"ENVASE ACTIVO INHIBIDOR DE PATóGENOS ALIMENTARIOS"

La presente invención se refiere a un nuevo envase activo inhibidor de patógenos alimentarios, bien mediante Ia generación de una atmósfera activa o por contacto directo, que comprende un soporte de papel, cartón, corcho aluminio o madera y un recubrimiento activo del mismo. Dicho recubrimiento consiste en una formulación de parafina y extractos de plantas naturales.

ESTADO DE LA TéCNICA ANTERIOR

La pérdida de calidad de los alimentos envasados se produce por distintas causas entre las que se encuentran los microorganismos (bacterias, hongos (levaduras y mohos)), Ia temperatura, Ia luz solar, el oxígeno o Ia humedad. Estos factores, provocan en el alimento proliferación microbiana, cambios en las vitaminas, alteraciones en las propiedades organolépticas y oxidación de las grasas (sabor rancio), con el consiguiente rechazo.

Es por ello que existen una gran cantidad de productos que actúan como agentes antimicrobianos y se utilizan para Ia protección de alimentos, entre otros, ciertos extractos de plantas naturales. La patente US 20040213861 , describe un procedimiento y una composición para inhibir el crecimiento de microorganismos en productos alimentarios, que consiste en Ia utilización de tomillo y canela como agentes antimicrobianos.

Por otro lado Ia necesidad de transportar y almacenar alimentos ha llevado a desarrollar envases y/o envoltorios que protejan estos alimentos frente a Ia contaminación por infecciones microbianas. Por ejemplo, en Ia Patente Internacional WO 01/49121 , se describe un envasado para conservar productos cárnicos que incluye un agente antimicrobiano. En Ia patente española ES 2144761 , también se describe un envase para conservar productos comestibles que incorpora un agente conservante (aceite de romero, de tomillo o su combinación). Igualmente en Ia patente US 6482452 se describe un envase impermeable para carne que incorpora conservantes basados en plantas. Estos envases o embalajes actúan por contacto directo con los alimentos.

El empleo de parafinas como barrera antihumedad también es conocido en el estado de Ia técnica. Este material se cita, entre otras, en Ia patente GB 669942, en Ia que se describe un envoltorio que contiene una capa de cera de parafina con ácido paranitrobenzoico, para Ia protección de alimentos frente al moho. Además, en Ia patente GB 473318, se describe el uso de parafina con cloramina T (como gases germicidas) para Ia conservación de alimentos perecederos, ó Ia patente US 2480010, que describe un envase para Ia conservación de materia orgánica contra el desarrollo de hongos, que contiene un revestimiento con ceras de parafina y ácido diclorosuccínico o sus esteres.

EXPLICACIóN DE LA INVENCIóN

Los autores de Ia presente invención han desarrollado un sistema de envase activo alternativo para su utilización en Ia industria de Ia alimentación como envase para alimentos capaz de inhibir el crecimiento de patógenos alimentarios debido a Ia generación de una atmósfera activa o a su contacto directo con el alimento.

La parafina en si, no solo se utiliza como barrera antihumedad en el envasado de los alimentos, sino como vehículo portador de agentes inhibidores de patógenos para proteger los alimentos de su deterioro por hongos, o bacterias.

El envase ó embalaje puede jugar un papel importante a Ia hora de prevenir el deterioro alimentario. La migración positiva de sustancias antioxidantes, antimicrobianas o de aromas desde el seno del envase al alimento, es Io que da lugar al envase activo. Un envase activo se define como aquel que aporta compuestos que protegen al alimento o bien absorbe aquellos que Io deterioran.

En un primer aspecto de Ia invención se describe un envase activo para alimentos capaz de inhibir el crecimiento de patógenos alimentarios, bien por generación de una atmósfera activa o por contacto directo, que

comprende un soporte y un recubrimiento activo de dicho soporte que está compuesto por parafina y agentes activos basados en extractos naturales.

El término de "envase activo" en Ia presente invención, se refiere a un sistema activo que comprende un material que actúa como soporte y un recubrimiento de una formulación base de parafina o parafina aditivada que incorpora agentes activos. Este conjunto se comporta como un sistema de envase ó embalaje activo.

Las parafinas se utilizan para formar una barrera hidrofugante y proteger los alimentos de Ia humedad. Esta barrera hidrofugante se prepara depositando una fina capa de parafina sobre Ia cara del material soporte que va a estar en contacto con el alimento, aprovechando sus propiedades altamente hidrófobas. Además de su gran versatilidad, facilidad de manejo y bajo precio, las parafinas son productos poco reactivos, por Io que no alteran las cualidades de los alimentos. Estos compuestos están especialmente indicados para el recubrimiento de papel en envases o embalajes y de cajas de cartón o madera destinadas al transporte de frutas, hortalizas, carne, pescado, productos lácteos y alimentos en general, ya sean húmedos, grasos o secos. También son adecuados para el recubrimiento de cualquier otro tipo de soporte que vaya a estar en contacto con este tipo de alimentos.

Así mismo, se podría utilizar cualquier material de recubrimiento con propiedades físico-químicas similares a Ia parafina.

