目前， 植物病原菌的检测主要采用常规病原菌分离培 养技术， 该方法费时、 费力， 且不 能检测专性寄生菌。 后来发展起来的免疫学技术和分子生物学方法 ， 如 PCR等， 这类方法能 准确、 灵敏、 快速地对植物病原菌进行定性及定量检测， 但是不能检测其活性。 然而， 植物 病原菌的活性评价， 是对病害进行准确预测预报的基础。 国内外关于植物病原菌活性检测分 析的研究较少， 主要采用传统的孢子萌发计数法 （Colony Forming Units, CFU) , 该方法虽 然对活性的检测准确、 可靠， 但检测时间较长。

荧光染色法是医学上检测细胞凋亡和细胞坏死 的重要手段。 细胞凋亡或坏死后， 会发生 细胞体积变化、 细胞膜通透性改变、 核 DNA 降解等变化， 根据这些特征， 选择适合的荧光 染料， 可以准确检测细胞状态。 植物病原菌细胞凋亡的表型和生理特征与动物 细胞相似， 而 且细胞结构和代谢过程简单。 目前， 荧光染色法在病原菌研究方面有少数报道， 利用坏死细 胞的特异性荧光染料碘化丙啶检测大豆猝死综 合病菌的活性， SYTOX Green用于检测环境及 水中的人类致病菌大肠杆菌和沙门氏菌的活性 。

高通量筛选（High thro ghput screening, HTS )技术是发现创新药物的重要技术手段之一， 己成为制药和生物技术研究中的重要工具。 现代农业对于杀菌剂的依赖越来越强， 随着环境 和消费安全的呼声日益提高， 以及有害生物抗药性的产生使杀菌剂使用寿命 缩短。 新农药的 创制与开发越来越迫切， 也越来越困难。 据统计， 一个高效、 低毒、 环境友好型新农药的成 功开发， 需要合成筛选 8万个化合物， 耗资上亿元。 这对新型杀菌剂的合成和筛选都提出了 新的挑战。 目前， 我国多采用孢子萌发法和菌丝生长速率法进行 杀菌剂的筛选， 而随着新型 杀菌剂创制技术的快速发展， 要求建立一种简单、 快速的筛选新化合物的方法。

通过对植物病原菌活性评价和杀菌剂筛选的现 有技术分析可以看出， 现有技术费时、 费 力、 而且成本较高或需要昂贵的仪器设备， 急需一种简单易行、 成本低廉、 不需昂贵仪器设 备就能进行快速定量植物病原菌活性评价的新 方法。 说 明 书

发明内容 本发明的目的是针对目前植物病原菌活性检测 和杀菌剂筛选费工、 费时， 检测结果不稳 定、 费用高等问题， 提供一种基于双重荧光染色的植物病原菌活性 评价和杀菌剂高通量筛选 方法及试剂盒， 通过检测病原菌有活力和无活力孢子或菌丝细 胞的荧光信号， 确定病原菌活 性， 实现杀菌剂的药效评价和高通量筛选。 该方法及试剂盒具有操作简单易行、检测时间 短、 检测量大、 成本低廉、 可同时评价多种杀菌剂的药效等特点， 可以广泛应用于杀菌剂筛选、 毒性评价、 食品安全评价、 水质评价等领域。 具体内容如下：

1、 一种基于双重荧光染色的植物病原菌活性评价 和杀菌剂高通量筛选方法

本发明公开一种植物病原菌活性评价和杀菌剂 高通量筛选方法， 以微量滴定板作为工具 载体， 采用两种不同的荧光染料， 分别对植物病原菌有活力和无活力的孢子或菌 丝细胞进行 荧光标记， 由于有活力与无活力孢子或菌丝细胞着色不同 ， 利用荧光显微镜或流式细胞仪检 测荧光信号， 并统计病原菌存活率， 可直接反映植物病原菌的活性， 实现杀菌剂药效评价及 高通量筛选。

