ADITIVO POTENCIADOR DE LA EFICIENCIA DEL PURÍN DE CERDO

COMO FERTILIZANTE

La presente invención se refiere a un aditivo potenciador de la eficiencia del purín de cerdo como fertilizante.

Más concretamente, la invención proporciona un aditivo potenciador de la eficiencia del purín como fertilizante basado en ácido quínico, reduciendo el aditivo los efectos fitotóxicos de los metales pesados y de las sustancias xenobióticas, en particular antibióticos, habitualmente presentes en los purines aplicados como fertilizantes en los suelos agrícolas, lo que mejora la eficiencia de aprovechamiento de éstos en su aplicación a dichos suelos.

En las últimas décadas el crecimiento de la ganadería porcina intensiva ha acarreado un importante incremento en la generación de purines, los cuales se pueden utilizar en suelos áridos y sem ¡áridos como fuente de nutrientes y de materia orgánica, constituyendo una oportunidad de valorizar este tipo de residuos.

Concretamente, España es el segundo país europeo (después de Alemania) en cabaña porcina, con más de 28 millones de cabezas en noviembre de 2015 (Eurostat, 2016) que generan aproximadamente 50 millones de toneladas de purín por año. En algunas áreas, el reciclado eficiente de tales grandes cantidades de purín porcino supone un difícil reto, debido fundamentalmente a la separación espacial entre ganadería y agricultura y al elevado contenido en agua del purín, lo que encarece su transporte a zonas alejadas de donde es producido.

La elevada concentración de granjas de porcino en algunas zonas de España y Europa ha conducido a la existencia de zonas excedentarias de purín en las que existen verdaderos problemas para su manejo, provocando efectos negativos sobre los recursos hídricos y la atmósfera. Hasta el momento, la mejor solución para evitar o reducir estos problemas pasa por la aplicación eficiente del purín al terreno como abono orgánico, especialmente en regiones como el nordeste español, donde existe, salvo en algunas zonas específicas, una extensa superficie agrícola tanto de secano como de regadío disponible para el reciclaje de los nutrientes del purín porcino.

Los puñnes de cerdo tienen composiciones químicas altamente variables dependiendo de diversos factores, tales como la granja de procedencia (de pie de cría, productoras de lechones, de engorde, de mejora, de ciclo completo), el tipo de alimentación de los cerdos, la forma de separación, el almacenamiento de los excrementos y la gestión del agua de la explotación. La inadecuada gestión del tratamiento y posterior aplicación de los puñnes en los campos agrícolas contribuye a la emisión de gases de efecto invernadero y a la eutrofización de los acuíferos, principalmente por la lixiviación de NO3 y PO4 ³ , (Brockman et al., 2014,“Environmental assessment of nutñent recycling from biological pig slurry treatment--impact of fertilizer substitution and field emissions”, Bioresour Technol. 163:270-9; Yuan et al., 2017, “Evaluating environmental impacts of pig slurry treatment technologies with a life-cycle perspective”, J Clean Prod. 188: 840-850).

Además, a pesar del valor fertilizante del purín, existe cierto riesgo de contaminar los suelos agrícolas con metales pesados y xenobióticos, principalmente con antibióticos empleados en la cría de los cerdos, sustancias potencialmente tóxicas para el ser humano y el medio ambiente (L’Herroux et al., 1997, “Behaviour of metáis following intensive pig slurry applications to a natural field treatment process in Bñttany (France)”, Environ Pollut. 97:119-30; De la Torre et al., 2000,“Ecotoxicological evaluation of pig slurry”, Chemosphere. 41 : 1629-35; Kumar et al., 2005,“Antibiotic Uptake by Plants from Soil Fertilized with Animal Manure”, J. Environ. Qual. 34:2082-2085). En España, se estima que el Cu y el Zn son los metales que se acumulan en mayores cantidades (4 y 15 kg/ha y año) en los suelos donde habitualmente se aplican puñnes, mientras que metales pesados como el Cd, Co, Cr, Ni y Pb se introducen en el orden de 260 g/ha y año (Moral et al., 2008,“Salinity, organic contení, micronutrients and heavy metáis in pig slurries from South-eastern Spain”, Waste Manag. 28:367-71 ). Por otra parte, los puñnes están contaminados con los antibióticos empleados con propósitos veterinarios o con los agentes de limpieza y desinfección usados en las granjas (Bloem y Kratz, 2016,“Organic xenobiotics” en: E. Schnug and L.J. De Kok (eds.), Phosphorus in Agñculture: 100% Zero).