Las parafinas o materiales relacionados que se consideran más utilizados son, pero sin limitarse, los siguientes:

1. Parafinas macrocristalinas (hidrogenadas ) CAS: 64742-51-4

2. Parafinas microcristalinas ( hidrogenadas) CAS 92045-76-6

3. Parafinas sintéticas (incluidas las Fisher Trops) :

.- Polietilénicas CAS: 099002-88-4 .-Polietilénicas oxidadas CAS: 068441-17-8 .-Ceras polipropilénicas CAS: 009003-07-0

4. Aceites blancos CAS: 801295-1

5. Ceras naturales ó esteres de origen vegetal o animal : .- Cera de Carnauba CAS 008015-86-9 .- Cera de Candelilla CAS: 008006-44-8 .- Cera de abeja CAS 008012-89-3 .- Cera japonesa CAS 008001-39-6 .-Ceras montánicas CAS: 008002-53-7 .- ácido esteárico CAS: 000057-11-4.

Un requisito indispensable para Ia utilización de estos productos o similares en Ia presente invención, es que estos deben ser aptos para el uso en contacto con los alimentos. Esto se consigue normalmente mediante un hidrotratamiento o un proceso equivalente y debe cumplir con las distintas normativas alimentarías en vigor como son FDA, Unión Europea, Mercosur o las normativas vigentes en el país de utilización.

En Ia Tabla 1 se indican las principales parafinas de origen de petróleo susceptibles de ser utilizadas como vehículos de estos agentes activos, siempre que cumplan con Ia condición anteriormente mencionada.

Tabla 1.- Parafínas de petróleo susceptibles de ser utilizadas como vehículos de agentes activos.

En una realización preferida de Ia presente invención, los extractos de esencias naturales son de canela, clavo, orégano o tomillo en porcentajes de incorporación a Ia parafina que varía entre el 0.5 y el 15 % del peso total, preferentemente entre el 1 y el 10 % y más preferentemente del 2 al 6%. En concreto dicho envase activo presenta al menos extracto de canela, más concretamente extracto de canela II, que es el extracto natural de mayor poder inhibitorio de crecimiento de los microorganismos el cual inhibe parcialmente el crecimiento de las bacterias Gram- y totalmente los mohos y Ia levadura a un porcentaje de incorporación al envase activo del 1 - 6% en peso.

En una realización aún más preferida de Ia presente invención dicho envase activo se encuentra recubierto por al menos extracto de canela, tomillo, clavo, orégano o cualquier combinación de los mismos.

En cuanto a los aceites esenciales, estos son líquidos que contienen compuestos relativamente volátiles, generalmente insolubles en agua, pero solubles en disolventes de tipo orgánico. En su mayoría no son oleosos al tacto y tienen un olor penetrante. Dependiendo de su estructura química sus componentes pueden agruparse en hasta cinco familias químicas diferentes: alcoholes, esteres, cetonas, aldehidos y ácidos. Los aceites

esenciales proceden de diversas partes de los vegetales, de las raíces, tallo, corteza, hojas, flores ó frutos.

El método de obtención más común del aceite esencial es por destilación con arrastre de vapor, aunque también se obtiene por extracción, bien con disolventes o con fluidos supercríticos y posteriormente se suele someter a un proceso de purificación por destilación a vacío.

Los principales componentes de los aceites esenciales son hidrocarburos alifáticos y aromáticos, alcoholes, aldehidos, esteres y cetonas. Desde el punto de vista de Ia parafina activa los componentes más importantes, aunque minoritarios, son los derivados biológicos del ácido mavalónico y se les cataloga como terpenos. Los derivados terpenos (monoterpenos C10 y sesquiterpenos C15) pueden ser los principales responsables de las propiedades anti microbianas de los aceites esenciales.

Como agentes activos se han utilizado extractos de esencias naturales de canela, clavo, orégano ó tomillo. En los ensayos realizados con Ia parafina activa, los mejores resultados se han obtenido con los aceites esenciales de canela (Canela ≡ Cinnamon zeylanicum N ⁰ CAS: 80591-6) natural, llamado Canela I, y aditivado, que llamaremos Canela II. El aceite esencial de canela II, es un derivado del aceite esencial de canela fortificado con el terpeno-derivado cinamaldehído, el cual se supone uno de los principales responsables de Ia acción antimicrobiana de Ia esencia de canela y con otros componentes que actúan como fijadores de los compuestos volátiles. Además de los mencionados, otros componentes de los aceites esenciales de canela son por ejemplo el alfa-pineno, estragol, ó beta-caryophileno.

La composición exacta del aceite esencial de canela es desconocida debido a que varía mucho dependiendo de diversos factores: especie de canela utilizada, parte de Ia planta de donde se ha obtenido el aceite esencial, etc.

Se ha demostrado, en los ejemplos de Ia presente invención, que Ia parafina activa empleando Ia formulación llamada canela (II) tiene claro

efecto antimicrobiano y antifúngico, con inhibición total en mohos y levaduras en concentración igual o superior a 2% en peso de esencia formulada respecto a Ia parafina.