该方法应用的第一种荧光染料可使有活力孢子 或菌丝细胞着色产生特定荧光， 选自吖啶 橙（AO)、荧光素二醋酸醋（FDA)、 Hoechst 33258 4'，6-二脒基 -2-苯基吲哚（DAPI)、 Annexin V-FITC等中的一种，但不限于此；第二种荧光染 料可使死孢子或菌丝细胞着色产生特定荧光， 选自碘化丙啶 （PI)、 溴化乙啶 （EB)、 SYTOX等中的一种， 但不限于此。

其中， 第一种荧光染料 AO的工作浓度为 10-1000 g/mL, 488 nm蓝色光激发下， 使活 细胞核呈绿色或黄绿色均匀荧光； FDA的工作浓度为 100-1000 g/mL， 488 nm蓝色光激发下， 在活细胞中产生绿色荧光； Hoechst 33258的工作浓度为 1-100 g/mL, 350 nm紫外光激发下， 活细胞发出蓝色荧光； DAPI的工作浓度为 5-500 g/mL， 358 nm紫外光照射时， 活细胞发 出亮蓝色荧光； Annexin V-FITC的工作浓度为 5-500 g mL， 480nm蓝色光激发下， 活细胞发 出绿色荧光； 第二种荧光染料 PI的工作浓度为 5-1000 _M g/mL, 358 nm紫外光激发下， 使死 细胞产生红色荧光； EB工作浓度为 10-1000 g/mL， 使死细胞产生桔黄色荧光； SYTOX的 工作浓度为 O.l-l g/mL, 使坏死细胞发绿色荧光。

其中， 第一种荧光染料 AO的染色时间为避光处理 10-25 min, FDA的染色时间为 5-40 min, Hoechst 33258的染色时间为 15-50 min, DAPI的染色时间为 3-15 min， Annexin V-FITC 的染色时间为避光处理 15-40 min; 第二种荧光染料 PI的染色时间为避光处理 4-30 min, EB 的染色时间为 20-40 min, SYTOX的染色时间为 5-20 min。

该方法中植物病原菌是人工纯培养获得， 或者是从病害组织中富集获得。 植物病原菌活 性评价的检测对象包括， 植物病原真菌的菌丝细胞或孢子， 植物病原细菌的孢子， 芸薹根肿 菌的休眠孢子。

将植物病原菌孢子或菌丝悬浮液， 等量加入含多个孔的微量滴定板中， 每孔孢子数量为 10 ² Ί0 ⁵ 个。 按次序分别加入两种荧光染料， 染色温度为 4-35°C。 最后， 采用流式细胞仪、 荧 光显微镜或荧光光谱仪检测荧光信号， 对植物病原菌活性进行定量评价。 说 明 书

~"该方法可广泛应用于新型化合物筛选、 杀菌剂筛选、 食品安全评价及水质评价等领域。

2、 一种基于双重荧光染色的植物病原菌活性评价 和杀菌剂高通量筛选试剂盒

利用本发明可制备成一种快速、定量评价植物 病原菌活性和杀菌剂高通量筛选的试剂盒， 该试剂盒含有一个或多个含多个孔的微量滴定 板， 两种荧光染料， 第一种荧光染料使有活力 植物病原菌孢子或菌丝细胞着色，第二种荧光 染料使无活力植物病原菌孢子或菌丝细胞着色 。

其中， 一个或多个含多个孔的微量滴定板， 从 12孔、 24孔、 96孔、 384孔、 1536孔微 量滴定板中进行选择， 其中以 96孔板和 384孔板最佳。微量滴定板每孔包含 1个或多个植物 病原菌孢子或菌丝，其中对于 96孔板，每孔 10 ³ -10 ⁵ 个孢子最佳；对于 384孔板，每孔 10 ² -10 ³ 个孢子最佳。

该试剂盒含有的第一种荧光染料选自吖啶橙 （AO )、 荧光素二醋酸醋 （FDA)、 Hoechst 33258、 4',6-二脒基 -2-苯基吲哚 （DAPI ) 等中的一种， 但不限于此， 可使有活力孢子或菌丝 细胞产生特定荧光： 第二种荧光染料选自碘化丙啶 （PI)、 溴化乙啶 （EB)、 SYT0X等中的 一种， 但不限于此， 可使死孢子或菌丝细胞产生特定荧光。

