Die Erfindung betrifft die Verwendung einer Aerosolerzeugungseinrichtung zur Erzeugung eines Aerosols einer Antisense-Molekül-haltigen Zusammensetzung, zur inhalativen Verabreichung der Zusammensetzung. Die Erfindung betrifft insbesondere die Verwendung nach Anspruch 1.

Falls nicht anders angegeben, werden die Begriffe„Expression“ und„Genexpression“ im Folgenden synonym verwendet. Darüber hinaus bezeichnet der Begriff„Aerosol“ im Folgenden ein Gemisch aus festen oder flüssigen Partikeln in Gasen oder Luft, wohingegen der Begriff„Nebel“ fein verteilte Flüssigkeitstropfen in der Luft bezeichnet.

Entzündungen der Atemwege sind die am häufigsten auftretenden Atemwegserkrankungen. Sie führen oft zu chronischen Entzündungen. Ein Beispiel für solche Entzündungen stellen Allergien dar, die durch eine überschießende Immunantwort auf für den Menschen üblicherweise harmlose Antigene wie Pollen, Tierhaare, Nahrungsmittel, Milben, Konservierungsstoffe, Farbstoffe, Reinigungsmittel etc. hervorgerufen werden. Andere typische Atemwegserkrankungen, die zu chronischen Entzündungen führen, sind zum Beispiel Autoimmunerkrankungen wie Asthma oder chronisch-obstruktive Lungenerkrankungen (COPD). Beim Fortschreiten der initialen Entzündungsreaktion bis zur chronischen Entzündung sind Destruktions- und Umbauprozesse beteiligt. In der Folge geht die Toleranz verloren, also die Fähigkeit, körpereigene Zellen, kommensale Erreger oder belanglose Allergene nicht anzugreifen.

An der Immunantwort sind Komponenten des angeborenen sowie des erworbenen Immunsystems beteiligt. Hierbei spielen vor allem der Th 1 -zellspezifische Transkriptionsfaktor Tbet, der die spezifische Entwicklung von Th1-Zellen reguliert, und der Th2-zellspezifische Transkriptionsfaktor GATA-3, der die spezifische Entwicklung von Th2-Zellen reguliert, eine wichtige Rolle.

Im gesunden Körper besteht ein Gleichgewicht zwischen Th1 - und Th2-Zellen. Dieses Gleichgewicht kann durch bestimmte Einflüsse gestört werden. So ist zum Beispiel bei einer chronischen Entzündung das Gleichgewicht zwischen Th1 - und Th2-Zellen durch die Expression von GATA-3 bzw. durch die Hemmung von Tbet zugunsten der Th2- Zellen verschoben. Es kommt zu einer Dominanz der Th2-Zellen, die wiederum typisch für viele chronisch entzündliche Erkrankungen in der Spätphase ist.

In anderen Fällen liegt eine Dominanz der Th1 -Zellen vor, wenn es zu einer Hemmung von GATA-3 kommt bzw. die Expression von Tbet für ein steigendes Th1-Zellen-Niveau sorgt.

Eine Therapiemethode besteht nun darin, die Transkriptionsfaktoren GATA-3 bzw. Tbet spezifisch zu hemmen bzw.„auszuschalten“, sobald eine Dominanz von Th1- bzw. Th2- Zellen vorliegt. Auf diese Weise lässt sich das Gleichgewicht zwischen den beiden Zelltypen wiederherstellen. Eine Möglichkeit stellt dabei die gezielte Inhibition der Genexpression der Transkriptionsfaktoren GATA-3 bzw. Tbet dar, etwa durch die Verwendung geeigneter Antisense-Moleküle.

In der WO 2005/033314 A2 ist die Wirkweise verschiedener GATA-3-spezifischer bzw. Tbet-spezifischer Antisense-Moleküle in Form von DNAzymen beschrieben. Der Offenbarungsgehalt der WO 2005/033314 wird daher als technologischer Hintergrund der vorliegenden Erfindung angesehen.

Insbesondere im Falle von Atemwegserkrankungen werden die jeweiligen Wirkstoffe inhalativ verabreicht, wobei unter „Inhalation“ das Einatmen von Aerosolen oder gasförmigen Wirkstoffen bezeichnet wird. Die Inhalation ist eine bewährte Methode und ermöglicht den direkten Zugang zu verschiedenen Regionen der Lunge. Auf diese Weise ist eine intra- und transpulmonale Medikamentenapplikation der Wirkstoffe möglich. Die Möglichkeit, über die Inhalation ein Arzneimittel über die Lunge bzw. über die Zielzellen in der Lunge aufzunehmen, kann einen wichtigen Faktor für die Wirksamkeit eines Arzneimittels darstellen. Hierbei spielt unter anderem die Größe der zu inhalierenden Partikel eine Rolle. Sie wird über den MMD („Mass Median Diameter“) bzw. über den MMAD („Mass Median Aerodynamic Diameter“) charakterisiert.

Es sind zahlreiche Inhalationsgeräte bekannt, wobei üblicherweise drei Gerätetypen eingesetzt werden, die sich jeweils in ihrer Handhabung unterscheiden: Dosierinhalatoren, Pulverinhalatoren sowie insbesondere

Aerosolerzeugungseinrichtungen. Prinzipiell gilt dabei, dass Tischgeräte nachteilig sind, weil bei ihrer Verwendung keine gezielte Verneblung in die Lunge erfolgt. Vielmehr hängt es vom Atemmanöver des Patienten ab, wie viele Tröpfchen er einatmet.

