Sector Técnico

La tecnología está orientada al área de la salud, más particularmente, corresponde a un aerogel que permite la absorción de sangre y formación de coágulo para la cicatrización de una herida.

Técnica Anterior

Las heridas son afecciones comunes que se presentan en los seres humanos y que en dependencia de su magnitud y el lugar donde se produce -sea vena o arteria- pueden conducir a hemorragias o sangramientos profusos, que pueden provocar hasta el deceso de una persona. Según reporta la Organización Mundial de la Salud (OMS), para el año 2017 las principales causas de defunción fueron dadas por afecciones cardiovasculares y diabetes, ambas enfermedades con tendencia directa a la aparición de sangramientos.

En general, para tratar estas afecciones se utilizan agentes hemostáticos (apósitos ideales), que deben lograr una curación rápida de la herida a un costo razonable y con el mínimo de inconvenientes para el paciente. Desde el punto de vista fisiológico, el apósito que se utilice debe ser compatible con las células de la piel que estén expuestas, además deben permitir una buena exudación en la herida, una correcta oclusión de la misma y garantizar la presencia de un ambiente húmedo para permitir que se mantenga un adecuado suministro de sangre y oxígeno, una temperatura adecuada, y con ello, se evite la infección (Boateng & Catanzano, 2015).

En dependencia del tipo y magnitud de la herida, nivel de exudado, presencia o no de infección y etapa de la curación en la cual se encuentre la herida, varios productos médicos han sido ocupados para estos fines. Estos materiales hemostáticos se pueden clasificar en dependencia de su modo de acción en el organismo en hidrogeles, hidrocoloides estándares, compresas impregnadas, apósitos bioactivos y de carbón, o materiales reabsorbióles como Gelfoam®, Surgicel® y aerogeles. Un factor importante para el uso de estos materiales como agentes hemostáticos son sus propiedades de superficie y en particular, su carga superficial. Ante esta situación, surge la necesidad de desarrollar formulaciones con propiedades mejoradas para la entrega eficaz y precisa de los agentes terapéuticos requeridos.

En el caso de materiales hemostáticos inorgánicos micro- o meso-porosos, estos promueven la hemostasia en base a la absorción rápida del fluido y la proliferación de células sanguíneas y plaquetas (Liang, et al., 2018). Un ejemplo de esto, son las gazas de quitosano modificada con polímeros sintéticos (Chan et al., 2016), cuya superficie cargada positivamente detiene el sangrado de heridas mediante la interacción electrostática con las membranas celulares cargadas negativamente de eritrocitos, para causar su aglutinación y el sellado de la herida mediante la adhesión tisular. Yan y colaboradores (2017) proponen un material tipo esponja basado en colágeno reforzado con quitosano y nanoflores de pirofosfato de calcio, el cual es capaz de activar el procedimiento intrínseco de la cascada de coagulación, induciendo la adherencia de hemocitos y plaquetas, y promoviendo la coagulación de la sangre hasta controlar la hemorragia in vitro e in vivo. Del mismo modo, se han desarrollado hidrogeles para actividad hemostática (Behrens et al., 2014), a partir de partículas de hidrogel sintético con N-(3-aminopropil) metacrilamida, mostrando un rápido hinchamiento debido a la absorción de sangre causando agregación local mientras retarda la coagulación en el seno del fluido, con lo cual se evitado el riesgo de la formación de trombos distales. Esto debido a la superficie altamente positiva y una baja densidad de reticulado. Estas tecnologías coinciden en la importancia de la modificación superficial para la mejora de sus propiedades y su posterior agregación plaquetaria iniciando el proceso de coagulación. No obstante, ellos no incorporan agentes activos que respondan al estímulo del sangrado, propiciando el proceso de coagulación.

