Область техники

Изобретение представляет собой группу изобретений и относится к области медицины, а именно к средствам и способам лечения и профилактики демиелинизирующих заболеваний живого организма, в том числе рассеянного склероза и состояний, связанных с демиелинизацией, полинейропатией и/или симптомов или признаков таких состояний.

Предшествующий уровень техники

Демиелинизирующие заболевания (далее ДЗ) относятся к числу аутоиммунных болезней, основным патоморфологическим проявлением которых считается разрушение миелина белого или серого вещества центральной и/или периферической нервной системы (далее ЦНС, ПНС). В последние годы во всем мире отмечается устойчивая тенденция к увеличению частоты ДЗ, растет число случаев с клиническим началом у детей и у взрослых в возрасте старше 45 лет, изменился характер течения

ДЗ.

В настоящее время доказано, что в основе этиологии ДЗ лежит взаимодействие факторов внешней среды и наследственной предрасположенности организма. Среди внешних факторов наибольшее значение имеют вирусы (Эпштейна— Барра, герпеса, кори, краснухи, ретровирусы), хроническая бактериальная и кампилобактерная инфекции, интоксикации (растворители, бензин, металлы), особенности питания (преобладание в диете животных жиров и белков), психоэмоциональный стресс, ухудшение экологической обстановки [Завалишин И.А., Жученко Т.Д., Переседова А. В. Вестник Российской академии медицинских наук., N°7, 2001 , С. 18-22]. Патогенетические механизмы ДЗ сходны и заключаются в развитии аутоиммунных реакций на нейроантигены, в качестве которых выступает ряд белков и липидов миелиновой оболочки. Исходным механизмом развития этих заболеваний является активация периферических Т-лимфоцитов, специфичных к основному белку миелина (МВР, myelin basic protein). Возможны несколько путей активации: 1) за счет молекулярной мимикрии, когда антигенная структура бактерий или вирусов оказывается сходной с МВР, поэтому рецепторы Т-клетки перестают различать «свои» и «чужие» антигены; 2) Т-клетки могут активироваться неспецифическим путем за счет высокой локальной концентрации цитокинов, сопровождающей любую воспалительную реакцию. Следующим этапом патологического процесса является проникновение аутореактивных лимфоцитов через гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) посредством увеличения экспрессии молекул адгезии. Проникшие в нервную систему Т-клетки выделяют провоспалительные цитокины (гамма-интерферон, лимфотоксин, ФНО-а). На этом фоне за счет резкого увеличения числа медиаторов воспаления быстро меняется микроокружение мозга, в ответ образуются антимиелиновые антитела. Заключительным этапом является гибель олигодендроцитов, развитие процесса демиелинизации вследствие активации системы комплемента, макрофагов, микроглии и фагоцитоза поврежденных структур.

Одним из серьезных демиелинизирующих заболеваний является рассеянный склероз (далее PC), который относится к числу наиболее часто встречающихся. Особенность болезни - одновременное поражение нескольких отделов ЦНС, что проявляется разнообразной неврологической симптоматикой. Для 85-90% больных на ранних стадиях характерно ремитирующее (волнообразное) течение, которое в последующем, как правило, сменяется прогредиентным. Кроме того, неясны конкретные причины возникновения заболевания, принято считать, что PC является мультифакторным заболеванием, возникающим у людей имеющих генетическую предрасположенность, а также попавших под воздействие какого-либо внешнего фактора. Как правило, процессам демиелинизации и воспаления предшествуют биохимические изменения, включающие нитрификацию и оксидативный стресс митохондриальных белков дыхательных комплексов, которые приводят к падению митоходриального потенциала и апоптозу нейронов. Миелин специфичные Т- лимфоциты вызывают повреждение митохондриальных макромолекул, тем самым обрывая дыхательную цепь митохондрий и снижая синтез АТФ, а также вызывая апоптоз. [Bernadette Kalman et. all. The involvement of mitochondria in the pathogenesis of multiple sclerosis.// Journal of Neuroimmunology N 188, 2007, p. 1-12]. Оксид азота (NO) - это свободный радикал, концентрация которого повышается при воспалительном процессе во время развития рассеянного склероза и играет важную роль в нарушении гематоэнцефалического барьера (ГЭБ), а также в процессе демиелинизации и гибели олигодендроцитов и потере аксонов. Миелин является белым веществом мозга, покрывающим аксоны нейронов, и способствует эффективной проводимости нервных импульсов между головным мозгом и другими частями тела. Потеря миелина (т.е. демиелинизация) или аномальный состав миелина может быть связан со снижением скорости или активности процессов в нервной системе и последующим ухудшением когнитивной функции. Миелиновая оболочка - это особый вид клеточной мембраны, окружающей отростки нервных клеток в основном аксоны в ЦНС и ПНС. Основные функции миелина: питание аксона, изоляция и ускорение проведения нервного импульса и сохранения ионных потоков путем сокращения емкости мембраны, а также опорная и барьерная функции. Это липопротеидная мембрана, состоящая из бимолекулярного липидного слоя, расположенного между мономолекулярными слоями белков, спирально закрученная вокруг нервного волокна. Миелины ЦНС и ПНС отличаются по своему химическому составу. В ПНС миелин синтезируется шванновскими клетками. Миелин ПНС заметно толще, чем в ЦНС. В ЦНС миелин синтезируется олигодендроцитами, причем одна клетка принимает участие в миелинизации нескольких волокон [Хухо Ф. Нейрохимия: основы и принципы: Перевод с англ. - М: Мир, 1990, 384с]. Разрушение миелина является универсальным механизмом реакции нервной ткани на повреждение. PC с точки зрения патогенеза рассматривался как воспалительное демиелинизирующее заболевание, при котором первичными мишенями деструктивного процесса являются миелиновая оболочка и олигодендроциты.

Иммунологические изменения при PC проявляются отклонениями клеточного и гуморального иммунитета. Со стороны клеточной реактивности определяются: снижение содержания Т-клеток супрессоров, подавление Т-клеточного ответа на митогены, изменение продукции интерферонов, увеличение цитотоксичности мононуклеарных клеток, изменения в системе интерлейкинов. Участие цитокинов разнонаправленного действия в патогенезе PC многократно показано в экспериментальных исследованиях. Фактор некроза опухолей-α (ФНО-а) считается классическим противовоспалительным цитокином, но недавно было показано, что этот цитокин обладает существенным противовоспалительным и нейропротективным эффектом при демиелинизирующих болезнях [TNF neutralization in MS: results of a randomized, placebo-controlled multicenter study. The Lenercept Multiple Sclerosis Study Group and The University of British Columbia MS/MRI Analysis Group.// Neurology, 53, 1999, P. 457-465]. Клинические проявления PC являются следствием развития демиелинизирующих очагов воспаления в ЦНС. Аутоиммунная природа этого заболевания имеет как экспериментальные, так и клинические подтверждения. При PC аутоиммунная агрессия может быть направлена на основной белок миелина (МВР), myelin basic protein), протеолипидный протеин (PLP, proteolipid protein), связанный с миелином гликопротеин (MAG, myelin-associated glycoprotein), миелиновый олигодендроцитный гликопротеин (MOG, myelin oligodendrocyte glycoprotein) и, возможно, другие миелиновые антигены [Zhang J. Т cell vaccination as an immunotherapy for autoimmune diseases. // Cell. Mol. Immunol. 2004; 1 : P. 321— 7]. Формирующиеся при PC в белом веществе головного и спинного мозга патологические очаги называются бляшками. Ведущая черта этих очагов - демиелинизация. Активация резидентных клеток ЦНС - микроглии и астроглии - стимулирует секрецию ими цитокинов и хемокинов (факторов, привлекающих клетки в очаг воспаления). В очаги мигрируют клетки гематогенного происхождения - моноциты/макрофаги, Т - и В-лимфоциты. Так начинается формирование бляшки. В очаге воспаления клетки секретируют множество активных молекул: цитокины, антитела, кислородные и азотные радикалы, протеазы. Эти молекулы являются основными факторами повреждения олигодендроцитов и миелина. Повторное обострение проявляется воспалением по периферии зоны глиоза, очаг увеличивается в размерах. Наряду с этим появляются новые очаги, а некоторые могут регрессировать. При гистологическом исследовании острых очагов выявляют частичную или полную деструкцию и потерю миелина. Аксональные окончания, в целом остаются интактными. Кроме демиелинизации, для бляшек характерна нейроглиальная реакция и инфильтрация мононуклеарными клетками (лимфоцитами и макрофагами). Хронические повреждения представлены, преимущественно, глиозом [Homes J, Madgwick Т, Bates D. The cost of multiple sclerosis.// Br. J. Med. Econ., 1995; 18: 181-93].

