Aktivierung und Stabilisierung empfindlicher Katalysatoren in segmentierten amphiphilen Netzwerken Die vorliegende Erfindung betrifft ein Katalysatorsystem, welches befähigt ist, empfindliche Katalysatoren, wie insbesondere Enzyme und Peptide, zu stabilisie- ren und zu aktivieren, so daß beispielsweise Synthesereaktionen, wie insbesonde- re solche zur Wirkstoffsynthese, auch in organischen Lösungsmitteln effizient durchgeführt werden können. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung ei- nen immobilisierten Katalysator, wobei der Katalysator in ein segmentiertes am- phiphiles Polymernetzwerk mit einer spezifischen Nanophasenseparation einge- bracht ist.

Enzyme und andere enantioselektive Katalysatoren haben vor allem in der Wirk- stoffsynthese große Bedeutung. Allerdings können viele dieser Katalysatoren nicht großtechnisch eingesetzt werden, da sie gegenüber dem verwendeten Lö- sungsmittel empfindlich sind bzw. wenig aktiv sind. Metalikatalysatoren bzw. me- tallorganische Katalysatoren sind in den eingesetzten Mengen beispielsweise durch ihren hohen Schwermetallgehalt häufig stark umwelttoxisch.

Zudem ist die natürliche Umgebung von Biokatalysatoren, wie insbesondere En- zymen, wäßrig. Wasser ist jedoch für viele präparative Reaktionen in der organi- schen Chemie ein schlechtes Lösungsmittel, da die meisten organischen Verbin- dungen in diesem Medium unlöslich sind. Außerdem ist das Entfernen von Was- ser aus Reaktionsgemischen aufgrund seines hohen Siedepunktes und der gro- ßen Verdampfungsenthalpie zeit-und energieaufwendig. Darüberhinaus treten in wäßriger Lösung verstärkt Nebenreaktionen wie Hydrolyse, Racemisierung bzw.

Polymerisationen auf. Ferner sind die gebildeten Produkte bei Anwesenheit von Wasser oft instabil. Um diese Probleme zu umgehen, werden daher die meisten organischen Synthesen in organischen Lösungsmitteln durchgeführt. Insofern aber die natürliche Umgebung von Biokatalysatoren, wie insbesondere Enzymen, wäßrig ist, erschwert dies die Verwendung solcher Katalysatoren in organischen

Lösungsmitteln, da üblicherweise Enzyme und andere Proteine in diesen instabi- ler und weniger aktiv sind. Enzyme sind in organischen Lösungsmitteln im we- sentlichen nicht löslich, trotzdem werden sie teilweise auch zum Einsatz in diesen Medien"immobilisiert". In diesem Fall spricht man von einer Trägerung. Sie er- leichter auch die Abtrennung der Katalysatoren, da lediglich größere Partikel ab- filtriert werden müssen. Außerdem erreicht man durch eine Trägerung eine größe- re Oberfläche des Biokatalysators und unter anderem dadurch auch eine höhere Aktivität. Meistens wird eine Adsorption des Enzyms auf mikro-oder makroporöse Träger wie z. B. Silica, Celite oder Glas ausgenutzt. In vielen Fällen führt eine der- artige Immobilisierung jedoch nicht zum gewünschten Erfolg, da die immobilisierte Substanz aufgrund von konformellen Änderungen oder Diffusionsproblemen nicht mehr aktiv oder zugänglich ist.

Amphiphile Polymere sind in diesem Zusammenhang bis heute Seiten verwendet worden. In der Literatur ist lediglich die Immobilisierung von Lipasen durch Ad- sorption auf mikroporöse amphiphil modifizierte Polyallylmethacrylat-co- Polyglycidyl-methacrylat-Partikel sowie auf Copolymere aus mit Divinyl vernetztem Polystyrol und tensidischen Monomeren beschrieben ; vgl. Yasuda et al., Macro- molecular Chemistry and Physics, 2001, Bd. 202 (16), Seiten 3189-3197, bzw.

2002, Bd. 203, Seiten 284-293 ; Journal of Polymer Science : Part A : Polymer Chemistry, 2002, Bd. 40, Seiten 874-884, bzw. Journal of Chemical Engineering of Japan, 2003, Bd. 35 (6), Seiten 519-526.

Tetrahedron Letters 44 (2003), Seiten 2379-2382, beschreibt einen Komplex bzw.

Aggregat aus Pd2+ und amphiphilen Copolymeren. Chemistry Letters (8) (1991), Seiten 1303-1306, beschreibt ein System aus Meerettichperoxidase und amphi- philen Blockcopolymeren, d. h. Tensiden. Die molekulare Struktur dieses Systems ist jedoch vielmehr ein Aggregat im Sinne von inversen Mizellen. US-A-5,073, 381 beschreibt amphiphile Netzwerke zur Freisetzung von Wirkstoffen.

Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, ein Katalysatorsy- stem bereitzustellen, welches befähigt ist, Enzyme, Peptide und andere enantio- selektive Katalysatoren zu stabilisieren und zu aktivieren, so daß organische

Synthesereaktionen, insbesondere solche zur Wirkstoffsynthese, auch in organi- schen Lösungsmitteln bzw. wenn Metalikatalysatoren oder metallorganische Ka- talysatoren vorgesehen werden, auch in wässrigen Lösungsmitteln effizient durchgeführt werden können.

