技术领域

本发明涉及佐剂的领域， 以及使用佐剂来调节目的疫苗所诱导的免疫 应答的方法和用途。 本发明具体涉及包含 HIV Tat蛋白或其片段或变体或 者编码 HIV Tat蛋白或其片段或变体的多核苷酸的佐剂， 以及所述佐剂增 强目的疫苗所诱导的免疫应答的方法和用途。 背景技术

DNA疫苗是使用经基因改造的 DNA分子诱导生物体内的免疫应答以 保护生物体免受病毒、 细菌等感染的技术。 DNA疫苗技术的优势之一在于 其可诱导各种类型免疫应答。 此外， 经过十多年的发展， DNA疫苗的临床 试验也提供了令人振奋的安全性数据， DNA疫苗在临床前研究和临床试验 中能被机体很好地耐受， 表现了良好安全性 （参见例如 Sandhya Vasan, Sarah J. Schlesinger. et.al. Phase 1 Safety and Immunogenicity Evaluation of AD VAX, a Multigenic, DNA-Based Clade C/B, HIV-1 Candidate Vaccine, PLoS One. 2010; 5(1): e8617 以及 Thomas C. Greenough, Coleen K. Cunningham, et.al. "Safety and immunogenicity of recombinant poxvirus HIV-1 vaccines in young adults on highly active antiretroviral therapy". Vaccine. 2008 December 9; 26(52): 6883—6893)。

但是大多数 DNA疫苗如今仍旧处于试验阶段，能用于临床应 用的并不 多。 其中很重要的原因是 DNA 疫苗在人体实验中仍然被证明免疫原性不 高。 由此导致 DNA疫苗使用剂量大， 免疫次数多或必须与其他疫苗联合使 用， 提高了疫苗的生产和使用成本， 大大限制了 DNA疫苗的应用。 能否大 幅度提高 DNA疫苗的免疫原性是决定 DNA疫苗技术发展前途的至关重要 的因素 (Lu S, Wang S, Grimes-Serrano JM. Current progress of DNA vaccine studies in humans. Expert Rev Vaccines. 2008 Mar;7(2): 175-91 )。

应用佐剂是提高 DNA疫苗免疫原性有效策略之一。 随着对 DNA疫苗 研究的深入，人们逐渐认识到直接注射裸 DNA进行免疫所诱导产生的免疫 应答和免疫记忆都不够理想， 但通过和佐剂联合使用能获得更加强大、 更 加持久的免疫效果 （Barouch DH, Santra S, Schmitz JE, Kuroda MJ, et al. Control of viremia and prevention of clinical AIDS in rhesus monkeys by cytokine-augmented DNA vaccination . Science, 2000, 290(5491): 486-92； Min W, Lillehoj HS, Bumside J,et al. Adjuvant effects of IL-lbeta, IL-2, IL-8, IL-15, IFN-alpha, IFN-gamma TGF-beta4 and lymphotactin on DNA vaccination against Eimeria acervulina. Vaccine, 2001, 20(1-2): 267-74； )。

免疫佐剂是指与抗原同时或分别应用于同一对 象， 能非特异性地增强 或改变机体针对该抗原的特异性免疫应答能力 的物质。 佐剂本身可以有抗 原性,也可以不具备抗原性,但根据世界卫生组� ��的推荐，佐剂必须具有安全 性。

HIV Tat是人类免疫缺陷病毒的一种转录反式激活蛋 白，其主要功能是 调节 HIV的转录， 通过与 HIV基因组上的 LTR区域的结合促进 HIV基因的转 录。 但近年有研究发现： HIV Tat蛋白可促进 DC细胞的活化和成熟， 从而增 强机体的抗原提呈能力， 有效提高机体的免疫反应水平 （Emanude Fanales-Belasio, Sonia Moretti, Filomena Nappi, et al. Native HIV-1 Tat Protein Targets Monocyte-Derived Dendritic Cells and Enhances Their Maturation, Function, and Antigen- Specific T Cell Responses. The Journal of Immunology, 2002, 168: 197-206; Emanuele Fanales-Belasio, Sonia Moretti, Valeria Fiorelli, et al. HIV-1 Tat Addresses Dendritic Cells to Induce a Predominant Thl-Type Adaptive Immune Response That Appears Prevalent in the Asymptomatic Stage of Infection. The Journal of Immunology, 2009, 182: 2888—2897)。

本发明首次将 HIV Tat作为佐剂与疫苗联合使用， 并在动物模型中证 实了其对疫苗所诱导的免疫反应的增强及调节 效应。 发明概述

本发明一方面涉及佐剂用于增强目的疫苗在对 象中所诱导的免疫反应 的用途。

在一个实施方案中， 本发明涉及 HIV Tat蛋白或其片段或变体或者编 码 HIV Tat蛋白或其片段或变体的多核苷酸在制备用于 增强目的疫苗在对 象中所诱导的免疫反应的佐剂或疫苗组合物中 的用途。 在一个实施方案中，本发明中的所述疫苗包含 DNA疫苗，而所述佐剂 或疫苗组合物包含编码 HIV Tat蛋白或其片段或变体的多核苷酸。

在一个实施方案中， 所述编码 HIV Tat蛋白或其片段或变体的多核苷 酸被插入到载体中。 在一些实施方案中， 所述载体选自质粒、 重组病毒载 体、 重组细菌载体、 假病毒颗粒、 和病毒样颗粒。