Исследования последнего десятилетия показали, что при PC происходит повреждение аксонов и нейронов, степень выраженности которого варьирует по интенсивности в различных очагах поражения у одного пациента, а также при сравнении очагов у разных больных PC. [Нейро дегенеративный процесс при рассеянном склерозе и возможный нейропротективный эффект терапии β- интерфероном 1а (авонекс). М. В. Давыдовская, А. Н. Бойко, А.Е. Подопригора, И. Н. Пронин, В. Н. Корниенко, Е.И. Гусев.// Журнал неврологии и психиатрии. Ν°9. Вып. 2, 2012, С. 129-135].

Течение PC очень индивидуально - нет двух больных с одинаковыми клиническими проявлениями патологического процесса. В большинстве случаев, после определенного периода времени, индивидуального для каждого больного, ремитирующее течение PC переходит во вторично-прогрессирующее с постепенным углублением неврологического дефицита, сокращением периодов клинической стабилизации, инвалидизацией пациентов.

В целом клинические проявления PC могут быть разделены на 7 основных групп:

1) поражение пирамидной системы с геми -, пара - и тетрапарезами с соответствующим повышением сухожильных рефлексов и патологическими пирамидными симптомами;

2) поражение мозжечка и его путей с развитием статической и динамической атаксии, мышечной гипотонии;

3) нарушения чувствительности, в начале глубокой, с развитием сенситивной атаксии и сенситивных парезов, а затем болевой и температурной по проводниковому типу;

4) поражение белого вещества ствола мозга с различными нарушениями черепной иннервации, чаще всего с развитием глазодвигательных симптомов, поражением лицевого нерва (периферический парез мышц лица);

5) невриты зрительного нерва (в том числе ретробульбарные невриты) со снижением остроты зрения и появлением скотом;

6) нарушения функции тазовых органов, чаще по типу императивных позывов, задержек мочеиспускания, в последующем до недержания мочи;

7) нейропсихологические изменения, ослабление памяти, эйфория или депрессия, характерен синдром хронической усталости.

В большинстве случаев у больных имеются симптомы поражения и головного, и спинного мозга (цереброспинальная форма). В некоторых случаях в клинической картине преобладают симптомы поражения спинного мозга (спинальная форма) или мозжечка (мозжечковая или гиперкинетическая форма). В последнем случае интенционное дрожание может быть настолько выраженным, что достигает степени гиперкинеза и делает невозможным любое целенаправленное движение. Возникают дисметрия, адиадохокинез, скандированная речь, выраженная атаксия. Магнитно- резонансная томография (МРТ) головного и спинного мозга в настоящее время является одним из наиболее информативных методов исследования. Характерным для ДЗ считается обнаружение в Т2- и протонных режимах очагов повышенной интенсивности круглой или овальной формы, различных размеров (от 3 мм до 3 см), расположенных в любых зонах мозга.

К другим демиелинизирующим заболеваниям относятся также ДЗ периферической нервной системы - острое начало (синдром Гийена-Барре (СГБ) встречается в любом возрасте (в 2 раза чаще у мужчин). Хроническая воспалительная демиелинизирующая полиневропатия (ХВДП) имеет два пика начала болезни: в 40— 50 лет и после 70 лет (менее выражена), в 3 раза чаще у мужчин. ХВДП диагностируется при наличии двух облигатных клинических признаков:

1 ) прогрессирующая либо рецидивирующая слабость в конечностях продолжительностью свыше 6 месяцев;

2) гипо - или арефлексия во всех четырех конечностях.

К отличительным клиническим признакам ХВДП относятся:

-преимущественно дистальный или смешанный (дистальный и проксимальный) характер парезов конечностей;

-выраженная мышечная гипотония и гипотрофия рук и ног;

-более частые и стойкие чувствительные и вегетативные нарушения в конечностях;

-крайне редко - присоединение дыхательных и тазовых расстройств.

Прогноз ХВДП менее благоприятный и зависит от типа течения

(прогрессирующего, прогредиентно-ремитирующего, регрессирующего, стационарного), а также возможного вовлечения в процесс структур ЦНС. Спустя год 30-60% больных утрачивают трудоспособность [Пирадов М.А. // Неврол. Журнал, N° 2, 2001 , С. 4 - 9].

Наследственная моторно-сенсорная полинейропатия I типа (болезнь Шарко-

Мари) патоморфологически является демиелинизирующим заболеванием. Полиневропатия, ассоциированная с анти-MAG (миелин-ассоциированный гликопротеин) моноклональной гаммапатией недавно выделена в самостоятельную нозологическую форму и клинически проявляется изолированно сенсорными нарушениями в конечностях. [Leger J.-M., Salachas F. // Eur. J. Neurol. 2001, N 8, P. 201—209].

Электронейромиография позволяет выявить признаки деструкции миелина и аксональную дегенерацию. Наиболее характерные изменения - значительное снижение скорости проведения импульса по периферическим нервам, увеличение дистальнои латенции, изменение формы М-ответа, задержка F-волны. Использование специальной методики симпатического кожного вызванного потенциала позволяет количественно оценить степень вегетативных нарушений в конечностях.

Несмотря на многочисленные исследования, этиология заболевания до сих пор остается неясной. Терапия рассеянного склероза заключается в своевременном адекватном купировании обострений, назначении препаратов, замедляющих прогрессирование болезни путем предупреждения обострений.

Известно, что лечение PC сводилось к купированию обострений заболевания с помощью препаратов кортикостероидной группы с целью подавления активности иммунной системы и проведению симптоматической терапии. Чаще всего используется метилпреднизолон, который вводится внутривенно капельно в дозе 1000 - 2000 мг в день (на 400-500 мл физиологического раствора) в течение 3-10 дней в зависимости от тяжести обострения [F. Barkhof et al. Comparison of MRI criteria at first presentation to predict conversion to clinically definite multiple sclerosis.// Brain. 1997, V.120, Р.2059-2069].

Однако гормональные препараты имеют ряд побочных действий [Bashir К., Buchward L., Coyle Р. К. Optimizing immunomodulatory therapy for MS patients // Int. JMCS Care. 2002, Vol. 4., P. 3-7]. Препараты, обладающие цитостатическим и антипролиферативным эффектом, а также общее облучение лимфоцитов, применяют, как правило, при злокачественном, неуклонно прогрессирующем PC у пациентов с непереносимостью кортикостероидов. Наибольшее количество исследований эффективности цитостатиков для лечения рассеянного склероза проводилось с использованием азатиоприна. Анализ контролируемых исследований показал незначительное, но статистически достоверное снижение частоты обострений после 2-3 лет терапии, некоторое замедление инвалидизации больных по сравнению с контрольной плацебо-группой (около 0,2 баллов по шкале EDSS за 2 года) [А.А. Порываева, О применении цитостатиков в лечении рассеянного склероза.// Современные наукоемкие технологии. N°l, 2005, С. 72-73].

Однако, применение таких цитостатиков связано с наличием серьезных побочных эффектов этой группы препаратов [Bashir К., Buchward L., Coyle Р. К. Optimizing immunomodulatory therapy for MS patients. // Int. JMCS Care. 2002, Vol. 4, P. 3-7]. B 90-х годах появились превентивные препараты патогенетической направленности, которые в значительной мере сокращают число обострений PC и замедляют его развитие, но, к сожалению, не приводят к полному выздоровлению. Это иммуномодулирующие средства, которые хорошо зарекомендовали себя в клинической практике.

К ним относятся интерфероны бета (интерферон бета- lb, интерферон бета- 1а) и препараты на их основе (бетаферон, ребиф, авонекс) и глатирамера ацетат. Все эти препараты являются средствами первого ряда, рекомендуемыми к назначению больным с ремитирующей формой течения PC при легкой и средней степени инвалидизации. Эти препараты, обладая совершенно различными механизмами действия, приводят к сокращению частоты обострений на 30-35% [Freedman М, Hughes В., Mikol D. et al. Efficacy of disease-modifying therapies in relapsing-remitting multiple sclerosis: a systematic comparison. // Eur.Neurol., 2008, v.60, p. 1-1 1]. Все эти иммуномодуляторы должны применяться постоянно, вводятся в виде инъекций и обладают определенным спектром нежелательных явлений.