Diese Aufgabe wird durch die in den Ansprüchen gekennzeichneten Ausfüh- rungsformen gelöst.

Insbesondere wird ein immobilisierter Katalysator bzw. Katalysatorsystem bereit- gestellt, wobei der Katalysator, insbesondere ein Enzym oder ein Peptid, in ein aus mindestens einer hydrophilen und einer hydrophoben Komponente aufge- bautes, segmentiertes amphiphiles Netzwerk, das eine Nanophasenseparation der jeweils aus der hydrophilen und der hydrophoben Komponente gebildeten Einheiten im Bereich von 5 nm bis 500 nm, vorzugsweise 8 bis 300 nm, beson- ders bevorzugt 8 bis 50 nm, aufweist, eingebracht ist. Ein derartiger immobilisier- ter Katalysator kann durch ein Verfahren hergestellt werden, umfassend die Schritte : (i) Herstellen eines segmentierten amphiphilen Polymernetzwerks durch Copo- lymerisation zweier Makromonomere unterschiedlicher Hydrophilie bzw. ei- nes Monomers und eines Makromonomers mit jeweils unterschiedlicher Hy- drophilie und (ii) Beladen des Polymernetzwerks mit dem Katalysator.

Die vorliegende Erfindung ist auf die Immobilisierung empfindlicher Katalysatoren, wie insbesondere Enzyme oder Peptide, in einem segmentierten amphiphilen Po- lymernetzwerk gerichtet. Unter einem segmentierten Netzwerk werden allgemein Netzwerkstrukturen verstanden, in denen ein Polymer A als ein makromolekularer Vernetzer für ein Polymer B fungiert. Das segmentierte, amphiphile Polymernetz- werk der vorliegenden Erfindung weist erfindungsgemäß eine Nanophasensepa- ration auf, so daß hydrophile und hydrophobe Einheiten des Polymernetzwerks im Bereich von 5 nm bis 500 nm benachbart liegen. Insofern die Phasenseparation

über AFM-Messungen beobachtet bzw. bestimmt wird, wird die an sich dreidimen- sionale Phasenseparation im Rahmen der vorliegenden Erfindung in eine eindi- mensionale Größe übersetzt. Diese Nanophasenseparation ist sowohl auf der Oberfläche als auch in der Masse des erfindungsgemäß eingesetzten segmen- tierten, amphiphilen Polymernetzwerks gegeben. Diese spezielle Netzwerkkonfi- guration ermöglicht den freien Zugang zu dessen Inneren sowohl für Katalysato- ren wie Enzyme oder Peptide (in wässriger Phase) als auch Substrate (in organi- scher Phase), was für das erfindungsgemäße Katalysatorsystemkonzept bei- spielsweise bei dessen Einsatz zur Wirkstoffsynthese wesentlich ist.

Journal of Molecular Catalysis A : Chemical 129 (1998), Seiten 27-34, bzw. Jour- nal of Molecular Catalysis A : Chemical 130 (1998), Seiten 85-93, beschreibt kata- lytisch aktive Pd-Partikel in einem amphiphilen Netzwerk, welches zwar hydrophile und hydrophobe Domänen enthält. Es handelt es sich dabei aber nicht um ein segmentiertes Netzwerk, in dem eine Phasenseparation der jeweils aus der hy- drophilen und der hydrophoben Komponente gebildeten Einheiten in der Größen- ordnung von 5 nm bis 500 nm vorliegt, da lediglich niedermolekulare Monomere zur Erzeugung des Netzwerks eingesetzt werden, so daß nur eine sehr kleinräu- mige Phasenseparation erreicht wird.

Grundsätzlich ist die Nanophasenseparation erfindungsgemäß derart gestaltet, daß die Größe der Domänen nicht kleiner als der einzulagernde Katalysator ist.

Die Nanophasenseparation kann beispielsweise durch AFM-Messungen bestätigt werden. In Abhängigkeit von der Art des Lösungsmittels (wäßrig, organisch) quel- len entweder die hydrophilen oder die hydrophoben Bereiche im erfindungsgemäß eingesetzten Polymernetzwerk. Infolgedessen kann ein Katalysator, wie insbe- sondere ein Enzym oder ein Peptid, in einem hydrophilen (hydrophoben) Lö- sungsmittel in das amphiphile Netzwerk eindiffundieren und dann in einem ande- ren hydrophoben (hydrophilen) Lösungsmittel eine katalytische Aktivität entfalten.

Die Verteilung des Katalysators im erfindungsgemäß verwendeten amphiphilen Polymernetzwerk ist homogen. Zudem gewährleistet die enge Nachbarschaft von hydrophilen und hydrophoben Bereichen geringe Diffusionswege. Beides sind Voraussetzungen für eine effiziente katalytische Reaktion.