Por otra parte, el progreso en la nanotecnología ha permitido la síntesis de nuevos precursores de nanomateriales y/o materiales inteligentes con la finalidad de ser aplicados en procesos hemostáticos, considerando que estos materiales presentan propiedades fisicoquímicas y biológicas que avalan su uso en el área biomédica (Howe & Cherpelis, 2013). Entre los mismos, se destacan los derivados del grafeno y en particular el óxido de grafeno (GO), ya que es calificado como un potencial material de construcción para producir sistemas de administración de fármacos debido a su gran superficie específica, abundantes grupos funcionales y a su biocompatibilidad (Mao et al., 2013). La presencia de grupos funcionales oxigenados en la estructura del GO, le han permitido desarrollar diversas propiedades favorables, las cuales han sido empleadas exitosamente en el área biomédica (Nezakati et al., 1987). Sin embargo, en este campo de estudio, este material ha presentado problemas de biocompatibilidad y toxicidad a determinadas concentraciones, por lo que ha sido unido a polímeros, cuyo proceso de funcionalización mejora las propiedades de ambos materiales (Pinto et al., 2013).

Por otra parte, los materiales compuestos basados en polímeros funcionalizados con GO, pueden transformarse en estructuras porosas 3D llamados aerogeles. Los aerogeles son materiales coloidales similares a los geles, con estructuras tridimensionales en las cuales el componente líquido es cambiado por gas, y como resultado se logran estructuras de baja densidad, altamente porosas, con una gran área superficial y buenas propiedades mecánicas (Araby et al., 2016). Para su obtención se utiliza una técnica sol-gel, que consiste básicamente en obtener un hidrogel altamente reticulado, el cual posteriormente se somete a procesos de liofilización o secado supercrítico con CO2 para dar lugar a la obtención de los aerogeles (Ma et al., 2015). Numerosos polímeros, naturales o sintéticos se han ocupado para generar aerogeles para estos fines, tales como el polietilenglicol (PEG), polivinilalcohol (PVA), ácido poliláctico, quitosano (CS), gelatina, poliacrilamida, entre otros (Pan et al., 2017; Bai et al., 2010; Bao et al., 201 1 ; Piao et al., 2015; Scaffaro et al., 2016).

El proceso de síntesis de los aerogeles está influenciado por variables tales como grado de oxidación del GO y tiempo de sonicación del mismo, temperatura de reacción del polímero y del GO, pH de la solución GO/polímero, proporción GO/polímero, carga superficial, entre otras. Estas variables generan cambios significativos en la estructura de los aerogeles, de ahí la importancia de considerar su estudio en nuevas formulaciones.

Adicionalmente, evidencias experimentales han demostrado que la inclusión de materiales con propiedades activas, en las matrices poliméricas de aerogeles modifican sus propiedades superficiales, en favor de mejorar la interacción con medios externos. Estos materiales que se cargan a los aerogeles pueden a su vez ser liberados al medio y actuar como fármacos en dependencia de la finalidad que se les otorgue.

Teniendo en cuenta estos antecedentes, un desafío actual es el desarrollo de materiales inteligentes cuyas modificaciones estructurales favorezcan las interacciones de estos biomateriales con medios externos como la sangre; permitiendo que los mismos actúen como agentes promotores de la hemostasia, acelerando los procesos de coagulación sanguínea.

Referencias:

• Araby, S., et al., Journal of Materials Science (2016) 51 (20), 9157.

• Aron, P. M., and Kennedy, J. A., Molecular Nutrition & Food Research (2008) 52 (1 ), 79.

• Bai, H., et al., Chemical Communications (2010) 46 (14), 2376.

• Bao, H., et al., Small (Weinheim an der Bergstrasse, Germany) (201 1 ) 7 (1 1 ), 1569.

• Behrens, A. M., et al., Acta biomaterialia (2014) 10 (2), 701 .

• Boateng, J., & Catanzano, O., Journal of pharmaceutical Sciences (2015) 104 (1 1 ), 3653.

• Chan, L. W., et al., Acta biomaterialia (2016) 31 , 178.

• Howe, N., and Cherpelis, B., Journal of the American Academy of Dermatology (2013) 69 (5), 659. e1 .

• Nezakati, T., et al., Archives of Toxicology (2014) 88 (1 1 ), 1987.

• Ma, Y., and Chen, Y., National Science Review (2015) 2 (1 ), 40.

• Li, G. F., et al., Colloids and Surfaces B-Biointerfaces (2018) 161 , 27.