在一个实施方案中， 本发明中的所述疫苗包含蛋白质疫苗， 而所述佐 剂或疫苗组合物包含 HIV Tat蛋白或其片段或变体。

在一些实施方案中， 本发明的所述目的疫苗包含 HIV Env 蛋白、 和 / 或 HIV Gag蛋白、 和 /或 HIV Pol蛋白、 或者其片段或变体； 或者本发明的 所述目的疫苗包含编码 HIV Env蛋白、 和 /或 HIV Gag蛋白、 和 /或 HIV Pol 蛋白、 或者其片段或变体的多核苷酸。

另一方面， 本发明还涉及增强目的疫苗在对象中所诱导的 免疫反应的 方法。

在一个实施方案中， 本发明的方法包括给对象施用所述疫苗， 以及在 施用所述疫苗之前、 同时、 或者之后给所述对象施用包含 HIV Tat蛋白或 其片段或变体或者编码 HIV Tat蛋白或其片段或变体的多核苷酸的佐剂。

在一个实施方案中，本发明的方法中的所述疫 苗包含 DNA疫苗， 并且 所述佐剂包含编码 HIV Tat蛋白或其片段或变体的多核苷酸。

在一个实施方案中， 本发明的方法中所述的编码 HIV Tat蛋白或其片 段或变体的多核苷酸被插入到载体中。 在一些实施方案中， 所述载体选自 质粒、 重组病毒载体、 重组细菌载体、 假病毒颗粒、 和病毒样颗粒。

在一个实施方案中， 本发明的方法中的所述疫苗包含蛋白质疫苗， 并 且所述佐剂包含 HIV Tat蛋白或其片段或变体。

在一些实施方案中， 本发明的方法中的所述疫苗包含 HIV Env蛋白、 和 /或 HIV Gag蛋白、 和 /或 HIV Pol蛋白、 或者其片段或变体； 或者所述疫 苗包含编码 HIV Env蛋白、和 /或 HIV Gag蛋白、和 /或 HIV Pol蛋白、或者 其片段或变体的多核苷酸。

在一些实施方案中，本发明的疫苗和 /或佐剂是通过肌肉和 /或皮内注射 途径进行施用的。

在另一方面， 本发明还涉及一种疫苗组合物。

在一个实施方案中， 本发明的疫苗组合物含有如下组分： （a) 疫苗， 其 包含免疫原和 /或编码免疫原的多核苷酸； 和 （b) 包含 HIV Tat蛋白或其片 段或变体或者编码 HIV Tat蛋白或其片段或变体的多核苷酸的佐剂。

在另一个实施方案中，本发明的疫苗组合物中 的所述疫苗包含 DNA疫 苗， 而所述佐剂包含编码 HIV Tat蛋白或其片段或变体的多核苷酸。 在一 些实施方案中， 所述编码 HIV Tat蛋白或其片段或变体的多核苷酸被插入 到载体中。 在一些实施方案中， 所述载体选自质粒、 重组病毒载体、 重组 细菌载体、 假病毒颗粒、 和病毒样颗粒。

在另一个实施方案中， 本发明的疫苗组合物中的所述疫苗是蛋白质疫 苗， 而所述佐剂包含 HIV Tat蛋白或其片段或变体。

在一些实施方案中， 本发明的疫苗组合物中的所述疫苗包含 HIV Env 蛋白、 和 /或 HIV Gag蛋白、 和 /或 HIV Pol蛋白、 或者其片段或变体； 或者 所述目的疫苗包含编码 HIV Env蛋白、 和 /或 HIV Gag蛋白、 和 /或 HIV Pol 蛋白、 或者其片段或变体的多核苷酸。

在另一方面， 本发明还涉及一种佐剂。

在一个实施方案中， 本发明的佐剂含有 HIV Tat蛋白或其片段或变体 或者编码 HIV Tat蛋白或其片段或变体的多核苷酸。 在一些实施方案中， 所述编码 HIV Tat蛋白或其片段或变体的多核苷酸被插入到载 体中。 在一 些实施方案中， 所述载体选自质粒、 重组病毒载体、 重组细菌载体、 假病 毒颗粒、 和病毒样颗粒。 附图说明：

图 1 : 小鼠免疫程序及检测时间点示意图。 第 0、 4周各免疫一次， 分 别于第 7周（2针免疫后 3周）进行小鼠的眼眶采血分离血清， 并在处死小 鼠后分离脾淋巴细胞。

图 2: 2针免疫后 3周小鼠血清中 Env蛋白特异结合抗体的 ELISA检 测结果。 为避免对图的干扰， 省略了误差线。 2针免疫后 3周小鼠血清的 ELISA检测结果显示： DNA疫苗加佐剂组较之 DNA单独免疫组能显著地 提高疫苗诱导的 Env特异的结合抗体强度。

图 3 : 2针免疫后 3周用 ELISPOT法检测 HIV-1 Env, Gag, Pol的特 异性细胞免疫结果。 细胞免疫检测结果分别用 Env、 Gag, Pol特异肽刺激 小鼠脾细胞后分泌 IFN-γ的细胞数量表示。 小鼠 IFN-γ的 ELISPOT检测结 果显示： DNA疫苗加佐剂组较之 DNA单独免疫组能极显著地提高疫苗诱 导的细胞免疫应答水平 （PO.01 ) 。

发明详述

除非另有说明， 所有技术和科学术语都具有本领域技术人员常 见的含 义。 所有专利， 专利申请， 公开出版物， GenBank序列， 网站以及其他公 开材料均全文援引加入本文， 除非另有说明。