Fig. 1 veranschaulicht schematisch die erfindungsgemäße Katalysatorsystemkon- zeption, worin beispielhaft ein Enzym in einem hydrophilen (wässrigen) Lösungs- mittel in die hydrophile Phase des amphiphilen, segmentierten Netzwerks eindif- fundiert und dann in einem anderen hydrophoben (organischen) Lösungsmittel seine katalytische Aktivität entfaltet.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der einge- setzte Katalysator ein Enzym oder ein Peptid, vorzugsweise ein Enzym. Die Klas- se des in das Netzwerk inkorporierten Enzyms unterliegt keiner spezifischen Be- schränkung. So kommen im Rahmen der vorliegenden Erfindung als Enzyme Oxidoreduktasen, Transferasen, Hydrolasen, Lyasen, Isomerasen und Ligasen in Frage. In besonders vorteilhafter Weise können im Rahmen der vorliegenden Er- findung Peroxidasen bzw. als deren Untergruppe Häm-Enzyme, die den Komplex Eisen-Protoporphyrin IX als prosthetische Gruppe enthalten, und Hydrolasen ein- gesetzt werden. Insbesondere ist hier Meerrettichperoxidase (HRP) und Chlorper- oxidase (CPO) als entsprechende Peroxidasen und Trypsin als entsprechende Hydrolase anzuführen. Als Peptid kommen insbesondere Transportproteine wie Hämoglobin und Myoglobin in Frage.

Peroxidasen können eine Reihe synthetisch nützlicher Reaktionen katalysieren, wie z. B. Polymerisationen elektronenreicher Aromaten, asymmetrische Sulfoxida- tionen und Epoxidierungen. Das Potential der Peroxidasen im Bereich der (asymmetrischen) Biotransformationen wird derzeit kaum in einer kommerziellen Synthese ausgenutzt, da diese Enzyme zwei große Nachteile aufweisen. Zum einen werden Peroxidasen wie Häm-Enzyme durch Peroxide inaktiviert. Zum an- deren limitiert die schlechte Wasserlöslichkeit vieler synthetisch interessanter Substrate bei Peroxidasen genauso wie bei den meisten anderen Enzymen die kommerzielle Anwendung der enzymatischen Biotransformationen. Eine Lösung dieses allgemeinen Problems wird erfindungsgemäß durch das Immobilisieren bzw. Einbetten solcher Enzyme wie beispielsweise Peroxidasen in eine segmen- tierte amphiphile Polymermatrix mit der vorstehenden Nanophasenseparation er- reicht.

Neben solchen Enzymen können im Rahmen der vorliegenden Erfindung aber auch empfindliche Metalikatalysatoren bzw. metallorganische Katalysatoren ein- gesetzt werden, die durch das Immobilisieren bzw. Einbetten in eine amphiphile Polymermatrix stabilisiert und aktiviert werden. So können wasserempfindliche Metalikatalysatoren durch Einschluß in die hydrophoben Phasen bzw. Bereiche der erfindungsgemäß verwendeten, segmentierten amphiphilen Polymernetzwer- ke stabilisiert und aktiviert werden. Als empfindliche Metallkatalysatoren, die im Rahmen der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden können, sind der Shar- pless-Katalysator zur asymmetrischen Epoxidation von Allylalkoholen, Grubbs- Katalysatoren zur Metathese von Alkenen bzw. Alkinen oder auch Pd- Nanoteilchen zur Heck-Reaktion oder zur Hydrierung, zu nennen.

Polymernetzwerke sind Polymere, bei denen die Polymerketten dreidimensional untereinander verknüpft sind. Bei einem Netzwerk sind sämtliche Polymerketten miteinander verknüpft, es liegt ein einziges großes Molekül vor. Die Synthese von Netzwerken kann prinzipiell durch Vernetzung von linearen Polymerketten mittels Polymer-analoger Reaktion oder durch eine vernetzende Copolymerisation mit einem niedermolekularen Vernetzer erfolgen. Bei der Copolymerisation können anstelle von Monomeren auch Makromonomere eingesetzt werden. Unter diesem Begriff versteht man Oligo-oder Polymere mit polymerisierbaren Gruppen. Durch die Copolymerisation eines an beiden Endgruppen mit einer polymerisierbaren Gruppe modifizierten Makromonomers und einem niedermolekularen Monomer entstehen Netzwerke mit einer segmentierten Topologie, die zwischen der von gepfropften bzw. Kammpolymeren und der von interpenetrierenden Netzwerken angesiedelt ist. Derartig aufgebaute segmentierte Polymernetzwerke, wie sie im Rahmen der vorliegenden Erfindung vorgesehen sind, werden üblicherweise mit Poly (A)-linked-Poly (B) bezeichnet, wobei Poly (A) ein polymerer Vernetzer für das Monomer B ist.

Chemisch vernetzte Polymere sind in allen Lösungsmitteln grundsätzlich unlöslich.

Gibt man jedoch ein Polymernetzwerk in ein Lösungsmittel, welches mit den Po- lymersegmenten gut verträglich ist, so dringt Lösungsmittel in die Probe ein. Das

Polymer quillt, bis sich ein Gleichgewicht zwischen dem osmotischen Druck des Lösungsmittels und der elastischen Rückstellkraft der Kettensegmente eingestellt hat. Ein gequollenes Netzwerk bezeichnet man als Gel.

Ist nun bei einem aus zwei Komponenten aufgebauten Netzwerk die eine Kompo- nente hydrophil und die andere hydrophob, so ist das Netzwerk in einem weiten Bereich von Zusammensetzungen sowohl in organischen Lösungsmitteln als auch in wäßrigen Medien quellbar. Man spricht dann von einem amphiphilen Netzwerk.

