzy- mes" " in K. Drauz und H. Waldmann, Enzyme Catalysis in Organic Synthesis 2002, Vol. III, 991 -1032, Wiley-VCH, Weinheim beschrieben. Experimenteller Teil:

Werden keine anderen Angaben gemacht, so können die im Rahmen der vorliegenden Erfindung durchgeführten Klonierungsschritte, wie z.B. Restriktionsspaltungen, Agarose Gelelektrophorese, Reinigung von DNA-Fragmenten, Transfer von Nukleinsäuren auf Nitrozellulose und Nylonmembranen, Verknüpfen von DNA-Fragmenten, Transformation von Mikroorganismen, Anzucht von Mikroorganismen, Vermehrung von Phagen und Sequenzanalyse rekombinanter DNA wie bei Sambrook et al. (1989) a.a.O. beschrieben durchgeführt werden.

Allgemeine Angaben

Materialien:

Die genomische DNA von Collinsella aerofaciens DSM 3979 (ATCC 25986, frühere Bezeichnung Eubacterium aerofaciens) wurde von der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) bezogen. DHCA, UDCS und 7-Keto-LCS sind an sich bekannte und in der Literatur beschriebene Ausgangsverbindungen. Alle übrigen Chemikalien wurden von Sigma-Aldrich und Fluka (Deutschland) bezogen. Sämtliche Restriktionsendo- nukleasen, die T4 DNA Ligase, die Taq DNA Polymerase, die Phusion DNA Polymerase und lsopropyl-ß-D-1 -thiogalactopyranosid (IPTG) wurden von Thermo Scientific (Deutschland) bezogen.

Medien:

LB-Medium, enthaltend Trypton 10 g, Hefeextrakt 5 g, NaCI 10 g pro Liter Medium

AI-Medium (Auto-Induktions-Medium), enthaltend 24 g Hefeextrakt, 12 g Casein hyd- rolysat, 5 g Glycerin, 50 g Glucose, 20 g Lactose in 100 mM KPi pH7.0 pro Liter Medium.

Sequenzen: In Figur 2 Aufgeführt sind die Aminosäure-Sequenzen des Wildtyp-Enzyms der 7ß-HSDH und von Mutanten, allerdings alle jeweils mit einem C-terminalen Hexa-Histidin-Tag versehen. In dieser Art sind alle Enzyme isoliert und charakterisiert worden

Beispiel 1 : Herstellung der rekombinanten 7ß-HSDH A) Plasmidtransformation:

Zur Expression rekombinanter 7ß-HSDH-Enzyme (Wildtyp- und Mutantenenzyme) wurde der kommerziell verfügbare Expressionsvektor pET28a(+)verwendet, in den das jeweilige 7ß-HSDH-Gen über die Schnittstellen der Restriktionsenzyme Λ/col und Xho\ in üblicher Weise einkloniert wurde. Der Expressionsvektor pET28a(+) ermöglicht es, dass direkt bei der Klonierung des HSDH-Gens eine Gensequenz an das HSDH-Gen angehängt wird, die für eine Abfolge von 6 Histidin-Molekülen kodiert. Diese Sequenz (als Hexahistidin-Tag oder His-Tag bezeichnet) erscheint dann nach der Expression C-terminal am HSDH-Protein. Das Ursprungs- bzw. Wildtyp-HSDH-Genstammt aus dem Bakterium Collinsella aerofaciens ATCC 25986, das Plasmid, das das jeweilige 7ß-HSDH-Gen enthält, wird als pET28a(+)_7ß- HSDH bezeichnet. Zur Transformation des pET28a(+)_7ß-HSDH-Plasmids wurden 5 μΙ Li- gationsansatz mit 100 μΙ kompetenten £ co//-Zellen BL21 (DE3)A7a-HSDH versetzt und die Transformation nach Hanahan (J. Mol. Biol. (1983), Vol. 166, pp. 557) durchgeführt, wobei dieselben Schritte mit dem Plasmid, das das Wildtyp-Gen und mit dem Plasmid, das mutierte HSDH-Gene enthält, durchgeführt wurden. Der £. co//-Stamm BL21 (DE3)A7a-HSDH, der hier regelmäßig verwendet wurde, zeichnet sich dadurch aus, dass in diesem Stamm das Gen für die 7a-HSDH deletiert wurde. Die genaue Charakterisierung der für diese Arbeiten verwendeten £ co//-Stämme ist in Tabelle 1 zusammengefasst.