La acumulación de metales pesados y de compuestos xenobióticos contribuye a la degradación de los suelos y limita el crecimiento de los cultivos agrícolas (Liu et al., 2009,“Effects of six selected antibiotics on plant growth and soil microbial and enzymatic activities”, Environ Pollut. 157:1636-42; Tiwañ y Lata, 2018, “Heavy Metal Stress, Signaling, and Tolerance Due to Plant-Associated Microbes: An OverView”, Plant Sci. 9:452). Asimismo, la aparición de bacterias resistentes a antibióticos y la presencia de metales pesados en los cultivos pueden llegar a suponer un riesgo para la salud humana.

Por los motivos expuestos, existe actualmente en el sector de la nutrición vegetal la necesidad de buscar tecnologías de carácter sostenible que reduzcan los efectos fitotóxicos de los metales pesados y xenobióticos presentes en los puñnes aplicados en los suelos agrícolas, lo que mejoraría la eficiencia de aprovechamiento de estos como fertilizante y minimizaría posibles riesgos para la salud humana.

Por otra parte, las plantas exudan a través de las raíces una parte considerable de los compuestos orgánicos generados en la fotosíntesis (entre un 11 y un 40%) con el fin de regular la composición química de la ñzosfera y promover el crecimiento de microorganismos que pueden aportar beneficios a la planta en un ecosistema dado (Badri y Vivanco, 2009, “Regulation and function of root exudates”, Plant, Cell and Environment 32, 666-681 ; Zhalnina et al., 2018, “Dynamic root exúdate chemistry and microbial substrate preferences drive patterns in rhizosphere microbial community assembly”, Nat Microbiol, 3(4):470- 480). Los compuestos presentes en los exudados radiculares incluyen azúcares, aminoácidos, ácidos orgánicos, ácidos grasos y metabolitos secundarios (Bais et al., 2006,“The role of root exudates in rhizosphere interactions with plants and other organisms”, Annu Rev Plant Biol. 57:233-66). Además de la especie cultivada y su estadio fenológico, en la composición y cantidad de estos exudados influyen principalmente señales ambientales, por ejemplo, la disponibilidad de nutrientes en el suelo o la presencia de sustancias fitotóxicas.

De hecho, las plantas cuentan con mecanismos de adaptación a los suelos contaminados con compuestos fitotóxicos tales como los metales pesados, entre los que se encuentra la liberación a nivel radicular de exudados radiculares (Montiel-Rozas et al., 2016,“Effect of heavy metáis and organic matter on root exudates (low molecular weight organic acids) of herbaceous species: An assessment in sand and soil conditions under different levels of contamination”, Environ Pollut. 216:273-281 ) y los microorganismos asociados a las plantas juegan un papel vital en la adaptación de las plantas a dichos ambientes (Tiwari y Lata, 2018, “Heavy Metal Stress, Signaling, and Tolerance Due to Plant- Associated Microbes: An OverView”, Front Plant Sci. 9:452). El mecanismo de acción de los exudados radiculares a la hora de conferir tolerancia a estreses causados por sustancias fitotóxicas puede deberse a su inactivación directa (por ejemplo, quelación en el caso de los metales pesados o modificación química en el caso de los antibióticos) o a la estimulación de microorganismos que confieren tolerancia al estrés causado por dichos compuestos.

A la vista de lo anterior, la presente invención parte de los enfoques citados de forma que los exudados radiculares pueden disminuir los efectos fitotóxicos de los metales pesados y antibióticos contenidos en los purines sobre los cultivos agrícolas. Así, sería deseable disponer de aditivos de purines que mimeticen a los exudados radiculares y tengan un efecto análogo que permita aumentar la tolerancia de los cultivos a los metales pesados y antibióticos contenidos en los purines y, a la vez, incrementar la eficiencia en su uso y la productividad de los cultivos.

