Описание изобретения

Область техники.

Изобретение относится к медицине и направлено на создание

фармацевтических аэрозолей с активными веществами белковой природы и выталкивающими пропеллентными системами для лечения широкого круга заболеваний у людей.

Предшествующий уровень.

Известна выталкивающая система «Модулит», состоящая из

водонерастворимого озон-сберегающего пропеллента, глицерола и этанола, которая применялась для изготовления противоастматических аэрозолей с активным веществом синтетической небелковой природы типа беклометазона [Ganderton et al. 2002]. Главными медицинскими пропеллентами нового поколения из группы озон- сберегающих (свободных от хлоросодержащих флюорокарбонов; CFC-free - chlorofluorocarbons free) служат 134А (1,1 ,1 ,2-тетрафторэтан) и 227 (1 ,1 ,1 ,2,3,3,3- гептафторпропан). Пропеллентная система Модулит может частично смешиваться с водной фазой. Однако для применения системы Модулит не известно, каким образом и в каком соотношении нужно соединить перечисленные четыре

компонента, чтобы создать гомогенную смесь, в водной фазе которого изначально растворен белковый ингибитор протеаз, включая апротинин, и предотвратить денатурацию белковой или полипептидной молекулы ингибитора протеаз на возможном разделе фаз под воздействием пропеллента или этанола. Белковые молекулы плохо растворимы в указанных флюорокарбоных смесях и денатурируют, теряя активность при смешивании с указанными поверхностно активными

веществами.

Известен способ лечения гриппа и других респираторных инфекций

аэрозолем ингибиторов протеаз, преимущественно апротинина, приготовленным из водного раствора или его сухого вещества [патент РФ 2054851]. Апротинин, ингибитор широкого спектра протеаз, который является природным

низкомолекулярным полипептидом, состоящим из 58 аминокислот (мол. масса 6 кД) [Trautschold et al. 1983]. Однако, в этом патенте не описано каким образом можно приготовить аэрозольный состав, содержащий в качестве активного ингредиента белковый или полипептидный ингибитор протеаз, включая апротинин, и в качестве выталкивающей силы водонерастворимый озон-сберегающий пропеллент, чтобы состав гомогенно смешивался и не денатурировал белковую и полипептидную молекулу ингибитора при распылении из аэрозольного устройства с клапаном. Эта задача решена в настоящем изобретении, которое описывает количественное соотношение компонентов и процедуру их смешивания для получения аэрозольного состава, позволяющего генерировать аэрозоль активного белкового вещества из группы ингибиторов протеаз.

Известны дозирующие аэрозольные устройства, состоящие из контейнера с особым покрытием устойчивым к озон-сберегающим пропеллентом и дозирующим устройством (головкой), выпускающей определенное количество аэрозоля за одно нажатие клапана. Например, устройства такого типа производят фирмы Bespack, Ovar ЗМ Pharmaceuticals и др. Аэрозольное устройство для медицинского

использования содержит находящийся под давлением пропеллент, активные и вспомогательные вещества. Фармацевтический аэрозольный состав

высвобождается из устройства путем распыления аэрозольного состава через выходное отверстие под действием выталкивающей силы пропеллента.

Сущность изобретения

Задачей изобретения являлось создание универсальной аэрозольной композиции, содержащей активное вещество полипептидной природы из группы ингибиторов протеаз и выталкивающую систему с водонерастворимым озон- сберегающим пропеллентом, пригодной для использования в различных

дозирующих аэрозольных устройствах.

Для достижения технического результата, заключающегося в создании аэрозолей с физиологически активными белками и полипептидами, необходим подбор уникального соотношения и режима смешивания указанных

вспомогательных ингредиентов и активного вещества, позволяющий (1) сохранить аэрозоль-генерирующие свойства многокомпонентной композиции и (2) не нарушить функциональные свойства активного вещества. Чтобы решить эту двоякую задачу мы используем уникальное соотношение композиционных ингредиентов и метод их поэтапного смешивания, при котором последовательно водный раствор ингибитора протеаз смешивают с глицеролом, этанолом, другими вспомогательными добавками и на последней стадии с пропеллентом.

Разработанный аэрозольный состав на основе озон-сберегающего

пропеллентов, преимущественно! 34А (1,1 ,1,2-тетрафторэтана), свободного от хлора и поэтому не оказывающего окислительного действия на полипептидные молекулы, пригоден для использования в аэрозольных устройствах, генерирующих аэрозоль активного протеазного ингибитора белковой и полипептидной структуры.

Использование этого состава в ручных ингаляторах позволяет оптимизировать

75 индивидуальное применение фармацевтического белкового аэрозоля и исключать кросс-контаминацию инфекции среди людей, которая имеет место при применении ингаляторов стационарного типа.