También se observa que una vez preparada Ia parafina activa, almacenada a temperatura ambiente, conserva Ia actividad durante al menos 70 días antes de su uso.

Como se ha indicado anteriormente, el envase activo de Ia presente invención puede estar constituido por cualquier compuesto capaz de ser utilizado para el envasado de alimentos y capaz de aportar los agentes activos descritos en Ia presente invención de forma que protejan al alimento o bien absorban aquellos que Io deterioran. En una realización preferida de Ia invención dicho compuesto es una formulación de parafina sólida, aditivada o no, o una emulsión de parafina. Por emulsión de parafina entendemos una dispersión en agua de partículas de parafina junto con aditivos de un tamaño de partícula aproximado de una miera y con una estabilidad mínima de 3 meses. En una realización aún más preferida de Ia invención, se utiliza una emulsión denominada REDEMUL P-58 que además de Ia parafina incorpora en su formulación otros componentes capaces de estabilizar Ia muestra y por otro lado, permitir Ia liberación gradual de los agentes activos que se incorporan. Esta emulsión, es una emulsión aniónica-no iónica con un contenido en sólidos del 50 %, una gran capacidad de recubrimiento y altamente resistente a aguas duras. En otra realización aún más preferida, se utiliza una parafina sólida aditivada denominada REDECOAT P-400 que además de Ia parafina, incorpora en su formulación otros componentes capaces de estabilizar Ia muestra y por otro lado, permitir Ia liberación gradual de los agentes activos que se incorporan.

Además, las parafinas o productos similares deben cumplir una serie de características físico-químicas para poder ser utilizadas en el campo de Ia presente invención, dependiendo de si se trata de parafinas sólidas o emulsionadas.

Las características de Ia parafina sólida se pueden determinar mediante varias normativas equivalentes, en Ia Tabla 2 se indican los rangos que

deben cumplir estos productos

Tabla 2.- Características físico-químicas típicas de las parafinas ASTM American Society for Testing and Materials (cSt) centistokes

*La viscosidad de estos productos tiene un rango muy amplio. Puede medirse además a varias temperaturas (el subíndice indica Ia temperatura de medida), Io que amplia aún más el rango de valores. La viscosidad puede medirse también como viscosidad dinámica.

En cuanto a las parafinas emulsionadas, en general no existen métodos normalizados para determinar las características de Ia parafina emulsionada, por Io que Ia determinación se suele realizar mediante procedimientos internos. En Ia Tabla 3 se indican los rangos que deben cumplir las emulsiones para funcionar como barrera antihumedad y como envase activo.

Tabla 3.- Características físico-químicas típicas de las emulsiones (cPs) centipoises

*La viscosidad de estos productos tiene un rango muy amplio. Puede medirse además a varias temperaturas (el subíndice indica Ia temperatura de medida), Io que amplia aún más el rango de valores, pero Io habitual es hacerlo a temperatura ambiente.

La parafina se puede aplicar sobre el soporte en caliente, utilizando parafina sólida fundida, o en frío, utilizando parafina emulsionada. Para conseguir que Ia emulsión de parafina sea manejable en frío, se pueden añadir tensioactivos que consiguen que se mantenga estable a Io largo del tiempo y que tenga una viscosidad adecuada a temperatura ambiente.

Por Io tanto, Ia composición de parafina del envase activo de Ia siguiente invención puede incorporar un tensoactivo que consigue que se mantenga estable a Io largo del tiempo y que tenga una viscosidad adecuada a temperatura ambiente.

Los tensioactivos pueden ser iónicos, si proporcionan carga eléctrica a las partículas de parafina dispersas, o no iónicos si no proporcionan carga eléctrica. Los tensioactivos iónicos pueden ser a su vez aniónicos, si Ia carga es negativa o catiónicos si Ia carga es positiva. Las emulsiones más habituales para esta aplicación son las aniónicas o aniónicas-no iónicas, aunque también es posible utilizar catiónicas o no iónicas en función del tipo de soporte. Además de tensioactivos, también se puede añadir a Ia emulsión otro tipo de aditivos como espesantes, aligerantes colorantes... etc. en función de Ia aplicación específica en Ia que se va a utilizar Ia emulsión.

Se pueden agregar una gran variedad de aditivos a Ia parafina activa para conseguir un mayor control sobre Ia liberación de los componentes de los aceites esenciales. Estos fijadores, añadidos en Ia proporción adecuada, consiguen que los compuestos activos se incorporen a Ia atmósfera del envase o al propio producto más lentamente, es decir de forma progresiva.

Las parafinas utilizadas en los ejemplos de Ia presente invención, son formulaciones que contienen componentes tensoactivos o fijadores de los compuestos volátiles aportados por los aceites esenciales.

El soporte del envase activo que se describe en Ia presente invención puede ser, pero sin limitarse, de papel, cartón, madera, corcho o aluminio y sobre dicho soporte se adiciona el recubrimiento activo con un gramaje preferido de entre 0,5 y 30 g/m ² aún mas preferido de entre 1 y 15 g/m ² .