Tabelle 1 : Verwendete Escherichia coli Stämme

Stamm Genotyp

Escherichia coli DH5a F- endA1 glnV44 thi-1 recA1 relA1 gyrA96 deoR nupG O80dlacZAM15 A(lacZYA- argF)U169, hsdR17(rK - mK+),A-

Escherichia coli BL21 (DE3) A7a-HSDH F- ompT gal dem Ion hsdSB(rB-mB-) A(DE3

(= £ coli mit deletierter 7a-HSDH) [lad lacUV5-T7 gene 1 ind 1 sam7 nin5]) hshA- KanR+

B) Expression und Zellvermehrung:

Zur Expression wurde der das Expressionskonstrukt (pET28a(+)_7ß-HSDH-Plasmid) enthaltende £. co//-Stamm in LB-Medium (Trypton 10 g, Hefeextrakt 5 g, NaCI 10 g pro Liter) für 20Std. bei 25°C vermehrt, wobei das Medium 50 μg ml Kanamycin enthält. Die Zellen wurden durch Zentrifugation (5,000xg, 30 min, 4°C) geerntet.

C) Rohextrakt-Gewinnung:

Das Pellet wurde im Aufschlusspuffer (10 mM Imidazol, 50 mM Natriumphosphat, 300 mM NaCI, pH 8) resuspendiert, wobei pro 1 g Zellen (Feuchtmasse) 4 ml Puffer zugesetzt wurden. Die Zellen wurden dann unter konstanter Kühlung durch einminütige Ultra- schallbehandlung (30 W Leistung, 50 % Arbeitsintervall und 1 min Pause) unter Verwendung eines Ultraschallgeräts Sonopuls HD2070 (Fa. Bandelin, Berlin, Deutschland) aufgeschlossen. Der Aufschluss wurde dreimal wiederholt. Die Zellsuspension wurde zentrifugiert (18,000xg, 30 min, 4°C), wobei der Überstand als zellfreier Rohextrakt bezeichnet wird.

D) Reinigung des Enzyms: Der His-Tag ermöglicht eine sehr einfache Reinigung des HSDH-Proteins, da diese

Sequenz von speziellem Chromatographiematerial (NTA (Ni-Nitrilotriacetat)-modifiziertes Trägermaterial, beladen mit 2-wertigen Nickelionen; z.B.„His Pur Ni-NTA" (Fa. Nimagen B. V., Nijmegen, Niederlande) hoch-spezifisch gebunden wird. Dazu wird der zellfreie Rohextrakt auf dieses Material enthaltende Tropfsäule aufgetragen, die vorher mit dem Auf- Rr ii issni iff ir ( is 5 Säulenvolumina) äquilibriert wurde. Schwach bindendes Protein wurde durch Waschen mit 3 bis 5 Säulenvolumina Waschpuffer (20 mM Imidazol, 50 mM Natriumphosphat, 300 mM NaCI, pH 8) entfernt. Das His-Tag-7ß-HSDH-Protein wurde mit Imida- zol-haltigem Elutionspuffer (250 mM Imidazol, 50 mM Natriumphosphat, 300 mM NaCI, pH 8) eluiert. Das Verfahren wurde bei Raumtemperatur durchgeführt. Durch Umpufferung wur- de das enthaltende Imidazol zu entfernen.

Die Proteinkonzentration wurde nach der von Bradford beschriebenen Methode bestimmt (100 μΙ Probe mit 900 μΙ Bradford Reagenz mischen, für mind. 15 min im Dunkeln inkubieren, dann bei 595 nm gegen eine mit Rinderserum-Albumin erstellte Kalibriergerade bestimmt). Für eine Analyse mittels SDS-PAGE (SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese) wurde das Gel mit Coomassie Brilliant Blue angefärbt.