Aerosolerzeugungseinrichtungen, auch als Vernebler bezeichnet, trennen feine T röpfchen (im Folgenden auch als T ropfen oder Partikel bezeichnet) von einem flüssigen Reservoir oder einer Lösung ab. Dadurch entsteht ein Aerosol, das vom Patienten eingeatmet werden kann. Es sind drei Funktionsprinzipien bekannt, nach denen die Vernebler eingeteilt werden. Bei Düsenverneblern erzeugt ein starker Luftstrom an einer Düse einen Unterdrück und zieht so Tröpfchen aus einem kapillaren System. Weil die Tröpfchen unterschiedliche Größen aufweisen, wird eine Prallplatte eingesetzt, um zu große Tröpfchen zurückzuhalten.

Bei Ultraschallverneblern werden die Tröpfchen durch einen Ultraschall generiert. Je höher die Frequenz des Ultraschalls, desto feiner werden die Tröpfchen.

Membranvernebler zeichnen sich durch eine sehr dünne Membran mit einer Vielzahl an Mikrobohrungen oder Durchgangsöffnungen aus, wobei eine Membran weit über tausend solcher Durchgangsöffnung aufweisen kann. Die Membran wird zur Vibration gebracht, wodurch jede Durchgangsöffnung als Pumpe fungiert und Tröpfchen mit einem definierten MMAD produziert.

Unter Antisense-Molekülen werden in der Regel Moleküle verstanden, die entweder aus meist einzelsträngigen RNA- und/oder DNA-Oligonukleotiden aufgebaut sind oder zumindest einen solche Oligonukleotid-Bestandteil aufweisen. Oligonukleotide sind wiederum aus wenigen Nukleotiden aufgebaute Moleküle, wie zum Beispiel Primer, die in der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) eingesetzt werden. Antisense-Moleküle besitzen meist Oligonukleotide, deren Basensequenz komplementär zu einer zellulären, viralen oder synthetischen RNA- oder DNA-Molekülen ist und über Watson-Crick- Basenpaarung an diese Moleküle binden können. Dieser Umstand kann zum Beispiel dazu genutzt werden, die Funktion einer beliebigen Ziel-mRNA zu hemmen, etwa durch die spezifische Bindung der Antisense-Moleküle an die Ziel-mRNA. Sowohl in der Forschung als auch in der therapeutischen Anwendung werden. Antisense-Moleküle eingesetzt, um die Expression eines Gens gezielt abgeschwächt beziehungsweise gänzlich zu unterdrücken. Seit einigen Jahren sind auch Antisense-Moleküle bekannt, die nicht auf Nukleinsäurebasis aufgebaut sind. Derartige Moleküle weisen dann in aller Regel Nukleinsäure-Analoga auf, welche hinsichtlich ihrer Fähigkeit der Basenpaarung mit echten Nukleinsäuren übereinstimmen.

Zurzeit sind für Antisense-Molekül-haltige Zusammensetzungen keine geeigneten Rahmenbedingungen oder Parameter für die Verwendung einer solchen Zusammensetzung mittels einer Aerosolerzeugungseinrichtung zur inhalativen Behandlung eines an einer mit chronischen Entzündungen einhergehenden Atemwegserkrankung leidenden Patienten bekannt. Vielmehr lässt sich bei der Verwendung einer Antisense-Molekül-haltigen Zusammensetzung das Phänomen beobachten, dass die Membranen der jeweils verwendeten Aerosolerzeugungseinrichtungen nach kurzer Zeit verstopfen können, weil Antisense- Molekül-haltige Zusammensetzungen oder Lösungen hoch viskos sind.

Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, eine Verwendung einer Aerosolerzeugungseinrichtung zu ermöglichen, mit der sich eine Antisense-Molekül- haltige Zusammensetzung zur Behandlung eines an einer mit chronischen Entzündungen einhergehenden Atemwegserkrankung leidenden Patienten inhalativ verabreichen lässt. Insbesondere soll die Antisense-Molekül-haltige Zusammensetzung mithilfe der Aerosolerzeugungseinrichtung einfach, zuverlässig und reproduzierbar applizierbar sowie definiert zu zerstäuben sein.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch Verwendung einer Aerosol- erzeugungseinrichtung zur Erzeugung eines Aerosols und einer entsprechend angepassten Zusammensetzung zur inhalativen Verabreichung gelöst, wobei die Zusammensetzung mindestens ein Antisense-Molekül umfasst, wobei die Zusammensetzung zur Erzeugung des Aerosols mit der Membran in Kontakt gebracht wird und die Membran der Aerosolerzeugungseinrichtung in Vibration versetzt wird, wobei die Perforation von mindestens einer Gruppe von Durchgangsöffnungen gebildet ist, wobei jede Durchgangsöffnung einer Gruppe an ihrer engsten Stelle einen Durchmesser von mindestens 3 pm und höchstens 5 pm aufweist und wobei die mindestens eine Gruppe von Durchgangsöffnungen maximal 500 Durchgangsöffnungen pro mm ² der Membran umfasst. Die Antisense-Molekül-haltige Zusammensetzung ist insbesondere eine Flüssigkeit oder eine Lösung. Vorzugsweise ist vorgesehen, dass jede Durchgangsöffnung der Membran an ihrer engsten Stelle einen Durchmesser von mindestens 3 pm und höchstens 5 pm aufweist. Die Durchgangsöffnung bzw. Mikrobohrungen können dabei verschiedene Geometrien aufweisen. Sie können zum Beispiel schlitzförmig, eckig oder oval sein oder eine Lochgeometrie aufweisen. Vorliegend werden vor allem Löcher als Mikrobohrungen der Membran eingesetzt, wobei mindestens 100 Mikrobohrungen oder Durchgangsöffnungen pro Membran vorgesehen sind. Ferner wird die Membran durch ein piezoelektrisches Element angeregt und in Schwingungen versetzt. Das Antisense-Molekül ist ausgewählt aus der Gruppe umfassend DNAzyme, siRNAs, asDNAs oder Ribozyme. Bei der vorliegenden Anmeldung werden bevorzugt DNAzyme als Antisense-Moleküle eingesetzt. Wahlweise kann das Antisense-Molekül jedoch auch aus der Gruppe der Moleküle umfassend Phosphorothioat-Oligonukleotide (PTO), 2'-Fluoro-RNAs, FANAs, 2'-0-Methyl- Oligonukleotide, 2'-0-Methoxyethyl-Oligonukleotide, „constrained ethyl oligonucleotides“ (cEt),„locked nucleic acids“ (LNA), ,,2'-0,4'-C-ethylene-bridged nucleic acid“ (ENA), Peptidnukleinsäuren (PNA), Morpholino, Ugimere, Tricyclo-DNA, DNA- Primer oder Aptamere.

Ein wesentlicher Vorteil, der sich aus der erfindungsgemäßen Verwendung der Aerosolerzeugungseinrichtung ergibt, besteht darin, dass sich die Antisense-Molekül- haltige Zusammensetzung in ein Aerosol überführen lässt, dessen Partikel einen VMD MV („Volume Median Diameter“) von ca. 4 pm aufweisen. Nur ein Aerosol mit Partikeln kleiner als 5 pm kann, aufgrund von Impaktationskräften von größeren Partikeln, chronische Entzündungen in den mittleren und unteren Atemwegen erreichen, sodass entsprechende Antisense-Moleküle, insbesondere DNAzyme, den Wirkort erreichen und dort therapeutisch wirksam werden. Somit steht eine wirksame, einfache und sichere Verabreichungsmöglichkeit der viskosen Antisense-Molekül-haltigen Zusammensetzung durch Inhalation zur Verfügung. Mit der erfindungsgemäßen Verwendung einer Aerosolerzeugungseinrichtung mit einer vibrierenden Membran, deren Mikrobohrungen jeweils einen Durchmesser von 3 pm bis 5 pm aufweisen, ist es möglich, Antisense-Molekül-haltige Zusammensetzungen, die in der Regel hoch viskos sind, zuverlässig in ein therapeutisch wirksames und inhalierbares Aerosol zu überführen. Die erfindungsgemäße Verwendung erlaubt es dem Patienten außerdem, pro Aktivierungsereignis der Aerosolerzeugungseinrichtung bzw. pro Inhalationsphase stets eine definierte Wirkstoffdosis zu erhalten. Somit kann eine Antisense-Molekül-haltigen Zusammensetzung sicher, zuverlässig und reproduzierbar verabreicht werden.

Das Merkmal, wonach die Gruppe von Durchgangsöffnungen maximal 500 Durchgangsöffnungen pro mm ² der Membran umfasst, unterstützt den vorteilhaften Effekt, den die Durchgangsöffnungen mit einem Durchmesser von mindestens 3 pm und höchstens 5 pm auf die Tröpfchenbildung haben, nämlich, dass sich die Antisense- Molekül-haltige Zusammensetzung in ein Aerosol überführen lässt, dessen Partikel einen VMD MV von ca. 4 pm aufweisen. So können Membranen mit einer höheren Lochdichte als 500 Durchgangsöffnungen pro mm ² dazu führen, dass die entstehenden Tröpfchen oder Partikel unmittelbar nach Austritt aus den Durchgangsöffnungen der Membran zu größeren Partikeln verschmelzen, aggregieren oder vereinigen. Das hätte wiederum zum Nachteil, dass die Partikel oder Tropfen aufgrund von Impaktationskräften nicht oder zumindest in verminderter Weise an ihren entsprechenden Wirkort gelangen würden. Folglich könnten die Antisense-Moleküle bzw. insbesondere die DNAzyme ihre therapierende Wirkung nicht an dem Ort entfalten, an dem die chronische Entzündung vorliegt. Demgegenüber steht durch die erfindungsgemäße Verwendung von Aerosolerzeugungseinrichtungen mit Membranen, die maximal 500 Durchgangsöffnungen pro mm ² umfassen, eine wirksame, einfache und sichere Verabreichungsmöglichkeit der viskosen Antisense-Molekül-haltigen Zusammensetzung durch Inhalation zur Verfügung. Die Zerstäubung der Zusammensetzung in ein Aerosol mit Tröpfchen der bevorzugten Größe wird außerdem durch die Vibration der Membran verstärkt.