• Liang, Y. P., et al., Colloids and Surfaces B-Biointerfaces (2018) 169, 168.

• Pan, C., et al., Macromolecular Materials and Engineering (2017) 302 (10).

• Piao, Y., and Chen, B., Journal of Polymer Science Part B: Polymer Physics (2015) 53 (5), 356.

• Pinto, A. M., et al., Colloids and surfaces. B, Biointerfaces (2013) 1 1 1 , 188.

• Scaffaro, R., et al., Composites Science and Technology (2016) 128 (Supplement C), 193. Yan, T. S., et al., Carbohydrate Polymers (2017) 170, 271 . DOI: 10.1016/j.carbpol.2017.04.080.

Breve descripción de las figuras

Figura 1 : Difracción de Rayos-X para muestras de GO y aerogel GO-MMW-CS a pH 10.

Figura 2: Espectroscopia FTIR para GO y GO-MMW-CS a pH 10.

Figura 3: Espectro Raman para muestra de GO-MMW-CS a pH 10.

Figura 4: Espectros Raman para muestras de GO-MMW-CS y GO-MMW-CS-Ext a pH 10.

Figura 5: Deconvolución espectros Raman para muestras de (A) GO-MMW-CS y (B) GO-MMW-CS-Ext a pH 10.

Figura 6: Modulo elástico de los aerogeles sintetizados.

Figura 7: Imágenes SEM de los aerogeles sin carga y con carga de extracto de uva (6% y 12%) a pH 4.

Figura 8: Imágenes SEM de los aerogeles sin carga y con carga de extracto de uva (6% y 12%) a pH 10.

Figura 9: Imágenes SEM y análisis de tamaños de poros y láminas para GO- MMW-CS a pH 10.

Figura 10: Imágenes SEM y análisis de tamaños de poros y láminas para GO- MMW-CS-Ext a pH 10.

Figura 1 1 : Absorción de PBS.

Figura 12: Absorción de agua.

Figura 13: Porcentaje de absorción de sangre en los aerogeles desarrollados, gaza y sangre fresca fueron usados como controles.

Figura 14: Imágenes SEM de los aerogeles con carga de extracto de uva de 6% (A) y 12% (B) a pH 10 una vez que absorbido la sangre.

Figura 15. Liberación del extracto de semilla de uva desde los aerogeles sintetizados.

Divulgación de la Invención

La presente tecnología corresponde a un aerogel en base a óxido de grafeno (GO) funcionalizado con un derivado desacetilado de la quitina (CS) no covalentemente, con la inclusión de proantocianidinas (PAs) en su matriz, cuyas propiedades fisicoquímicas permiten la absorción de sangre y formación de coágulo; y a su vez, permite la liberación de los extractos, que promueven la carga negativa de la superficie del aerogel propiciando la cicatrización de una herida.

Este aerogel posee una alta área superficial específica (390 - 600 m ² /g), una carga superficial negativa, lo que le confiere una gran capacidad de absorber fluidos, principalmente sangre, que lo hacen adecuado como agente hemostático. Esto se debe a que el óxido de grafeno (GO), dado sus propiedades químicas y físicas, se funcionaliza con quitosano (CS) permitiendo la generación de una estructura porosa, ligera y de gran versatilidad.

Específicamente, el aerogel comprende al menos los siguientes componentes: a. óxido de grafeno (GO) entre 60 - 93% p/p;

b. un derivado desacetilado de la quitina (CS) entre 50 - 5% p/p; y c. proantocianidinas (PAs) entre 15 - 2 % p/p.

Donde las proantocianidinas se obtienen a partir de extractos de semilla de uva, para qué mediante un proceso de liberación sostenida se liberen desde el aerogel.

Este aerogel presentan un tamaño de poro entre 10,2 - 13,0 pm y logra absorber entre 50 - 70 g/g de agua y PBS, respectivamente, conviertiéndolo en un buen absorbente.