该试剂盒还可以包括一种或多种植物病原菌， 及该病原菌的培养介质与清洗介质， 该介 质可以是冻干形式或液体形式。

该试剂盒还可以包括杀菌剂高通量筛选说明书 ， 或者化合物或其他方法处理植物病原菌 的说明书。

该试剂盒还可以包括防治某种特定病原菌的对 照药剂。

3、在此项技术中， 还有许多有效的生物染色剂可用。不同的染色 剂在病原菌细胞或组织 的不同部位反应或集中， 并且可以使用这些特性来揭露特定部分区域。 可用的生物染色剂包 括， Hoest 33342、 胭脂红（Carmine)、 考马斯亮蓝（Coomassie blue)、 结晶紫、 DAPI、 伊红、 溴化乙锭、 品红、 苏木色精 （Haemat _0X ulin)、 碘、 孔雀石绿、 甲基氯、 亚甲基蓝、 中性红、 尼罗红、 四氧化锇、 罗丹明和沙黄（Safranin)等。 与背景技术相比本发明具有的有益效果是：

( 1 )本发明建立了适合于植物病原菌活性评价的� �光染色方法及工作环境， 包括： 荧光 染料类别的选择、 染色方法、 染色时间、 孵育环境、 荧光检测方法等；

(2 )所提供的方法及试剂盒可直接检测植物病原� �存活率， 操作简单， 设备、 费用要求 低， 在普通实验室就可实现；

(3 ) 从制样到完成检测仅需 30分钟， 可以直接对单个孢子或菌丝的活性进行判断， 具 有快速、 准确、 灵敏、 重复性好等特点， 有望替代传统的孢子萌发方法和菌丝生长速率 法， 适合于农业科研、 植物保护等部门使用；

(4)本发明提供的植物病原菌存活率检测方法及 试剂盒具有操作快速、可同时筛选多个 化合物等特点， 节省人力、 物力和时间， 可广泛应用于杀菌剂高通量筛选、 食品安全及水质 评价等方面。 说 明 书

附图说明

图 1为 FDA和 PI荧光染色法鉴别灰葡萄孢菌 Botrytis cinerea )分生孢子的活性。图中： A . 用荧光显微镜绿色偏振光观察， FDA染色后， 活孢子发绿色荧光； B . 在荧光显微镜下蓝 色偏振光观察， PI染色后， 死孢子发红色荧光； C . 活孢子和死孢子混合同时用 FDA和 PI 染色， 荧光显微镜下绿色偏振光下观察， 活孢子发绿色荧光， 死孢子发红色荧光。

图 2为 FDA和 PI荧光染色法鉴别茄病镰刀菌（ wrar/w^oto ')分生孢子和菌丝的活性。 图中： A. 用荧光显微镜绿色偏振光观察， FDA染色后， 活孢子和活菌丝发绿色荧光； B . 在 荧光显微镜下蓝色偏振光观察， PI 染色后， 死孢子和死菌丝发红色荧光； C . 有活力和无活 力孢子、 菌丝混合同时用 FDA和 PI染色， 绿色偏振光下观察， 活孢子和活菌丝发绿色荧光， 死孢子和死菌丝发红色荧光。

图 3为 FDA和 PI荧光染色法鉴别丁香假单胞菌流泪致病变种� ��P5«o/omcwa^ «gae pv. lachrymans )孢子的活性。 图中： A. 用荧光显微镜绿色偏振光观察， FDA染色后， 活孢子发 绿色荧光； B . 在荧光显微镜下蓝色偏振光观察， PI染色后， 死孢子发红色荧光。

图 4为 FDA和 PI荧光染色法鉴别芸薹根肿菌 ίΡΙ odiophora brassicae )孢子的活性。 图中： A. 用荧光显微镜绿色偏振光观察， FDA染色后， 活孢子发绿色荧光； B . 在荧光显微 镜下蓝色偏振光观察， PI染色后， 死孢子发红色荧光； C . 有活力和无活力孢子、 菌丝混合 同时用 FDA和 PI染色， 荧光显微镜下绿色偏振光下观察， 活孢子发绿色荧光， 死孢子发红 色荧光。