E) Aktivitätsbestimmung:

Die Aktivität der 7ß-HSDH und der Mutanten wurde mit einem photometrischen As- say bestimmt, wobei die Abnahme der Extinktion wird bei 340 nm über einen Zeitraum von 30 Sekunden gemessen wurde. Die Reaktionslösung enthielt in einem Gesamtvolumen von 1 ml: 874 μΙ 50 mM Kaliumphosphat (KPi) Puffer, pH 8.0; 100 μΙ 100 mM einer DHCA- Lösung (DHCA gelöst in 50 mM KPi, pH 8); 10 μΙ der Enzymlösung (gfls. verdünnt); 16 μΙ einer 12,5 mM NADPH-Lösung (gelöst in dest. H ₂ 0). Die Aktivität wird im Folgenden in Units (U) angegeben, wobei 1 U der Abnahme von 1 μΜοΙ NADPH / min entspricht.

Beispiel 2: Herstellung von 7ß-HSDH Mutanten in Aminosäure-Position 64 und deren Charakterisierung

A) Primer:

Für die positionsgerichtete Mutagenese der 7ß-HSDH wurden die unten angegebenen Mutageneseprimer verwendet (siehe Tabelle 2). Die Primer wurden auf Grundlage der 7ß-HSDH-Gensequenz dahingehend ausgewählt, dass sie den gewünschten Aminosäurenaustausch bewirken. Zur Erzeugung der Mutanten wurden folgende Primerpaare verwendet:

Tabelle 2: Primer für die positionsgerichtete Mutagenese der 7ß-HSDH an Position 64

Bezeichnung Austausch Primer SEQ ID NO 5 ^' 3 ^' Sequenz

R64E for forward 12 ACCAAGGTCGTGGAGGCCGACTTTAGC

R64E

R64E rev reverse 13 GCTAAAGTCGGCCTCCACGACCTTGGT

R64D for forward 14 ACCAAGGTCGTGGACGCCGACTTTAGC

R64D

R64D rev reverse 15 GCTAAAGTCGGCGTCCACGACCTTGGT

R64T for forward 16 ACCAAGGTCGTGACGGCCGACTTTAGC

R64T

R64T rev reverse 17 GCTAAAGTCGGCCGTCACGACCTTGGT

R64W for forward 18 ACCAAGGTCGTGTGGGCCGACTTTAGC

R64W

R64W rev reverse 19 GCTAAAGTCGGCCCACACGACCTTGGT R64Y for forward 20 ACCAAGGTCGTGTACGCCGACTTTAGC