Die Aerosolerzeugungseinrichtung ist dabei bevorzugt ein tragbares und handliches Gerät, das auch in Notfallsituationen einsetzbar ist. Die Energieversorgung der Vorrichtung erfolgt dabei über Kabel, über eine oder mehrere Batterien oder induktiv. Durch die erfindungsgemäße Verwendung ist das erzeugte Aerosol der Antisense- Molekül-haltigen Zusammensetzung außerdem frei von schädlichen Treibgasen. Die aufgeführte Verwendung verringert die Risiken für Nebenwirkungen im restlichen Organismus, zudem ist durch das örtlich gezielte Wirken der Antisense-Moleküle eine geringere Wirkstoffdosis pro Applikation notwendig, als bei unspezifischen Verabreichungsformen.

Es kann außerdem vorgesehen sein, dass die Aerosolerzeugungseinrichtung eine Chip- Technologie wie z.B. Bluetooth® aufweist, um etwa die Einhaltung und Compliance der Patienten zu überwachen.

Gemäß einer vorteilhaften Weiterentwicklung kann außerdem vorgesehen sein, dass die Membran an einen piezoelektrischen Kristall oder Wandler gekoppelt ist, der die Membran in Vibration versetzt. Durch diese Ausgestaltung kann die Membran zur Vibration gebracht werden, wobei eine Vibrationsfrequenz von 10 kHz bis 150 kHz bevorzugt wird. Durch die Vibration bewegt sich die Membran einige Mikrometer auf und ab und wirkt somit wie eine „Mikropumpe“, indem sie die Antisense-Molekül-haltige Zusammensetzung als Aerosol in Richtung des Ausgangs der Aerosolerzeugungseinrichtung presst.

Es kann erfindungsgemäß vorgesehen sein, dass die Durchgangsöffnungen konisch ausgebildet sind, wobei der Durchmesser je einer konisch ausgebildeten Durchgangsöffnung in Richtung des Bereichs der Durchgangsöffnung, an dem das Aerosol aus der Durchgangsöffnung austritt, abnimmt. Diese Ausgestaltung sorgt für eine möglichst und einheitliche Größe der Tröpfchen im Aerosol.

Es ist auch von Vorteil, wenn die Perforation der Membran wenigstens zwei Gruppen von Durchgangsöffnungen aufweist.

Als besonders bevorzugte Variante ist bei der Verwendung einer Aerosolerzeugungseinrichtung vorgesehen, dass die Membran einen Durchmesser von 1 mm bis 8 mm aufweist, wobei insbesondere eine Membran mit einem Durchmesser von 6 mm bis 8 mm vorgesehen ist. Eine weitere vorteilhafte Ausführungsform sieht vor, dass die Membran aus einem Material hergestellt ist, das Silizium und/oder mindestens ein Metall umfasst, wobei das Metall insbesondere ein Element aus der Gruppe Edelstahl, Nickel, Palladium, Kobalt, rostfreier Stahl ist und/oder eine Legierung von mindestens zwei der Elemente ist. Dabei wird eine aus rostfreiem Stahl oder aus Nickel hergestellte Membran besonders bevorzugt. Darüber hinaus kann die perforierte Membran der Aerosolerzeugungseinrichtung rund, oval oder eckig ausgebildet sein. Die Verwendung einer Membran aus einem derartigen Material hat eine hohe Stabilität der Membran zur Folge. Gleichzeitig ist eine solche Membran günstig in der Herstellung. Eine Aerosolerzeugungseinrichtung, die eine derartige Membran aufweist, ist außerdem widerstandsfähig und somit langlebig.

Es ist außerdem von Vorteil, wenn die Zusammensetzung eine Antisense-Molekül- Konzentration von unter 75 mg/ml aufweist. So lässt sie sich ideal zur inhalativen Verabreichung bei der Behandlung von Patienten einsetzen, die an einer mit chronischen Entzündung einhergehenden Atemwegserkrankung leiden. Das liegt vor allem daran, dass Zusammensetzungen mit Antisense-Molekül-Konzentrationen, die 75 mg/ml übersteigen, derart viskos sind, dass sie sich mit einer Aerosolerzeugungseinrichtung nicht oder nur schlecht als Aerosol verabreichen lassen, weil die Durchgangsöffnungen der Perforation der Membran aufgrund der hohen Viskosität der Zusammensetzung leicht verstopfen. Zusammensetzungen mit einer Antisense-Molekül-Konzentration von über 75 mg/ml zeigen außerdem einen Wirkstoffverlust von etwa 6 %. Dies liegt an der dreidimensionalen Struktur der Antisense-Moleküle, die leicht miteinander verklumpen und somit eine Polymerstruktur ausbilden. Diese Eigenschaft ist bei DNAzymen besonders gut zu beobachten.

Es ist daher besonders von Vorteil, wenn die Zusammensetzung eine Antisense- Molekül-Konzentration von 20 mg/ml bis 50 mg/ml aufweist. Zusammensetzungen mit einer Antisense-Molekül-Konzentration von 20 mg/ml bis 50 mg/ml zeigen einen optimalen Wirkungseffekt bei der erfindungsgemäßen Verwendung mit einer Aerosolerzeugungseinrichtung.