图 5为 Hoest 33258和 PI对灰葡萄孢菌孢子染色后，不同时间检测荧� ��强度。图中： A.染 色后不同时间， ％孔微量滴定板收集 PI荧光强度变化； B . 染色后不同时间， 384孔微量滴 定板收集 PI荧光强度变化； C. 染色后不同时间， 96孔微量滴定板收集 Hoest 33258荧光强度 变化； D. 染色后不同时间， 384孔微量滴定板收集 Hoest 33258荧光强度变化。

图 6为流式细胞仪检测瓜类炭疽菌 i Colletotrichum orbiculare )孢子活性定量分析。图中： A . 阴性对照管； B . Annexin V-FITC染色单阳管； C . PI染色单阴性管； D. 待测样品管。

图 7流式细胞仪检测瓜类炭疽菌有活力孢子比例� �孢子萌发率线性关系图。

图 8为杀菌剂对芸薹根肿菌休眠孢子活力影响。 图中： A. 甲基硫菌灵对芸薹根肿菌的灭 杀效果； B. 氟啶胺对芸薹根肿菌的灭杀效果。

图 9为 2 mg/mL氟啶胺处理对芸薹根肿菌 t Plasmodiophora bmssicae 休眠孢子活力的影 响。 图中： A. 2 mg/mL氟啶胺处理 10 min芸薹根肿菌休眠孢子生活力状态； B. 2 mg/mL氟啶胺 处理 30 min芸薹根肿菌休眠孢子生活力状态； C. 2 mg/mL氟啶胺处理 1 h芸薹根肿菌休眠孢子 生活力状态； D. 2 tng/mL氟啶胺处理 2 h芸薹根肿菌休眠孢子生活力状态。 具体实施方式

下面结合附图和实施例详细说明本发明的实质 内容及有益效果。 以下实施例仅用于对本 发明进行进一步的说明， 不应理解为对本发明的限制。 说 明 书

试剂：

荧光素二醋酸醋 （ Fluorescein diacetate, FDA): Sigma;

碘化丙啶 （Propidine iodide, PI): Sigma;

Annexin V-FITC: Sigma;

Hoechst 33258： Sigma;

其它试剂均为国产分析纯。

仪器：

奥林巴斯荧光显微镜 （ OLYMPUS BX51);

流式细胞仪 （BDFACSCalibur);

电热恒温水浴锅 （XMTD-700) 。 实施例 1基于荧光 染色法的植物病原菌活性和药剂评价靶标筛选 采用 FDA (荧光素二醋酸醋）和 PI (碘化丙啶）作为染料， 对植物病原真菌的孢子、 菌 丝， 以及植物病原细菌的孢子活力进行鉴定， 筛选荧光双染法可鉴定的植物病原菌靶标。

1. 实验方法

以植物病原真菌孢子、 菌丝和植物病原细菌孢子为靶标筛选对象 （表 1)， 采用 FDA/PI双 染法鉴定植物病原菌活性。

荧光染色液的配置： 称取 0.05gFDA， 溶于 lmL丙酮中， 力 Π入 9 mL PBS 7.4， 配制成浓度 为 5 mg/mL的 FDA储备液， 置棕色瓶 -20 °C保存备用， 使用前用 PBS稀释成终浓度为 100 g/mL 待用。称取 0.005 gPI， 加入 10 mL PBS 7.4缓冲液， 配成 500 μ ₈ /mL的储存液， 置棕色瓶 4Ό避 光保存， 使用前用 PBS将其稀释成终浓度为 5 g/mL的染色液。

染色方法： 取新鲜配制的孢子或菌丝悬浮液 2 mL， 分装为两组， 一组为未经水浴处理的 活孢子或菌丝， 另一组为经 95 °C水浴处理 10 min的死孢子或菌丝。 取初始浓度为 100 gmL 的 FDA染色液（溶解于 PBS) 10 加入 90 孢子或菌丝悬浮液， 混匀， 终浓度为 10 g/mL， 室温染色 15min后， 离心弃去染液； 然后加入 100 L浓度为 5 g/mL的 PI染色液， 室温避光染 色 15min。 采用荧光显微镜对染色制片的孢子或菌丝进行 观察， 采集病原菌染色结果图像， 拍摄参数为： 绿色通道 （激发光 450〜490nm、 发射光 >510nm) ， 物镜为 40倍。