本发明一方面涉及佐剂用于增强目的疫苗在对 象中所诱导的免疫反应 的用途。

在一个实施方案中， 本发明涉及 HIV Tat蛋白或其片段或变体或者编 码 HIV Tat蛋白或其片段或变体的多核苷酸在制备用于 增强目的疫苗在对 象中所诱导的免疫反应的佐剂或疫苗组合物中 的用途。

本文所用的术语"疫苗"和"目的疫苗"可互换使� �， 其均是指： 为有效 预防和控制传染病的发生、 蔓延， 接种于生物体， 具有预防或治疗传染性 疾病的一类生物制品。可分为多种类型， 例如但不限于 DNA疫苗、 蛋白质 疫苗、 病毒载体疫苗、 减毒疫苗、 灭活疫苗等等。

本如文所用， 术语"疫苗"和"目的疫苗"中可包含抗原或者编� �抗原的 多核苷酸。 所述抗原是指可诱导目的对象中免疫应答的抗 原， 所述免疫应 答涉及到某些疾病的缓解、 阻抑、 减轻和 /或治疗， 所述疾病主要是指涉及 某些病毒的传染性疾病， 例如但不限于 HIV病毒、 甲、 乙、 丙型肝炎病毒、 人乳头状瘤病毒疫苗、 黄热病毒疫苗等， 所述疾病还可包括例如疟疾等传 染性疾病。 因此本文所述的疫苗可包括 HIV相关的疫苗、 以及甲、 乙、 丙 型肝炎病毒疫苗、 人乳头状瘤病毒疫苗、 黄热病毒疫苗、 疟疾疫苗等传染 疾病的疫苗。

术语"疫苗组合物"是指含有疫苗的组合物， 此外其中还可以含有药物 学可接受的载体、 佐剂等辅助成分。

如本文所用， 术语"佐剂"是指一种免疫调节剂， 其本身不具有免疫原 性或具有一些免疫原性， 但是可以用于刺激免疫系统以改善对其它具有 免 疫原性的物质的应答。例如同目的抗原一起使 用或分别施用于同一对象时， 可直接或间接地调节所述抗原诱导的免疫反应 或改变该抗原的免疫反应类 型。 所述的免疫反应包括例如体液免疫、 细胞免疫等。 术语" HIV Tat"是指人类免疫缺陷病毒的一种转录反式激� �蛋白， 在本 文中 HIV Tat蛋白可包括其全长蛋白或者该蛋白的功能性 片段或变体。 本 文中所述的"片段"和"功能性片段"可互换使用� � 均是指可实现本发明目的 的蛋白的某些部分。 而本文中所述的"变体"和"功能性变体"也可互� �使用， 其均是指可实现本发明目的的蛋白的突变体， 例如通过采用插入、 缺失、 或取代一个或多个氨基酸等方法所获得的突变 体。

在一个实施方案中，本发明中的所述疫苗包含 DNA疫苗，而所述佐剂 或疫苗组合物包含编码 HIV Tat蛋白或其片段或变体的多核苷酸。

术语" DNA疫苗"也可称作基因疫苗或核苷酸疫苗等， 其是指将含有编 码某种抗原的核苷酸序列的表达载体直接注射 到动物体内， 使所述核苷酸 序列在体内表达， 从而产生的抗原激活机体的免疫系统， 其可用于诱导特 异性的体液免疫和细胞免疫应答。 本文所用的术语"体液免疫应答""细胞免 疫应答 "均具有本领域所熟知的含义。

在一个实施方案中， 所述编码 HIV Tat蛋白或其片段或变体的多核苷 酸被插入到载体中。 在一些实施方案中， 所述载体选自质粒、 重组病毒载 体、 重组细菌载体、 假病毒颗粒、 和病毒样颗粒。

本文中所述的载体是指能够携带外源抗原并能 够在宿主细胞中进行呈 递的系统。 其中包括质粒载体、 重组病毒载体、 重组细菌载体、 假病毒颗 粒、 病毒样颗粒等。 所述的"质粒"是指细菌质粒载体， 包括各种商业化和 实验室构建的质粒载体， 例如但不限于 pDRVISVl.O (由中国疾病预防控制 中心性病艾滋病预防控制中心病毒免疫室构建 的 DNA 疫苗载体， 可参见 CN 1560259 A (中国专利申请 200410028280.3))。 所述的 "重组病毒载体"是 指基于重组病毒构建的能够携带外源基因的载 体， 包括例如重组腺病毒载 体、 重组痘病毒载体、 杆状病毒载体等。 所述的 "重组细菌载体"是指以基 于重组细菌而构建的能够携带外源基因的载体 ， 包括例如重组李斯特菌 (Listeria)载体、 减毒沙门氏菌 (Salmonella)载体等。 所述的 "假病毒颗粒 "是 指用 HIV的框架质粒 DNA与携带膜基因的质粒 DNA共转染细胞而产生的 具有单轮感染活性，但不具有后续感染能力的 病毒，包括例如 HIV假病毒。 所述的 "病毒样颗粒 "是指是含有某种病毒的一个或多个结构蛋白� �空心颗 粒， 其没有病毒核酸， 不能自主复制， 在形态上与真正病毒粒子相同或相 似， 包括例如 HIV病毒样颗粒、 流感病毒病毒样颗粒。 本文中所述的"插入"是指用本领域中常规的技� ��来将感兴趣的抗原引 入到目标载体中， 例如使用重组 DNA技术等。