Los microorganismos en los que se ha ensayado Ia parafina activa son representativos de los que habitualmente actúan como patógenos alimentarios: bacterias Gram. positivas y negativas, mohos y levaduras. Las bacterias Gram. + actúan sobre productos cárnicos en general, embutidos y cereales. También pueden aparecer por malas prácticas higiénicas y contaminación de aguas. Las bacterias Gram. - aparecen en los productos frescos: carne, aves, huevos, etc. Además, también surgen por mala manipulación de los alimentos o por contaminación fecal. Los mohos crecen principalmente en alimentos secos, pan, queso, cereales, frutos secos y también en frutas. La levadura C. albicans suele crecer en Ia pasta, el pan o las patatas. Otras levaduras también surgen en diversas variedades de fruta.

Algunas de las bacterias Gram. negativas pueden ser P. aeruginosa, S. choleraesuis, Y. enterocolitica o E. coli. Como bacterias Gram. positivas: E. faecalis, L. monocytogenes, S. aureus o B. cereus, como levadura: C. albicans o Z. roxii y como mohos: P. nalgiovense, E. repens, P. islandicum, P. roqueforti ,A. flavus, B. cinérea, P. expansum, P. digitatum o D. hansenii.

Como demuestran los ejemplos de Ia presente invención, los ensayos han sido realizados con cultivos de las cepas señaladas en concentraciones muy superiores a las que pueden iniciarse o generarse como deterioro espontáneo de los alimentos. Esto significa que en condiciones de uso normal algunas de las formulaciones ensayadas pueden mostrar también actividad inhibitoria, ya que microorganismos que no se consideran inhibidos en el ensayo de laboratorio porque Ia disminución de Ia concentración de colonias no es total, se ven alterados cuando están en alta concentración y presumiblemente serán inhibidos a bajas concentraciones. En consecuencia, no se pueden descartar ninguna de las esencias ensayadas.

Por lo tanto, el envase activo de Ia presente invención es capaz de inhibir el crecimiento de al menos los siguientes patógenos alimentarios: bacterias Gram negativas (Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Yersinia enterocolitica o Salmonella choleraesuis), bacterias Gram positivas (Staphylococcus aureus, Lysteria monocytogenes, Enterococcus faecalis o Bacillus cereus), mohos (Penicillium islandicum, Penicillium roquefort\, Penicillium nalgiovense, Aspergillus flavus y Eurotium repens) o Ia levadura C. albicans.

En un segundo aspecto de Ia presente invención, se proporciona el uso del envase activo para Ia inhibición del crecimiento de patógenos alimentarios. En particular su uso como antioxidante, conservante, antimicrobiano o antifúngico en cualquier tipo de alimentos, secos o húmedos.

Mas particularmente se describe el uso del envase activo definido anteriormente para Ia inhibición del crecimiento de las bacterias Gram negativas (Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Yersinia enterocolitica ó Salmonella choleraesuis), las bacterias Gram positivas (Staphylococcus aureus, Lysteria monocytogenes, Enterococcus faecalis ó Bacillus cereus), mohos (Penicillium islandicum, Penicillium roquefort\, Penicillium nalgiovense, Aspergillus flavus ó Eurotium repens) ó Ia levadura C. albicans.

En otro aspecto de Ia presente invención se proporciona el uso del envase activo descrito con anterioridad por generación de una atmósfera activa o por contacto directo del alimento.

En otro aspecto más de Ia presente invención se describe el método de obtención del envase activo descrito anteriormente, que comprende los siguientes pasos, a) preparación de Ia parafina activa b) Recubrimiento del soporte con Ia parafina preparada en el punto a).

Para Ia preparación de Ia parafina activa, dependiendo de si se trata de parafina sólida ó en emulsión se siguen los siguientes pasos.

En el caso de Ia parafina sólida: a) se funde Ia parafina b) se añaden los aditivos necesarios en el orden, T ^a y cantidad adecuada c) se añaden los aceites esenciales d) se agita y se deja enfriar a T ^a ambiente

En el caso de Ia parafina en emulsión

e) se procede según se describe en los pasos a) a c) del caso de Ia parafina sólida. f) se añaden los tensoactivos necesarios en el orden, T ^a y cantidad adecuada. Los hidrosolubles se tratan en agua y posteriormente esa fase acuosa, se hace reaccionar con Ia fase parafínica. g) se pasa por un homogenizador de alta presión para ajustar el tamaño de partícula h) se pasa por un intercambiador de calor para dejar Ia emulsión a temperatura ambiente.

El aceite esencial se incorpora en un porcentaje preferentemente de entre el 2-10% en peso de Ia parafina. En el caso de que el aceite esencial sea de canela, el resultado es una parafina de color crema y olor a canela, tanto mayor cuanto mayor es el porcentaje de aceite esencial incorporado.

En el caso de que el aceite esencial añadido sea de canela I o de canela II, se ha demostrado que si el porcentaje de aceite esencial que se añade a Ia formulación de parafina es superior al 10%, al agitar Ia mezcla se produce Ia desnaturalización de Ia formulación de parafina, Ia cual pierde sus propiedades mecánicas y físicas, con Io que no se puede utilizar para recubrimiento. Este comportamiento puede extenderse a otros aceites esenciales.