La presente invención cumple los dos objetivos citados anteriormente, proporcionando un aditivo aplicable a los purines de cerdo que incluye ácido quínico como protector frente a compuestos fitotóxicos, tales como metales pesados, en particular cadmio y plomo, y antibióticos, en particular sulfametoxazol y sulfametazina, comúnmente contenidos en los purines, donde el ácido quínico reduce los efectos fitotóxicos de los metales pesados y antibióticos de los purines y mejora la eficiencia agronómica de los mismos.

El ácido quínico, o ácido (1 S,3R,4S,5R)-1 ,3,4,5- tetrahidroxiciclohexanocarboxílico, es un poliol cíclico y un ácido ciclohexanocarboxílico que se encuentra de forma natural en los tejidos vegetales (Pero et al., 2009,“Antioxidant metabolism induced by quinic acid. Increased urinary excretion of tryptophan and nicotinamide”, Phytother Res. 23:335-46).

Ácido quínico Tal como se ha mencionado anteriormente, en un primer aspecto, la presente invención proporciona un aditivo potenciador de la eficiencia del purín de cerdo como fertilizante que incluye ácido quínico. En una forma de realización, el aditivo de purines objeto de la invención consiste en un 100% en peso de ácido quínico en forma de un polvo hidrosoluble.

En otra forma de realización, el aditivo de purines objeto de la invención comprende entre un 40 y un 85% en peso de ácido quínico y entre un 15% y un 60% en peso de otros componentes seleccionados del grupo consistente en azúcares, aminoácidos, ácidos orgánicos, poliaminas, alcoholes y combinaciones de los mismos, estando el aditivo en forma de un polvo hidrosoluble.

Cuando están presentes en el aditivo de purines, los azúcares se seleccionan preferentemente de entre mono- y di-sacáridos tales como sacarosa, fructosa, trehalosa, glucosa, arabinosa, lactosa, maltosa, así como mezclas de los mismos.

Cuando están presentes en el aditivo, los aminoácidos se seleccionan preferentemente de entre treonina, sina, glutamina, ácido glutámico, fenilalanina, metionina, GABA, ornitina, glicina, ácido aspártico, serina, asparagina, tirosina, triptófano, valina, leucina, isoleucina, prolina, 4- hidroxiprolina, arginina, histidina, alanina, cisterna, y sus mezclas.

Cuando están presentes en el aditivo, los ácidos orgánicos se seleccionan preferentemente de entre ácido láctico, ácido succínico, ácido oxálico, ácido glucónico, ácido treónico, ácido cítrico, ácido acético, ácido fumárico y mezclas de los mismos.

Cuando están presentes en el aditivo, los alcoholes se seleccionan preferentemente de entre glicerol, sorbitol, manitol, mioinositol y mezclas de los mismos. Las poliaminas, en caso de estar presentes en el aditivo, preferentemente se seleccionan de entre putrescina, espermidina, espermina y mezclas de las mismas. La presencia de estos otros componentes diferentes al ácido quínico en el aditivo de la invención se basa en el hecho de que tales componentes forman parte de los exudados radiculares en los cultivos ensayados en presencia de purines que se describen posteriormente o bien se encuentran descritos en la literatura como componentes de dichos exudados en condiciones normales para el desarrollo de la planta (Zhalnina et al., 2018,“Dynamic root exúdate chemistry and microbial substrate preferences drive patterns in rhizosphere microbial community assembly”, Nat Microbiol, 3(4):470-480), siendo por ello deseables con el objeto antes mencionado de disponer de un aditivo cuyo uso que mimetice los exudados radiculares con un efecto análogo que pueda permitir aumentar el aprovechamiento de los purines.

El aditivo de purines objeto de la invención se formula en forma de polvo hidrosoluble, como se ha indicado anteriormente, pero también puede formularse como una composición líquida mediante su disolución en agua.

De acuerdo con un segundo aspecto, la invención se refiere a un purín de cerdo que incluye un aditivo tal como el descrito anteriormente en combinación con otra sustancia adicional susceptible de ser aplicada en los purines y seleccionada de entre ácidos inorgánicos, ácidos orgánicos, sustancias húmicas, residuos orgánicos animales y vegetales, micronutrientes, leonardita, agentes mojantes, agentes dispersantes, enzima fitasa, así como combinaciones de los mismos, y/o en combinación con uno o más bioestimulantes seleccionados del grupo consistente en hidrolizados de proteínas y mezclas de aminoácidos, extractos de algas, microorganismos vivos, extractos de microorganismos y combinaciones de los mismos. En este caso, el aditivo de la invención está presente en una proporción del 0,5 al 10% con respeto al peso del purín.