Esta tecnología tiene como ventaja, absorber el sangrado profuso durante la lesión, y a la vez, liberar los componentes bioactivos (extracto natural) en el lugar de la lesión, en respuesta a un cambio de pH que genera la liberación de sangre y los exudados de la herida. Esto en comparación a los absorbentes comunes como las gazas, significa una mejora en un 100% del desempeño del absorbente. Este efecto combinado, por una parte, de absorber la sangre en caso de sangrado profuso, y a la vez, liberar un componente activo desde la matriz (extracto de semilla de uva), lo convierten en un producto único que no se comercializa actualmente.

Ejemplo de aplicación

Ejemplo 1 . Síntesis de aerogeles GO-CS con extracto de uva.

Primeramente, se procedió a la obtención de óxido de grafeno, luego a la síntesis de aerogeles GO-CS, y finalmente se obtuvieron aerogeles GO-CS con extracto de uva, el detalle de cada uno se presenta a continuación:

1 .1 . Síntesis de óxido de grafeno.

El GO fue sintetizado a partir de escamas de grafito en polvo, para lo cual se utilizó el método de Hummers modificado según el protocolo de Marcano et al. (ACS nano (2010) 4 (8), 4806), por ser un método recomendado para exfoliación de las capas superpuestas de grafeno. Se preparó una mezcla sólida de KMn04 (3,6 g) y grafito (0,6 g), luego se agregó lentamente a una mezcla líquida de H2SO4 (72 mL) y H3PO4 (8 mL) agitando en baño de hielo bajo campana. Luego de que se enfrió, se mantuvo a una temperatura de 50°C con agitación por 12 horas. Se enfrió y detuvo la reacción con H2O2 al 30% v/v y se filtró el producto con un filtro grande. Se lavó y centrifugó por 10 minutos a 20.000 rpm, donde el sobrenadante se desechó y se recolectó el sólido. Se lavó lo recolectado con HCI al 30% v/v, se filtró y centrifugó a 20.000 rpm por 10 minutos. A continuación, se realizó un lavado con etanol, se filtró y centrifugó. Estos lavados y centrifugados se repitieron con agua Mili-Q (MQ) dos veces. El material resultante fue coagulado con éter y recuperando el sólido final para luego ser liofilizado durante 3 días.

1 .2.- Síntesis de los aerogeles GO-CS.

Los compuestos de GO y CS fueron liofilizados para preparar la funcionalización no-covalente de GO-CS según el protocolo de Yu et al. {Journal of Environmental Chemical Engineering (2013) 1 (4), 1044), modificado para evaluar la influencia del pH y el peso molecular del quitosano.

Se preparó una mezcla de 0,5 mg/mL de GO y 600 mL de agua MQ a pH 6 y se mantuvo bajo agitación. Luego se preparó una solución de CS de bajo peso molecular (LMW-CS) (1 ,0 mg/mL, pH 2, 30 mL), la cual fue agregada lentamente mediante goteo con una pipeta de embolo en la mezcla de GO, observándose un precipitado color café. Se mantuvo mediante agitación por una hora y luego se realizaron 3 lavados con agua MQ a 4500 rpm por 5 minutos obteniéndose un producto en el fondo. Se depositó en una placa Petri de vidrio sellada con papel film y tapada. Luego se congeló utilizando el quipo CFC FREE y liofilizó durante tres días.

Se recreó el mismo protocolo agregando NaOFI 1 M mediante goteo a la mezcla resultante GO-LMW-CS hasta alcanzar un pH=10, observándose un precipitado más oscuro. Luego se siguieron los mismos pasos de agitación, centrifugado y lavado.

Finalmente, se llevó a cabo el mismo protocolo anterior utilizando CS de medio peso molecular (MMW-CS). Con esto se obtuvo un total de 4 GO-CS, dos utilizando LMW-CS a pH 4 y 10, y dos utilizando MMW-CS a pH 4 y 10. En la Tabla 1 se presentan las condiciones a las cuales se produjeron los aerogeles.

Tabla 1 . Condiciones de síntesis para aerogeles

1 .3.- Síntesis de los aerogeles GO-CS con extracto de uva (GO-CS-ext.).

Para la carga de los aerogeles se ocupó el protocolo de Yu et al. ( Journal of Environmental Chemical Engineering (2013) 1 (4), 1044), con modificaciones. Estando la mezcla de GO-CS en agitación, habiendo ya ajustado su pH, se le agregaron lentamente 20 o 40 mg de extracto de semilla de uva. Luego de una hora en agitación se centrifugo, lavó, congeló y liofilizó la muestra de aerogel GO-CS-Ext.