Para conseguir una buena barrera antihumedad, incluso en cartones que permanecen en frigoríficos largos periodos de tiempo, el gramaje aconsejado debe estar entre 1 y 15 g/m ² , más preferentemente entre 5 y 10 g/m ² , aunque Ia elección del gramaje esta en función de Ia calidad del

papel. Papeles de baja calidad, reciclados o de bajo g ramaje, necesitan mayor cantidad de parafina que papeles de alta calidad tipo Kraft de alto gramaje. Cuanto mayor sea Ia calidad del papel mayor será Ia duración de Ia barrera.

Los ensayos realizados con diferente gramaje no muestran diferencias significativas en su comportamiento antimicrobiano, Io cual significa que el mecanismo principal de actuación tiene lugar desde Ia superficie de Ia parafina, a partir de Ia cual se genera una atmósfera activa protectora, con concentraciones variables de los componentes volátiles aportados por los agentes antimicrobianos empleados (canela (II), etc).

La emulsión se puede aplicar pura o diluida. La dilución de Ia emulsión depende fundamentalmente de Ia velocidad de Ia cinta transportadora y de Ia temperatura de los rodillos calientes. Aunque es aconsejable realizar un ajuste individualizado de las condiciones en cada maquinaria para conseguir el gramaje adecuado, en Ia siguiente tabla se indican de forma aproximada Ia dilución aconsejada en función de las condiciones de proceso:

Otro aspecto de Ia presente invención radica en Ia aplicación de Ia emulsión. El lugar preferido de aplicación de Ia emulsión es en Ia cinta transportadora justo antes de entrar en contacto con el rodillo caliente. El recubrimiento del papel por Ia emulsión se suele realizar por un sistema de rodillos aplicadores. (Ver Figura 1).

El proceso se realiza de Ia siguiente manera; un rodillo de impregnación, tipo unilox, entra en un baño de emulsión situado justo debajo de él y baña el rodillo aplicador, de caucho, que distribuye Ia emulsión sobre el papel

que pasa por Ia parte superior del rodillo. El exceso de emulsión se retira con una cuchilla colocada a Ia salida del dispositivo de aplicación y se incorpora al depósito original. La dosificación de emulsión sobre el papel se ajusta con otro rodillo metálico cuya distancia con el rodillo de impregnación es graduable (Figura 1).

Como se ha descrito anteriormente, Ia dilución de Ia emulsión depende fundamentalmente de Ia velocidad de Ia cinta transportadora y de Ia temperatura de los rodillos calientes, pudiendo superar los 15O ⁰ C. Esto en principio podría suponer un problema a Ia hora de Ia aplicación de Ia nueva parafina activa, puesto que los componentes del aceite esencial, que son los responsables del efecto antimicrobiano, son volátiles y se desprenden del soporte con Ia temperatura, con Io que Ia capacidad antimicrobiana podría verse disminuida dependiendo de Ia temperatura (y duración del proceso) a Ia que sean sometidos. No obstante, tanto en Ia composición de Ia formulación de parafina como en Ia mezcla final, existen componentes tensoactivos polares, entre otros, capaces de fijar los componentes volátiles en Ia formulación y por tanto, retenerlos cuando Ia temperatura aumenta, manteniendo de esta forma Ia capacidad antimicrobiana de Ia formulación final.

El mecanismo de actuación de Ia nueva parafina activa, tiene lugar por las mismas leyes que rigen procesos como Ia migración de sustancias del envase al alimento. En este caso, los componentes de los aceites esenciales, derivados del terpeno en su mayoría y que son los que poseen Ia capacidad antimicrobiana, migran desde Ia superficie de Ia parafina activa a Ia atmósfera o quedan directamente en dicha superficie formando una interfase con el alimento (caso de que sea por contacto directo) por un mecanismo de transferencia de masa. Así mismo, también ha de haber un mecanismo de transferencia de masa por el cual los compuestos difunden desde Ia matriz de Ia parafina a Ia superficie de Ia misma. Estos mecanismos actúan mientras se mantengan los correspondientes gradientes de concentraciones. No obstante, los resultados obtenidos sugieren que el equilibrio se alcanza siempre, de forma que una vez liberados los compuestos en superficie, Ia capa de parafina activa no está agotada, siendo capaz de regenerar de nuevo Ia atmósfera antimicrobiana

y seguir actuando durante mucho tiempo. La independencia observada en Ia actividad antimicrobiana respecto al espesor de parafina aplicada, confirma este comportamiento.

En general, Ia velocidad a Ia cual el material se transfiere depende de Ia naturaleza de las sustancias químicas que se transfieren, del tipo de aditivos utilizados en Ia formulación de Ia parafina activa, del alimento, y también de Ia naturaleza o Ia forma del envase.

En esta invención se entiende por efecto bactericida, aquél que aniquila completamente al microorganismo mientras que efecto bacteriostático es aquél que tan sólo retrasa el crecimiento del microorganismo.