2. 实验结果

利用 FDA/PI双重荧光染色法， 对植物病原菌孢子或菌丝进行染色， 在荧光显微镜下观 察， 有活力孢子或菌丝经 FDA/PI染色后， 发绿色荧光， 而无活力孢子或菌丝则发红色荧光。 根据此荧光特征， 确定了荧光双重染色法可以对多种植物病原真 菌和细菌的孢子或菌丝进行 活性评价和鉴定（表 1)。主要包括：（1)植物病原真菌的单胞型分� �孢子：白粉菌属（ « /^)、 霜霉菌属 ( Pseudoperonospora ) , 葡萄孢属 ( Botrytis ) ^ 青霉属 ( Penicillium ) 叶点霉属

(.Phyllosticta)^轮枝抱属 Verticillium、炭疽菌属 (CoUetotrkhum、疫霉属 Phytophtho 等植物病原真菌的单胞型分生孢子 （图 1); (2)植物病原真菌的多胞型分生孢子： 壳二孢属 scochyta) 等植物病原真菌的双胞型分生孢子； （3) 植物病原真菌的多胞型分生孢子： 钉 说 明 书

孢属 iPassalora)^芽枝霉属 (Cladosporium),镰刀菌属 (Fus rium),壳多抱属 iStagonospora) 等植物病原真菌的多胞型分生孢子 （图 2); (4)植物病原真菌的砖隔状分生孢子： 棒孢菌属

(Corynespora), 链格孢属 (A!te ία 匍柄霉属 Stemphyliun 等植物病原真菌的砖隔状 分生孢子； （5) 植物病原真菌的线状分生孢子： 尾孢属 (Ce ροηι 壳针孢属 Septoria 等植物病原真菌的线状分生孢子； （6) 植物病原真菌的菌丝： 丝核菌属 Rhizoctonia 核 盘菌属 Sckwtinia 等植物病原真菌的菌丝； （7) 植物病原细菌的单生、 双生或链生孢子： 假单胞杆菌 (Pseudomo 棒形杆菌属 (C!avibacter 劳尔氏菌 to"it 黄单胞菌属

(Xanthomonas),欧文氏菌 (Envinia)等植物病原细菌的单生、双生或链生孢 子（图 3); (8) 原生动物界单孢型休眠孢子： 根肿菌属 Plasmodiophom 、 粉痂菌属 iSpongospom 等植 物病原菌的单孢型孢子 （图 4) 。

表 1 基于荧光双重染色法的植物病原菌活性和药剂 评价靶标筛选

植物病原菌 荧光特征 类型 靶标 属 种 有活力 无活力 葫芦科白粉菌

白粉菌属 Erysiphe 强绿色荧光 红色荧光

E. c ucurb it ace arum

霜霉菌属

古巴假霜霉菌 _P cubensis 绿色荧光 淡红色荧光

Pse udoperonospora

葡萄孢属 Botryiis 灰葡萄孢 ^ cinerea 淡绿色荧光 红色荧光 青霉属 Penicillium 扩展青霉 P. expansion 强绿色荧光 红色荧光 单胞型

叶点霉属 Pfiylhsticta 斑点叶点霉 commonsii 绿色荧光 红色荧光 分生孢子

轮枝抱属 Verticill im 大丽花轮枝孢 · dahliae 绿色荧光 红色荧光 炭疽菌属 瓜类炭疽菌 C orbiculare 淡绿色荧光 强红色荧光

Colletotrichum 辣椒刺盘孢 C. capsici 强绿色荧光 红色荧光 疫霉属 Phytophthor 辣椒疫霉 . capsici 淡绿色荧光 淡红色荧光 腐霉属 Pythium 瓜果腐霉尸. aphanidermatum 绿色荧光 红色荧光 双胞型