R64Y

R64Y rev reverse 21 GCTAAAGTCGGCGTACACGACCTTGGT

R64F for forward 22 ACCAAGGTCGTGTTCGCCGACTTTAGC

R64F

R64F rev reverse 23 GCTAAAGTCGGCGAACACGACCTTGGT

R64C for forward 24 ACCAAGGTCGTGTGCGCCGACTTTAGC

R64C

R64C rev reverse 25 GCTAAAGTCGGCGCACACGACCTTGGT

R64N for forward 26 ACCAAG GTCGTG AACG CCG ACTTTAGC

R64N

R64N rev reverse 27 GCTAAAGTCGGCGTTCACGACCTTGGT

R64Q for forward 28 ACCAAGGTCGTGCAGGCCGACTTTAGC

R64Q

R64Q rev reverse 29 GCTAAAGTCGGCCTGCACGACCTTGGT

R64H for forward 30 ACCAAGGTCGTGCACGCCGACTTTAGC

R64H

R64H rev reverse 31 GCTAAAGTCGGCGTGCACGACCTTGGT

R64K for forward 32 ACCAAGGTCGTGAAGGCCGACTTTAGC

R64K

R64K rev reverse 33 GCTAAAGTCGGCCTTCACGACCTTGGT

R64I for forward 34 ACCAAGGTCGTGATCGCCGACTTTAGC

R64I

R64I rev reverse 35 GCTAAAGTCGGCGATCACGACCTTGGT

R64G for forward 36 ACCAAGGTCGTGGGCGCCGACTTTAGC

R64G

R64G rev reverse 37 GCTAAAGTCGGCGCCCACGACCTTGGT

R64A for forward 38 ACCAAGGTCGTGGCCGCCGACTTTAGC

R64A

R64A rev reverse 39 GCTAAAGTCGGCGGCCACGACCTTGGT

R64V for forward 40 ACCAAGGTCGTGGTCGCCGACTTTAGC

R64V

R64V rev reverse 41 GCTAAAGTCGGCGACCACGACCTTGGT

R64L for forward 42 ACCAAGGTCGTGCTCGCCGACTTTAGC

R64L

R64L rev reverse 43 GCTAAAGTCGGCGAGCACGACCTTGGT

R64S for forward 44 ACCAAGGTCGTGAGCGCCGACTTTAGC

R64S

R64S rev reverse 45 GCTAAAGTCGGCGCTCACGACCTTGGT

B) QuikChange®-PCR:

Nachdem eine erste Mutante, in der die Aminosäure Arginin in Position 64 durch As- paraginsäure ersetzt worden war, eine deutlich höhere Aktivität als das Wildtyp-Enzym zeigte, sollte in dieser Position weitere proteinogen Aminosäuren eingebaut und diese verschiedenen Mutanten bezüglich ihrer Aktivität getestet werden. Ein gezielter Austausch einer Aminosäure kann mit Hilfe der„QuikChange®-PCR"-Methode erreicht werden. Dazu wurde folgende PCR-Reaktion (Reaktionsansatz s. Tab 3) durchgeführt: Zuerst erfolgte ein 2 min langer initialer Denaturierungsschritt bei 95°C, danach wurden 20 Zyklen von Denaturierung (30 s bei 95°C), Primerhybridisierung (1 min bei 60 - 68°C) und Elongation (13 min bei 68°C) durchgeführt. Als letzter Schritt erfolgte eine finale Elongation von 10 min bei 68°C bevor die Polymerasekettenreaktion durch Kühlen auf 4°C beendet wurde. Als Templat wurde ein pET28a-Vektor mit dem Gen der 7ß-HSDH (Wildtyp) verwendet.

Tabelle 3: PCR-Ansatz für die Erzeugung der verschiedenen 7ß-HSDH Varianten

PCR-Reaktionsansatz

Puffer (10x) 5,0 μΙ

dNTP-Mix (10 mM) 1 ,5μΙ Forward-Primer (10

5,0 μΙ

pmol/μΙ)

Revers-Primer (10 pmol/μΙ) 5,0 μΙ

Template 1 ,0 μΙ

Pfu Polymerase 0,5 μΙ

DMSO 2,0 μΙ

ddH ₂ 0 30,0μΙ

50,0 μΙ

Um Aminosäuren in Proteinsequenzen gezielt austauschen zu können, wird die DNA-Sequenz des entsprechenden Gens positionsgerichtet mutiert. Hierzu werden zueinander komplementäre Primer genutzt, die die gewünschte Mutation in ihrer Sequenz tra- gen. Als Template dient N6-adeninmethylierte, doppelsträngige Plasmid-DNA, die das zu mutierende Gen tragen. N6-adeninmethylierte Plasmid-DNA werden aus einem dam+ £. co//-Stamm wie zum Beispiel E. coli DH5a isoliert.

Die Polymerasekettenreaktion wird wie oben beschrieben durchgeführt. Dabei werden die Primer komplementär zum Template verlängert, wodurch Plasmide mit der ge- wünschten Mutation entstehen, die einen Strangbruch aufweisen. Anders als bei anderen PCR-Reaktionen steigt die DNA-Ausbeute hierbei nur linear, da neu gebildete DNA- Moleküle nicht als Template für die PCR-Reaktion dienen können.