Die starke Unverträglichkeit zwischen den polaren und unpolaren Komponenten bzw. Kettensegmenten führt zu einer Phasenseparation, dabei verhindern aller- dings die kovalenten Bindungen zwischen den Segmenten eine makroskopische Phasentrennung, es kommt lediglich zu einer viel kleinräumigeren Trennung, und es bilden sich Domänen im Nanometerbereich. Die Netzwerke erscheinen da- durch makroskopisch homogen und optisch klar. Amphiphile Netzwerke sind aus miteinander nicht mischbaren, d. h. unverträglichen Polymerketten aufgebaut. Als häufigste Synthesestrategie ist im Stand der Technik die vorstehend diskutierte Makromonomermethode zu finden, welche die Copolymerisation eines Makromo- nomeren mit einem niedermolekularen Monomer vorsieht und, topologisch be- trachtet, zu segmentierten Netzwerken führt.

Die erfindungsgemäß verwendeten segmentierten amphiphilen Netzwerke können durch Copolymerisation eines Monomers (hydrophil oder hydrophob) mit einem Makromonomer (hydrophob oder hydrophil) bzw. durch Copolymerisation zweier Makromonomere unterschiedlicher Hydrophilie erzeugt werden. Vorzugsweise wird in Schritt (i) des erfindungsgemäßen Verfahrens ein hydrophobes Makromo- nomer mit einem hydrophilen Monomer copolymerisiert.

Die hydrophobe Komponente des segmentierten, amphiphilen Netzwerks unter- liegt keiner spezifischen Beschränkung. So können beispielsweise Monomere bzw. Komponenten auf Basis von Alkyl (meth) acrylaten (z. B. Methylmethacrylat, n- Butylmethcrylat, n-Hexylmethycrylat), Styrol, Vinylacetat, Olefinen (wie z. B. Pro- <BR> <BR> pylen, Ethylen, Isopren, Cyclooctadien, etc. ), Poly (s-Caprolacton), Milchsäure, Di- isocyanaten, Diolen, Diaminen, Disäuren, Polylactiden, Polypropylenfumarat,

Diglycidylethern von Bisphenol A, Poly-THF, Polyalkyloxazolinen (z. B. 2- Phenyloxazolin), Perfluorpolyethern oder Siloxane wie Dimethylsiloxan, etc., so- wie Copolymeren dieser Monomere zum Einsatz kommen. Im Rahmen der vorlie- genden Erfindung ist die hydrophobe Komponente des segmentierten, amphiphi- len Netzwerks vorzugsweise ein Polydialkylsiloxan-Makromonomer wie insbeson- dere ein Polydimethylsiloxan-Makromonomer. Das Molekulargewicht eines sol- chen Polydialkylsiloxan-Makromonomers unterliegt wiederum keiner spezifischen Beschränkung. Beispielsweise können Polydialkylsiloxan-Makromonomere wie z. B. Polydimethylsiloxan-Makromonomere mit einem Molekulargewicht Mn im Be- reich von 500 bis 1.000. 000 g/mol3 eingesetzt werden. Üblicherweise wird zur Synthese des segmentierten, amphiphilen Netzwerks ein a, cl- endgruppenfunktionalisiertes Polydialkylsiloxan-Makromonomer, beispielsweise ein bifunktionelles a, (o-Methacryloyloxypropyl-funktionalisiertes PDMS- Makromonomer (PDMS (MA) 2) mit einem Molekulargewicht Mn im Bereich von 500 bis 1.000. 000 g/mol3 eingesetzt.

Die hydrophile Komponente des segmentierten, amphiphilen Netzwerks unterliegt keiner spezifischen Beschränkung. So können beispielsweise Komponenten auf Basis von Monomeren, wie (Meth) acrylat und dessen Derivate, Diisocyanate, Diole, Diamine, Disäuren, Acylamid, N-Isopropylacrylamid, N-Vinylcaprolactam, 2, 3-Dihydroxypropylmethycrylat, Maleinsäure, Fumarsäure oder Vinylacetat, oder auf Basis von Makromonomeren wie Poly-1, 3-dioxolan, Polyethylenimin, Polypro- pylenimin, Polyethylenglycol, Polypropylenglycol und Polyoxazolinen mit Methacrylat-, Epoxy, Amino-, Isocyanato-oder Hydroxylendgruppen, etc., zum Einsatz kommen. Die hydrophile Komponente wird vorzugsweise aus (Meth) acrylsäure, (Meth) acrylat und deren Derivaten, insbesondere Hydroxyethyl- acrylat, Hydroxyethylmethacrylat, Dimethylacrylamid und Dimethylaminoethyl- methacrylat, ausgewählt. Mit den Bezeichnungen (Meth) acrylsäure bzw.

(Meth) acrylat sind hier im folgenden Acrylsäure und Methacrylsäure bzw. Acrylat und Methacrylat gemeint.

Selbstverständlich können auch amphiphile und nicht-amphiphile Blockcopolyme- re, Triblockcopolymere usw. (AB, ABA, BAB) als Bausteine zur Erzeugung des segmentierten, amphiphilen Netzwerks eingesetzt werden, und zwar mit Blöcken aus den vorgenannten Monomeren, beispielsweise ein unter dem Handelsnamen Pluronice erhältliches Polyethylenglycol-b-Polypropylenglycol-b-Polyethylenglycol.