Es kann außerdem vorgesehen sein, dass die Zusammensetzung eine Viskosität aufweist, die niedriger ist als 3,5 mPa-s. Bei einer Zusammensetzung mit einer Viskosität von über 3,5 mPa-s kann eine Aerosolerzeugungseinrichtung nicht ohne Weiteres den für die Zerstäubung bzw. Verneblung der Zusammensetzung nötigen Druck erzeugen. Das führt wiederum dazu, dass die Durchgangsöffnungen bzw. Löcher der Membran verstopfen oder verschmieren. Dieses Risiko wird durch eine Zusammensetzung, deren Antisense-Molekül-Konzentration niedriger ist als 75 mg/ml, signifikant minimiert. Eine Zusammensetzung mit einer derartigen Viskosität ist mittels der erfindungsgemäßen Verwendung problemlos und ohne signifikanten Wirkstoffverlust inhalativ applizierbar. Als bevorzugte Variante ist bei der erfindungsgemäßen Verwendung einer Aerosolerzeugungseinrichtung vorgesehen, dass die Gruppe von Durchgangsöffnungen maximal 200 Durchgangsöffnungen pro mm ² der Membran umfasst. Als besonders bevorzugte Variante ist vorgesehen, dass die Gruppe von Durchgangsöffnungen maximal 50 Durchgangsöffnungen pro mm ² der Membran umfasst. Die Limitierung der Lochdichte auf 200 bzw. sogar auf 50 Durchgangsöffnungen pro mm ² verstärkt den vorteilhaften Effekt der Lochdichte, wonach ein Verschmelzen, Aggregieren oder Vereinigen der Tröpfchen nach deren Austritt aus den Durchgangsöffnungen verhindert wird. Die erfindungsgemäße Verwendung von Aerosolerzeugungseinrichtungen mit Membranen, die maximal 200 bzw. maximal 50 Durchgangsöffnungen pro mm ² umfassen, ermöglicht demnach eine wirksame, einfache und sichere Verabreichungsmöglichkeit der viskosen Antisense-Molekül-haltigen Zusammensetzung durch Inhalation.

Nach einer vorteilhaften Ausgestaltung der Verwendung ist vorgesehen, dass Zusammensetzung mindestens ein Antisense-Molekül umfasst, das ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend DNAzyme, siRNAs, asDNAs oder Ribozyme. Dabei kann insbesondere vorgesehen sein, dass das mindestens eine Antisense-Molekül die Expression von GATA-3 spezifisch herunterreguliert oder die Expression von Tbet spezifisch herunterreguliert. Vorzugsweise handelt es sich bei den Antisense-Molekülen um DNAzyme. Dabei binden und spalten die spezifischen Antisense-Molekül in vivo die mRNA der Transkriptionsfaktoren GATA-3 und/oder Tbet, deren Proteine wiederum zentrale Schlüsselmoleküle für die Entstehung von Th1- bzw. Th2-abhängigen chronischen Entzündungserkrankungen darstellen. Durch diese Spaltung der mRNA können die mRNAs nicht mehr in funktionale Proteine translatiert werden. Folglich wird das GATA-3- bzw. Tbet-Proteinniveau signifikant minimiert.

Nach einer bevorzugten Ausführungsvariante ist vorgesehen, dass das mindestens eine Antisense-Molekül ein DNAzym ist. Bevorzugterweise ist das DNAzym ausgewählt aus einer Gruppe umfassend die DNAzyme hdg1 bis hdg70 oder aus einer Gruppe umfassend die DNAzyme td 1 bis td78. Dabei ist insbesondere vorgesehen, dass das DNAzym die Sequenz hdg40 (GTGGATGGAggctagctacaacgaGTCTTGGAG) aufweist. Eine derartige Sequenz zeigt eine besonders hohe Enzymaktivität und spaltet GATA-3- mRNA mit einer hohen Spezifität sowie mit hoher Effizienz. Folglich eignet sich ein DNAzym mit der Sequenz hgd40 (SEQ ID No. 40) hervorragend zur gezielten und effektiven Behandlung von Atemwegserkrankungen, die Th2-abhängig sind, die also mit einem erhöhten GATA-3-Spiegel korrespondieren. Gemäß einer vorteilhaften Weiterbildung kann die Zusammensetzung mindestens einen Nuklease-Inhibitor aufweisen, wobei der mindestens eine Nuklease-Inhibitor insbesondere Desoxyribonukleasen spezifisch inaktiviert, also ein DNase-lnhibitor ist. Durch einen derartigen Nuklease-Inhibitor wird das mindestens eine DNAzym vor dem enzymatischen Abbau durch DNasen geschützt.

Ein Beispiel einer Antisense-Molekül-haltigen Zusammensetzung ist in der folgenden Tabelle dargestellt:

Weiterhin ist es möglich, dass die Zusammensetzung mindestens ein Salz und/oder mindestens ein Kation umfasst. Eine derartige Zusammensetzung eignet sich auf vorteilhafte Art und Weise zur Anwendung bei der Therapie von Patienten, die an einer mit chronischen Entzündungen einhergehenden Atemwegserkrankung leiden, weil die Zusammensetzung dadurch ein physiologisch günstiges Milieu aufweist und somit für Patienten leicht verträglich ist. Dabei ist insbesondere eine Phosphatgepufferte Salzlösung (PBS) vorgesehen.