Ejemplo 2. Evaluación de las propiedades del aerogel GO-CS.

Se realizaron varios ensayos para demostrar las propiedades del aerogel, las que se detallan a continuación:

2.1 .- Espectro Difracción de Rayos X (DRX).

El espectro DRX fue medido utilizando un difractómetro de rayos X marca Bruker AXS modelo D4 Endeavor con radiación Cu K (l=1 .541841 A; 2.2kW) como punto de referencia, un voltaje de 40 kV, y una corriente de 20 mA. Las muestras fueron medidas desde 2 a 50° (2Q) con pasos de 0,02 ^Q y un tiempo de medición de 141 s por paso. La cristalinidad del GO y los aerogeles formados fue analizada mediante DRX.

En la Figura 1 se presentan los difractogramas para el GO (a) y para los aerogeles GO-MMW-CS (b) a pH 10. Para el GO se observa un pico de difracción en 10° (ángulo 2Q), propio de este tipo de material grafitico. Para la muestra de aerogel se muestra un único pico de difracción en 10°, similar al del GO, debido a hojas de GO apiladas en el compuesto. Al incorporar el CS al GO y formar el aerogel se observa una pequeña disminución en el pico de difracción, sumado a una disminución en la intensidad de éste, dado que aumenta el espacio interlaminar. Este efecto se atribuye a que las cadenas de CS se intercalan entre las láminas de GO, lo que también se asocia a una correcta distribución de las cadenas de CS en las hojas del GO.

2.2.- Espectroscopia FTIR.

Las muestras fueron evaluadas por espectroscopia infrarroja con transformada de Fourier (FTIR), utilizando un espectrómetro FTIR marca Perkin Elmer modelo Spectrum two con accesorio UATR, en un rango de número de onda desde 500 a 4000 cnr ¹ .

La presencia de grupos funcionales del GO (a) y GO-CS (b) fue identificada en los correspondientes espectros que se muestran en el rango entre 500 - 4000 cnr ¹ en la Figura 2. Los rasgos propios en el espectro FTIR del GO (a) son las bandas de absorción correspondientes a los enlaces C-0 en 972 cnr ¹ y enlaces C=0 a 1733 cnr ¹ , lo que demuestra los distintos grupos oxigenados presentes en la superficie del GO. Se observa una banda ancha con peak 3300 cnr ¹ correspondiente a la presencia de enlaces -OFI, grupos hidroxilos, carboxilos y agua (correspondiente a agua interlaminar). En el espectro FTIR de la muestra de GO-CS (b) se observa un gran pico a 3550 cnr ¹ lo que indica enlaces -OH y -NH presentes en la estructura del CS. La presencia de enlaces C=0 queda demostrada por un peak a 1628 cnr ¹ .

2.3.- Espestroscopía Raman.

El análisis vibracional se llevó a cabo mediante espectroscopia Raman en un espectrómetro marca Horiba, modelo Labram HR Evolution con una línea de excitación de 633 nm, una potencia de 13,3 mW y 1 ,96 eV. La ubicación del láser fue centrada en la muestra usando un lente Olympus 100x VIS y una cámara NUV (B/S UV 50/50 + Lente F125 D25). La intensidad del láser se mantuvo constante para minimizar cualquier daño en la muestra. Todas las muestras fueron medidas usando un soporte de objetos a temperatura ambiente y ninguna de ellas fue evaluada en solución.

En la Figura 3 se presenta el espectro Raman del aerogel (GO-MMW-CS) sin extracto a pH 10, donde se pueden apreciar tres picos principales. El primer pico localizado a 1339 cnr ¹ , denominado banda D, el cual es asociado al modo de respiración de los anillos de carbono sp ² con enlaces libres en las terminaciones de los planos. El segundo pico principal representa la banda G, localizado a 1583cnr ¹ , se origina de la vibración en el plano de los átomos de carbono con hibridación sp ² . El tercer pico, denominado banda 2D, se presenta a 2700 cnrr ¹ . Se conoce que el CS posee un pico a 2837 cnr ¹ , correspondiente a la vibración de estiramiento C-H, el cual no se encuentra presente en el espectro para el aerogel GO-MMW-CS, lo cual indica que el CS fue incorporado al material.