Nach Abschluss der PCR-Reaktion wurde das PCR-Produkt mittels PCR- Purification-Kit (Analytik Jena AG, Jena, Deutschland) aufgereinigt und die parentale, N6- adeninmethylierte mit Hilfe des Restriktionsenzyms dpn\ verdaut. Dieses Enzym hat die Besonderheit, dass es unspezifisch N6-adeninmethylierte DNA restringiert, jedoch nicht die neu gebildete, nichtmethylierte DNA. Die Restriktion erfolgte, indem 1 μΙ dpn\ zum PCR- Reaktionsansatz hinzu gegeben und für 2 h oder über Nacht bei 37°C inkubiert wurde. Zur Transformation von 100 μΙ chemisch-kompetenten DH5a-Zellen wurden 7,5 μΙ dieses Ansat- zes eingesetzt.

C) Aktivitätswerte der Enzymmutanten:

Die Aktivitätsmessung (s. Beispiel 1 ) der Mutanten, die in Position 64 mutagenisiert worden sind, ergab die in der folgenden Tabellen 4 aufgeführten Werte. Dabei bedeutet die Schreibweise [R64E] in der ersten Tabellenspalte, dass bei der betrachteten Mutante das Arginin (R) in Position 64 der Proteinsequenz durch Glutaminsäure (E) ersetzt wurde. Die jeweilige Aminosäure wird dabei nach dem internationalen Ein-Buchstaben-Code abgekürzt. Analog bedeutet [R64D], dass in dieser Position eine Asparaginsäure eingefügt wurde.

Tabelle 4: Aktivitäten der verschiedenen 7ß-HSDH-Varianten, die an der Position 64 verändert wurden.

Volumetrische Aktivität spezifische Aktivität

Mutante

[U/ml] [U/mg]

7ß-HSDH (WT) 96,8 8,7

7ß-HSDH [R64E] 892,7 60,2

7ß-HSDH [R64D] 641 ,6 32, 1

7ß-HSDH [R64T] 450,5 27,4

7ß-HSDH [R64L] 334 20,9

7ß-HSDH [R64S] 333,7 20, 1

7ß-HSDH [R64P] 402,0 19, 1

7ß-HSDH [R64V] 407,7 15, 1

7ß-HSDH [R64K] 296,5 15, 1

7ß-HSDH [R64C] 269,7 14, 19

7ß-HSDH [R64A] 273 13,77

7ß-HSDH [R64G] 223 12,36

7ß-HSDH [R64Q] 217 12,2

7ß-HSDH [R64F] 216 10,5

7ß-HSDH [R64W] 214 10, 1

7ß-HSDH [R64I] 171 9,83

7ß-HSDH [R64Y] 220,3 9,7

7ß-HSDH [R64H] 97,8 5,34

7ß-HSDH [R64N] 3,4 0,6

D) Michaelis-Menten-Kinetiken Die besten Mutanten der jeweiligen Position wurden entsprechend Beispiel 1 D gereinigt und die kinetische Konstanten v _max und K _M für das Substrat DHCA und das Coenzym NADPH ermittelt. In Figur 3 sind die Verlaufsdiagramme der Kinetiken abgebildet und in Tabelle 5 die kinetischen Konstanten aufgelistet.

Tabelle 5: Kinetische Konstanten für das aufgereinigte Enzym 7ß-HSDH [R64E] für das Substrat DHCA und den Kofaktor NADPH. (x = keine Inhibierung)

Enzym Substrat v _max (U/mg) Ki (mM)

DHCA 41 ,56 ± 1 ,9 81 ,01 ± 18,9 74,23 ± 24,9

7ß-HSDH

[R64E]

NADPH 60,31 ± 15,6 45,48 ± 3,5 X

7ß-HSDH DHCA 8,7 ± 0,2 20,5 ± 2,9 79,8 ± 16,4

(WT)

NADPH 8,8 ± 0,2 15,2 ± 2,2 X Aus Tabelle 5 geht hervor, dass die maximale Geschwindigkeit gegenüber dem Wildtypenzym um ca. das 5-fache gesteigert werden konnte. Der K _M -Wert ist gleich geblieben. Die Substratinhibierung ist deutlich schwächer geworden.