Um zu verhindern, daß die starke Unverträglichkeit zwischen den unterschiedli- chen Kettensegmenten nicht schon bei der Synthese zu einer makroskopischen Phasentrennung führt, werden die erfindungsgemäß vorgesehenen amphiphilen Netzwerke üblicherweise nicht in Masse, sondern aus einer Lösung als Gele po- lymerisiert. Wenn die Monomere nicht miteinander mischbar sind und die Ver- wendung von Phasen vermittelnden Lösungsmitteln nicht ausreichend ist bzw. wenn eines der Monomere bereits in diesem unlöslich ist, so können in vorteil- hafter Weise Schutzgruppen-modifizierte Monomere eingesetzt werden. Diese können dann aus Lösung oder in Masse polymerisiert werden. Ein Beispiel für diese Strategie ist der Ersatz des hydrophilen Monomers Methacrylsäure (MAA) durch das hydrophobe Trimethylsilylmethacrylat (TMSMA), welches mit hydropho- ben Makromonomeren und organischen Lösungsmitteln gut verträglich ist. Es ent- stehen dann zunächst Vorläufernetzwerke, deren polare Kettensegmente Trime- thylsilyl-Schutzgruppen tragen. Um daraus ein segmentiertes, amphiphiles Netz- werk zu erhalten, werden die Schutzgruppen dann in einem zweiten Schritt durch Hydrolyse mit AlkohoI/Wasser-Gemischen abgespalten.

Vorzugsweise werden die in der vorliegenden Erfindung verwendbaren segmen- tierten, amphiphilen Netzwerke durch thermisch oder UV-initiierte radikalische Co- polymerisation von PDMS-Makromonomeren und (Meth) acrylaten- bzw. deren Derivate synthetisiert, wobei als hydrophile Komponenten vorzugsweise Methacrylsäure (MAA), Hydroxyethylmethacrylat (HEMA), Hydroxyethylacrylat (HEA) und Dimethylaminoethylmethacrylat (DMAEMA) zum Einsatz kommen.

MAA, HEMA und HEA können dabei in Form ihrer hydrophoben Trimethylsilyl- geschützten Derivate ins Polymernetzwerk inkorporiert werden, wonach das Vor- läufernetzwerk anschließend durch Entfernung der Schutzgruppen in ein segmen- tiertes, amphiphiles Netzwerk überführt wird.

Mittels der vorstehend ausgeführten Synthesestrategie können beispielsweise auch PHEMA-I-PIB bzw. PMAA-I-PIB basierende Netzwerke hergestellt werden.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung können die segmentierten, amphiphilen Netzwerke durch radikalische Copolyme- <BR> <BR> risation eines Polydimethylsiloxan (PDMS) -Makromonomers mit zwei Methacrylat- Endgruppen und des Monomers Hydroxyethylacrylat (HEA) hergestellt werden.

Ein derartiges Copolymerisat weist die gewünschte Phasenseparation auf. Wäh- rend die hydrophile Phase (Poly-HEA) selektiv in Wasser quillt, kann die hydro- phobe Phase (PDMS) in Lösungsmitteln wie Toluol oder n-Heptan gequollen wer- den. Derartige amphiphile Netzwerke können erfindungsgemäß mit Enzymen, wie beispielsweise Meerrettichperoxidase (HRP) oder Chlorperoxidase (CPO), bela- den werden, indem sie in einer wäßrigen Enzymlösung inkubiert werden. Nach dem Trocknen befindet sich das Enzym in der hydrophilen Phase des Netzwerks und zeigt bei einer HRP-katalysierten Reaktion wie beispielsweise der oxidativen Kupplung von Phenol und N, N-Dimethylphenylendiamin mit t-Butylhydroperoxid in n-Heptan gegenüber dem freien Enzym eine um mehr als das 40 bis 120-fache höhere Aktivität und eine bis dreimal höhere Stabilität. Bei der CPO-katalysierten Reaktion bezüglich der oxidativen Kupplung von Phenol und N, N- Dimethylphenylendiamin mit t-Butylhydroperoxid in n-Heptan wurde gegenüber dem freien Enzym eine um mehr als das 18-fache höhere Aktivität und eine bis zwanzigmal höhere Stabilität beobachtet. Eine derartig überraschende vorteilhafte Eigenschaft wird jedoch nicht bei einer Trägerung der jeweiligen Enzyme in Netz- werken, die aus PHEA und einem kurzkettigen Vernetzer aufgebaut sind und demgemäß keine Nanophasenseparation im erforderlichen Bereich zeigen, beob- achtet.

Die erfindungsgemäß verwendeten segmentierten, amphiphilen Netzwerke kön- nen in Form von Filmen bereitgestellt werden, welche mit dem Katalysator wie z. B. einem Enzym beladen sind, der wiederum durch den Einschluß in das seg- mentierte, amphiphile Polymernetzwerk stabilisiert und aktiviert wird und damit für Reaktionen in organischen Lösungsmitteln einsetzbar gemacht wird. Die erfin-

dungsgemäße Immobilisierung empfindlicher Katalysatoren wie z. B. Enzyme durch die Verwendung segmentierter amphiphiler Polymernetzwerke ermöglicht insbesondere, daß im organischen Lösungsmittel selektiv die hydrophobe Phase quillt, während sich die Enzymmoleküle in der hydrophilen Phase befinden und von dieser schützend umschlossen werden. Somit sind die hydrophilen Phasen und damit auch die Enzymmoleküle üblicherweise leicht für im organischen Lö- sungsmittel gelöste Substrate zugänglich, wodurch die Enzymaktivität gesteigert wird.