Однако, наиболее значимым нежелательным явлением, возникающим при применении интерферонов бета, является гриппоподобный синдром с повышением температуры, головными и мышечньми болями, который возникает после введения препарата и иногда длится достаточно долго.

При применении глатирамера (копаксон) возникают также побочные явления в виде системных постинъекционных реакций, проявляющиеся в виде вегетативных кризов, и атрофии жировой клетчатки в местах введения препарата. Применение иммуномодуляторов первого ряда не у всех пациентов приводит к желаемому результату. Это обусловлено целым рядом причин и прежде всего - генетическими особенностями различных пациентов. Кроме того, применение интерферонов бета в ряде случаев сопровождается образованием нейтрализующих антител, снижающих биологическую активность препаратов [Vartanian Т., Sorensen P., Rice G. Impact of neutralizing antibodies on the clinical effect of interferon beta in multiple sclerosis. //J. Neurol., 2004, 251 , suppl. 2, 25-30]. Значимым фактором недостаточного ответа на терапию является и неполная приверженность лечению из-за боязни инъекций, «усталости» от постоянного многолетнего инъекционного введения препарата или непереносимых побочных явлений [Gold R. Adherence to treatment: value of patient support. // Cl.Trends in Neurol.,2005, v.l , p. l 1-14]. Известно применение препарата финголимод (Гилениа) производства компании «Новартис», который применятся сравнительно недавно. Он был разрешен к применению в США (с 2010 года), Европе (с 2011 года) и в России (с 2010 года). Препарат является производным мириоцина и выделяется из грибка Saria sinclairii, используемого в традиционном лечении травами. С помощью сфингозин-киназы он в печени превращается в активный метаболит - финголимод фосфат. Финголимод является модулятором 4 из 5 известных сфингозин-фосфатных рецепторов [Dominguez М., Casals D., Sabate М. Et al. Prediction of pharmacokinetic/pharmacodynamic behaviour in humans of LAS 189913, a SI PI receptors agonist, based on preclinical studies in three animal species./ Mult.Scl, 2010, V.16, suppl. 10, S 150, P 453], которые представлены в разных тканях, но особенно широко в лимфоцитах, клетках центральной и периферической нервной системы.

Количество циркулирующих в крови «аутоагрессивных» Т-клеток уменьшается и степень воспалительных изменений в ЦНС снижается. Кроме того, показано, что финголимод, будучи липофильным по природе, проникает через гематоэнцефалический барьер в центральную нервную систему, где действует на сфингозин-1 фосфатные рецепторы клеток глии и нейронов, оказывая нейропротекторный эффект [Osinde М., Mullershausen F., Dev К. Phosphorylated FTY720 stimulates ERK phosphorylation in astrocytes via SIP receptors. // Neuropharm., 2007, v.52, p. 1210-1218]. Однако, при его использовании часто наблюдаются побочные нежелательные явления - головная боль, диспноэ, диарея, тошнота.

Впервые 3-4 месяца лечения уровень печеночных ферментов может возрастать. Нормализация его происходит примерно через 2 мес. после прекращения приема препарата. Финголимод обладает эффектом «первой дозы», приводя в дозе 0,5 мг к симптоматической брадикардии примерно у 0,5% пациентов, поэтому применение финголимода требует наблюдения за пациентом в течение 6 часов после применения первой дозы препарата. Перед назначением препарата и через 3-4 месяца после начала его применения необходим осмотр окулиста, т.к. прием финголимода в дозе 0,5 мг приводил к развитию отека макулы глаза у 0,3% пациентов. Особого внимания требуют пациенты, страдающие сахарным диабетом и имеющие в анамнезе увеит. [Рекомендации по использованию новых препаратов (тизабри, гилениа, мовектро) для патогенетического лечения рассеянного склероза. Всероссийское Общество Неврологов. Секция по демиелинизирующим заболеваниям. Москва, 2011]. Известно, что для лечения PC предложено использовать трансплантацию стволовых клеток костного мозга, но это связано с риском повторной аутоиммунизации организма, а с другой стороны, более высокой смертности при аллотрансплантации (15-35%), чем при аутоиммунизации (3-10%). Для лечения PC также предлагается гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор [Заявка 201 1145434, публикация РСТ WO 2010/128035, 2010.1 1.1 1]. Для лечения рецидивирующего рассеянного склероза предлагаются препараты на основе моноклональных антител - Lemtrada (Лемтрада, алемтузума) [Coles A.J,et al. Alemtuzumab vs interferon beta- la in early multiple sclerosis. //New England Journal of Medicine 2008; 359: 1786-1801]. Однако, появляются значимые побочные явления в клинике - это идиопатическая тромбоцитопеническая пурпура - заболевание, которое нарушает процессы свертываемости крови, оно было фатальным в одном случае и отмечалось у 1-3% участников, и нарушение функции щитовидной железы у 20-30% больных.

Однако, если учесть, что PC продолжается довольно продолжительное время, то эти средства и методы лечения могут оказаться очень дорогостоящими и недоступны всем пациентам. Так, на сегодняшний день затраты на лечение больных в умеренной стадии в европейских странах колеблются от€ 28524 до€ 43948 в год. [Россия, Медицинские новости. 2002, б, С. 3-7].

Наиболее близким аналогом к заявляемому изобретению является патент US N°

2444356, который предлагает использовать полиненасыщенные жирные кислоты для лечения деменции. Вариант осуществления этого изобретения относится к способу задержки демиелинизации или уменьшению тяжести демиелинизации у индивидуума. Способ включает введение индивидууму комбинации полиненасыщенных жирных кислот (PUFA) или их предшественников, или источников для задержки демиелинизации, или уменьшения тяжести демиелинизации.

Однако, полиненасыщенные жирные кислоты могут рассматриваться как вспомогательные средства в основном для профилактики демиелинизирующих состояний, но не для лечения. Кроме того, полиненасыщенные жирные кислоты и масла, в которых они растворены, обычно отличаются нестабильностью и переходят в трансформу, которая уже оказывается вредна для человека, в частности, они повышают внутриглазное давление у людей, предрасположенных к глаукоме. Рацион с более высоким содержанием полиненасыщенных жиров, чем насыщенных (животных) чаще приводит к желчекаменной болезни и может вызывать спазмы желчного пузыря, связанные с загустением желчи. [Мэри Ден Идз. Витамины и минеральные вещества: Полный медицинский справочник. 2 изд.- Санкт-Петербург, 1996, 503с]. Поэтому продолжительное введение полиненасыщенных жирных кислот для профилактики и лечения демиелинизирующих заболеваний может рассматриваться как превентивная мера.

Раскрытие изобретения

Задачи, на решение которых направлено изобретение, заключаются в создании нового лекарственного средства, новой фармацевтической композиции и нового способа лечения, включая профилактику демиелинизирующих заболеваний.

Технический результат изобретения заключается в получении минимального побочного эффекта при применении нового лекарственного средства и новой фармацевтической композиции растительного происхождения, созданных на основе принципиально нового класса соединений - полипренолов (длинноцепочечных полиизопреноидных спиртов), в способе лечения демиелинизирующих заболеваний живого организма, включая профилактику заболеваний, в том числе рассеянного склероза и состояний, связанных с демиелинизацией, и/или симптомов или признаков таких состояний.

Поставленные задачи решены следующим образом.

Полипренолы формулы (1)

СН ₃ СН ₃

Н - (СН ₂ - С = СН - СН ₂ ) _П - СН ₂ - С = СН - СН ₂ ОН, где п = 8-20

были применены в качестве активного ингредиента для производства лекарственного средства для лечения демиелинизирующих заболеваний живого организма.

Полипренолы формулы (1)

СН ₃ СН ₃

I I

Н - (СН ₂ - С = СН - СН ₂ )„ - СН ₂ - С = СН - СН ₂ ОН, где п = 8-20

были применены в качестве активного ингредиента для производства лекарственного средства для профилактики демиелинизирующих заболеваний 0459

- 12 - живого организма.

Лекарственное средство для лечения демиелинизирующих заболеваний живого организма, включая профилактику заболевания, отличается тем, что представляет собой полипренолы формулы (1)

СН ₃ СН ₃

Н - (СН ₂ - С = СН - СН ₂ ) _П - СН ₂ - С = СН - СН ₂ ОН, где п = 8-20.

