次に、本発明の好ましい実施態様につい� ��詳細に説明する。ただし、本発明は以下の� ��ましい実施態様に限定されず、本発明の範� ��内で自由に変更することができるものであ� ��。尚、本明細書において百分率は特に断り� ��ない限り質量による表示である。

 本発明に係る異常型プリオン蛋白質の検出� ��法は、好ましい実施態様において、次の工� ��:
 ラクトフェリンが担体に固定化されてなる� ��常型プリオン蛋白質結合剤を、試料に接触� ��せる工程、
 試料に接触させた異常型プリオン蛋白質結� ��剤から、結合した成分を分離する工程、
 分離した成分に含まれる異常型プリオン蛋� ��質を検出する工程、
を含む方法として、実施することができる。

 この方法によれば、試料中に含まれてい� ��異常型プリオン蛋白質を、異常型プリオン� ��合剤中に固定化されているラクトフェリン� ��よって、特異的に結合(吸着)することがで� �、次に、異常型プリオン結合剤中に固定化� �れているラクトフェリンと結合した異常型� �リオン蛋白質を、分離して回収することが� �き、このように分離された異常型プリオン� �白質を、次に検出することで、異常型プリ� �ン蛋白質を正常型プリオン蛋白質と区別し� �、検出することができる。

 分離した成分に含まれる異常型プリオン� ��白質を検出する工程は、分離した成分に含� ��れる異常型プリオン蛋白質を免疫学的検出� ��によって検出する工程であることが、好ま� ��い。

 好ましい免疫学的検出法としては、ウェ� ��タンブロット法、ELISA法、又は免役沈降法� �挙げることができる。

 分離した成分に含まれる異常型プリオン� ��白質を検出する工程で行われる検出は、上� ��免疫学的検出法を含めて、異常型プリオン� ��白質を検出することができる方法であれば� ��く、異常型プリオン蛋白質と正常型プリオ� ��蛋白質を区別することができない方法であ� ��ても、当然に使用することができる。これ� ��、本発明においては、それ以前の工程で、� ��クトフェリンとの結合を行うことによって� ��異常型プリオン蛋白質に対する特異性は既� ��確保されているためである。従って、上記� ��免疫学的検出法においては、異常型プリオ� ��蛋白質と正常型プリオン蛋白質を区別しな� ��抗体であっても、当然に使用することがで� ��る。

 ラクトフェリン(lactoferrin:以下、LFと略記� ��ることがある。)とは、主に母乳中に含まれ ている分子量約80キロダルトンの鉄結合性糖� ��白質であり、大腸菌、カンジダ菌、クロス� ��リジウム菌、ブドウ球菌等の有害微生物に� ��する抗菌作用や、免疫賦活作用、抗腫瘍作� ��等、様々な作用をもつ乳タンパク質として� ��られている。ラクトフェリンは乳由来の糖� ��ンパク質であることから、安全性が高く、� ��期連用することが可能で、それ自体は殆ど� ��味無臭であり、各種の食品・医薬品・飼料� ��添加物として、汎用性が高い。しかし、異� ��型プリオン蛋白質との特異的な結合能は、� ��れまで知られていなかった。

 本発明に使用するラクトフェリンは、市� ��のラクトフェリンや、哺乳動物(例えば、ヒ ト、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ウマ等。)の初乳� �移行乳、常乳、末期乳、又はこれらの乳の� �理物である脱脂乳、ホエー等を原料とし、� �えばイオン交換クロマトグラフィー等の常� �により、前記原料から分離して得られるラ� �トフェリンを用いることができる。中でも� �工業的規模で製造されている市販のラクト� �ェリン(例えば、森永乳業社製)を使用するこ とが好適である。更に、遺伝子工学的手法に より、微生物、動物細胞、トランスジェニッ ク動物等で生産したラクトフェリンを使用す ることも可能である。牛乳由来のホエーは、 乳製品製造の副産物として安定して大量に得 ることができるという利点があるために、本 発明に使用するラクトフェリンの原料として 、特に好適である。