En la Figura 4 se comparan los espectros Raman de las muestras de aerogel (GO-CS) sin extracto (a) y con extracto (b), sintetizadas con CS de MMW y pH 10. Al cargar las muestras con extracto (b) se observó un ligero desplazamiento en las bandas D y G, posicionándolas a 1337 y 1574 cnr ¹ , respectivamente. Para la muestra de aerogel sin extracto (a) se calculó una proporción de intensidades de ID/IG=3,57, la cual aumentó a ID/IG=4,33 en el aerogel cargado con extracto de semilla de uva, lo que evidencia la presencia éste en el aerogel.

En la Figura 5 se presenta la deconvolución de la señal Raman para muestras de aerogeles sin (A) y con (B) extracto, respectivamente. En ambas muestras se observa la banda D ^* , que representa la presencia de carbonos amorfos y su hibridación sp ³ , la cual no presentó variaciones en su intensidad al cargar el aerogel (<10%). La intensidad de la banda D ^** , al ser cargado el aerogel, no presentó una variación apreciable (<10%). Este resultado es razonable, puesto que no existió una modificación química de la estructura del GO y allí se representan las vibraciones de los enlaces C=C, C-H y de grafito residual. Al ser cargado el aerogel con extracto de semilla de uva, este aumentó la intensidad de los defectos de la muestra, fenómeno representado por la banda D', la cual aumento en un 330%.

2.4.- Área superficial y distribución de poros.

El área superficial de los aerogeles GO-CS, GO-CS-extrac (12%) a pH 4 y 10 se estimó mediante la ecuación BET con los datos obtenidos del equipo Micromeritics Gemini Vil, adsorbiendo N2 a una temperatura de -198,85°C de baño criogénico con desgasificación manual, obteniéndose los datos de PPo hasta una presión de saturación de 760 mm Hg.

Se utilizó la ecuación 1 de diseño de BET, donde (v) es el volumen del gas adsorbido a la presión (P); (Po) es la presión de saturación; (v _m ) es el volumen del gas absorbido cuando la superficie del adsorbente está completamente cubierta por una capa unimolecular; y (c) corresponde a una constante relacionada con el sistema adsorbato-adsorbente.

Los resultados indicaron para los aerogeles tuvieron un área superficial en un rango entre 390 - 600 m ² /g y un radio de poro medio de 53 - 40 Á, lo que genera una gran cantidad de volumen para absorber la sangre.

2.5.- Módulo Elástico.

Los ensayos de compresión uniaxial para obtener las curvas de esfuerzo contra deformación fueron tomadas con una máquina de ensayos universal marca Instron, modelo 4468, equipada con un software Instron Serie IX con una celda de 500 kN y un desplazamiento de 1 mm/min.

El módulo elástico de los aerogeles fue influenciado por el pH de la síntesis del composit (Figura 6). La resistencia a la compresión aumentó al pasar de pH ácido a básico, lo cual está relacionado con una mayor interacción entre los grupos funcionales del CS y del GO, al alejarse de los respectivos puntos isoeléctricos de los componentes originales (Pl: GO=pH 2,0, CS=pH 5,0), éstos deben tener sus grupos funcionales activados. Al agregar el extracto, los aerogeles se endurecieron y el modulo elástico aumentó aún más, siendo este aumento directamente proporcional a la concentración de extracto adicionado, lo que ayudaría a mantener la integridad del composit durante si aplicación.

2.6.- Morfología de los aerogeles.

Las propiedades morfológicas y superficiales de las partículas fueron estudiadas mediante microscopía electrónica de barrido (SEM) (JSM-6380LV, JEOL).

En las Figuras 7 y 8 se muestran las imágenes SEM de los aerogeles sintetizados sin extracto (A), y cargados con 6% (B) y 12% (C) de extracto a pH 4 y pH 10, respectivamente. El pH de la síntesis tuvo efecto sobre la estructura de los aerogeles, a pH básico se observa una estructura más intrincada y rugosa que a pH ácido.