Beispiel 3: Herstellung von 7ß-HSDH Mutanten in Aminosäure-Position 39 und deren Charakterisierung

A) Primer:

Für die positionsgerichtete Mutagenese der 7ß-HSDH wurden die in Tabelle 6 aufgeführten Mutageneseprimer verwendet. Die Primer wurden auf Grundlage der 7ß-HSDH- Gensequenz dahingehend ausgewählt, dass sie den gewünschten Aminosäurenaustausch bewirken. Zur Erzeugung der Mutanten wurden folgende Primerpaare verwendet:

Tabelle 6: Primer für die positionsgerichtete Mutagenese der 7ß-HSDH an Position 39

Bezeichnung Austausch Primer SEQ ID NO 5 -> 3 ^' Sequenz

G39S for forward 54 GTCGTCATGGTCAGCCGTCGCGAGGAG

G39S

G39S rev reverse 55 CTCCTCG CG ACG GCTG ACCATG ACG AC

G39V for forward 56 GTCGTCATGGTCGTCCGTCGCGAGGAG

G39V

G39V rev reverse 57 CTCCTCGCGACGGACGACCATGACGAC

G39I for forward 58 GTCGTCATGGTCATCCGTCGCGAGGAG

G39I

G39I rev reverse 59 CTCCTCGCGACGGATGACCATGACGAC

G39C for G39C forward 60 GTCGTCATGGTCTGCCGTCGCGAGGAG G39C rev reverse 61 CTCCTCG CG ACGG CAG ACCATG ACG AC

G39K for forward 62 GTCGTCATGGTCAAGCGTCGCGAGGAG

G39K

G39K rev reverse 63 CTCCTCGCGACGCTTGACCATGACGAC

G39Y for forward 64 GTCGTCATGGTCTACCGTCGCGAGGAG

G39Y

G39Y rev reverse 65 CTCCTCGCGACGGTAGACCATGACGAC

G39F for forward 66 GTCGTCATGGTCTTCCGTCGCGAGGAG

G39F

G39F rev reverse 67 CTCCTCGCGACGGAAGACCATGACGAC

G39R for forward 68 GTCGTCATGGTCCGCCGTCGCGAGGAG

G39R

G39R rev reverse 69 CTCCTCGCGACGGCGGACCATGACGAC

B) QuikChange®-PCR:

Der gezielte Austausch von Glycin in Position 39 gegen Serin wurde wie in Beispiel 2B beschrieben mittels QuikChange®-PCR durchgeführt.

C) Aktivitätswerte der Enzymmutanten:

Die Aktivitätsmessung (s. Beispiel 1 ) der Mutante, die in Position 39 Serin an Stelle von Glycin enthält (7ß-HSDH [G39S]), ergab eine volumetrische Aktivität von 735 U/ml und eine spezifische Enzymaktivität von 52,9 U/mg Protein, während das Wildtyp-Enzym dazu im Vergleich eine volumetrische Aktivität von 96,8 U/ml und eine spezifische Aktivität von 8,7 U/mg aufwies.

D) Michaelis-Menten-Kinetiken

Die kinetischen Parameter Konstanten v _max und K _M wurden mit aufgereinigtem En- zym aufgenommen. In Figur 4 sind die Verlaufsdiagramme der Kinetiken abgebildet und in Tabelle 7 die kinetischen Konstanten aufgelistet.

Tabelle 7: Kinetische Konstanten für das aufgereinigte Enzym 7ß-HSDH [G39S] für das Substrat DHCA und den Kofaktor NADPH. (x = keine Inhibierung)

Enzym Substrat v _max (U/mg) K, (mM)

DHCA 52,0 ± 1 ,9 352,4 ± 42,7 51 ,8 ± 10,1

7ß-HSDH

[G39S]

NADPH 48,8 ± 2,2 34,5 ± 6,6 X

7ß-HSDH DHCA 8,7 ± 0,2 20,5 ± 2,9 79,8 ± 16,4

NADPH 8,8 ± 0,2 15,2 ± 2,2 X

Aus Tabelle 7 geht hervor, dass die maximale Geschwindigkeit gegenüber dem Wildtypen um ca. das 6-fache gesteigert werden konnte. Der K _M -Wert ist dafür um das 4-fache schlechter geworden. Die Substratinhibierung ist genau wie bei der Mutante in Position 64 etwas schwächer geworden, wurde aber nicht eliminiert.