 ここで、ラクトフェリンの調製(乳等の原 料からのラクトフェリンの分離、精製)方法� �一例を以下に示す。まず、イオン交換体(た� ��えばCM-セファロースFF(商品名、アマシャム� ��ァルマシア社製))をカラムに充填し、塩酸� �通液し、水洗してイオン交換体を平衡化す� �。続いて、4℃に冷却したpH6.9の脱脂牛乳を� �ラムに通液し、透過液を回収し、再度同様� �カラムに通液する。次いで、蒸留水をカラ� �に通液し、食塩水を通液し、イオン交換体� �吸着した塩基性蛋白質の溶出液を得る。こ� �溶出液に飽和度80%の硫酸アンモニウムを添� �し、タンパク質を沈殿させ、遠心分離して� �殿物を回収する。回収した沈殿物を、飽和� �80%の硫酸アンモニウム溶液で洗浄し、脱イ� �ン水を添加して溶解し、得られた溶液を限� �濾過膜モジュール(たとえばSLP0053(商品名、� �化成社製))を用いて脱塩し、凍結乾燥して、 粉末状ウシラクトフェリンを得る。このよう にして、純度が95質量%以上のウシラクトフェ リンが得られる。なお、本明細書におけるラ クトフェリンの純度は液体クロマトグラフ法 により測定して得られる値とする。

 ラクトフェリンは、多くのタンパク質と� ��じく、種、属、個体等の違いによって、1又 は複数の位置での1又は複数の塩基の置換、� �失、挿入、付加、又は逆位等の変異が当然� �在し、このような変異を有する遺伝子がコ� �ドするタンパク質のアミノ酸においても変� �が生じている場合がある。本発明に用いる� �とができるラクトフェリンには、異常型プ� �オン蛋白質との特異的な結合性が損なわれ� �い範囲において、このような変異を含むも� �も含有される。

 ラクトフェリンが担体に固定化されてな� ��異常型プリオン蛋白質結合剤を調製するた� ��に使用することができるラクトフェリンの� ��定化の方法は、異常型プリオン蛋白質との� ��異的な結合性が損なわれないものであれば� ��通常の固定化の方法を使用することができ� ��。このような方法としては、例えば、ポリ� ��プチドの第一級アミノ基に対して直接に共� ��結合を形成する方法、ポリペプチドのスル� ��ヒドリル基(チオール基)に対して直接に共� �結合を形成する方法等を挙げることができ� �。

 ラクトフェリンが担体に固定化されてな� ��異常型プリオン蛋白質結合剤において、ラ� ��トフェリンが固定化される担体は、所望の� ��件下で、固体層として操作できるものであ� ��ばよく、タンパク質が固定化されて使用さ� ��る一般的な担体であれば、使用することが� ��きる。このような担体として、例えば、親� ��性又は疎水性の樹脂を表面に有するものを� ��げることができ、その形状として、例えば� ��粒子状(ビーズ状)、膜状、繊維状、中空糸� �、網状等を挙げることができる。好ましい� �体として、ビーズ状(粒子状)の形状のものを 挙げることができる。ビーズ(粒子)の粒径(直 径)は、目的に応じて選択することができる� �、例えば、一般に0.5~200μm、好ましくは1.0~100 μm、さらに好ましくは1.0~50μm、さらに好まし くは1.0~20μm、さらに好ましくは1.0~10μm、特に 好ましくは1.0~5.0μmの範囲のものを使用する� �とができる。

 好ましい態様において、担体として、疎� ��性又は親水性の樹脂を表面に有するビーズ( 粒子)を使用することができ、このときには� �ラクトフェリンが担体に固定化されてなる� �常型プリオン蛋白質結合活性担体とは、ラ� �トフェリン固定化ビーズである。このよう� �担体を使用すれば、液体中に懸濁して分散� �せることができる一方で、操作上の必要に� �じて沈降させて回収することも容易である� �

 さらに好ましい態様において、担体とし� ��、疎水性又は親水性の樹脂を表面に有する� ��ーズ(粒子)であって、その内部(中心部)に磁 性化可能な材料を含むものを使用することが でき、このときには、ラクトフェリンが担体 に固定化されてなる異常型プリオン蛋白質結 合活性担体とは、磁性化可能なビーズを使用 されてなるラクトフェリン固定化ビーズであ る。このような担体を使用すれば、液体中に 懸濁して分散させることができる一方で、操 作上の必要に応じて磁石によって容易に沈降 させて回収することができる。このような操 作は、ラクトフェリン固定化ビーズを、試料 に接触させる工程、結合した成分を分離する 工程、などの工程中において、あるいはその 工程の前後に、作業上の所望に応じて、当業 者が行うことができる。