在一个实施方案中， 本发明中的所述疫苗包含蛋白质疫苗， 而所述佐 剂或疫苗组合物包含 HIV Tat蛋白或其片段或变体。

在一些实施方案中， 本发明的所述目的疫苗包含 HIV Env 蛋白、 和 / 或 HIV Gag蛋白、 和 /或 HIV Pol蛋白、 或者其片段或变体； 或者本发明的 所述目的疫苗包含编码 HIV Env蛋白、 和 /或 HIV Gag蛋白、 和 /或 HIV Pol 蛋白、 或者其片段或变体的多核苷酸。

本文所述的 HIV Env蛋白是指 HIV包膜蛋白 (HIV envelope)以及其功能 性片段或变体， 例如但不限于 HIV包膜蛋白的膜外部分， 如 gpl45 ; 本文 所述的 HIV Gag蛋白是指由 HIV 基因编码的核心蛋白或外壳蛋白及其 其功能性片段或变体， 例如但不限于 P55; 本文所用的 HIV Pol蛋白是指由 HIV pol基因所编码的的各类酶蛋白及其片段或变体 ，例如但不限于反转录 酶、 整合酶、 或者蛋白酶等。

本文所述的对疫苗诱导的免疫应答进行的调节 包括直接或间接地促 进、 加快、 提高、 或者延长所述免疫应答， 如体液免疫和 /或细胞免疫等； 或者改变免疫应答的类型， 例如先天免疫或者获得性免疫等。

再一方面， 本发明还涉及增强目的疫苗在对象中所诱导的 免疫反应的 方法。

在一个实施方案中， 本发明的方法包括给对象施用所述疫苗， 以及在 施用所述疫苗之前、 同时、 或者之后给所述对象施用包含 HIV Tat蛋白或 其片段或变体或者编码 HIV Tat蛋白或其片段或变体的多核苷酸的佐剂。

本发明的佐剂可以与所述疫苗共同使用或分别 单独使用。 其中共同使 用可包括将二者直接混合后在一起给对象进行 施用。 而单独使用可包括将 所述佐剂预先施用于对象， 然后再将所述疫苗施用于同一对象。 或者先施 用所述疫苗后再将所述佐剂施用于同一对象。 其中施用的时间间隔例如为 1 天、 2天、 3天、 4天、 5天、 6天、 1周、 2周、 3周、 或者 4周。

给对象进行免疫的方法和技术是本领域熟知的 。 本领域技术人员可以 在本发明的基础上， 根据需要选择适当的免疫策略以提高免疫效果 。 例如 采用不同的免疫顺序， 不同的免疫频率， 不同的免疫剂量， 使用不同的目 标动物， 在不同的部位免疫等等。 其中所使用的佐剂的剂量范围例如可以 是： 从 l g到 100μ _§ 。作为示例的剂量例如可以是 l g 、 5μg, 10μ _§ , 25μg, 50μg, 或者 100μ ₈ 。 应理解这些选择都属于本领域中常规的技术选 择， 是 在本领域技术人员能力范围之内的。 因此本发明的技术方案涵盖了这些选 择。

在本发明的实施方案中， 对对象进行免疫可以通过本领域任何已知方 法进行。 本发明用来进行免疫的对象可以是人， 也可以是本领域常用的动 物， 例如但不限于小鼠、 大鼠、 猴、 兔、 棉羊、 山羊、 马、 牛等。

在一个实施方案中，本发明的方法中的所述疫 苗包含 DNA疫苗， 并且 所述佐剂包含编码 HIV Tat蛋白或其片段或变体的多核苷酸。

在一个实施方案中， 本发明的方法中所述的编码 HIV Tat蛋白或其片 段或变体的多核苷酸被插入到载体中。 在一些实施方案中， 所述载体选自 质粒、 重组病毒载体、 重组细菌载体、 假病毒颗粒、 和病毒样颗粒。

在一个实施方案中， 本发明的方法中的所述疫苗包含蛋白质疫苗， 并 且所述佐剂包含 HIV Tat蛋白或其片段或变体。

在一些实施方案中， 本发明的方法中的所述疫苗包含 HIV Εην蛋白、 和 /或 HIV Gag蛋白、 和 /或 HIV Pol蛋白、 或者其片段或变体； 或者所述疫 苗包含编码 HIV Env蛋白、和 /或 HIV Gag蛋白、和 /或 HIV Pol蛋白、或者 其片段或变体的多核苷酸。

在一些实施方案中，本发明的疫苗和 /或佐剂是通过肌肉和 /或皮内注射 途径进行施用的。

在另一方面， 本发明还涉及一种疫苗组合物。

在一个实施方案中， 本发明的疫苗组合物其含有如下组分： （a) 疫苗， 其包含免疫原和 /或编码免疫原的多核苷酸； 和 （b)包含 HIV Tat蛋白或其 片段或变体或者编码 HIV Tat蛋白或其片段或变体的多核苷酸的佐剂。

在另一个实施方案中，本发明的疫苗组合物中 的所述疫苗包含 DNA疫 苗， 而所述佐剂包含编码 HIV Tat蛋白或其片段或变体的多核苷酸。 在一 些实施方案中， 所述编码 HIV Tat蛋白或其片段或变体的多核苷酸被插入 到载体中。 在一些实施方案中， 所述载体选自质粒、 重组病毒载体、 重组 细菌载体、 假病毒颗粒、 和病毒样颗粒。

在另一个实施方案中， 本发明的疫苗组合物中的所述疫苗是蛋白质疫 苗， 而所述佐剂包含 HIV Tat蛋白或其片段或变体。 在一些实施方案中， 本发明的疫苗组合物中的所述疫苗包含 HIV Env 蛋白、 和 /或 HIV Gag蛋白、 和 /或 HIV Pol蛋白、 或者其片段或变体； 或者 所述目的疫苗包含编码 HIV Env蛋白、 和 /或 HIV Gag蛋白、 和 /或 HIV Pol 蛋白、 或者其片段或变体的多核苷酸。