En una realización, el ácido inorgánico adicional está presente en la combinación en una proporción del 5 al 90% en peso y se selecciona de entre los ácidos sulfúrico y fosfórico.

En otra realización, el ácido orgánico adicional está presente en la combinación en una proporción del 5 al 90% en peso y se selecciona de entre ácido láctico, ácido succínico, ácido oxálico, ácido glucónico, ácido treónico, ácido cítrico, ácido acético, ácido fumárico.

Aún en otra realización, las sustancias húmicas adicionales están presentes en la combinación en una proporción del 5 al 90% en peso y se seleccionan de entre ácidos húmicos, ácidos fúlvicos y derivados de los mismos.

En otra realización, los residuos orgánicos animales o vegetales están presentes en la combinación en una proporción del 5 al 90% en peso. Aún en otra realización, los micronutrientes adicionales están presentes en la combinación en una proporción del 1 al 30% en peso y se seleccionan de entre sulfato férrico, sulfato de magnesio, sulfato de zinc, sulfato de manganeso, sulfato de cobre, molibdato amónico, cloruro de cobalto. En otra realización, la leonardita adicional está presente en la combinación en una proporción del 5 al 90% en peso.

En otra realización adicional, el agente mojante adicional está presente en la combinación en una proporción del 0,1 al 2% en peso.

En otra realización adicional, el agente dispersante adicional está presente en la combinación en una proporción del 0,1 al 2% en peso. En otra realización adicional, la enzima fitasa adicional está presente en la combinación en una proporción del 0,1 al 2% en peso. En el caso de la combinación del purín y el aditivo de la invención con bioestimulantes tal como se ha descrito anteriormente, preferentemente los bioestimulantes están presentes en la combinación en una proporción del 5 al 90% en peso. Es también objeto de la invención el uso del aditivo solo o en las combinaciones antes descritas en forma de polvo hidrosoluble o en forma líquida previa disolución de agua para su aplicación en el purín.

Ejemplos

1. Ensayo de obtención e identificación de exudados radiculares en presencia de purín de cerdo

Con el objetivo caracterizar en detalle la respuesta de los cultivos a la presencia de purín de cerdo e identificar los metabolitos exudados por las raíces, la Solicitante analizó el perfil diferencial de exudados radiculares de maíz en presencia de purines procedentes de crías de cerdo (cebo) y de hembras adultas (madre). A continuación, se describe brevemente el ensayo para determinar los exudados radiculares emitidos en presencia de purines.

En el procedimiento, similar al usado por otros autores (Naveed et al., 2017, “Plant exudates may stabilize or weaken soil depending on species, origin and time”, European Journal of Soil Science), se emplearon semillas de maíz (variedad LG 34.90). Las semillas se esterilizaron superficialmente realizando un lavado de 5 minutos con etanol al 96%, seguido de 10 minutos en lejía al 5%. A continuación, las semillas se lavaron extensamente y se dejaron hidratar en agua MilliQ estéril durante 4 horas. Para su germinación, las semillas se colocaron en un lecho de papel de filtro humedecido con agua MilliQ estéril. Las semillas se dejaron germinar en oscuridad durante 4 días, tras lo cual se dispusieron las plántulas en bandejas de cultivo hidropónico, sumergiendo las raíces en solución nutritiva Hoagland estándar. En cada bandeja se colocaron 12 plantas, destinándose tres bandejas (cada una correspondiente a una repetición biológica) al tratamiento control, tres al tratamiento con purines de madre y tres al tratamiento con purines de cebo. Se aplicó la dosis de purín tanto de madre como de cebo de 1 mi por litro de solución nutritiva. Las plantas crecieron con una temperatura y fotoperiodo de 25°C y 16 h luz/22°C y 8 h oscuridad y una intensidad lumínica de 4.000 luxes en superficie.

La solución nutritiva se reemplazó por solución fresca cada tres días, incluyendo los suplementos adecuados, y se mantuvo en todo momento aireada mediante sondas de burbujeo. Después de 10 días de crecimiento, concluyó la incubación y se procedió a la obtención de los exudados radiculares.