Фармацевтическая композиция для лечения демиелинизирующих заболеваний живого организма, включая профилактику заболевания, отличается тем, что включает эффективное количество полипренолов формулы (1)

СН ₃ СН ₃

Н - (СН ₂ - С = СН - СН ₂ ) _П - СН ₂ - С = СН - СН ₂ ОН, где п = 8-20

и фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества, включая носители, и/или растворители, добавки и/или лубриканты.

Фармацевтическая композиция может быть выполнена в виде раствора, суспензии, капсулы, таблетки, гранулы, свечи.

Способ лечения демиелинизирующих заболеваний живого организма, включая профилактику заболевания, отличается тем, что в живой организм вводят эффективное количество полипренолов формулы (1)

СН ₃ СН ₃

Н - (СН ₂ - С = СН - СН ₂ ) _П - СН ₂ - С = СН - СН ₂ ОН, где п = 8-20

в виде самостоятельного препарата или в виде фармацевтической композиции, дополнительно включающей вспомогательные ингредиенты.

Указанные выше полипренолы выделяют из хвойных пород, в том числе, из древесной зелени хвои сосны и ели, пихты, гингко билобы.

Применение полипренолов по формуле (1) возможно в комплексной терапии совместно с ремиелинизирующим средством и противовоспалительным средством, которое представляет собой адренокортикотропный гормон, кортикостероид, интерферон, глатирамер-ацетат или нестероидное противовоспалительное лекарственное средство.

Краткое описание чертежей Изобретение поясняется чертежами. На фиг.1 приведена диаграмма демиелинизации головного мозга мышей под действием купризона, на фиг.2 - диаграмма восстановления площади мозолистого тела под влиянием Ропрена после демиелинизации, на фиг.З - диаграмма влияния Ропрена на демиелинизацию головного мозга мышей по результатам иммуногистохимических исследований, на фиг. 4 - диаграмма влияния Ропрена на нейрогенез в субвентрикулярной зоне головного мозга мышей на модели демиелинизации, на фиг. 5 - диаграмма влияния Ропрена на нейрогенез в зубчатой извилине гиппокама головного мозга мышей на модели демиелинизации.

Осуществление изобретения

Авторами изобретения была выявлена не известная ранее возможность применения полипренолов формулы (1) для лечения и профилактики у больных состояний, связанных с демиелинизацией, и/или симптомов или признаков таких состояний, с нарушением прохождения нервного импульса по миелиновой оболочке, включая больных, страдающих рассеянным склерозом

СН ₃ СН ₃

Н - (СН ₂ - С = СН - СН ₂ )п - СН ₂ - С = СН - СН ₂ ОН, где п = 8-20. (1) Полипренолы формулы (1) это природная смесь олигомеров (изопреноидов) ведет себя как одно вещество (Ропрен), но может быть разделена на обращеннофазных сорбентах на индивидуальные изопреноиды. Ропрен получают из зелени хвойных пород (сосны, ели, пихты) (патент RU2017782). Этот полипренол показал противоязвенное действие [Н.А.Скуя и др. Продукты переработки древесной зелени - перспективы использования в гастроэнтерологии./ В книге: Функциональная диагностика и эффективность лечения заболеваний органов пищеварения. Вильнюс, 1988, часть 4, с. 675-676], гепатопротекторное (патент US5731357), иммуномодулирующее (патент RU2137479). Самая чистая фракция изопренолов - Ропрен получена способом, описанным в патенте PCT/RU 2004/000162. Препарат стимулирует процессы естественной регенерации печени (RU 2252026), применяется как средство для лечения алкоголизма и осложнений, связанных с ним (PCT/RU 2008/000298, RU 2327448), как средство для лечения больных с дементным синдромом (PCT/RU 2008/000297).

Однако, в настоящее время препараты для ускорения восстановления миелинизации нервных окончаний и ускорения нейрогенеза не применяются. Применение препаратов растительного происхождения на основе полипренолов является перспективным направлением.

К ним относится препарат Ропрен, который может служить экзогенным источником изопреноидных звеньев, из которых образуется эндогенный продукт в организме - долихол. Изопреновые звенья, из которых состоит Ропрен, могут использоваться организмом, как для построения холестерина, так и для построения убихинона - жизненно важных метаболитов для организма. Полиизопренодные спирты (пренолы/долихолы) это метаболиты в живом организме, которые имеют важное значение, они присутствуют в любом живом организме - от бактерии до каждой клетки человеческого организма. Они участвуют в мевалонатном пути биосинтеза холестерина и при нарушении этого биосинтеза, который может проходить как с участием долихолов, так и без них, что может привести к нарушению липидного обмена в организме. Другой путь биосинтеза, где участвуют полипренолы в виде фосфорилированных производных - это биосинтез гликопротеинов, где они участвуют в процессах гликозилирования белков и распознавания глюкопротеина на мембране (например, в качестве кофактора при образовании фосфатидилионизитола (GPI), который как якорь, закрепляется на мембране и участвует в передаче нервного импульса). Также они участвуют в распознавании антигенов на мембране, регулируют текучесть и вязкость мембран, а, следовательно, раскрытие ионных каналов, а также прохождение нервного импульса через мембрану. Все функции полипренолов до конца не открыты, но на основании исследований эти соединения представляют большой интерес для фармакологии [Surmacz L, Swiezewska Е. Polyisoprenoids - Secondary metabolites or physiologically important superlipids, Biochem Biophys Res Commun. 201 1 Apr 22; 407(4):627-32. doi: 10.1016/j.bbrc.201 1.03.059. Epub 201 1 Mar 16].

Есть данные, указывающие, что полипренол (долихол), содержится в черной субстанции мозга в нейромеланине, причем его содержание достаточно велико - до 15%, но функции его пока неизвестны. [Joshida К., Engel J., Liljequst S. Naunyn. Investigation of lipid component of neuromelani (NM). //Schmiedebergs Arch. Pharmacol. 1982, Oct., 321(1), 3-74,]. Ропрен, является перспективным препаратом для лечения таких нейродегенеративных заболеваний, как деменция и болезнь Альцгеймера (БА) за счет его влияния на активность митохондриальных ферментов: бутирилхолинэстеразу (БуХЭ) и моноаминооксидазу (МАО).

Как известно, белое вещество мозга у высших организмов более чем на 50% состоит из миелина, поэтому нарушения в образовании миелина при онтогенезе или изменения в структуре миелина в развитой нервной системе при патологии приводят к демиелинизирующим заболеваниям и тяжелым невропатиям.

Обычно в мембранах преобладают белки, но в случае миелиновой оболочки нервов три четверти массы составляют липиды, причем холестерин от общей массы липидов составляет 28% и располагается на внешней стороне мембраны. Общее содержание липидов в миелине в 2 раза больше - они примерно составляют 70-85%, а белки составляют до 20% сухой массы миелина по сравнению с другими плазматическими мембранами. Липиды миелина представлены фосфолипидами, гликолипидами и стероидами. Миелин целиком не метаболизирует, период полуразложения липидов колеблется от 5 недель до 2-4 месяцев (у фосфатидилсерина и фосфотидилхолина), до 1 года (у холестерина). Для белков этот период колеблется от 2 до 6 недель (основной белок и протеолипид). Однако, интересно то обстоятельство, что период полуразложения различен для каждого компонента мембраны и они обновляются независимо друг от друга, т.е. обмен происходит между всеми слоями мембраны [Хухо Ф. Нейрохимия: основы и принципы: Пер. с англ. М:Мир, 1990,91 -109с].