在另一方面， 本发明还涉及一种佐剂。

在一个实施方案中， 本发明的佐剂含有 HIV Tat蛋白或其片段或变体 或者编码 HIV Tat蛋白或其片段或变体的多核苷酸。 在一些实施方案中， 所述编码 HIV Tat蛋白或其片段或变体的多核苷酸被插入到载 体中。 在一 些实施方案中， 所述载体选自质粒、 重组病毒载体、 重组细菌载体、 假病 毒颗粒、 和病毒样颗粒。 以下结合具体实施例对本发明做进一步的阐述 。

实施例

除非另有说明， 以下实施例中所使用的分子技术均是本领域技 术人员 熟知的常规技术。 此类技术的具体实施步骤可参见各种实验室手 册以及教 科书等，例如 J. Sambrook的 Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbour Laboratory Press, 1989)、 J. Perbal的 A Practical Guide to Molecular Cloning (John Wiley and Sons, 1984)、 T. A. Brown等的 Essential Molecular Biology: A Practical Approach (IRL Press, 1991)、以及 D. M. Glover 等的 DNA Cloning: A Practical Approach (IRL Press, 1995和 1996)等。

本发明所使用的实验材料： pDRVISVl.O是由中国疾病预防控制中心性 病艾滋病预防控制中心病毒免疫室构建的 DNA 疫苗载体。 可按照 CN 1560259 A (中国专利申请 200410028280.3) 所述的方法构建载体 pDRVISVl.O, 在此通过引用将 CN 1560259 A并入本文。在 DNA疫苗载体 pDRVISVl.O基础上构建的 HIV BVC 重组毒株 Env、 Gag, Pol基因的疫苗 质粒。制备无内毒素的质粒 DNA的 Endofree Plasmid Giga Kit为 Qiagen公 司产品； Mouse lFN-y ELISPOT检测试剂盒为 U-CyTech公司产品。细胞培 养液购自 Hyclone公司。胎牛血清购自杭州四季青生物工� �材料有限公司。 抗 HIV-1 阳性血清来自性病艾滋病预防控制中心参比室 (可经规范程序获 得)；辣根过氧化物酶 HRP标记羊抗鼠 IgG购自北京中山公司；来源于 BVC 重组亚型 HIV-1毒株 Env的合成肽用于 ELISPOT分析，由美国国立卫生研 究院艾滋病研究参比试剂项目 （NIH AIDS Research & Reference Reagent Program) 馈赠 (；可免费获得：)； ELISA检测所用 HIV-1 Env抗原由性病艾滋 病预防控制中心病毒免疫室提供， 其是依据常规技术进行表达的； Laborzentrifugen台式冷冻离心机为 Sigma公司产品， Beckman J2-MC高速 冷冻离心机； 二氧化碳培养箱为 SANYO 公司产品； ELISPOT 读板仪为 BIOSIS公司产品；实验动物为 6-8周龄 BALB/c H-2d雌性小鼠，体重 18-25 克， 购自中国医学科学院动物繁殖中心， 于北京昭衍新药研究中心清洁级

实施例 1 : 质粒的构建

所有本实施例中用到的质粒均为 pDRVISVl.O, 简称 pl.0。

使用如下引物将 HIV Tat序列插入到 DRVISVl.O载体内：

Rv-Tat: GAAGATCTTTAGTCGAATGGGTCTGTCTCTG (SEQ ID NO: 2) 所使用的模板 Tat 序列由 Invitra en 公司合成， 其具体序列为:

1. PCR (PCR仪购自 Takara公司） 条件如下

(PCR所有试剂均购自 Takara公

lOx聚合酶缓冲液， 含 Mg2+ 5μ1

dNTP(10mmol/L) 4μ1

上游引物 （50μηιο1/:0 Ιμΐ

下游引物 （50μηιο1/:0 Ιμΐ

模板 DNA 0.5μ1

DNA聚合酶 Ιμΐ Pyrobest DNA Polymerase

加 ddH20至总体积 50μ1

混匀后， 置 PCR仪上进行循环反应。 首先 94°C变性 5 min; 然后 94°C 30sec， 52 °C 30sec, 72 °C 30sec, 29个循环; 最后 72°C延伸 10min。 反应完 毕， 取 Ιμΐ扩增产物在 1.0%琼脂糖凝胶中进行电泳检测。 2. PCR产物的凝胶回收 (使用购自 Omega公司的 E.Z.N.A Cycle-Pure Kit)

(a)切取含目的 DNA 的琼脂糖凝胶。

(b)称量胶的重量加入 3-6 倍体积的 Binding Buffer。

(c) 55 -65°C温浴直至胶完全溶解。

(d)将胶溶解液转移到 DNA制备管置于 2ml 离心管 14000 rpm离心 10 秒弃滤液。

(e)将制备管置回离心管加 750m 1 DNA Wash Buffer 14000 rpm离心 10 秒弃滤液。

(f)重复步骤 (e)—次。

(g)将制备管置回离心管 14000 rpm离心 2 min后， 将制备管移入新的 1.5ml 的离心管中， 在 DNA制备膜正中央加 50μ1双蒸水室温静置 1 min,

14000 rpm离心 2 min洗脱 DNA。

3. 酶切 （所使用的酶均购自 Takara公司）

将胶回收基因片段和表达质粒载体分别进行 双酶切， 体系如下:

Sai l Ιμΐ

Bgl ll Ιμΐ

ΙΟχΗ buffer 2μ1

质粒载体或 Tat片段 Ιμΐ

加 ddH20至总体积 20μ1

37°C水浴， 过夜。

4. 连接 (试剂盒购自 Takara公司）

连接体系如下：

酶切后的载体 Ιμΐ 酶切后的 Tat片段 Ιμΐ

10χ酶连缓冲液 2μ1

连接酶 0.5μ1

20μ1

5. 转化

(a)取出于— 70°C冻存的 E coli (DH5a) 感受态细胞， 置于冰上； (b)再加入 ΙΟμΙ连接产物， 轻轻混匀， 置冰浴 30min， 另设质粒及不加 质粒 DNA的感受态细胞实验对照；

(c) 42°C热休克 90sec， 不要摇动试管， 迅速放入冰浴 2min;

(d)每管加入 800μ1 37°C预热的 LB培养液，于 37°C培养 lhr，使细胞复 苏， 并表达质粒编码的抗生素标记基因。

(e)将转化的细胞分别涂布于含有卡那霉素的 LB琼脂平皿上， 37°C倒 置培养 16hrs以上。

6. 质粒提取 (试剂盒购自 Omega公司：)。 质粒命名为： pl.0-Tat。 7. 最后质粒送 Invitrogen公司测序正确。

8. 本发明的实施例中所使用的各种 DNA疫苗均可参照上述过程采用常规 技术进行构建。所得到的质粒分别命名为 pl.0-Gag、 pl.O-Env,和 pl.0-Pol。 本文中统一使用 "质粒名 +目的基因名"的命名方式。 其中用到如下模板：

Env模板： 保藏号为 CGMCC No.2112的质粒 pDRVI3.1-env (；参见中国 专利申请 200710129786.7， 公开号 CN101353665A, 该出版物援引加入本 文)。

Pol模板： 保藏号为 CGMCC No.1003的质粒 pCRScript-gpnef (参见中 国专利申请 200710088735.4， 公开号 CN 101270363A, 该出版物援引加入 本文：)。

Gag模板： 保藏号为 CGMCC No.1003的质粒 pCRScript-gpnef (参见中 国专利申请 200710088735.4， 公开号 CN 101270363A, 该出版物援引加入 本文：)。 其中所使用的引物为：

pl.O-Gag构建的引物：

Fwd-Gag: ACGCGTCGACGCCACCATGGCCGCCAGGGCCAG (SEQ ID NO: 4) Rv-Gag: CGGGATCCTCACTGGCTGCTGGGGTCGTTG (SEQ ID NO: 5)

退火温度为 60°C， 72°C延伸 2分钟。 pl.O-Pol构建的引物：

Fwd-Pol: ACGCGTCGACGCCACCATGGCCGCCAGGGCCAGC (SEQ ID NO: 6) Rv-Pol: GATATCTTACTTGGTCCTGTGCTGGCCGATC (SEQ ID NO: 7)

退火温度为 63°C， 72°C延伸 4分半。 pl.O-Env构建的引物：

Rv-Env: GATATCTCAGTAGCCCTGCCTCACCCTG (SEQ ID NO: 9)

退火温度为 60°C， 72°C延伸 4分钟。

其余的步骤均类似于上述过程。

实施例 2: HIV Tat与 DNA疫苗联合免疫小鼠

实验动物分组： 42只 6-8周龄 Balb/c雌性小鼠分为 6个免疫组 （三种 DNA疫苗各含有一个单独施用组和一个添加佐剂 组）、 以及 1个空载体对 照组。 分组及免疫方案如表 1所示：

表 1. DNA疫苗免疫小鼠实验方案

6只 /组

Gag+佐剂 pl.O-Gag 50μ _§ pl.O-Tat 肌肉 2次

6只 /组

Pol单独 pl.O-Pol 50μ _§ 无 肌肉 2次

6只 /组

Pol+佐剂 pl.O-Pol 50μ _§ pl.O-Tat 肌肉 2次

6只 /组 空载体对照 pl.O 50μ _§ pl.O-Tat 肌肉 2次

免疫方法： 对于 DNA疫苗加佐剂免疫组， 取 5(^L浓度为 l g/ L的 DNA疫苗和 5(^L浓度为 l g/ L的 pl.O-Tat混匀， 然后注射小鼠。 对于无 佐剂的 DNA疫苗免疫组， 取 5(^L浓度为 l g/ L的 DNA和 50μΙ^浓度为 l g/ L的空载体质粒混匀注射小鼠。空载体组对照� �取 5(^L浓度为 l g/ L 的 pDRVIl.O空质粒载体和 5(^L浓度为 l g/ L的 DNA Tat混匀， 然后注 射小鼠。 注射部位为 Balb/C鼠胫骨前肌， 左右腿各注射 50μΙ^。

免疫程序及检测时间如图 1示： 免疫程序为第 0、 4周各免疫一次。 于 第 7周先用巴比妥那麻醉后再眼眶采血分离血清� � 之后处死小鼠后分离脾 淋巴细胞。 实施例 3： HIV Tat与 Env的抗原 DNA疫苗联合免疫小鼠后的体液免疫检 第 0、 4 周各免疫一次，第 7周先用巴比妥那麻醉后再眼眶采血分离血 清， ELISA检测 Env抗原)特异性结合抗体滴度。 Env抗原蛋白是通过上述 构建的用于免疫小鼠的质粒 pl.O-Env 在 293 悬浮细胞表达系统 （购自 Invitrogen公司） 里表达获得。