Para estudiar los poros y lámina de los GO-CS aerogeles se utilizó el software “Digital Gafan Microscopy 3.0” y se realizó una magnificación de la imagen SEM, representada en la Figura 9, para GO-MMW-CS a pH 10. Luego con esta imagen se realizó un perfil transversal para poder determinar cuánto medía cada lámina y los poros, determinando que las láminas tenían medidas entre 0,38 - 0,62 prm y los poros medían entre 10,2 - 13,0 pm.

La carga del extracto en el aerogel hizo que el tamaño de las láminas aumentara y el de los poros disminuyera mientras más se incrementaba la carga. Para el caso del aerogel GO-CS-Ext se obtuvieron láminas de GO con medidas entre 0,9 - 1 ,4 pm y poros que medían entre 2,2 - 7,2 pm (Figura 10). Al adicionarse el extracto al aerogel, éste provocó una redistribución en la interacción de CS y GO, lo cual provocó una disminución en el tamaño de poros. Este dato concuerda con lo observado luego de sintetizar el GO-CS-Ext, el cual macroscópicamente presentó un aspecto más denso. A esto se le suma una mayor rigidez observada en los análisis de compresión, lo cual es coincidente con este análisis.

2.7.- Carga superficial de los aerogeles.

Se disolvieron pequeños trozos de aerogeles de aproximadamente 1 cm ³ en 30 mi de agua y luego se sonicaron por 30 min. Posteriormente, se agitaron vigorosamente con ayuda del vortex, hasta obtener una solución homogénea. Se midió el Potencial Z en el equipo HORIBA SCIENTIFIC {nano partióle analyzer), el detalle de estos resultados se presenta en la Tabla 2.

Los resultados indican que los aerogeles sintetizados presentaban carga negativa y al contrastar las muestras, se observó que la adición del extracto hizo que los aerogeles se volvieran aún más negativos frente una condición simulada de sangre (buffer PBS). La concentración de extracto y el pH de la síntesis tuvieron influencia en la carga superficial final. A mayor concentración y a pH de síntesis ácido, los aerogeles estuvieron más cargados negativamente, lo cual favorecería la activación de la cascada de coagulación en la herida.

Tabla 2. Potencial Z de aerogeles determiando en agua

2.8.- Cinética de absorción de agua y en buffer fosfato (PBS).

Se evaluó la cinética de absorción de los aerogeles LMW-CS y MMW-CS a pH 10, con muestras de medidas 10mm x 10mm x 7mm, en promedio, las cuales fueron inmersas en 5 mi de agua MQ en una placa de vidrio (100x 15mm) retirando el exceso de ésta a distintos tiempos (5, 10, 15, 30, 60, 300, 900, 2700 segundos). Se midió la masa de cada muestra antes (So) y después (Sw) de cada inmersión y se evaluó la razón según la siguiente expresión:

Para la absorción de buffer fosfato (PBS, pH 7,4), se realizó el mismo procedimiento reemplazando el agua MQ por el buffer fosfato y tomando muestras al cabo de 5, 15, 30, 60, 300, 1200 y 2700 segundos, para LMW-CS a pH 4 y 10, y a MMW-CS a pH 4 y 1 . Los resultados se presentan en la Figura 1 1 para la absorción de PBS y en la Figura 12 para la absorción de agua. Una de las principales propiedades de los aerogeles es su alta capacidad de absorción, donde se comprobó que los aerogeles alcanzaron su máxima capacidad de absorción independiente del fluido, a pocos segundos de empezar su contacto. Los aerogeles lograron almacenar 70 g/g de PBS y 50 g/g de agua, respectivamente; esto es causado por la presencia de una carga más negativa en el aerogel, lo que permitió una mayor atracción de las moléculas de soluto. Para el agua, no hubo influencia del peso molecular del CS, pero sí para la absorción de PBS.

2.10.- Cinética de adsorción de sangre fresca.