Beispiel 4: Herstellung von 7ß-HSDH Mutanten in Aminosäure-Position 17 und deren Charakterisierung

A) Primer:

Für die positionsgerichtete Mutagenese der 7ß-HSDH wurden die in Tabelle 8 aufgeführten Mutageneseprimer verwendet. Zur Erzeugung der Mutanten wurden folgende Pri- merpaare verwendet:

Tabelle 8: Primer für die positionsgerichtete Mutagenese der 7ß-HSDH an Position 17

B) QuikChange®-PCR:

Die gezielten Austausche von Threonin in Position 17 gegen die in Tabelle 8 aufgeführten Aminosäuren wurden wie in Beispiel 2B beschrieben mittels QuikChange®-PCR durchgeführt.

C) Aktivitätswerte der Enzymmutanten:

Die Aktivitätsmessungen (s. Beispiel 1 ) der Mutanten, die in Position 17 eine andere Aminosäure als Threonin enthalten, sind in Tabelle 9 zusammengefaßt.

Tabelle 9: Aktivitäten der verschiedenen 7ß-HSDH-Varianten, die an der Position 17 verändert wurden.

Volumetrische Aktivität spezifische Aktivität

Mutante

[U/ml] [U/mg] 7ß-HSDH (WT) 96,8 8,7

7ß-HSDH [T17F] 645,2 46, 1

7ß-HSDH [T17A] 541 20,3

7ß-HSDH [T17I] 299,8 18,4

7ß-HSDH [T17S] 580 17,2

Beispiel 5: Herstellung von 7ß-HSDH Mutanten, die in mehreren Positionen Aminosäure-Austausche enthalten und deren Charakterisierung

Neben den in den Beispielen 2 - 4 beschriebenen Einzelmutanten kann man Mutati- onen auch vorteilhaft kombinieren. Als Beispiel wurde eine Doppelmutante erzeugt, bei der gleichzeitig die Positionen 39 und 64 verändert wurden. Dabei wurde der beste Aminosäure- Austausch in Position 39 ([G39S]) kombiniert mit dem besten Austausch in Position 64 ([R64E]).

A) Erzeugung und Aktivitätswerte für die Doppelmutante

Die Methode zur Gewinnung der Doppelmutante und der Aktivitätstest richtete sich dabei nach den Methoden, wie sie unter 2B und 2C beschrieben sind.

In Tab. 10 sind die Aktivitätswerte für die Doppelmutante im Vergleich zu den Werten für das Wildtypenzym zusammengestellt.

Tabelle 10: Aktivitätswerte der 7ß-HSDH-Doppelmutante [G39S/R64E] im Vergleich zum Wildtypenzym.

Volumetrische Akspezifische Aktivität

Mutante

tivität [U/ml] [U/mg]

7ß-HSDH (WT) 96,8 8,7

7ß-HSDH [G39S/R64E] 1 1 15,0 57,5

B) SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE)

Eine SDS-PAGE wurde durchgeführt, um die Expressionsleistung der heterologen Expression bewerten zu können. Als Beispiel wurde die Doppelmutante aufgetragen. In Figur 5 ist ein solches SDS-Gel dargestellt, das durch Auftragung des Zell-Rohextrakts zeigt, dass diese Mutante eine sehr gute Überexpression zeigt; die dicke Bande, die bei ca. 30 kDa läuft, belegt, dass das intrazelluläre lösliche Protein in hohem Maß nur aus der Dop- pelmutante besteht. Zusätzlich belegt das Gel den Reinheitsgrad der aufgereinigten Dop- pelmutante. Das Molekulargewicht der Mutante beträgt ca. 29,9k Da.