Alternativ werden aber auch andere gepufferte Lösungen eingesetzt, in denen Nukleinsäuren in physiologisch günstigem Milieu gelöst vorliegen, wie zum Beispiel TE- Puffer. Entsprechend ist ein anorganischer und/oder organischer Zusatz vorgesehen, wobei der Zusatz bevorzugterweise ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend die Stoffe Natriumchlorid (NaCI), Kaliumchlorid (KCl), Dinatriumhydrogenphosphat (Na ₂ HP04), Dinatriumhydrogenphosphat Dihydrat, Kaliumdihydrogenphosphat (KH ₂ PO4), TRIS und EDTA. Das Kation kann dabei ausgewählt sein aus der Gruppe umfassend Na, Mg, K, Li, Ca, Fe, Cu und Ag. Alternativ ist auch ein organisches Kation vorgesehen, wie zum Beispiel Mg(N(S02CF3)2)2 oder Mg(0S02CFs)2. Alternativ wird ein bivalentes Kation verwendet. Eine derartig gepufferte Zusammensetzung eignet sich besonders zum Schutz der Antisense-Moleküle, weil das Antisense-Molekül durch den anorganischen und/oder organischen Zusatz stabilisiert und vor enzymatischem Abbau geschützt wird. Darüber hinaus ermöglicht das Salz eine gute Aufnahme der Zusammensetzung in die Zielzellen. Die bivalenten Kationen können als Co-Faktoren der Antisense-Moleküle die Antisense-Molekül-Aktivität steigern, da die Antisense-Moleküle eine von bivalenten Kationen (vorzugsweise Mg ²⁺ ) abhängige katalytische Domäne aufweisen. Somit wirken bivalente Kationen als „Enhancer“ oder Verstärker. Nach einer vorteilhaften Weiterentwicklung kann die Zusammensetzung mindestens einen anorganischen und/oder organischen Zusatz und/oder einen Lösungsvermittler und/oder einen Konservierungsstoff umfassen. Der Lösungsvermittler dient dabei vor allem der Komplexbildung. Darüber hinaus verbessert er die Lösemitteleigenschaften der Zusammensetzung. Als Lösungsvermittler können bevorzugterweise Glycerolderivate und/oder Polyethylenglycole oder auch Lecithine vorgesehen sein. Der Konservierungsstoff kann zum Beispiel Paraben sein.

Mögliche zusätzliche Komponenten der Antisense-Molekül-haltigen Zusammensetzung sind:

Es können außerdem Zusätze vorgesehen sein, die beispielsweise eine Veränderung der Oberflächenspannung der Zusammensetzung oder eine Senkung der Viskosität der Zusammensetzung bewirken.

Die oben geschilderten Vorteile und Wirkungen ergeben sich insbesondere bei der Verwendung einer Aerosolerzeugungseinrichtung zur Erzeugung eines Aerosols einer Zusammensetzung zur inhalativen Verabreichung bei der Behandlung eines Patienten, der an einer mit chronischen Entzündungen einhergehenden Atemwegserkrankung leidet.

Weitere Merkmale, Einzelheiten und Vorteile der Erfindung ergeben sich aus dem Wortlaut der Ansprüche sowie aus der folgenden Beschreibung von Ausführungsbeispielen und Figuren.

Ausführungsbeispiele

Die nachfolgende Tabelle 1 zeigt die GATA-3 spezifischen DNAzyme hgd1-70 mit den Sequenz-IDs gemäß Sequenzprotokoll:

Die nachfolgende Tabelle 2 zeigt die Tbet-spezifischen DNAzyme td 1 -78 mit ihren Sequenz-IDs gemäß Sequenzprotokoll:

Bei den vorliegend getesteten Aerosolerzeugungseinrichtungen wurde jeweils eine Zusammensetzung mit einer Antisense-Molekül-Konzentration von unter 75 mg/ml eingesetzt. Anschließend wurde die Größe der Tropfen bzw. Tröpfchen des entstandenen Aerosols bestimmt.

In einer ersten Testphase wurden Aerosolerzeugungseinrichtungen mit einer perforierten Membran ohne piezoelektrischen Wandler getestet. Mit diesen Aerosolerzeugungseinrichtungen konnte eine Antisense-Molekül-haltige Zusammensetzung zur Behandlung eines an einer mit chronischen Entzündungen einhergehenden Atemwegserkrankung leidenden Patienten nicht vernebelt werden.

Dabei wurde überraschenderweise herausgefunden, dass durch die Verwendung einer Zusammensetzung mit einer Antisense-Molekül-Konzentration von unter 75 mg/ml, zusammen mit einer Aerosolerzeugungseinrichtung mit vibrierenden Membranen, wobei die Durchgangsöffnungen der Membranen einen Durchmesser von mindestens 3 pm bis höchstens 5 pm und die Membranen einen Durchmesser von 6 mm bis 8 mm aufweisen, ein Aerosol mit Tröpfchen mit einem VMD MV von ca. 4 pm entstehen. Die Durchgangsöffnungen der Membranen verstopfen dabei nicht. Dieses Phänomen lässt sich insbesondere bei einer Antisense-Molekül-Konzentration zwischen 20 mg/ml und 50 mg/ml beobachten.

Es wurden Aerosolerzeugungseinrichtungen mit verschiedenen Materialien der perforierten Membran getestet: rostfreier Stahl, Edelstahl, Nickel, Palladium, Kobalt oder Legierungen davon. Diese Materialen erweisen sich als kostengünstiger für die Herstellung der Membran als zum Beispiel Silizium, Siliziumdioxid oder Siliziumnitrid. Es wurden Aerosolerzeugungseinrichtung mit unterschiedlichen Geometrien der Durchgangsöffnungen/Löcher der Membran getestet z.B. trichterförmige Bohrungen. Dabei zeigten insbesondere zylindrische und konische geformte Durchgangsöffnungen eine sehr gute Tropfenbildung. Die Verfahren (z.B. Lithographie, Lasercutting o.ä.), mit denen diese Bohrungen in die Membran eingebracht werden, sind dem Fachmann bekannt.