En Ia presente invención todos los términos técnicos y científicos tienen el mismo significado que el comúnmente entendido por un experto en Ia materia a Ia que Ia invención pertenece. A Io largo de Ia descripción y las reivindicaciones Ia palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, componentes o pasos. Para los expertos en Ia materia, otros objetos, ventajas y características de Ia invención se desprenderán en parte de Ia descripción y en parte de Ia práctica de Ia invención. Los siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de Ia presente invención.

DESCRIPCIóN DE LAS FIGURAS

Figura 1.

En Ia figura se muestra el proceso de recubrimiento del papel por Ia emulsión, donde un rodillo de impregnación (c), tipo unilox, entra en un baño de emulsión situado justo debajo de él y baña el rodillo aplicador, de caucho, que distribuye Ia emulsión sobre el papel que pasa por Ia parte superior del rodillo. El exceso de emulsión se retira con una cuchilla colocada a Ia salida del dispositivo de aplicación y se incorpora al depósito original. La dosificación de emulsión sobre el papel se ajusta con otro rodillo metálico cuya distancia con el rodillo de impregnación es graduable. A continuación se describen las partes mas características de Ia figura 1.

a) Papel virgen b) Papel parafinado c) Rodillo de impregnación d) Contenedor de emulsión

Figura 2

Figura 2a. Placa Petri con papel activo (vista anterior) Figura 2b. Placa Petri con papel activo (vista posterior)

Figura 3. C. albicans con esencia de canela Il al 4%. Se observa inhibición total.

En esta figura se muestra una placa control (derecha) y una placa de C. Albicans con extracto de canela Il al 4%. Se puede observar que en Ia placa que ha estado con el papel parafinado no se ha producido crecimiento en absoluto (inhibición total).

Figura 4. Placa del moho A. flavus con un 4% de Ia esencia de canela Il en Ia parafina (derecha) y placa control.

Se puede observar que en Ia placa que ha estado con el papel parafinado no se ha producido crecimiento en absoluto (inhibición total).

Figura 5. Placa de Ia bacteria B. cereus con un 4% de Ia esencia de canela Il en Ia parafina (derecha) y placa control.

Se observa el mismo crecimiento en ambas placas, no hay inhibición.

Figura 6. Placa de E. coli con canela Il al 6% (derecha) y placa control.

Se observa un menor tamaño de las UFC respecto de las de Ia placa control.

Figura 7.

Resultados parciales del ensayo del envase parafínico antimicrobiano con fresas

En Ia imagen se muestran las fresas, transcurridos 6 días desde el inicio del ensayo. A Ia izquierda de Ia imagen se puede ver el envase con canela Il al 4%, en el centro el envase control, esto es, en el papel parafinado SIN esencia de canela Il y a Ia derecha el envase con canela Il al 2%.

Se observan alteraciones (aparición de mohos, contracción de Ia pieza de fruta o exudado de jugos) en las fresas que están sobre el envase control y en las que están sobre el envase con canela Il al 2% . En el envase con el componente activo (canela II) al 4%, se observa Ia ausencia del exudado de jugo, característico de Ia putrefacción de Ia fresa, Ia ausencia de contracción de Ia pieza de fruta y Ia no proliferación de mohos.

EXPOSICIóN DETALLADA DE MODOS DE REALIZACIóN

A continuación se ilustrará Ia invención mediante unos ensayos realizados por los inventores, que pone de manifiesto Ia efectividad del envase parafinado activo.

Ejemplo 1.

Para Ia obtención del envase parafinado activo: se mezcla homogéneamente Ia parafina preparada tal como se describe en Ia memoria de Ia presente invención con el aceite esencial natural al porcentaje deseado, por ejemplo canela al 6% en peso. Posteriormente, se recubre una hoja de papel con el producto resultante y para ello se utiliza una máquina automática de recubrimiento, de este modo se consigue un recubrimiento más homogéneo. El gramaje del recubrimiento (3-4 g/m2) se controla por pesada. De esta forma se obtienen las hojas de papel parafinado activo, que se almacenan a temperatura ambiente hasta el día siguiente en que son utilizadas. Una vez preparada Ia parafina activa, ésta

se aplica de Ia misma forma que Ia formulación de parafina convencional sin agentes activos

Ejemplo 2.

2.1 PARAFINA BASE UTILIZADA EN LA EXPERIMENTACION.-

Parafina sólida.-

Para comprobar los efectos de los inhibidores de patógenos se realizó una formulación con Ia parafina hidrogenada de N ⁰ CAS: 64742-51-4. Esta preparación cumplía con las diferentes normativas que afectan a los productos en contacto con alimentos (principalmente FDA, epígrafes FDA 176.170 y FDA 176.180 y BGVV XXV A). En Ia Tabla 4 se indican las principales características de esta formulación.

Tabla 4.- Características físico-químicas típicas de Ia parafina utilizada en el experimento ASTM American Society for Testing and Materials (cSt) centistokes

Parafina emulsionada.-

Para comprobar el efecto de Ia emulsión de parafina se formuló una emulsión aniónica-no iónica de Ia parafina descrita anteriormente. Las características de esta emulsión se indican en Ia Tabla 5

Tabla 5.- Características fisico-quϊmicas típicas de la emulsión utilizada en el experimento

(cPs) centiPoises

2.2 PORCENTAJES MáXIMOS DE ACEITES ESENCIALES

Se han realizado los ensayos microbiológicos con parafina activa de las distintas esencias naturales: canela, canela II, orégano, clavo, tomillo y citronella.