步骤 1 : 用纯度大于 95%的 HIV-1 BVC重组毒株重组 Env抗原蛋白包 被酶标板 （O.l g/ml), 每孔加 0.1ml相应的所述蛋白抗原， 4°C过夜。 次日 洗涤缓冲液洗涤 3次， 甩尽残余液体。 以抗体稀释液封闭 60min， 洗涤缓 冲液洗涤 3次， 甩干后作检测， 或晾干后 4°C保存；

步骤 2:将抗体稀释液系列稀释的待检样品 (稀释的样品为小鼠血清:) (JA 1:100开始， 倍比稀释至 1 : 12800) 0.1ml加入到上述已包被的反应孔中， 置 37°C孵育 60min， 洗涤 8次 （同时做空白、 阴性及阳性孔对照。 空白为： 不加 任何血清； 阴性为： 空白小鼠的血清； 阳性为： 之前已鉴定过反应为阳性 的小鼠的血清：)；

步骤 3 : 于反应孔中， 加入新鲜 1 : 5000抗体稀释液稀释的酶 (辣根过氧 化物酶:)标记的第二抗体 (抗抗体 (所有 ELISA检测中的二抗均为抗鼠的辣根 过氧化物酶》 0.1ml, 37°C孵育 60min， 洗涤 8次， 甩尽残余液体， 在纸上拍 干；

步骤 4: 加底物液显色： 于各反应孔中加入临时配制的 TMB底物溶液 0.1ml, 37°C避光反应 lOmin, 待显色完全后加入 50μ1的 2M硫酸终止反应； 步骤 5: 结果判定： 在 ELISA检测仪上， 于 450nm处 （630为参考波长：)， 以空白对照孔调零后测各孔 0D值， 若大于阴性对照 0D值的 2.1倍， 即判定 为阳性。

针对 Εην抗原的检测结果见图 2。 小鼠 2 次免疫后 3 周进行血清的 ELISA检测 （如图 2示） 显示： DNA疫苗加佐剂组较之 DNA疫苗单独免 疫组能显著地提高疫苗诱导的 Env特异的结合抗体强度。 检测结果均表明 HIV Tat佐剂可以显著地提高 DNA疫苗所诱导的体液免疫反应的强度。

就 Env特异的结合抗体而言： 比较"单独免疫 pl.O-Env 组"和"免疫 pl.O-Env+pl.O-Tat组"的小鼠血清中的结合抗体滴度 ， 在相应组的小鼠血清 被 200倍、 400倍、 800倍稀释后， 用酶标仪检测其吸光值 （OD值） ， 可 看到"免疫 pl.O-Env+pl.O-Tat 组"的小鼠血清中的结合抗体滴度较"单独免 疫 pl.O-Env组"的小鼠而言， 有近 2倍的提高。且具体数值均大于阴性对照 值的 2.1。 实施例 4: HIV Tat与 DNA疫苗联合免疫小鼠后的细胞免疫检测

( 1 ) 小鼠脾淋巴细胞的提取 (；本实验中所用 RPMI1640均购自 Hyclone：)。

1 ) 处死小鼠后， 将小鼠整体于 75%的酒精中稍微浸泡进行消毒， 无 菌超净工作台条件下进行操作；

2) 无菌条件下取出小鼠脾脏， 在 5ml的 Hanks洗液 （由中国疾病预防 控制中心病毒病预防控制所配液室提供） 中以双层纱布研磨分散 脾细胞， 转移至 15ml无菌离心管中， 4°C， lOOOrpm条件下离心 5min;

3 ) 弃去上清中大部分的 Hanks洗液，用少量残留液体重悬细胞后，每 管加入 37°C预热的红细胞裂解液 (购自 Hyclone)2ml，从第一管开始 计时， 作用 4min后， 再加入 5ml的 RPMI1640洗液终止裂解反应， 马上于 4°C， lOOOrpm条件下离心 5min;

4) 弃大部分上清， 用少量残留液体重悬细胞后， 每管再加入 5ml的 RPMI1640洗液洗细胞， 于 4°C， lOOOrpm条件下离心 5min;

5 ) 弃大部分上清， 用少量残留液体重悬细胞后， 每管加入 2ml的含 10%胎牛血清 （购自杭州四季青生物工程材料有限公司产品 ） 的 RPMI1640完全培养液 (；可购自 Hyclone), 混匀后取细胞悬液 ΙΟΟμΙ 加入 900μ1的 PBS中， 在细胞计数仪中进行细胞计数， 按照所得细 胞数调整细胞浓度到 1 X 10 ⁷ /ml。

(2) ELISPOT检测脾淋巴细胞反应水平

1) 包被:在 ELISPOT 板中每孔加入包被抗体 (；纯化的抗 IFN-γ 的单 抗) 50μ1， 用 PBS补充体积至每孔 ΙΟΟμΙ, 加盖， 37°C 2h。