Figuren

Fig. 1 zeigt die grafische Darstellung der Viskosität der Antisense-Molekül- haltigen Zusammensetzung in Abhängigkeit ihrer Konzentration.

Fig. 2 zeigt Viskositätsmessergebnisse der Antisense-Molekül-haltigen

Zusammensetzung in Abhängigkeit ihrer Konzentration

Fig. 3 zeigt Messergebnisse eines FAT („Factory Acceptance Test“) von

Zusammensetzungen mit unterschiedlichen Antisense-Molekül- Konzentrationen der Antisense-Molekül-haltigen Zusammensetzung

Fig. 4 zeigt Messergebnisse eines FAT der Antisense-Molekül-haltigen

Zusammensetzung mit Antisense-Molekül-Konzentrationen von 20 mg/ml bzw. 50 mg/ml.

Fig. 5 zeigt Messergebnisse der Antisense-Molekül-haltigen

Zusammensetzung, die durch verschiedene

Aerosolerzeugungseinrichtungen mit Membranen unterschiedlicher Perforationen wurden.

Fig. 1 zeigt in einer grafischen Darstellung die Viskosität einer Antisense-Molekül- haltigen Zusammensetzung in Abhängigkeit ihrer Konzentration. Bei dem Antisense- Molekül handelt es sich in dem gezeigten Beispiel um ein DNAzym. Das DNAzym kann dabei die Expression von GATA-3 und/oder die Expression von Tbet spezifisch herunterregulieren. Nach bevorzugter Ausführung sind vor allem Antisense-Moleküle aus einer Gruppe umfassend die DNAzyme hdg1 bis hdg70 oder aus einer Gruppe umfassend die DNAzyme td 1 bis td78 vorgesehen. Bevorzugt wird das DNAzym hgd40 mit der Sequenz GTGGATGGAggctagctacaacgaGTCTTGGAG eingesetzt. Hdg40 inhibiert die Expression von GATA-3 spezifisch. In Fig. 1 ist beispielhaft die Viskosität einer hgd40-haltigen Zusammensetzung graphisch dargestellt. Entlang der Y-Achse des Graphen aus Fig. 1 wird die Viskosität der Zusammensetzung in mPa-s aufgetragen; die X-Achse gibt die DNAzym-Konzentration der Zusammensetzung in mg/ml an. Aus der Darstellung ergibt sich, dass die Viskosität der DNAzym-haltigen Zusammensetzung im Wesentlichen exponentiell zunimmt. Dabei ist insbesondere ab einer Konzentration von 50 mg/ml und höher ein starker Anstieg der Viskosität zu beobachten. Bereits bei einer Konzentration von etwa 75 mg/ml ist eine Viskosität von 3,5 mPa-s zu beobachten.

Fig. 2 zeigt die Ergebnisse einer Viskositätsmessung einer Antisense-Molekül-haltigen Zusammensetzung in Abhängigkeit ihrer Konzentration, wobei es sich bei den untersuchten Antisense-Molekülen um DNAzyme handelt. Die tabellarisch dargestellten Ergebnisse belegen den exponentiellen Anstieg der Viskosität einer Antisense-Molekül- haltigen Zusammensetzung mit einer Antisense-Molekül-Konzentration zwischen 50 mg/ml und 100 mg/ml. Die hier gezeigte Korrelation zwischen Nukleinsäurekonzentration und Viskosität ist für andere, doppelsträngige DNA-Moleküle nicht derart ausgeprägt; üblicherweise steigt die Viskosität einer Doppelstrang-DNA- haltigen Lösung im Wesentlichen linear mit steigender DNA-Konzentration. Bei einer Viskosität von über 3,5 mPa-s ist der Druck, den eine Aerosolerzeugungseinrichtung erzielen müsste, zu hoch. Das kann dazu führen, dass die Durchgangsöffnungen bzw. Löcher der Membran verstopfen oder verschmieren. Dieses Risiko wird durch eine Zusammensetzung signifikant minimiert, deren Antisense-Molekül-Konzentration niedriger ist als 75 mg/ml, weil die Viskosität einer derartigen Antisense-Molekül-haltigen Zusammensetzung unter 3,5 mPa-s liegt.