Los porcentajes de incorporación de los diferentes aceites esenciales varían dentro del rango que admite, sin que se vean modificadas las propiedades mecánicas de Ia parafina para cada esencia (ver Tabla 6).

Tabla 6. Porcentajes máximos de aceites esenciales incorporados a Ia parafina.

Aceite esencial Porcentaje (en peso)

Canela 10 %

Canela Il 10 %

Orégano 6 %

Clavo 6 %

Citronella 8 %

Tomillo 6 %

Ejemplo 3.

FORMULACIóN DE ENVASE ACTIVO

La formulación del envase activo se ha realizado mediante Ia siguiente metodología:

En el caso de Ia parafina sólida, se fundió Ia parafina a una temperatura de 110 ± 5 ⁰ C, añadiendo los aditivos pertinentes en cada caso y agitando durante un tiempo de 25 ± 3 minutos, tras los cuales se disminuyó Ia temperatura a 95 ± 5 ⁰ C y se añadieron los aceites esenciales, agitándose de nuevo durante un tiempo de 10 ± 1 minutos. Posteriormente se añadieron el resto de los aditivos y se volvió a agitar durante un tiempo de 15 ± 1 m. Se dejó enfriar a temperatura ambiente.

En el caso de Ia parafina en emulsión, se preparó Ia fase parafínica de Ia misma manera que en el caso de Ia parafina sólida, es decir, se fundió Ia parafina a una temperatura de 110 ± 5 ⁰ C, añadiéndole los aditivos en el orden y cantidad especificados y agitando durante un tiempo de 25 ± 3 minutos, tras los cuales se disminuyó Ia temperatura a 95 ± 5 ⁰ C y se añadieron los aceites esenciales, agitándose de nuevo durante un tiempo de 10 ± 1 minutos. Posteriormente se añadieron el resto de los aditivos y se volvió a agitar durante un tiempo de 15 ± 1 m.

En este punto, a diferencia del anterior, se añadieron los tensioactivos y se dejó enfriar hasta 70 ± 5 ⁰ C. En un recipiente independiente se calentó agua a 70 ± 5 ⁰ C y se añadieron los tensioactivos hidrosolubles. Se hizo reaccionar Ia fase parafínica y Ia fase acuosa en un reactor aparte a 70 ± 5 ⁰ C. Posteriormente se pasó por un homogenizador de alta presión para ajustar el tamaño de partícula y por último se pasó por un intercambiador de calor para dejar Ia emulsión a temperatura ambiente.

Ejemplo 4.

ENSAYO ANTIMICROBIANO

Para el ensayo antimicrobiano: en una placa Petri, se adiciona el medio de cultivo idóneo para el crecimiento de cada microorganismo. Los medios de cultivo son las disoluciones nutritivas que se usan en el laboratorio para el cultivo de los microorganismos en las condiciones más favorables. A

continuación, se inoculan 100 μl de una dilución (concentración de inoculación 10 ⁴ UFCVml) del microorganismo en cuestión y se extiende por el medio de cultivo utilizando un asa estéril. Una vez inoculado el medio, se coloca el papel parafinado activo en Ia cara opuesta al medio inoculado de Ia placa y se sujeta con una brida. En todo momento se procura que el papel activo no quede en contacto con el medio inoculado, (ver figuras 2a y 2b).

La placa Petri, así dispuesta, se incuba en una estufa en las condiciones (ver Tabla 7) que favorecen el crecimiento microbiano. En todos los casos se realiza siempre un ensayo control, que sigue idéntico procedimiento al descrito anteriormente pero en lugar de poner el papel activo, se coloca Ia tapa de Ia placa Petri.

Tabla 7. Condiciones de cultivo microbianas.

Microorganismo Tiempo (días) Temperatura ( ⁰ C)

Gram. + 2 30

Gram. - 1 30

Mohos 7 36,5

Levaduras 2 30

Concentración de inoculación: 10 ⁴ UFC/ml

Para Ia estimación del crecimiento microbiano producido en las placas, se usa el método del recuento de células viables. Este recuento se hace por conteo directo de las unidades formadoras de colonias (UFC) que aparecen en Ia placa. A menor número de UFC, mayor actividad antimicrobiana del papel activo. Además, el número de UFC se compara con el del ensayo control, que no ha estado en contacto con el papel activo.

Los resultados obtenidos para estos ensayos se detallan a continuación:

¹ UFC: Unidad formadora de colonias

• En el caso de los aceites esenciales de orégano, clavo, tomillo y citronella, el papel recubierto con Ia parafina activa (al máximo porcentaje de incorporación de esencia que admite Ia parafina) no mostró actividad antimicrobiana alguna.