Bei Einlagerung solcher Enzyme in die erfindungsgemäß verwendeten segmen- tierten, amphiphilen Polymernetzwerke zeigen die beladenen Netzwerke, wenn als Film bereitgestellt, nach drei Wochen Lagerung bei 4°C keinen merklichen Aktivi- tätsverlust. Die Vorteile der erfindungsgemäßen Einlagerung von derartigen Kata- lysatoren, wie insbesondere Enzymen, gegenüber einer Trägerung an mikroporö- sen Materialien wie z. B. Silica, liegt insbesondere darin, daß es sich um ein orga- nisches Polymer handelt, welches das segmentierte, amphiphile Polymernetzwerk aufbaut, was eine beliebige Formgebung ermöglichen kann. Zudem ist die Kataly- satorverteilung im Trägermaterial viel feiner als bei entsprechenden mikroporösen Materialien, da Domänen im Nanometerbereich vorliegen und sich der Katalysator nicht nur auf einer inneren Oberfläche befindet, sondern direkt in eine der Phasen eingelagert ist. In Schritt (b) des erfindungsgemäßen Verfahrens kommt es inso- fern zu einer Anreicherung des Enzyms im Polymernetzwerk. Dies ist darauf zu- rückzuführen, daß Enzyme die Tendenz besitzen, sich an Oberflächen anzula- gern. Fasst man die Grenzflächen zwischen den hydrophilen und den hydropho- ben Bereichen bzw. Phasen des Netzwerkes als Oberfläche auf, so ergibt sich durch die Nanophasenseparation eine sehr große"innere"Oberfläche, an der sich die Enzyme im Vergleich zur Lösung aufkonzentrieren können. In Abhängigkeit von der Enzymkonzentration in der entsprechenden Lösung, mit welcher das Po- lymernetzwerk in Schritt (b) behandelt wird, und dem spezifischen chemischen Aufbau des gewählten segmentierten amphiphilen Polymernetzwerks werden übli- cherweise Beladungen im Bereich von 1 bis 100 pg Enzym, wie z. B. HRP, pro cm2 Polymernetzwerk (entspricht 0,5 mg/cm3 bis 500 mg/cm3) in der Form eines Films

erreicht. Die Quantifizierung der Enzymbeladung kann z. B. im Falle von Meerret- tichperoxidase durch UVNIS-Spektroskopie erfolgen.

Die meisten Enzyme sind üblicherweise in organischen Lösungsmitteln unlöslich.

Sie werden üblicherweise als Lyophilisat kristallin oder auf bestimmten Materialien geträgert eingesetzt. Bei den Trägermaterialien handelt es sich sehr häufig um mikroporöse Materialien wie Silica. Takahashi et al., Chemical Materials, 2000, Bd. 12, Seiten 3301-3305, beschreibt die Trägerung von Meerrettichperoxidase an Silica, wobei eine Steigerung der Aktivität um den Faktor 10 erreicht wird. Demge- genüber zeigt eine nach dem erfindungsgemäßen Verfahren stabilisierte Meerret- tichperoxidase in organischen Lösungsmitteln eine gegenüber dem reinen Enzym um das 120-fache gesteigerte Aktivität. Dies ist insbesondere darauf zurückzufüh- ren, daß das Enzym durch den Einschluß in die hydrophile Phase des segmen- tierten, amphiphilen Netzwerks"quasi-gelöst"vorliegt.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung des erfindungsgemäßen immobilisierten Katalysatorsystems in der organischen Syn- these, insbesondere der Wirkstoffsysnthese.

Noch ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung von segmentierten amphiphilen Polymernetzwerken, die eine Nanophasensepa- ration der jeweils aus der hydrophilen und der hydrophoben Komponente gebil- deten Einheiten im Bereich von 5 nm bis 500 nm aufweisen, zur Immobilisierung von Katalysatoren, wie insbesondere Enzymen.

Die vorliegende Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert.

Beispiele 1. Modifizierung von Glasoberflächen mit Methacrylatgruppen Mit einem Glasschneider wurden Objektträger (mit Mattrand, Länge : 7,6 cm) auf die Breite eines Tesafilms (1,5 cm) zurechtgeschnitten und anschließend mit Pi-

ranha-Lösung (45 ml konz. H2S04 und H202-Lösung (30 %) im Verhältnis 3 : 2) in einem Färbetrog und unter Einwirkung von Ultraschall angeätzt.

Anschließend wurden sie mit Wasser gespült und an Luft getrocknet. Die so vor- behandelten Objektträger wurden in einem Färbetrog mit einer Lösung von 3- Methacryloyltrimethoxysilan (50 ml, 20 Vol.-% in Toluol) versetzt und bei Raum- temperatur 2 h geschüttelt. Danach überführte man sie in einen weiteren, mit Wasser (50 ml) gefüllten Trog, behandelte sie für 5 min mit Ultraschall, tauschte das Wasser aus (50 ml) und behandelte erneut mit Ultraschall (5 min). Abschlie- ßend wurden die Objektträger mit Wasser gespült, an Luft getrocknet und über Nacht bei Raumtemperatur gelagert.