Se evaluó la cinética de adsorción de sangre fresca de los aerogeles GO-CS, GO-CS-extrac (6%) y GO-CS-extrac (12%) a pH 4 y 10, en placas well de 12 pocilios, a las cuales se les agregó 50 pl de sangre fresca dejándolo a distintos tiempos (30, 60, 120, 180 y 240 s); transcurrido este periodo se agregaron 3 mL de agua MQ de manera homogénea formando un sobrenadante.

El sobrenadante fue vertido sobre una celda de vidrio para ser analizada mediante absorción UV a 540 nm. En donde al igual que en el procedimiento anterior, se evaluó la capacidad de absorción a partir de un blanco correspondiente a absorción con gaza y sangre pura.

% Absorbancia = Promedio muestra * 100% (3)

En la Figura 13 se observa que la absorción fue casi inmediata, ya en los primeros 30 segundos de contacto entre la sangre y el aerogel prácticamente, el 100% de ésta fue incorporada a la matriz. Haciendo un zoom de los primeros segundos del ensayo, se observa que los aerogeles con carga de extracto 12% a pH 4, fueron los que presentaron una mejor absorción de sangre. Estos resultados validan el uso de los aerogeles como agentes hemostáticos, ya que su desempeño es muy superior de lo que ocurre con la gaza, un apósito usado tradicionalmente frente a sangrados.

En la Figura 14 se presentan imágenes SEM del proceso de absorción de sangre empleando los aerogeles con 6% (A) y 12 % (B) de extracto. En ellas es posible distinguir la presencia de glóbulos blancos, rojos y plaquetas atrapados en los poros del aerogel, lo que da cuenta del éxito de la absorción de la sangre.

2.1 .1 . Cinética de liberación del extracto

Los aerogeles GO-CS, GO-CS-extrac (6%) y GO-CS-extrac (12%) a pH 4 y 10, fueron sometidos a una liberación en PBS y la concetranción de fenoles totales fue determianda por el ensayo Folin Ciocalteau.

Se montó un baño termostático a 37,5 °C (Fried Electric TEPS-1 N° Serie 1881 ), y alcanzada la temperatura de trabajo, se agregó un trozo de aerogel de masa conocida en un volumen de 250 mL de PBS. El tiempo de liberación comenzó al momento de añadir el trozo de aerogel de masa conocida a la solución de PBS. Se tomaron alícuotas de 1 ,5 mL en intervalos de tiempo fijos y los caules fueron transferidos a tubos Eppendorf. Entre 0 - 10 minutos se tomaron porciones en intervalos de 2,5 min. Luego entre 30 - 60 minutos, se realizaron extracciones con intervalos de 15 min; también se tomaron alícuotas a 60 y 120 minutos. Pasadas 12 horas se extrajo la última alícuota en el equilibrio. Obtenidas las muestras, se realizó el análisis espectrofotométrico según indica el método de determinación de fenoles totales utilizando el reactivo Folin-Ciocalteu. Las mediciones fueron tomadas en un espectrofotómetro Spectroquant Prove 600 a 765 nm.

El porcentaje de liberación de extracto finalmente está dado por la siguiente expresión:

% Liberación = ^Atest x 100 (4)

Acontrol

Donde Atest es la absorbancia de la muestra extraída de la solución de PBS y Acontroi es la absorbancia de la muestra control con % de extracto conocida.

En la Figura 15 se muestran los datos de liberación de los aerogeles en PBS. En ella, se observa una liberación sostenida del extracto durante los primeros minutos, sin observar diferencias entre las muestras. Al alcanzar el equilibrio, la liberación del extracto fue directamente proporcional a la masa de éste, a mayor concentración cargada, más se liberó llegando a liberarse cerca del 30% de lo cargado (a las 12 h o 720 min). El aerogel sintetizado a pH 4 con 12% de extracto, fue el que más liberación presentó, producto de que las proantocianidinas son más estables a pH ácido que a pH básico. Estos resultados son concordantes con lo observado en la absorción de sangre, donde el aerogel que más absorbió fue el que tenía más concentración de extracto.

Finalmente, estos resultados permitieron demostrara la capacidad hemostática que presenta el aerogel a base de óxido de grafeno y quitosano, además de extracto de uva.