• Para el aceite esencial de canela, Ia parafina preparada según el ejemplo 3, sí posee cierta actividad antifúngica (inhibe el crecimiento de algunas especies de hongos) aunque no posee actividad anti bacteriana. Se ha observado inhibición total del moho P. islandicum. La placa de control (sin el papel parafinado activo) tuvo un crecimiento de 14 unidades formadoras de colonias (UFC) mientras que en Ia placa con papel parafinado con esencia de canela al 4% en peso no creció ninguna UFC. En el caso de Ia levadura C. albicans, Ia parafina con canela al 10% dio lugar a una inhibición total (0 UFC de Ia placa con el papel activo frente a ~3500 UFC de Ia placa control) pero al bajar el porcentaje de incorporación de canela al 4% no se observa inhibición, esto es, el número de UFC es similar al de Ia placa control ~3500 UFC. Para las bacterias, tanto Gram. positivas como negativas, el papel parafinado con aceite esencial de canela no inhibe el crecimiento de los microorganismos. Es decir, no hay diferencias de crecimiento respecto de las placas control.

• Los mejores resultados se han obtenido para el aceite esencial de canela II, es decir de todas las esencias ensayadas, el aceite esencial de canela Il es el que mayor actividad antimicrobiana ha demostrado.

> Ensayos con esencia de canela Il y Levaduras.

Se observa inhibición total de Ia levadura C. albicans, con un porcentaje de esencia respecto de Ia parafina del 4% en peso. En Ia Figura 3 se compara con Ia placa control (dcha.) y se observa que se ha producido Ia inhibición total.

> Ensayos con esencia de canela Il y Mohos

Inhibición total de todos los mohos (A. flavus, P. islandicum, P. roqueforti, P. nalgiovense y E. repens) con un porcentaje del 4% de Ia esencia en Ia parafina. En Ia Figura 4 se compara con Ia placa control (izq.) y se observa que se ha producido Ia inhibición total.

> Ensayos con esencia de canela Il y Bacterias Bacterias Gram. positivas (E. faecalis, L. monocytogenes, B. cereus y S. aureus). No hay inhibición a ninguna concentración de esencia. Ver Figura 5, B cereus con canela Il al 4% (drcha.) y placa control. Bacterias Gram. negativas (Y. enterocolitica, E. coli, S. choleraesuis y P. aeruginosa). Existe un claro efecto inhibitorio pero es muy poco reproducible. Por ejemplo, para un mismo porcentaje de esencia en Ia parafina y para un mismo microorganismo, se han observado % de inhibición (relación UFC de Ia placa del ensayo respecto del control) en un rango del 100 al 0%.

En muchos casos, no hay una inhibición total pero se observa claramente que las unidades formadoras de colonias tienen un tamaño menor que las UFC de Ia placa control. (Ver Figura 6, E. coli con canela Il al 6% (dcha) y placa control. Se observa un menor tamaño de las UFC respecto de las de Ia placa control). De igual modo, las colonias de P. aeruginosa de las placas con el envase activo presentan un color más pálido y amarillento que las colonias de Ia placa control (color verde brillante). En ambos casos, estas características indican anomalías en el crecimiento del microorganismo.

Ejemplo 5.

ESTUDIO DE LA ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA EN EL TIEMPO

Con el objeto de medir Ia duración de Ia actividad antimicrobiana del papel activo, se han efectuado ensayos espaciados en el tiempo con láminas

hechas un día determinado y almacenadas después hasta el día del ensayo. Se han realizado dos réplicas por cada ensayo, con su correspondiente placa control. El papel activo utilizado tiene Ia siguiente composición: papel de oficina recubierto de Ia forma habitual con parafina en emulsión (P-58) conteniendo un 4% en peso de Canela II. El gramaje aplicado es de 4g/m ² . Estas láminas de papel activo son almacenadas en archivadores de plástico (no estancos) y a una temperatura ambiente aproximada de entre 3 y 1O ⁰ C. Como microorganismos han sido seleccionados el moho A. flavus y Ia levadura C. albicans ya que, por ensayos previos, se sabe que a ese porcentaje de Canela Il (4%) inhibe totalmente el crecimiento de las colonias. Las bacterias del tipo Gram. - no han sido estudiadas porque de los resultados previos se desprende que Ia inhibición es parcial y poco reproducible.

Resultados

Tanto para C. albicans como para A. flavus, se ha observado una inhibición total en ambas réplicas con un tiempo de almacenamiento de Ia lámina de hasta 71 días. En el caso del moho, los controles oscilan entre 104 y 105 unidades formadoras de colonias. En Ia levadura, los controles mostraron entre 300 y 900 UFC.

Ejemplo 6.

RESULTADOS DEL ENSAYO DEL ENVASE ACTIVO PARA LA CONSERVACIóN DE FRESAS

En este ejemplo se utilizó como alimento perecedero, fresas de distintas variedades.

Se compararon los resultados en el tiempo de fresas en contacto con un envase control con papel parafinado SIN esencia incorporada y con papel parafinado, con esencia de canela Il incorporada al 4% en peso.

Transcurridos 6 días desde el inicio del ensayo se pudo observar que las fresas del envase con canela Il al 4% no presentan alteraciones

apreciables ni siquiera en una etapa inicial, como demuestra Ia ausencia de exudado de jugo. Por otro lado, en el envase control se observa junto al exudado, proliferación de moho.