2) ELISPOT板的封闭 (blocking)。

3) 取出已包被过的 ELISPOT板，吸取并弃去每孔中的包被抗体溶液� �

4) 无菌条件下通过 300μ1移液器用 PBST(PBS+Tween20)洗涤 6次。

5) 在 ELISPOT板中，每孔加入 200μ1含 1%BSA (；或封闭缓冲液 (Block buffer))的 PBS, 37 °C lh。

6) 取出 37°C下封闭 lh的 ELISPOT板， 吸弃每孔中的封闭液。

7) 在 ELISPOT 板中， 加入 ΙΟΟμΙ 相应的所述抗原蛋白 (；浓度为 lO g/ml), 最后加入 ΙΟΟμΙ上述所获取的淋巴细胞， 总体积到 200μ1 (；细胞的 终浓度为 l x l0 ⁷ /ml，即每孔细胞总数为 l x l0 ⁶ )。阴性对照不加多肽，加 ΙΟΟμΙ RPMI1640完全培养基。 阳性对照不加多肽， 加入 ΡΜΑ 2.5μ1 (25ι¾/ηι1)， 肌 霉素 (Inomycin) Ιμΐ (l g/ml^ 免疫组均为一式两份。

8) 盖好 ELISPOT板， 放入 37°C、 含 5%C02的孵箱培养 30 h。

9) 培养 30h后， 取出 ELISPOT板。 甩去细胞后， 每孔加入 200 μΐ的 去离子水。 把 ELISPOT板放置在冰浴中 10分钟。

10)用 PBST洗 8次 ELISPOT板。

11)每孔加入 ΙΟΟμΙ 生物素化的检测抗体 (即生物素化的抗 IFN-γ的单 抗)。用膜封住 ELISPOT板后，把 ELISPOT板放置在 37°C 孵箱中孵育 lh。

12)取出 ELISPOT板， 倒去检测抗体溶液， 用 PBST洗涤 8次。

13)每孔加入 50μ1 GABA溶液。用膜封住 ELISPOT板后，把 ELISPOT 板放置在 37°C 孵箱中孵育 lh。 14)取出 ELISPOT板， 倒去 GABA溶液。 用 PBST洗涤 8次。 洗涤完 毕后， 在吸水纸上轻轻拍干 ELISPOT板。

15)每孔加入 30 μΐ 显色液 (可常规商业购买：)。 在暗处、 室温下孵育 (15〜40分钟）。

16)出现斑点后， 用蒸馏水冲洗， 终止反应。

17)室温下避光干燥， BIOSIS读板仪检测以评价 Τ淋巴细胞免疫反应 水平。

结果见图 3。 小鼠 2次免疫后 3周 ELISPOT法检测 HIV-1 Env、 Gag, Pol特异性细胞免疫的结果。 由于 Tat序列、 Gag序列、 Pol序列和 Env序 列相互之间不存在序列的相似性，而且 ELISpot和 ELISA实验都是抗原特 异性很强的试验。 所以上述结果表明： 与单独 DNA免疫组相比较， DNA 疫苗加佐剂组能显著地提高 Env、 Gag, Pol 的特异性细胞免疫反应水平 (P<0.01 )。 这些检测结果表明 HIV Tat佐剂可以显著提高 DNA疫苗所诱 导的细胞免疫反应的强度。

"单独免疫 pl.O-Env 组"和"免疫 pl.O-Env+pl.O-Tat 组"、 "单独免疫 pl.O-Gag组"和"免疫 pl.O-Gag+pl.O-Tat组"、 "单独免疫 pl.O-Pol组"和"免 疫 pl.O-Pol+pl.O-Tat组"的 ELISPOT结果具体分析如下：

"单独免疫 pl.O-Env组"和"免疫 pl.O-Env+pl.O-Tat组"： 1 以 SFU值（每 百万个细胞）大于 50作为判定为阳性反应的标准； 2 用单因素方差分析的 方法检测组间数据的统计学差异。 结果显示： "单独免疫 pl.O-Env组"的平 均 SFU<50， 为阴性； "免疫 pl.O-Env+pl.O-Tat组" 的平均 SFU>50， 为阳 性。 且 2组间的统计学分析显示： ？值<0.05。 故结论为： 在本实验条件下， Tat佐剂的辅助可使 Env特异性的 T细胞反应由阴性变为阳性， 增强倍数 达 3倍之多， 且具有显著的统计学差异。

"单独免疫 p 1.0-Gag组"和"免疫 p 1.0-Gag+p 1.0-Tat组"： 1 以 SFU值（每 百万个细胞）大于 50作为判定为阳性反应的标准； 2 用单因素方差分析的 方法检测组间数据的统计学差异。 结果显示： "单独免疫 pl.O-Gag组"的平 均 SFU>50， 为阳性； "免疫 pl.0-Gag+pl.0-Tat组" 的平均 SFU>50， 为阳 性。 但 2组间的统计学分析显示： ？值<0.01。 故结论为： 在本实验条件下， Tat佐剂的辅助可明显增强 Gag特异的 T细胞反应， 增强倍数达 6倍之多， 且具有显著的统计学差异。 "单独免疫 pl.O-Pol组"和"免疫 pl.O-Pol+pl.O-Tat组"： 1 以 SFU值（每 百万个细胞）大于 50作为判定为阳性反应的标准； 2 用单因素方差分析的 方法检测组间数据的统计学差异。 结果显示： "单独免疫 pl.O-Pol组"的平 均 SFU>50，为阳性； "免疫 pl.O-Pol+pl.O-Tat组" 的平均 SFU>50，为阳性。 但 2组间的统计学分析显示： ？值<0.01。 故结论为： 在本实验条件下， Tat 佐剂的辅助可明显增强 Pol特异的 T细胞反应， 增强倍数达 6倍之多， 且 具有显著的统计学差异。 以上实施例仅用于说明本发明， 其无意于对本发明的范围做出任何限 制。 显然， 在不脱离本发明的精神和实质的情况下， 本领域人员可以对本 发明做出多种改动和变化， 因此， 这些改动和变化同样在本申请要求保护 的范围内。