Las plantas se retiraron cuidadosamente de las bandejas de cultivo y se lavaron con abundante agua, aplicándose un último lavado con agua destilada. Las plantas correspondientes a cada bandeja se dispusieron en matraces de cuello ancho conteniendo 200 mi de agua MilliQ, quedando las raíces inmersas en el agua. Las plantas se incubaron en los matraces durante 6 h. Posteriormente, se retiraron las plantas y se eliminó el material insoluble de la solución filtrando con filtros de 0,20 pm. El material filtrado se ultracongeló en nitrógeno líquido y se sometió a liofilización. El material seco obtenido se pesó y se analizó mediante Cromatografía de Gases-Masas previa derivatización con metoxiamina y N- metil-(thmetilsililthfluoroacetamida).

En la Tabla 1 y la figura 1 se muestran los metabolitos cuya exudación aumenta en presencia de ambos tipos de purín, mostrando un aumento de dos veces en, al menos, uno de los dos tratamientos respecto a las condiciones control. Tabla 1. Aumento de metabolitos emitidos en presencia de purín respecto al control

Se aplicó cada uno de los metabolitos a una dosis de 1 kg/ha en una maceta con 3 kg de tierra, se sembraron plantas de trigo (3 macetas por tratamiento con 10 plantas por maceta) y se observó el efecto sobre su peso seco a las 6 semanas. Asimismo, se observó el efecto de los metabolitos a la misma dosis después de haberlos mezclado previamente en un purín de madre aplicado a razón de 20 m ³ /ha. Tal y como se muestra a continuación en la Tabla 2, el ácido quínico es el metabolito que más potencia el efecto beneficioso de la aplicación de purín.

Tabla 2. Biomasa seca de trigo a las 6 semanas de crecimiento

2. Ensayo de protección frente a los metales pesados y antibióticos del purín Se prepararon tres aditivos (A, B, C) de purín en forma de polvo hidrosoluble de acuerdo con la invención con la siguiente composición:

A: un 100% en peso de ácido quínico.

B: una combinación de entre un 40 y un 85% en peso de ácido quínico y entre un 5 y un 20% de maltosa, entre un 5 y un 20% de prolina y entre un 5 y un 20% de ácido treónico.

C: una combinación de entre un 40 y un 85% en peso de ácido quínico y entre un 5 y un 20% de arabinosa, entre un 5 y un 20% de triptófano y entre un 5 y un 20% de ácido nicotínico. Estos aditivos (A, B, C) se probaron en ensayos de invernadero con plantas de trigo en combinación con un purín de hembra adulta (Purín 1 ) con la siguiente composición en metales pesados y de los antibióticos sulfametoxazol y sulfametazina:

Los mismos aditivos se ensayaron con el mismo Purín al que se le adicionaron metales pesados hasta alcanzar las siguientes concentraciones (Purín 2):

Los mismos productos se ensayaron con el mismo Purín al que se le adicionaron los antibióticos sulfametoxazol y sulfametazina hasta alcanzar las siguientes concentraciones (Purín 3):

Los aditivos y el purín se aplicaron en las siguientes dosis:

• A: 5,0 kg/ha en mezcla con el purín.

• B: 5,0 kg/ha en mezcla con el purín.

• C: 5,0 kg/ha en mezcla con el purín.

• Purín: 40 m ³ /ha

El rendimiento del trigo se muestra en la siguiente Tabla 3 y en la figura 2: Tabla 3

Tal como se observa en la tabla anterior y en la figura 2, la presencia de altas concentraciones de metales pesados y antibióticos en el purín (purines 2 y 3) tuvo efectos negativos sobre el rendimiento del trigo. La aplicación de los tres aditivos diseñados (A, B y C) mejoró la productividad del cultivo, siendo dicha mejora más pronunciada en los purines 2 y 3, con mayores concentraciones de metales pesados y antibióticos, respectivamente. Estos resultados demuestran que los aditivos basados en ácido quínico contrarrestan los efectos fitotóxicos de los metales pesados cadmio y plomo y de los antibióticos sulfametazina y sulfametoxazol presentes en el purín de cerdo, mejorando notablemente su capacidad fertilizante. 3. Ensayo de degradación de antibióticos

Es sabido que determinados microorganismos edáficos tienen capacidad de degradar antibióticos (Massé et al., 2014,“Potential of Biological Processes to Elimínate Antibiotics in Livestock Manure: An OverView Animáis (Basel)”, 4(2): 146-163; Kumar et al. , 2019,“Antibiotics bioremediation: Perspectives on its ecotoxicity and resistance”, Environ Int. , 124:448-461 ). Por ello, se estudió la capacidad del aditivo de purines para incrementar la degradación de dos antibióticos presentes de forma frecuente en los purines: sulfametazina y sulfametoxazol.