2. Herstellung dünner, kovalent an Oberflächen gebundener Filme Ein Monomergemisch für Polyhydroxyethylacrylat-l-polydimethylsiloxan-Filme (PHEA-I-PDMS) wurde hergestellt, indem der Photoinitiator Irgacure 651 (5 mg/ml) in frisch destilliertem Trimethylsilyloxyethylacrylat (TMSOEA) unter Schüt- teln gelöst, dazu PDMS5. 2 (MA) 2 gegeben und erneut kräftig geschüttelt wurde.

Auf einen unmodifizierten Objektträger wurde blasen-und faltenfrei ein Streifen Tesafilm geklebt und auf diesen das Monomergemisch (60 1ll) gleichmäßig aufge- tragen. Anschließend wurde ein"silanisierter"Objektträger parallel zum Tesafilm unter Vermeidung eines Luftblaseneinschlusses auf das Monomergemisch gelegt.

Die Polymerisation erfolgte durch Bestrahlen mit einer handelsüblichen UV- Polymerisationslampe (Heraflash der Fa. Heraeus Kulzer) (2 x 180 s von jeder Seite mit jeweils 30 s Abkühlzeit zwischen den Belichtungen ; Gesamtbelichtungs- zeit : 720 s). Der Tesafilm wurde dann mitsamt dessen Träger vorsichtig von dem amphiphilen Film gelöst und letzterer in ein MeOH/H20 Gemisch (9 ml pro Ob- jektträger, 1 : 1) gegeben. Darin wurde er bei Raumtemperatur für mindestens 12 h unter Schütteln und mit zweimaligen Wechseln des Lösungsmittels inkubiert. An- schließend wurden die geträgerten Filme mit MeOH gewaschen und im Trocken- schrank (50 mbar, 60°C) bis zur Gewichtskonstanz getrocknet.

Auf diese Weise wurden PHEA-I-PDMS-Filme der Zusammensetzung 91/9, 77/23, 50/50,41/59 bzw. 9/91 hergestellt.

3. Herstellung dünner, ungeträgerter PHEA-I-PDMS-Filme Es wurden ungeträgerte PHEA-I-PDMS-Filme der Zusammensetzung 90/10, 77/23,50/50, 30/70 bzw. 10/90 hergestellt. Die Synthese erfolgte analog zu der oben für die Herstellung von kovalent an Träger gebundene Filme beschriebenen Methode. Anstelle eines oberflächenmodifizierten Objektträgers wurde ein unmo- difizierter verwendet, der Film ließ sich nach dem Entschützen in MeOH/Wasser von diesem im Wasserbad trennnen. Anschließend wurde er auf eine Teflonfolie überführt und auf dieser zunächst an Luft, später im Trockenschrank (50 mbar, 60°C) getrocknet.

4. Beladung von dünnen, kovalent an Träger gebundenen amphiphilen Netzwerken mit Enzymen Von den vorstehend erhaltenen Filmen wurde das Mattrandende des Objektträ- gers mit einem Glasschneider entfernt, die Träger mit dem Film nach oben zei- gend in eine eigens dafür gefertigte Teflonwanne (Innenabmessungen : 5,7 x 1,7 cm, Tiefe : 1,5 cm) gelegt und mit Enzymlösung (2 ml, c = 1 mg/ml bzw. 25 llmolA, Meerrettichperoxidase (HRP) in Phosphatpuffer (0,1 M, pH 7) versetzt. Anschlie- ßend wurde bei T = 4°C unter Schütteln für mindestens 16 h inkubiert, dann der Film aus dem Beladungsbad genommen, mit einem Papiertuch getrocknet, mit Phosphatpuffer gespült (3 x 5 ml) und erneut mit einem Papiertuch getrocknet.

Zum abschließenden Trocknen wurde der beladene Film an Luft stehen gelassen (30 min). Die Lagerung der Filme erfolgte bei 4°C.

5. Aktivitätsbestimmung geträqerter und suspendierter HRP am Beispiel der oxidativen Kupplung von Dimethvlaminoanilin und Phenol in Heptan Aktivitätsassays mit Dimethylaminoanilin und Phenol wurden in n-Heptan durch- geführt. Es wurden die folgenden Lösungen angesetzt : 1. Dimethylaminoanilin-Lösung (2,724 mg/ml, 20,00 mM in n-Heptan) 2. Phenol-Lösung (1,882 mg/ml, 20,00 mM in n-Heptan) 3. teff-Butylhydroperoxid (10 mM in n-Heptan) : 9,10 zizi einer tert-BuOOH-Lösung (ca. 5,5 M in Dekan) wurden mit Heptan auf 5 ml aufgefüllt. <BR> <BR> <P>Die Konzentrationen im Assayvolumen betrugen (s. u. ) : c (Dimethylaminoanilin) = 1,67 mM, c (Phenol) = 1,67 mM, c (H202 bzw. t-BuOOH) = 0,83 mM.