Полипренолы (долихол) также работают на мембране, они проявляют мембранно-активные свойства, влияющие на текучесть и вязкость мембран. По- видимому, за счет связывания полиизопреноидного фрагмента на его а-конце с гликопротеинами, а затем и с белком, происходит облегчение транспорта белка или пептида и передача нервного импульса. Основный белок миелина и гликопротеины миелина - это основные макромолекулы олигодендроцита. Можно предположить, что при подавлении синтеза белка в миелиновой оболочке полипренолы (Ропрен) способствуют и/или участвуют в переносе белков миелина, в том числе основного белка миелина (МВР, myelin basic protein) и секретируют их через мембрану и тем самым облегчают передачу нервного импульса и защищают их от аутоиммунной агрессии. Кроме того, в каждой клетке в везикулах вместе с холестерином всегда содержится долихол, который участвует в биосинтезе холестерина. Можно предположить, что когда под воздействием различных факторов (например, окислительного стресса) миелиновая оболочка повреждается, то полипренолы приходят на помощь и компенсируют нехватку холестерина, тем самым предотвращая потерю миелина (т.е. демиелинизацию), а также восстанавливая скорость или активность процессов в нервной системе, что подтверждается новыми данными. А именно, стеролы и другие липиды (долихол), участвующие в биосинтезе холестерина, являются проводниками основных протеинов через мембрану и участвуют в регуляции прохождения нервного сигнала [Friedhelm Schroeder, Barbara P. Atshaves at al-Sterol Carrier Protein-New roles in regulating lipid rafts andsignaling.// Biochem.Biophys. Acta, 2007, June,1771 (6), р.700-718]. Длинноцепочечные полипренолы и полипренил-фосфаты вездесущие и основные компоненты клеточных мембран во всех сферах жизни. [Hartley M.D., Imperiali В. At the membrane frontier: a prospectus on the remarkable evolutionary conservation of polyprenols and polyprenyl- phosphates. //Arch Biochem Biophys. 2012,Jan.l5;517(2):83-97.doi: 10.1016/j. abb.201 1.10.018. Epub 2011, Nov. 10.]. Кроме того, полипренолы в мембранах могут вызывать внутриклеточный резонанс и, по-видимому, участвовать в передаче сигнала [Knudsen M.J.I, Troy F.A. Nuclear magnetic resonance studies of polyisoprenols in model membranes.// Chem. Phys. Lipids. 1989, Nov; 51(3-4):205-12].

В экспериментальном исследовании на животных при ишемии головного мозга было показано, что Ропрен обладает церебропротекторным действием. [Отчет по теме: «Изучение действия лекарственного препарата Ропрен на энергетический обмен при ишемии головного мозга у крыс». // Российская Военно-медицинская академия имени СМ. Кирова, кафедра Фармакологии, Санкт-Петербург]. К другим демиелинизирующим заболеваниям относятся также ДЗ периферической нервной системы. Применение Ропрена в дозе 4,3 мг/кг и 11,3 мг/кг в течение 7 суток после окклюзии общих сонных артерий снижает выраженность неврологических нарушений у крыс и увеличивает их выживаемость в постишемическом периоде. Ропрен в этих дозах защищает головной мозг от развития метаболического ацидоза и предупреждает развитие нарушений энергетического обмена. На фоне ишемии и гипоксии головного мозга пирацетам лишь на 46,5%, а ропрен в дозе 1 1 ,6 мг/кг на 62% (то есть почти на две трети) снижает лактацидоз. В этой же дозе ропрен на 73% повышает содержание креатинфосфата (пирацетам на 60%) и на 173% содержание аденозинтрифосфата (АТФ) в тканях головного мозга. На уровень аденозиндифосфата (АДФ) ропрен и препарат сравнения пирацетам действуют приблизительно одинаково, на 40-43% снижая его уровень. При этом и пирацетам и Ропрен восстанавливали до нормы энергетический заряд, характеризующий общее состояние энергетического обмена в мозге. Энергостабилизирующие эффекты ропрена сопоставимы с действием пирацетама. [Шабанов П. Д., Зарубина И.В., Султанов B.C. К механизму действия полипренолов при ишемии головного мозга. // Медицинский академический журнал 201 1, т. 11, N 2., С.25-32]. Полипренолы обладают иммуномодулирующим и противовирусным действием [Safatov AS at all, A prototype prophylactic anti-influenza preparation in aerosol form on the basis of Abies sibirica polyprenols // J. Aerosol Med. 2005, Spring; 18(1):55-62]. Ропрен способен повышать уровень интерферона (ИНФ) в крови и в отличие от других препаратов (Циклоферон), он обладает пролонгированным действием [Зарубаев В. В, Султанов B.C., Сухинин В.П, Рощин В.И, Никитина Т.В. Изучение динамики интерфероногенной активности препаратов Ропрен и его модифицированного аналога в опытах на белых мышах.// Материалы 4-ой международной конференции «Идеи Пастера в борьбе с инфекциями», СПб, 2-4 июня, 2008, с.12]. Кроме того при изучении влияния Ропрена на уровень ФНО- у мышей с асцитной и солидной формой карциномы Эрлиха в эксперименте было установлено, что при этом наблюдается - снижение концентрации ФНО-а (TNF-α) в сыворотке крови (для Ропрена на 38 % при солидной опухоли и на 78 % - при асцитной, а для препарата сравнения - Глутоксима - на 29 и 75 % соответственно. [Отчет по теме: «Исследование противоопухолевой активности и механизмов действия препарата Ропрен на моделях солидной и асцитной форм карциномы Эрлиха у белых мышей», НИИ Гриппа Российская Академия Медицинских Наук, Санкт-Петербург, 2007]. Возможно, это свойство Ропрена (снижение концентрации ФНО-α в сыворотке крови) будет способствовать профилактике, снижению воспаления и замедлению процесса развития PC.

Известно, что при аутоиммунной агрессии и развитии рассеянного склероза - снижение уровня ФНО-α является хорошим прогностическим фактором, снижая воспаление. Установлено достоверное повышение продукции ФНО-α у больных PC в активную стадию ремитирующего или первично-прогрессирующего заболевания по сравнению с контрольными показателями или данным при стабилизации заболевания, повышение продукции ФНО-а считают предвестником активизации иммунопатологического процесса при PC. Максимальное повышение продукции этого цитокина наблюдается за 5-14 дней до клинического обострения заболевания, снижаясь в подострую стадию [Евтушенко С. К., Деревянко И.Н. Современные подходы к лечению рассеянного склероза: достижения, разочарования, надежды. // Международный неврологический журнал. 2006, No 2 (6), С. 23-35].

Варианты осуществления изобретения

Авторы изобретения, провели дополнительные исследования по препарату

Ропрен и выявили неизвестное ранее свойство этого соединения, а именно, - композиция на основе полипренолов оказывает положительное действие при демиелинизирующих состояниях, в том числе, оказывает ремиелинизирующее (восстанавливающее) действие, ускоряет (повышает) процесс нейрогенеза, а также обладает иммуномодулирующим и метаболическим действием. Это новое свойство Ропрена подтверждено экспериментальными данными.

Основанием для применения соединения формулы (1) по заявленному назначению послужило выявление ряда новых активностей, ранее неизвестных для этого соединения.

В эксперименте на животных исследовали влияние Ропрена на миелинизацию белого и серого вещества на модели рассеянного склероза путем интоксикации купризоном. Интоксикация купризоном представляет собой превосходную модель, использующуюся во всем мире, для изучения патологий, таких как рассеянный склероз, эпилепсия и шизофрения. [Preisner А1, Albrecht S, Cui Q.L, Hucke S. Non- steroidal anti-inflammatory drug indometacin enhances endogenous remyelination.// Acta Neuropathol. 2015, May 6. (Epub ahead of print)]. Замечено, что трехнедельного воздействия купризона достаточно, чтобы вызвать глубокую демиелинизацию. [Dewar, D., Underbill, S.M., Goldberg, М.Р. Oligodendrocytes and ischemic brain injury. //Cereb. Blood Flow Metab. 23., 2003, P. 263-274]. Введение купризона вызывает отек аксонов, который происходит из-за перераспределения каналов Na+ и митохондриального дефицита, который приводит к нарушению натриевого и кальциевого гомеостаза. Тем не менее, есть отличия - в купризоновой модели отсутствуют воспаленные сосуды, а также Т-клетки находятся в минимальном количестве [Rossi, L., Lombardo, M.F., Ciriolo, M.R., Rotilio, G. Mitochondrial disfunction neurodegenerative diseases associated with copper imbalance. // Neurochem. Res. 29. 2004. H. 493-504]. Под действием купризона происходит массовый апоптоз олигодендроцитов на четвертую неделю воздействия с участием иммунной системы, а к 6 недели клетки предшественники олигодендроцитов дифференцируются во взрослые клетки. Ранние изменения нейронов происходят на уровне синапса, где концентрация медиатора нарушена, вследствие изменения деятельности синтезирующих ферментов. Кроме того, в демиелинизированных участках аксона можно наблюдать торможение активности транспортных белков, что в итоге приводит к потере аксона. Некоторое количество нейронов выживают при купризоновой интоксикации, несмотря на то, что они в равной или зачастую в большей степени уязвимы к метаболическим нарушениям по сравнению с олигодендроцитами. Возможным объяснением является метаболическая связь нейронов с астроцитами, которые защищают их от окислительного стресса. При окислительном стрессе астроциты могут запускать процесс гликолиза, тем самым создавая буфер, защищающий нейроны от окислительного стресса [Biancotti, J. С, Kumar, S., de Vellis. Activation of inflammatory response by a combination of growth factors in cuprizone-induced demyelinated brain leads to myelin repair. // J. Neurochem. Res. 33, 2008, P. 2615-2628].