 試料は、異常型プリオン蛋白質(感染性プ リオン蛋白質)の存在が疑われるあらゆる液� �試料を使用することができるが、異常型プ� �オン蛋白質が存在している場合に十分に分� �されているものとなっていることが好まし� �。検査の対象が動物組織である場合には、� �れが十分に可溶化されていることが好まし� �。このように可溶化された試料として、例� �ば動物組織に界面活性剤を添加して均一化� �て得られた液体試料を挙げることができる� �このような液体試料のpHは、好ましくは中性 付近であり、一般にpH5.5~7.8、好ましくはpH6.0~ 7.7、特に好ましくはpH6.5~7.6の範囲のpHを好適� ��使用することができるが、これに限られる� ��のではない。このような液体試料を調製す� ��ために使用される界面活性剤としては、動� ��組織を可溶化するために一般的に使用され� ��界面活性剤であれば使用することができる� ��、可溶化とプリオン蛋白質の高次構造の保� ��の点から、非イオン性界面活性剤を使用す� ��ことが好ましく、好適に使用可能な界面活� ��剤としては、例えばtween 20、triton X-100、NP- 40、好ましくは、tween 20、triton X-100、NP-40、� ��に好ましくはtween 20、NP-40を挙げることが� �きる。試料は、ラクトフェリンと異常型プ� �オン蛋白質との特異的な結合性の確保のた� �に、後述のような条件下で、異常型プリオ� �蛋白質結合活性担体と接触できるような液� �試料として、調製されていることが好まし� �。

 ラクトフェリンと異常型プリオン蛋白質� ��の特異的な結合性の確保のために、異常型� ��リオン蛋白質結合活性担体と試料との接触� ��、一般にpH5.5~7.8、好ましくはpH6.0~7.7、特に� ��ましくはpH6.5~7.6の範囲、一般に3~30℃、好ま しくは3℃~20℃、特に好ましくは3~5℃の範囲� �温度、一般に5~300分、好ましくは10~180分、特 に好ましくは15~90分の範囲の接触時間の条件� ��、好適に行うことができるが、これらの条� ��に限られるものではない。

 可溶化される動物組織としては、異常型� ��リオン蛋白質(感染性プリオン蛋白質)の存� �が疑われるあらゆる動物組織を使用するこ� �ができるが、早期診断のためには、異常型� �リオン蛋白質の蓄積が多いことが知られて� �る、哺乳動物の脳、脊髄、眼、及び/又は小� ��であることが好ましい。

 試料に接触させた異常型プリオン蛋白質� ��合剤から、結合した成分を分離する工程に� ��いては、蛋白質-蛋白質の相互作用の解離に 一般的に使用される条件のうち、比較的強い 解離条件で解離させて、結合した成分を分離 して溶出させることができる。このような条 件としては、例えば、中性付近のpHで界面活� ��剤を含有させた溶液によって3~30℃の範囲の 温度で行う条件を挙げることができる。また 、ラクトフェリンと異常型プリオン蛋白質と の特異的な結合を解離するために、ラクトフ ェリンを含有する溶液で溶出させることによ って行うことができる。

 好ましい実施の態様においては、ラクト� ��ェリンが担体に固定化されてなる異常型プ� ��オン蛋白質結合剤を試料に接触させる工程� ��後であって、試料に接触させた異常型プリ� ��ン蛋白質結合剤から結合した成分を分離す� ��工程の前に、試料に接触させた異常型プリ� ��ン蛋白質結合剤を、洗浄する工程を設ける� ��とができる。この洗浄は、主として非特異� ��な吸着をしている成分があった場合に、こ� ��を試料に接触させた異常型プリオン蛋白質� ��合剤から除去することを目的として行われ� ��ものであり、このような目的で行われる一� ��的な手法に従って行うことができ、例えば� ��異常型プリオン蛋白質結合剤に接触させる� ��料を調製するために使用された溶液であっ� ��、可溶化された動物組織等が含まれていな� ��溶液を使用して洗浄することで、行うこと� ��できるが、これに限られるものではない。

 さらに、本発明は、異常型プリオン蛋白質� ��分離方法にもあり、本発明に係る異常型プ� ��オン蛋白質の分離方法は、好ましい実施の� ��様において、次の工程:
 ラクトフェリンが担体に固定化されてなる� ��常型プリオン蛋白質結合剤を、動物組織が� ��溶化された試料に接触させる工程、
 試料接触処理工程を受けた異常型プリオン� ��白質結合活性担体から、結合した成分を分� ��する工程、
を含む方法として、実施することができる。

 この方法によれば、試料中に含まれてい� ��異常型プリオン蛋白質を、異常型プリオン� ��合剤中に固定化されているラクトフェリン� ��よって、特異的に結合(吸着)することがで� �、次に、異常型プリオン結合剤中に固定化� �れているラクトフェリンと結合した異常型� �リオン蛋白質を、分離して回収することが� �きる。これによって異常型プリオン蛋白質� �分離、濃縮、及び精製を可能としている。