Aktivitätsassay von HRP-beladenen amphiphilen Filmen : Aktivitätsassays wurden mit HRP-beladenen PHEA-I-PDMS-Filmstücken der Zu- sammensetzung 77/23 (A (Film) = 0,7-1, 3 cm2) in n-Heptan durchgeführt. Die Flächenkonzentration an HRP lag zwischen 10 bis 24 ug/cm2. Für den Blinder- such wurde ein mit Trypsin beladenes PHEA-I-PDMS (77/23)-Filmstück verwen- det. Die Filmstücke wurden in eine Küvette (d = 1 cm) gegeben, Lösungsmittel (1,8 ml), Dimethylaminoanilin-Lösung (200 tl) und Phenol-Lösung (200 1li) zuge- setzt und die Reaktion durch Zugabe von t-Bu00H-Lösung (200 pilz gestartet. Die Aktivität des Enzyms wurde durch die Zunahme der Absorption im Absorptions- maximum des gebildeten Farbstoffes (BmaX = 546 nm) gegen reines Lösungsmittel als Hintergrund gemessen. Dazu wurde die Reaktionslösung mit einem Rührfisch gerührt und in regelmäßigen Abständen (60 s bzw. 5 min) die Absorption aufge- zeichnet.

Aus dem linearen Bereich der Reaktionen (tRxn = 30-70 min) kann unter Berück- sichtigung der Blindreaktion nach der folgenden Gleichung die spezifische Aktivi- tät bestimmt werden :

AA546nm _ hABIind, 546nm zspez = At At-. 1000 IU/itgl A (Film)'CFläche Eine Unit wurde definiert als die Zunahme der Absorption im Absorptionsmaxi- mum um 0,001 pro Minute bei einem Reaktionsvolumen von 2,4 ml und einer Schichtdicke von 1 cm.

Die spezifischen Aktivitäten der geträgerten HRP betrugen 0,02 bis 0,05 U/g En- zym, während das Enzym über einen Zeitraum von ca. 40 min keine Abnahme der Aktivität zeigte.

Aktivitätsassay von ungeträgerter HRP Die Aktivität von ungeträgerter HRP wurde in n-Heptan in zwei Versuchen mit un- terschiedlichen Enzymmengen bestimmt (350 pg und 740 fig). Für jeden dieser Versuche wurde in mehreren Rollrandgläsern die gleiche Enzymmenge eingewo- gen und jeweils 1,8 ml Heptan (auf 25 °C temperiert) zugegeben. Anschließend suspendierte man das Lyophilisat durch kurze Ultraschallbehandlung gab Dime- thylaminoanilin-Lösung (je 200 lli) und Phenol-Lösung (je 200 ; J) zu und startete die Reaktionen simultan durch Zugabe von t-BuOOH-Lösung (je 200 pI). Man rührte kräftig bei 25 °C. In zeitlichen Abständen von zunächst 2 bis 5 min und ab einer Reaktionszeit von 20 min wurde jeweils einer der Ansätze durch einen Sprit- zenfilter filtriert und die Absorption des Filtrats bei 546 nm gemessen (Schichtdicke 1 cm).

Die spezifische Aktivität ergibt sich gemäß nachstehender Gleichung unter Be- rücksichtigung der Blindreaktion (s. o. ) aus dem linearen Bereich der Reaktionen (t, " = 30-45 min) M546nm tABIind, 546nm z = At At 1000 [U/Rg] ru (HRP)

Die spezifische Aktivität von suspendierter HRP lag bei 0,0004 bis 0,0005 U/ug Enzym, während die Aktivität über ca. 20 min keine Abnahme der Aktivität zeigte.

Ähnliche Ergebnisse wurden bei Verwendung von Chlorperoxidase (CPO) als Katalysator bzw. Enzym erzielt.

Beladung von PHEA-I-PDMS-Filmen mit weiteren Enzymen bzw. Peptiden : Durchführung : siehe Ausführungsbeispiel für Meerrettichperoxidase Lösungen jeweils in Acetatpuffer (pH 5,0, 0,1 M) Trypsin : 1 mg/ml, 421lmol/ml Myoglobin : 1 mg/ml, 53 limol/mol Hämoglobin : 1 mg/ml, 15, 5 tmoi/ml Trypsin-Aktivitätsassay : Die Aktivität von Trypsin wurde durch die Aminolyse von Na-Benzoyi-L-Arginin-p- Nitroanilid (Bz-L-Arg-NH-Np) durch L-Leucinamid (L-LeuNH2) in Toluol bei Raum- temperatur bestimmt. Dazu wurden 7 lli einer 50 mM Bz-L-Arg-NH-Np- Hydrochlorid-Lösung in MeOH zu Toluol (875 ul) gegeben und ein Wassergehalt von 50 mM durch Zugabe von 18 lli einer wasserhaltigen Acetonlösung (5 Vol.-% Wasser) eingestellt. Nach Zugabe des Katalysators (Trypsin in PHEA-I-PDMS bzw. natives Trypsin) wurde die Reaktion durch die Zugabe von 100 pl einer 100 mM L-LeuNH2-Lösung in Toluol, die 2 vol% MeOH enthielt, gestartet. Die Reakti- on wurde durch die Zunahme der Absorption bei 349 nm verfolgt, als Hintergrund diente eine Blindreaktion, zu der ein unbeladenes PHEA-I-PDMS-Polymer zuge- geben wurde.

Trypsin in PHEA-I-PDMS (77 Gew. % PHEA) zeigte nach 24 h einen um 3 Grö- ßenordnungen höheren Umsatz pro Menge Enzym als ungeträgertes natives Trypsin.