В соответствии с международной классификацией выделяют 4 основных типа течения PC. Lucchinetti С, описывает 4 основных типа рассеянного склероза: 1 и 2 типы считаются аутоиммунными в то время, как в типах 3 и 4 первопричиной считается олигодендропатия (апоптоз олигодендроцитов). [Lucchinetti, С, Bruck, W.,at al,. Heterogeneity of multiple sclerosis lesions: implications for the pathogenesis of demyelization.// Ann. Neurol. 2000, 47, 707-717]. В частности, 3-й тип рассеянного склероза имеет много схожих черт с интоксикацией купризоном: активно демиелизирующихся участков с небольшим участием лимфоцитов, но большим участием микроглии и макрофагов, гипоксическим повреждением тканей и признаками оксидативного стресса, а также митохондриальным дефицитом, именно на этой модели авторы изучали действие препарата Ропрен. Работа была выполнена на 24 мышах самцах линии CD-I (возраст - 8 недель на начало эксперимента), полученных из питомника Научно-исследовательского института фармакологии и регенеративной медицины имени Е.Д. Гольдберга (г. Томск).

Исследования проводились в соответствии с правилами, принятыми Европейской Конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и иных научных целей. Экспериментальные процедуры были одобрены Комиссией по биоэтике Института цитологии и генетики СО РАН (г. Новосибирск). Животные были разделены на 3 экспериментальные группы: «Контроль», «Демиелинизация» и «Ропрен+демиелинизация». Животные групп «Демиелинизация» и «Ропрен+демиелинизация» получали стандартный корм с 0.5% содержанием купризона в течение 10 недель, а животные группы «Контроль» - стандартный корм в течение 10 недель. Животным группы «Ропрен+демиелинизация»» вводили препарат «Ропрен» внутрибрюшинно в дозе 12 мг/кг, начиная с 6-й недели эксперимента, животным групп «Контроль» и «Демиелинизация» вводили внутрибрюшинно в той же дозе растворитель - растительное оливковое масло (содержащее смесь полиненасыщенных и насыщенных жирных кислот).

Через 10 недель было проведено сканирование головного мозга мышей на магнитно-резонансном томографе Broker «BioSpec 1 17/16USR» под газовой анестезией с использованием 2% изофлурана.

По окончании эксперимента животных умерщвляли под эфирным наркозом методом транскардиальной перфузии по большому кругу кровообращения 4% параформальдегидом. Головной мозг крыс извлекли и на сутки помещали в 4% раствор формальдегида. Спустя 24 часа головной мозг извлекали из формалина и на сутки помещали в 10% раствор сахарозы, затем перемещали в 20% раствор сахарозы, после чего замораживали в парах жидкого азота и помещали в морозильную камеру на -80°С для дальнейшего иммуногистохимического анализа.

Исследование было проведено с помощью современных методов магнитно- резонансной томографии (МРТ) головного мозга и иммуногистохимического анализа срезов головного мозга мышей.

Методы исследования

МРТ-исследования. Через 10 недель после начала эксперимента было проведено сканирование головного мозга мышей с использованием нескольких последовательностей (Turbo Rare, Т2-взвешенное изображение, Исследование по трехмерному (3D) протоколу для картирования макромолекулярной протонной фракции (MPF) в головном мозге грызунов со следующими параметрами: MT-w последовательность: TR=22 мс, ТЕ=2,5 мс, угол поворота 9°, ширина спектральной полосы 125 кГц; для насыщения макромолекулярных протонов используется внерезонансный радиочастотный импульс гауссовой формы с длительностью 10 мс, отстройкой частоты 6 кГц и номинальным углом поворота 900°), а также с Tl-w последовательностью: TR=16 мс, TE=2,5 мс, угол поворота 16°, ширина спектральной полосы 125 кГц, а также с PD-w последовательностью: TR=16 мс, ТЕ=2,5 мс, угол поворота 3°, ширина спектральной полосы 125 кГц, а также с FieldMap последовательностью для картирования поля ВО (метод двойного эхо): TR=20 мс, ТЕ 1=2,4 мс, ТЕ 1=4,1 мс, угол поворота 8°, ширина спектральной полосы 200 кГц., и наконец с AFI последовательностью для картирования поля В1 (метод двойного TR): TR1=12 мс, TR2=60 мс, ТЕ=3,6 мс, угол поворота 60°, ширина спектральной полосы 59,5 кГц, инкремент угла сдвига фазы 39°.

В последнее десятилетие параметр MPF (молекулярная протонная фракция), также известный как "связанная фракция" (bound pool fraction) или "ограниченная протонная фракция" (restricted proton fraction) широко используют как маркер миелина из-за сильных корреляций между MPF и содержанием миелина в нервных тканях. Импульсные последовательности и метод картирования макромолекулярной протонной фракции (MPF) разработаны доктором В.Л.Ярных [Yarnykh VL. Fast macromolecular proton fraction mapping from a single off-resonance magnetization transfer measurement./ Magn. Reson Med 2012;68 (1): 166-178]. Рядом независимых групп и доктором В.Л.Ярных показана высокая корреляция параметра MPF с количественным содержанием миелина в различных зонах мозга [Underhill HR, Rostomily RC, Mikheev AM, Yuan C, Yarnykh VL.. Fast bound pool fraction imaging of the in vivo rat brain: Association with myelin content and validation in the C6 glioma model./ Neuroimage 201 1 ;54(3):2052-2065.; Samsonov Д Alexander AL, Mossahebi P, Wu YC, Duncan ID, Field AS. Quantitative MR imaging of two-pool magnetization transfer model parameters in myelin mutant shaking pup. /Neuroimage 2012;62: 1390- 1398].

Сканирование осуществлялось в аксиальной проекции. Параметры геометрии, пространственное разрешение и число усреднений сигнала устанавливались для мыши: поле зрения 20x20x24 мм, матрица 200x200x80, разрешение 100x100x300 мкм, 4 усреднения сигнала, полное время сканирования 48 минут. Для последовательностей картирования полей ВО и В1 разрешение в плоскости устанавливалось вдвое ниже, чем для остальных последовательностей ввиду гладкости пространственных изменений поля. Соответственно использовалась матрица 100x100x80.

Для групп мышей с демиелинизацией и контрольной группы были реконструированы MPF карты головного мозга с помощью одноточечного алгоритма с использованием синтетического референтного изображения [Yarnykh VL. Fast macromolecular proton fraction mapping from a single off-resonance magnetization transfer measurement./ Magn. Reson Med 2012;68 (1): 166- 178] и исследована степень демиелинизации в структурах белого (мозолистое тело, свод, комиссура, внутренняя капсула) и серого (кора, таламус, фиссура гиппокампа, зубчатая извилина и поле СА1 гиппокампа) вещества.

Средние значения MPF в исследуемых структурах вещества головного мозга у демиелинизированньгх и контрольных мышей подсчитывали с помощью программного обеспечения Image J . Для этого на картах MPF регион интереса (ROI) фиксированного размера помещался в соответствующую анатомическую структуру, измерялась среднее значение параметра в регионе интереса. Полученные значения параметра использовались для оценки потери миелина при демиелинизации.

Площадь структуры белого вещества головного мозга - Corpus callosum (мозолистое тело) для групп контроля, «Демиелинизация»,

«Демиелинизация+Ропрен» измеряли в пикселях с помощью программного обеспечения Image J по сумме площадей 12-14 срезов от переднего края обонятельной луковицы по Т2-взвешенным изображениям.

Очерчивание контуров мозолистого тела и измерение MPF проводились одним и тем же оператором для всех групп животных вслепую, без информирования оператора о принадлежности животного к конкретной группе.