In Fig. 3 sind Messergebnisse eines FAT („Factory Acceptance Test“) von Zusammensetzungen mit unterschiedlichen Antisense-Molekül-Konzentrationen in tabellarischer Form dargestellt, wobei es sich bei den Antisense-Molekülen um DNAzyme, speziell um das DNAzym hgd40 handelt. Ein FAT ist mit einer Werksabnahme vergleichbar, in der die Anwendbarkeit eines Produkts getestet werden soll. Die Tabelle zeigt, dass sich eine Zusammensetzung mit einer Antisense-Molekül- Konzentration von über 75 mg/ml nicht mehr durch die Aerosolerzeugungseinrichtung aus dem Test vernebeln lässt (vgl. dazu Zeile 3 der Tabelle aus Fig. 3). Wird eine Zusammensetzung mit einer Antisense-Molekül-Konzentration von 75 mg/ml im Vorfeld des Testlaufs steril gefiltert, so wird die Antisense-Molekül-Konzentration auf unter 75 mg/ml herabgesenkt. Eine Zusammensetzung mit einer derartigen DNAzym- Konzentration kann mit der im Test verwendeten Aerosolerzeugungseinrichtung vernebelt werden (vgl. dazu Zeilen 5 und 6 der Tabelle aus Fig. 3). Der FAT gibt die Viskosität (dP/ml) in Prozent an. Zum Bestehen des hier durchgeführten FAT musste die Viskosität unter 5 % liegen. Die Abkürzung„WFI“ in der zweiten und vierten Zeile der Tabelle aus Fig. 3 steht für„Water for Injection“ und stellt die Testkontrolle dar - entsprechend korrespondieren die„WFI“-Kontrollen mit einer Viskosität von 1 dP/ml.

In Fig. 4 sind Messergebnisse eines FAT einer Zusammensetzung mit Antisense- Molekül-Konzentrationen von 20 mg/ml bzw. 50 mg/ml gezeigt. Dabei umfassen die hier untersuchten Antisense-Moleküle insbesondere DNAzyme. Die Ergebnisse zeigen, dass derartige Zusammensetzungen den FAT bestehen und sich mittels der erfindungsgemäßen Verwendung vernebeln lassen (vgl. dazu„bestanden“ in den Zeilen 3, 4, 6 und 7 der Tabelle aus Fig. 4).

Die Messergebnisse aus den Figuren 3 und 4 zeigen also, dass eine Antisense-Molekül- haltige Zusammensetzung und hierbei insbesondere eine DNAzym-haltige Zusammensetzung mit einer DNAzym-Konzentrationen von unter 75 mg/ml mittels einer Aerosolerzeugungseinrichtung gemäß den vorliegend beschriebenen Merkmalen als Aerosol verwendet werden kann. Somit ist die erfindungsgemäße Verwendung ideal zur Behandlung eines an einer mit chronischen Entzündungen einhergehenden Atemwegserkrankung leidenden Patienten geeignet. Dabei werden bevorzugterweise Antisense-Molekül- bzw. DNAzym-Konzentrationen von 20 mg/ml bis 50 mg/ml eingesetzt.

Fig. 5 zeigt Messergebnisse einiger der getesteten Aerosolerzeugungseinrichtungen. Die Messergebnisse zeigen, dass Aerosolerzeugungseinrichtungen mit den erfindungsgemäßen Merkmalen optimal zur Aerosolerzeugung einer Antisense-Molekül- haltigen Zusammensetzung geeignet sind (Fig. 5 Spalten B-D). In dem in Fig. 5 gezeigten Beispiel handelt es sich bei den Antisense-Molekülen um DNAzyme. Bei den Geräten aus den Spalten B-D entsteht das Aerosol, indem die Zusammensetzung in Kontakt mit der in Vibration versetzten Membran der Aerosolerzeugungseinrichtung gebracht wird. Erfindungsgemäß weist die Membran dabei eine Perforation auf, die von mindestens einer Gruppe von Durchgangsöffnungen gebildet ist, wobei die Durchgangsöffnungen an ihrer engsten Stelle einen Durchmesser aufweisen, der zwischen 3 pm und 5 pm liegt (Fig. 5, Zellen B5, C5 und D5), und wobei die Gruppe von Durchgangsöffnungen maximal 500 Durchgangsöffnungen pro mm ² der Membran umfasst (Fig. 5, Zellen B6, C6 und D6). Dabei entstehen Tröpfchen bzw. Partikel mit einer Größe von ca. 4 pm (Fig. 5, Zellen B1 1 -B13, C14, D12 und D14), was als optimal zur Aerosolerzeugung einer Antisense-Molekül-haltigen Zusammensetzung zur Behandlung eines an einer mit chronischen Entzündungen einhergehenden Atemwegserkrankung leidenden Patienten angesehen wird. Die Ausbildung von Tröpfchen mit der bevorzugten Größe wird durch die Vibration der Membran verstärkt.

Ein Gerät, bei dem die Durchgangsöffnungen an ihrer engsten Stelle einen Durchmesser von weniger als 3 pm aufweisen (Fig. 5, Zelle 5A) oder dessen Membran mehr als 500 Durchgangsöffnungen pro mm ² (Fig. 5, Zelle 6A) aufweist, hat ein Aerosol mit Tröpfchen mit einer Größe von mehr als 5 pm VMD MV zur Folge (Fig. 12A, 13A und 14A). Tröpfchen dieser Größe haben den Nachteil, dass sie aufgrund von Impaktationskräften nicht oder zumindest nur in stark verminderter Weise an ihren entsprechenden Wirkort gelangen. Demzufolge könnten die Antisense-Moleküle bzw. insbesondere die DNAzyme ihre therapierende Wirkung nicht an dem Ort entfalten, an dem die chronische Entzündung vorliegt. Grund hierfür ist unter anderem die Lochdichte: Bei einer Lochdichte von über 500 Durchgangsöffnungen pro mm ² der Membran kann es dazu kommen, dass die entstehenden Tröpfchen oder Partikel unmittelbar nach Austritt aus den Durchgangsöffnungen zu größeren Partikeln verschmelzen, aggregieren oder vereinigen.