C) Michaelis-Menten-Kinetiken

Die Mutante [G39S/R64E] wurde aufgereinigt (siehe Punkt 3) und die kinetischen Parameter für das gereinigte Enzym bestimmt. In Figur 6 sind die Verlaufsdiagramme abgebildet und in Tabelle 1 1 die kinetischen Konstanten aufgelistet.

Tabelle 11 : Kinetische Konstanten für das aufgereinigte Enzym 7ß-HSDH [G39S/R64E] für das Substrat DHCA und den Kofaktor NADPH. (x = keine Inhibierung)

Enzym Substrat Κ _Μ (μΜ) K, (mM)

DHCA 54,3 ± 1 ,6 349,3 ± 5,23 X

7ß-HSDH

[G39S/R64E]

NADPH 75,5 ± 4,8 76,6 ± 15,9 X

Aus dem Verlaufsdiagramm (für das Substrat DHCA) in Figur 6 fällt auf, das die Kombination der Positionen 39 und 64 zur Folge hatte, dass die 7ß-HSDH keine Substratinhibierung mehr aufweist. Weiterhin konnte die Aktivität um ca. 7-fache gesteigert werden.

Zusammenfassung der erfindungsgemäß beispielhaft erzielten Verbesserun gen/Änderungen): n.b. = nicht bestimmt

(Angaben im Vergleich zum Wildtyp) Zuordnung von SEQ ID NOs:

SEQ ID NO: Beschreibung Typ

1 7ß-HSDH C. aerofaciens (Wildtyp) NS

2 7ß-HSDH C. aerofaciens (Wildtyp) AS

3 7ß-HSDH C. aerofaciens (Wildtyp) (mit His-Tag) AS

4 7ß-HSDH R64E Mutante(mit His-Tag) AS

5 7ß-HSDH G39S Mutante(mit His-Tag) AS

6 7ß-HSDH G39S R64E Mutante(mit His-Tag) AS

7 GDH (B. subtilis) NS

8 GDH (B. subtilis) AS

9 3a-HSDH (C. testosteroni) NS

10 3a-HSDH (C. testosteroni) AS

1 1 FDH (Wildtyp) (M.vaccae) AS

12 PCR Primer NS

13 PCR Primer NS

14 PCR Primer NS

15 PCR Primer NS

16 PCR Primer NS

17 PCR Primer NS

18 PCR Primer NS

19 PCR Primer NS

20 PCR Primer NS

21 PCR Primer NS

22 PCR Primer NS

23 PCR Primer NS

24 PCR Primer NS

25 PCR Primer NS

26 PCR Primer NS

27 PCR Primer NS

28 PCR Primer NS

29 PCR Primer NS

30 PCR Primer NS

31 PCR Primer NS

32 PCR Primer NS

33 PCR Primer NS SEQ ID NO: Beschreibung Typ4 PCR Primer NS5 PCR Primer NS6 PCR Primer NS7 PCR Primer NS8 PCR Primer NS9 PCR Primer NS0 PCR Primer NS1 PCR Primer NS2 PCR Primer NS3 PCR Primer NS4 PCR Primer NS5 PCR Primer NS6 PCR Primer NS7 PCR Primer NS8 PCR Primer NS9 PCR Primer NS0 PCR Primer NS1 PCR Primer NS2 PCR Primer NS3 PCR Primer NS4 PCR Primer NS5 PCR Primer NS6 PCR Primer NS7 PCR Primer NS8 PCR Primer NS9 PCR Primer NS0 PCR Primer NS1 PCR Primer NS2 PCR Primer NS3 PCR Primer NS4 PCR Primer NS5 PCR Primer NS6 PCR Primer NS7 PCR Primer NS SEQ ID NO: Beschreibung Typ

68 PCR Primer NS

69 PCR Primer NS

AS = Aminosäuresequenz

NS = Nukleinsäuresequenz

Auf die Offenbarung der hierin erwähnten Druckschriften wird ausdrücklich Bezug genommen.