植物 壳二抱属 Ascochyt 西瓜壳二抱 A citrullina 绿色荧光 红色荧光 分生孢子

病原

钉抱属 Passalora 黄褐钉孢 强绿色荧光 红色荧光 真菌

壳多孢属

水仙壳多抱 S. cuitisii 淡绿色荧光 红色荧光 Stagonospora

多胞型

芽枝霉属 瓜疮痂枝孢菌

分生孢子 绿色荧光 红色荧光

Cladosporium C. cucumerinum

尖孢镰刀菌 F. oxyspor m 绿色荧光 淡红色荧光 镰刀菌属 Fusarium

茄病镰刀菌 F. solani 绿色荧光 红色荧光 棒孢菌属

多主棒孢 C. mazei 强绿色荧光 红色荧光 Corynespora

砖隔状

链格孢属 Alternaria 芸苔链格抱 . bras sic ae 绿色荧光 红色荧光 分生孢子

匍柄霉属

¾fi¾J柄霉 5*. solani 淡绿色荧光 淡红色荧光 Stemphylium

线状 尾抱属 Cercospora 芹菜尾孢 C, apii 绿色荧光 强红色荧光 分生孢子 壳针孢属 Septoria 番 壳针抱 S. lycopersici 强绿色荧光 红色荧光 丝核菌属 Rhizoctonia 立枯丝核菌 solani 强绿色荧光 淡红色荧光 菌丝

核盘菌属 Sclerotinia 核盘菌》. sclerotiorum 绿色荧光 红色荧光 说 明 书

表 1 基于荧光双重染色法的植物病原菌活性和药剂 评价靶标筛选 （续)

Hoechst 33258/PI染色法药剂筛选最佳荧光检测时间的确� �� 使用荧光双重染色法评价植物病原菌活性或进 行杀菌剂高通量筛选的一个关键条件是， 确定最佳的荧光检测时间， 以使该方法结果具有最大的可重复性。 这里以灰葡萄孢菌 （ ci rea)孢子活性鉴定为例， 采用 96孔微量滴定板和 384孔微量滴定板分别进行实验。

1. 实验方法

灰葡萄抱菌在 PDA培养基中培养 10天，采用刷孢子法收集孢子悬浮液，将其分� ��三组， 第一组孢子经 95 °C水浴处理 10 min致死，第二组为不经任何处理的有活力孢子 ，第三组为热 处理致死和新鲜活孢子的等量混合， 每组样本设三次重复。 将三组样本分别加入 96孔和 384 孔微量滴定板中进行实验， 96孔板每孔加入浓度为 3 X 10 ⁶ 个孢子 /mL的孢子悬浮液 200 μί， 384孔板每孔加入浓度为 3 X 10 ⁶ 个孢子 /mL的孢子悬浮液 50 。每组样本都采用 PI( 5 g/mL ) 和 Hoechst 33258 ( 5 μg/mL ) 染色， 染色后每间隔 10 min检测一次荧光强度， 直到 120 min 结束。 荧光检测强度为三次重复的平均值。

2. 实验结果

采用 Hoechst 33258/PI双染法评价灰葡萄孢菌孢子活力， 96孔板每孔 6 X 10 ⁵ 个孢子， 384 孔板每孔 1.5 X 10 ⁵ 个孢子。采用 96孔和 384微量滴定板时，随着时间延长， PI和 Hoest 33258 荧光强度逐渐增强， 最终达到一个最大值， 相对荧光强度不再增加而保持稳定。 检测 PI的最 佳时间为染色后 4-30 min, 检测 Hoest 33258的最佳时间为染色后 15-50 min (图 5 ) 。 说 明 书

实施例 3 流式细胞仪检测植物病原菌活性定量分析 以瓜类炭疽菌（C. orbiculare )孢子为靶标， 利用流式细胞仪， 检测经 Annexin V - FITC/PI 双染的瓜类炭疽菌孢子活力， 进行孢子存活率定量分析。 同时， 采用孢子萌发法作为对照， 比较荧光双重染色法流式细胞仪检测结果与传 统孢子萌发法检测结果的相关性。

1. 实验方法

以瓜类炭疽菌 5个菌株作为实验材料。新鲜配制的孢子悬浮� �，分别在 30 °C、40 °C、50 Ό、 60 °C下均进行 3种时间处理， 即 5 min、 10 min, 20 min,将所有样品分为两组，一组用 Annexin V-FITC/PI双染后，流式细胞仪上样，分析病菌孢 子活性；另一组进行孢子萌发实验，运用 SAS 软件， 对各处理流式细胞仪检测结果与孢子萌发率的 关系进行统计分析。