Иммуногистохимические исследования

Коронарные срезы головного мозга мышей толщиной 10 мкм получали с помощью криотома НМ525. Срезы были получены в зонах 0.74-Ю.26 и -1.34-^-1.70 от Bregma согласно атласу (G.Paxinos, К.В. J.Franklin, 2001). Полученные срезы окрашивали иммуногистохимически на основной белок миелина (МВР) и даблкортин (DCX, маркер молодых нейронов) с использование первичных (Goat anti МВР (sc- 13914), Goat anti Doublecortin (C-18): sc-8066, Santa Cruz) и вторичных (Donkey anti goat AlexaFlour 488 (705-545-147), Jackson Immunoresearch) антител. Фотографирование осуществляли с помощью микроскопа Axio Imager Z2 (Carl Zeiss, Германия) и программного обеспечения Axio Vision 4.8 (Carl Zeiss, Германия) с модулем MozaiX, позволяющим получать снимки размером ~1 1 мм2 совмещением 20-28 изображений меньшего размера, в зависимости от размеров среза. Микрофотографии целых срезов мозга, окрашенные на МВР, оценивали способом, аналогичным обработке карт MPF: подсчитывали среднюю интенсивность флуоресценции на площади исследуемых структур мозга (мозолистое тело, внутренняя капсула, кора, таламус, поле СА1 гиппокампа, фиссура гиппокампа, зубчатая извилина, комиссура, свод) Полученную интенсивность нормировали по фону и средней интенсивности целого среза, полученные значения включали в дальнейшую статистическую обработку. Для каждого животного анализировали фотографии 10-14 срезов мозга.

Число DCX+ (новообразованных молодых нейронов) подсчитывали визуально в двух основных нейрогенных зонах - субвентрикулярной зоне вблизи боковых желудочков (SVZ) и субгранулярной зоне зубчатой извилины гиппокампа (DG).

Различия между группами оценивали с использованием программного обеспечения Statistica 6.0 дисперсионным анализом (ANOVA) и последующим post- hoc анализом с использованием Т-теста либо непараметрического критерия Манна- Уитни в случае, если распределение отличается от нормального. Различия считались статистически значимыми при р < 0.05.

Пример 1. Влияние Ропрена на миелинизацию головного мозга по результатам МРТ-исследований. Проведено исследование белого и серого вещества головного мозга с помощью картирования макромолекулярной протонной фракции MPF. Дисперсионный анализ MPF карт показал значимость влияния фактора введения купризона на миелинизацию мозга мышей (F(8, 40)=3.9490, р=0.00161). Post-hoc анализ подтвердил демиелинизацию под действием купризона для основных структур мозга с использованием Т-теста и показал наличие значимой демиелинизации для белого вещества мозга: уменьшение параметра MPF в 1 ,9 раза в мозолистом теле и в 1,5 раза - в комиссуре, а также для серого вещества: уменьшение параметра MPF в 1,3 раза в коре и таламусе. Таким образом, 10-недельное пероральное введение купризона привело к значимой демиелинизации структур как белого, так и серого вещества, что показано на диаграмме фиг.1 , где видны различия параметра MPF мышей с купризоновой демиелинизацией и контрольных животных ** - р<0.01, * - р < 0.05, Т-тест.

Получены Т2-взвешенные изображения мышей групп контроля, «Демиелинизация», «Демиелинизация+Ропрен», где визуализируется мозолистое тело, демиелинизированное у мыши с введением купризона, и без демиелинизации для групп «Контроль и «Демиелинизация+Ропрен». Была проведена количественная оценка площади мозолистого тела у мышей разных групп, которая показала значимое уменьшение площади мозолистого тела у мышей от введения купризона, по сравнению с контрольной группой. В то же время при введении Ропрена площадь мозолистого тела практически не отличалась от контрольной группы, несмотря на введение купризона, что свидетельствует о защитном действии Ропрена на головной мозг при интоксикации купризоном, вызывающей его демиелинизацию. Этот эффект продемонстрирован на диаграмме фиг.2, где площадь мозолистого тела у мышей группы «Демиелинизация» значимо (Р < 0.05, Т-тест) меньше на 21,5% того же показателя для групп «Контроль» и «Демиелинизация + Ропрен», в то же время значимые различия между группами «Контроль» и «Демиелинизация + Ропрен» отсутствуют.

Таким образом, 10-недельное пероральное введение купризона по результатам МРТ-исследований приводит к значимой демиелинизации головного мозга. При демиелинизации обнаружено достоверное уменьшение площади мозолистого тела. Введение Ропрена оказывает защитное действие на белое вещество головного мозга, а именно, восстанавливая площадь мозолистого тела до контрольных значений.

Пример 2. Влияние Ропрена на миелинизацию головного мозга по результатам иммуногистохимических исследований. Микрофотографии срезов головного мозга, окрашенных на основной белок миелина (МВР), мышей групп «Контроль», «Демиелинизация», Демиелинизация+ Ропрен» отчетливо указывают на снижение интенсивности флуоресценции и контраста между белым и серым веществом головного мозга. В то время как на микрофотографиях срезов головного мозга, окрашенных на основной белок миелина (МВР), у мышей группы «Демиелинизация+Ропрен» интенсивность флуоресценции не снижается и визуально срезы выглядят так же, как у контрольной группы мышей.

Количественный анализ интенсивности флуоресценции показал достоверное снижение интенсивности, отражающее содержание основного белка миелина МВР, для группы «Демиелинизация» по сравнению с контролем от 10 до 54% во всех исследуемых структурах мозга, кроме комиссуры, где* - р<0.05, ** - ρθ.01 , Т-тест, а также различия между группами «Демиелинизация» и «Контроль» составляли - р<0.01 , Т-тест. Показатели интенсивности флуоресценции, отражающие содержание основного белка миелина МВР, в группе «Демиелинизация+Ропрен» были выше, чем в группе «Демиелинизация» на 20,0 -75,0%, а также превысили контрольные значения в различных структурах мозга (диаграмма на фиг. 3).

Введение Ропрена статистически достоверно увеличивало миелинизацию в этих структурах, в части структур миелинизация оказалась выше, чем в группе контроля, что говорит о восстанавливающем (ремиелинизирующем) действии Ропрена,

Пример 3. Влияние Ропрена на нейрогенез в нейрогенных зонах мозга по результатам иммуногистохимических исследований.

Проанализировано влияние Ропрена на нейрогенез у мышей. На полученных микрофотографиях срезов мозга субвентрикулярной зоны вблизи боковых желудочков для животных разных групп, окрашенные на даблкортин, который является маркером молодых нейронов и визуализируется с помощью специфических антител, конъюгированных с флюорохромом зеленого свечения (AF488), видно уменьшение молодых нейронов в группе мышей «Демиелинизация» по сравнению с контролем. На микрофотографиях срезов мозга этой же зоны из группы «Демиелинизация+Ропрен» наблюдается увеличение количества молодых нейронов по сравнению с группами «Демиелинизация» и « Контроль».

Обнаружено, что при купризоновой демиелинизации уменьшается количество молодых нейронов во всех основных нейрогенных зонах головного мозга по сравнению с контрольной группой (р<0,001). В субвентрикулярной зоне (SVZ) у мышей, получавших препарат на основе полипренолов (Ропрен), наблюдается тенденция к повышению уровня нейрогенеза по сравнению с контрольной группой (р=0,05) и статистически значимое увеличение количества молодых нейронов по сравнению с группой «Демиелинизация» (диаграмма на фиг. 4).

В гранулярном слое клеток зубчатой извилины гиппокампа (DG) статистически значимых различий между контрольной группой и группой мышей, получавших препарат на основе полипренолов, нет (р>0.05), в то же время для этой группы «Демиелинизация+Ропрен» количество молодых нейронов значительно выше по сравнению с группой «Демиелинизация» (р<0,001) (диаграмма на фиг. 5).

Результаты, полученные в опытах на животных на модели демиелинизации купризоном, позволили с достоверностью установить новые свойства Ропрена, а именно, препарат восстанавливает миелинизацию в структурах белого и серого вещества головного мозга до уровня контроля, что подтверждается результатами МРТ и иммуногистохимических исследований. На купризоновой модели рассеянного склероза наблюдалась значительная демиелинизация структур, как белого, так и серого вещества, подтвержденная результатами МРТ-исследований с использованием картирования макромолекулярной протонной фракции и иммуногистохимических исследований. Количественная оценка интенсивности окрашивания срезов мозга на основной белок миелина показала, что лечение Ропреном защищает головной мозг от демиелинизации.