 上記の本発明に係る異常型プリオン蛋白� ��の分離方法の実施の態様は、本発明に係る� ��常型プリオン蛋白質の検出方法の好ましい� ��施態様として説明した工程のうち、分離し� ��成分に含まれる異常型プリオン蛋白質を検� ��する工程を除いて、同じ工程を行うことで� ��施することができるものとなっている。従� ��て、異常型プリオン蛋白質の検出方法の好� ��しい実施の態様に関連して既に述べた内容� ��、異常型プリオン蛋白質の分離方法の実施� ��態様においても、そのままあてはめること� ��できる。

 本発明に係るラクトフェリンが含まれて� ��る異常型プリオン蛋白質結合剤は、ラクト� ��ェリンが担体に固定化されてなる異常型プ� ��オン蛋白質結合剤として上述のような実施� ��態様において使用できるほか、次のような� ��施の態様においても使用することができる� ��

 すなわち、本発明に係る異常型プリオン蛋� ��質結合剤の好適な使用の態様として、次の� ��程:
 ラクトフェリンを、異常型プリオン蛋白質� ��結合させる工程、
 異常型プリオン蛋白質に結合したラクトフ� ��リンを検出する工程、
を含む、異常型プリオン蛋白質の検出方法を 、挙げることができる。

 この異常型プリオン蛋白質の検出方法に� ��れば、ラクトフェリンは特段の修飾を行う� ��となく異常型プリオン蛋白質結合剤として� ��用することができる。異常型プリオン蛋白� ��の検出は、結合したラクトフェリンの検出� ��よって行うことができる。

 ラクトフェリンの検出法としては、一般� ��に使用されるあらゆる検出方法を使用する� ��とができ、例えば、ラクトフェリンに対す� ��抗体を使用した免疫学的な検出法を使用す� ��ことができる。

 また、本発明に係る異常型プリオン蛋白質� ��合剤の好適な使用の態様として、次の工程:
 標識部位を有するラクトフェリンを、異常� ��プリオン蛋白質に結合させる工程、
 異常型プリオン蛋白質に結合したラクトフ� ��リンの標識部位を検出する工程、
を含む、異常型プリオン蛋白質の検出方法を 、挙げることができる。

 この異常型プリオン蛋白質の検出方法に� ��れば、ラクトフェリンは、あらかじめ標識� ��位を付しておき、この標識部位を有するラ� ��トフェリンを異常型プリオン蛋白質結合剤� ��して使用する。異常型プリオン蛋白質の検� ��は、ラクトフェリンに付された標識部位の� ��出によって行うことができる。

 標識部位としては、生体高分子に対して一� ��的に使用される標識部位であれば使用する� ��とができる。このような標識部位として、� ��えば、蛍光標識、放射線標識、酵素標識を� ��げることができる。蛍光標識としては、例� ��ば、Alexa Fluor(登録商標)(ベクトンディッキ� ��ソン社製)シリーズの色素、及びCyeDye(登録� �標)(ベクトンディッキンソン社製)シリーズ� �色素を挙げることができ、例えば、Alexa Fluo r(登録商標)488及びAlexa Fluor(登録商標)647、あ� ��いはCy3、Cy5.5及びCy7を好ましいものとして� �げることができる。放射線標識としては、� �えば、 ¹⁴ C及び ³⁵ Sを使用した標識を挙げることができる。酵� �標識としては、例えば、西洋ワサビペルオ� �シダーゼ(HRP、HorseRadish Peroxydase)あるいはア� ��カリホスファターゼ(ALP、 Alkaline Phosphatase) を使用した標識を挙げることができる。

 本発明は、さらに、異常型プリオン蛋白� ��結合剤を使用して異常型プリオン蛋白質の� ��己会合を阻害する方法、及び異常型プリオ� ��蛋白質の自己会合阻害剤にもある。異常型� ��リオン蛋白質は多数の分子が自己会合して� ��量体を形成すること、おそらくそれによっ� ��プリオン病の病原性が高められることが、� ��在のところ信じられているが、本発明に係� ��異常型プリオン蛋白質結合剤は、異常型プ� ��オン蛋白質に特異的に結合してこの自己会� ��を阻害することができる。一方で、本発明� ��係る異常型プリオン蛋白質結合剤は、正常� ��プリオン蛋白質には結合しないために、正� ��型プリオン蛋白質が有していると思われる� ��知の生体機能に、悪影響を与えるおそれは� ��い。