2. 实验结果

瓜类炭疽菌孢子样本经不同温度和时间处理后 ， 同时采用 Annexin V-FITC/PI荧光双染 与流式细胞仪结合的检测方法 （图 6 ) 和孢子萌发法检测孢子存活率。 流式细胞仪检测的有 活力孢子比例与孢子萌发率检测结果一致， 二者成正相关。 流式细胞仪检测的有活力孢子比 例 y与孢子萌发率 X线性关系显著，相关系数为 R ² =0.9357，回归方程分别为 y=0.9380x+1.3192 (图 7 ) 。 说明荧光双重染色后， 采用流式细胞仪检测植物病原菌活性结果准确 ， 检测速度 快， 可用于植物病原菌活性的定量分析。 实施例 4基于 Hoechst 33258/PI双重荧光染色的芸薹根肿菌防治药剂筛� �� 以芸薹根肿菌休眠孢子为靶标，采用 Hoechst 33258/PI双重荧光染色法鉴定芸薹根肿菌 brassica )休眠孢子活力， 评价氟啶胺、 甲基硫菌灵等不同药剂对芸薹根肿菌的灭杀效 果， 筛 选芸薹根肿菌的高效防治药剂。

1. 实验方法

取新鲜配制的芸薹根肿菌休眠孢子悬浮液，以 3 X 10 ⁴ 孢子 /孔的密度接种于 96孔培养板上， 每孔 100 孢子悬浮液。 分别将不同浓度的氟啶胺、 甲基硫菌灵（0.1， 0.5， 1 , 2 mg/mL )加 入孔内， 每一药剂浓度设 4个平行孔， 每孔加入 100 药剂。 分别处理 10 min, 30 min, 1 h， 2 h后， 弃去上清液。 每孔加入孢子染色缓冲液 50 μί， Hoechst 33258染色液 50 μί， PI染色液 50 μί， 4 Ό孵育 30 min后， 采用荧光显微镜对处理孢子进行观察， 采集病原菌染色结果图像， 拍摄参数为： 紫外光激发， 物镜为 40倍。

2. 实验结果

采用， Hoechst 33258/PI双染法在紫外光激发下 （40倍镜） 观察孢子死活， 有活力孢子发 蓝色荧光， 无活力孢子发红色荧光。 随着药剂浓度增高， 对根肿菌杀灭效果增强； 处理时间 越长， 杀灭效果越好 （图 8 ) 。 其中， 氟啶胺按浓度 0.1， 0.5， 1， 2 mg/mL处理 1 h对芸薹 根肿菌杀灭效果分别为 60.8%、 68.7%、 93.3%、 95.8%, 处理 2 h对芸薹根肿菌杀灭效果分别 为 72.9%、 78.4%、 95.4%和 99.5%， 可以看出， 氟啶胺 1 mg/mL处理 1 h， 芸薹根肿菌休眠孢 说 明 书

子致死率达到 90%以上 （图 9) 。 甲基硫菌灵按浓度 1 mg/mL处理 2 h或 2 mg/mL处理 1 h， 对芸薹根肿菌杀灭效果达到 80%以上 （表 2 ) 。 氟啶胺对芸薹根肿菌的杀灭效果好于甲基硫 菌灵， 可用于田间防治的十字花科蔬菜根肿病的备选 药剂。

表 2 不同杀菌剂对芸薹根肿菌休眠孢子活力影响

浓度 不同处理时间孢子死亡率(％)

供试药剂 平均死亡率(％)

(mg/mL) 10 min 30 min 1 h 2 h

0.1 3.8 19.4 50.8 70.5 36.1

50%甲基硫菌灵 0.5 5.2 24.8 58.2 76.9 41.3 thiophanate-methyl 1 7.3 38.4 75.4 82.6 50.9

2 15.5 48.4 80.7 85.8 57.6

0.1 4.8 20.1 60.8 72.9 39.7

50%氟啶胺 0.5 6.4 33.4 68.7 78.4 46.7 fluazinam 1 12.7 40.6 93.3 95.4 60.5

2 22.4 54.8 95.8 99.5 68.1 对照 control - 1.5 2.4 2.9 3.4 36.1