Исследование показало значительное повышение под действием Ропрена уровня нейрогенеза в основных нейрогенных зонах головного мозга у мышей с демиелинизацией, тогда как уровень нейрогенеза при демиелинизации уменьшается в 3,6 раза.

В гранулярном слое клеток зубчатой извилины гиппокампа (DG) Ропрен значительно увеличивает - в 4 раза количество молодых нейронов по сравнению с демиелинизацией, их становится даже больше, чем в контроле на 15% (Диаграмма 5). Та же тенденция наблюдается и в другой зоне - субвентрикулярной зоне у мышей (SVZ), количество нейронов в этой области увеличивается в 2,2 раза по сравнению с демиелинизацией, а по сравнению с контролем на 37,5%.

Эти новые, не известные ранее свойства Ропрена впервые наглядно показаны и доказаны с помощью МРТ и иммуногистохимических исследований, что дает возможность применять этот препарат в лечении рассеянного склероза и демиелинизирующих заболеваний и состояний.

Клинический опыт использования Ропрена

(при токсической энцефалополинейропатии с выраженной демиелинизацией, нарушением проводимости обеих конечностей)

Хроническая алкогольная полинейропатия (ПНП) представляет собой первичный дегенеративный процесс с распадом миелина, разрушением осевых цилиндров и заменой нервной ткани соединительной, богатой сосудами. Поражаются, прежде всего, двигательные нервы: раньше всего - лучевой нерв в верхних конечностях и перинеальные нервы в нижних конечностях. Вовлекается в патологический процесс грудные и диафрагмальные нервы. Нередко поражается зрительный нерв, сетчатка. [Тринитатский Ю.В., Тринитатский И.Ю. Лечение хронических демиелинизирующих полинейропатий., Государственнй Медицинский университет, Ростов-на-Дону, 2003, с.176].

В клиническом исследовании участвовали больные с хронической алкогольной полинейропатией, которые были разделены на две группы по выраженности клинической симптоматики: с умеренной ПНП без признаков демиелинизации и с выраженной, и тяжелой формой ПНП, принимавшие суррогаты алкоголя, что приводило к более стойким нарушениям в неврологической симптоматике и к демиелинизирующему состоянию в результате с дегенерации миелина.

В контрольной группе больных с диагнозом - полинейропатия (ПНП) было 25 человек, 14 из них был поставлен диагноз токсическая энцефалополинейропатия. В опытной группе - 57 человек, из них 23 больным был поставлен диагноз - токсическая энцефалополинейропатия. Токсическая энцефалополинейропатия (демиелинизирующее состояние - ДС) клинически характеризовалась присоединением полиневритов конечностей, преимущественно нижних конечностей, выражающаяся в парестезии и онемении конечностей, боли, жжении, в снижении рефлексов, болевого порога, вибрационной, температурной, тактильной чувствительностью конечностей ног и рук. Степень тяжести ПНП оценивали на основании исследования порогов 4 видов чувствительности (тактильной, болевой, температурной и вибрационной) и рефлексов (ахилловых и коленных) на основании стандартизированных международных тестов по шкале Янга(Уошщ M.J,1993) по сумме баллов:

- от 3-5 баллов - умеренная форма ПНП,

- от 6-8 баллов - выраженная форма ПНП,

- от 9-10 баллов - тяжелая форма ПНП.

В опытной группе из 23 больных с выраженной и тяжелой формой ДС в течение 1 месяца лечения Ропреном, наступало улучшение в демиелинизирующем состоянии больных, что заключалось в переходе ПНП в более легкую стадию заболевания по шкале Янга и только у 2-х больных эти проявления были менее выражены. Трое больных с демиелинизирующим состоянием выздоровели, а в контрольной группе - никто не выздоровел к концу лечения. В контрольной группе незначительно выраженный эффект у 3-х больных наступает к 15 дню лечения, в то время как в опытной группе к этому же дню лечения наступал эффект у основной массы больных. После 30 дней лечения Ропреном из 16 больных с тяжелой формой ПНП у 3 человек (18,8%) наступает незначительное улучшение и переход в выраженную форму, у 1 1 человек (68,8%) - переход в умеренную форму, то есть более значительное улучшение, а 2 человека - выздоровели к концу лечения. Из 7 человек с выраженной формой ПНП улучшение наступило у 6 человек (85,7%), а 1 человек выздоровел и не имел признаков ПНП. Таким образом, в опытной группе из 23 больных за период лечения Ропреном выздоровели 3 человека, у остальных наблюдалась положительная динамика. В контрольной группе за этот же период у больных, которые прошли курс лечения (они получали ноотропы, церебропротекторы и витамины группы «В» в виде инъекций) значительных улучшений в состоянии не наблюдалось. Так из 9 больных с тяжелой формой ПНП произошел переход в выраженную форму ПНП у 8 человек (89,0%), а 1 (1 1%) больной был без динамики. Остальные 5 больных с выраженной формой ПНП, из которых 2 человека (40%) перешли в умеренную стадию, а 3 (60%) - были без динамики. Эффективность от лечения препаратом Ропрен наиболее видна с тяжелой формой ПНП, когда добиться успеха в лечении заболевания достаточно сложно. Такого эффекта в контрольной группе больных с тяжелыми формами ДС, не происходит, даже к концу лечения.

По данным электроэнцефалографии (ЭЭГ) было отмечено улучшение состояния больных с демиелинизирующим заболеванием. До лечения Ропреном у большей части исследуемых больных в исходной ЭЭГ отмечалось отчетливое снижение выраженности альфа-активности и увеличение выраженности бета-активности, которая часто имела акцент в лобных областях. Из 23 человек в опытной группе после лечения у 13, то есть более чем у 50% больных выявлена ярко выраженная положительная динамика на ЭЭГ. После лечения Ропреном отмечены выраженные перестройки в биоэлектрической активности, отражающие отчетливые положительные нейрофизиологические сдвиги. Увеличение выраженности -ритма, его более правильная организация отражает нормализацию общего функционального состояния ЦНС и оптимизацию корково-подкорковых взаимоотношений.

Пример 4. (Опыт). Больной, 49 лет, длительность заболевания 5 лет. Диагноз: Токсическая энцефалополинейропатия (ДС) с эпилептическим синдромом (интенсификация припадков последние 3 года), хронический алкоголизм 2-ой степени, судорожный симптом. Улучшение наступило на 15-й день, уменьшение очаговой церебральной симптоматики и полиневротических выпадений. Приступов эпилепсии не было. К 30-дню лечения - выраженное улучшение очаговой церебральной симптоматики. ПНП перешла из тяжелой степени в умеренную стадию. Регресс неврологического статуса значительный. Данные ЭЭГ показывают положительную динамику - усиление альфа-ритма.

Пример 5. (Опыт). Больной, 39 лет, длительность заболевания 10 лет. Диагноз: Токсическая энцефалополинейропатия (ДС), хронический алкоголизм 2-ой степени. На 16 сутки значительный регресс очаговой неврологической симптоматики: исчез нистагм, уменьшились мозжечковые нарушения. К 30 дню сохраняется лишь микроочаговая церебральная симптоматика, значительный регресс ПНП (с 10 баллов до 4 баллов по шкале Янга, т.е. из тяжелой формы ПНП перешла в умеренную форму). По данным ЭЭГ - после лечения наблюдается положительная динамика в виде значительного усиления альфа - ритма, снижения выраженности реакции усвоения ритмов фотостимуляции (РФС).

Промышленная применимость

Результаты изучения действия лекарственного средства и фармацевтической композиции на основе соединения (1), Ропрен на животных на купризоновой модели рассеянного склероза, которая вызывает демиелинизацию в головном мозге мышей, а также при лечении в клинике больных с токсической энцефалополинейропатией (демиелинизирующее заболевание) позволили сделать вывод об эффективности лечения демиелинизирующих заболеваний. Ропрен стимулирует образование новых нейронов в нейрогенных зонах мозга, значительно улучшает неврологические нарушения и приводит к ремиелинизации (восстанавлению демиелинизирующего состояния).

Препарат Ропрен является недорогим средством, его получение основано на известном способе экстракции древесной зелени хвойных пород.