Sulfametazina

Se estudió la degradación biológica del antibiótico sulfametazina en el suelo realizando un análisis de su mineralización, descomposición mediada por los microorganismos edáficos que se puede determinar cualificando el C02 liberado por el metabolismo microbiano a partir de sulfametazina marcada con el radioisótopo ¹⁴ C (Topp et al., 2013,“Accelerated Biodegradation of Veterinary Antibiotics in Agricultura! Soil following Long-Term Exposure, and Isolation of a Sulfamethazine-degrading sp”, J Environ Qual. 42(1 ): 173-8; Hirth et al., 2016, “An effective bioremediation approach for enhanced microbial degradation of the veterinary antibiotic sulfamethazine in an agricultura! soil”, Chem. Biol. Technol. Agrie. (2016) 3:29). La ¹⁴ C-sulfametazina se aplicó en una concentración de 1 mg/kg en un suelo agrícola. Posteriormente se aplicaron 40 m ³ /ha de los siguientes tratamientos:

- A: 5,0 kg/ha en mezcla con agua.

- B: 5,0 kg/ha en mezcla con agua.

- C: 5,0 kg/ha en mezcla con agua.

- D: agua (control negativo) Finalmente se determinó la mineralización de la ¹⁴ C-sulfametazina en función del tiempo empleando un contador de centelleo líquido. Los resultados se muestran en la siguiente Tabla 4 y en la figura 3.

Tabla 4. Mineralización de ¹⁴ C-sulfametazina en suelo agrícola expuesto a 1 mg/kg del antibiótico y a los tratamientos A-D

Los resultados mostrados en la Tabla 4 y la figura 3 demuestran que los tratamientos incrementan notablemente la degradación biológica del antibiótico sulfametazina, en especial el tratamiento B.

Sulfametoxazol

Para determinar la biodegradación de este antibiótico en el suelo, se realizó un ensayo de disipación basado en el de Wu et al., 2012 (“Dissipation of sulfamethoxazole and trimethoprim antibiotics from manure-amended soils”, J Environ Sci Health B., 47(4):240-9). Se aplicaron 10 mg/kg de sulfametoxazol y se fue midiendo la concentración que permanecía en el suelo a lo largo del tiempo empleando SPE-HPLC-MS/MS.

Los resultados del ensayo se muestran en la siguiente Tabla 5 y la figura 4. Tabla 5. Disipación de sulfametoxazol en suelo agrícola expuesto a 10 mg/kg del antibiótico y a los tratamientos A-D.

Los resultados indican que los tratamientos, en especial el tratamiento B, aumentan la degradación del antibiótico sulfametoxazol en un proceso que es mediado por microorganismos del suelo (Wu et al., 2012, supra).

4. Ensayo de disponibilidad de metales pesados Numerosos géneros bacterianos tienen la capacidad de mejorar la tolerancia de las plantas a metales pesados mediante diversos mecanismos, entre los que se encuentran la sorción de los metales, la bioacumulación, y la oxidación/reducción a formas no tóxicas (Tiwari y Lata, 2018,“Heavy Metal Stress, Signaling, and Tolerance Due to Plant-Associated Microbes: An OverView”, Frontiers in Plant Science 9(452)).

Se determinó el efecto de los tratamientos A-D sobre la disponibilidad de dos metales pesados (Cd y Pb), midiendo su concentración en estados asimilables por las plantas.

Los resultados del ensayo se muestran en la Tabla 6 siguiente. Tabla 6

Tal como se desprende de los datos indicados, la aplicación de los tratamientos disminuye las concentraciones de cadmio y cromo en formas asimilables por las plantas. El efecto del tratamiento B es más acentuado que los tratamientos A y C.