Медицинская применимость

Грипп и другие респираторные инфекции вирусной и бактериальной природы

80 приносят огромный вред здоровью человека. Для лечения гриппа предлагается

аэрозоль порошка занамивира, ингибитора нейраминидазы, для ингаляций у гриппозных больных [Moscona 2005]. Аэрозольный занамивир ингибирует

размножение вируса в респираторном тракте посредством ингибирования вирусной нейраминидазы. Хорошо известно, что респираторные инфекции, включая

85 гриппозную инфекцию, сопровождаются нарушением протеолитического баланса в респираторном тракте [Kido et al. 2007]. Для коррекции этого нарушения

предлагается применение ингибиторов протеаз, которые имеют белковую природу или полипептидную структуру, состоящую из аминокислот и их дериватов. Наиболее рациональным лечебным способом применения служит прямое орошение очага

90 инфекции в респираторном тракте аэрозольной формой ингибиторов протеаз, среди которых типичным представителем служит апротинин. Такое воздействие

ингибитора протеаз, во-первых, блокирует размножение вируса за счет

ингибирования протеазной активации вирусных белков и, во-вторых, подавляет патогенез заболевания за счет снижения уровня вредных протеаз непосредственно

95 в очаге и в инфицированном организме. В результате, в отличие от занамивира, аэрозоль ингибиторов протеаз оказывает бинарное антивирусное и

патогенетическое лечебное действие.

Разработанный фармацевтический аэрозольный состав ингибиторов протеаз, преимущественно апротинина - ингибитора обширного спектра протеаз, найдет

100 широкое медицинское применение, поскольку нарушение протеолитического

баланса, требующее коррекции ингибиторами протеаз, развивается при многих заболеваниях человека и животных. В частности, антипротеазный аэрозольный состав может найти применение при таких заболеваниях, как респираторные инфекции, включая грипп, кератоконъюнктивиты вирусной и бактериальной

105 этиологии, герпетические поражения слизистых оболочек и кожи, хроническая

обструктивная бронхопневмония, астма и другие. Примеры реализации изобретения

Пример1. Получение аэрозольного состава из водного раствора апротинина и озон-сберегающего пропеллента.

ПО

Для получения аэрозольного состава приведен состав N1 , для его получения проводят последовательное один за другим смешивание индивидуальных

компонентов в следующей последовательности и соотношениях: 0,12 мл водного раствора, содержащего 3,64 мг белка (или 25000 Калликреин Ингибирующих Единиц

115 (КИЕ)) белка апротинина, в него вносят 1 ,2 мл 96% водного раствора глицерола; далее в полученную смесь вносят 2,0 мл 96% этанола и к полученной смеси добавляют 0,013 мл масла мяты перечной и на заключительном этапе при

постоянном помешивании добавляют 13,5 мл пропеллента 134А под давлением в герметичной емкости. В качестве дополнительного примера приведен аэрозольный

120 состава N2, который получен смешиванием компонентов в большем объеме в

последовательности, приведенной в составе N1. Полученные аэрозольные составы имеют следующее соотношение ингредиентов (Таблица 1).

Таблица 1. Соотношение компонентов в аэрозольном составе

водорастворимого апротинина и водонерастворимого пропеллента 134А.

125

Полученный аэрозольный состав разливают принудительно под давлением в герметичные баллоны, выполненные из сплава алюминия и снабженные

дозированным выпускным клапаном, имеющим отверстие с диаметром 0,3 мм. Заполненные баллоны хранят при температуре 18-20 град. С в течение 0,5 и 4 лет.

130

Пример 2. Полипептидные ингибиторы протеаз медицинского назначения.

Пример иллюстрирует список различных ингибиторов протеаз полипептидной природы, которые растворяют в водно-глицерино-спиртовой фазе предлагаемого 135 аэрозольного состава, приготовленной согласно зависимому пункту 1 формулы, для использования в качестве активного компонента в фармацевтическом аэрозольном составе.

Таблица 2.

Список полипептидных ингибиторов протеаз медицинского назначения.

Пример 3. Отсутствие физической денатурации аэрозольного состава.

Чтобы оценить смешиваемость ингредиентов в полученных образцах 145 аэрозольного состава, исследовали оптические свойства, т.е. прозрачность

раствора. С этой целью аэрозольный состав выпускали из баллона путем открытия клапана и выпуска аэрозоля в пробирки объемом 15 мл (фирма Falcon; Германия). Сразу после выпуска порцию собранного раствора из 15-миллитровой пробирки переносили в кювету для измерения (объемом 0,5 мл) и определяли оптическую 150 плотность раствора в потоке видимого света на спектрофотометре Ultraspec-2

(Pharmacia, Швеция). Оптическую плотность (прозрачность) аэрозольного раствора сравнивают с оптической плотностью дистиллированной воды, которую принимают за нулевое значение. Тестируют три порции аэрозольного состава: из полного баллона (выпуски номер 10-40), выпуски 120-150 (наполовину заполненный баллон); 155 выпуски 190-240 (последняя фракция баллона). Всего в баллоне содержалось 25 мл аэрозольного состава, что позволяло сделать около 300 выпусков объемом 85 мкл каждый из одного баллона. Результаты оптической плотности аэрозольного состава трех фракций приведены в таблице 3.

160 Таблица 3. Оптическая плотность ранних и поздних фракций аэрозольного состава.

165 Данные таблицы 3 показывают, что аэрозольный раствор, генерированный из ранних и поздних фракций баллона, имеет полную прозрачность подобно

дистиллированной воде. Этот результат указывает на хорошую совместимость компонентов и отсутствие преципитации компонентов взвешенных частиц в аэрозольном составе как в баллоне, так и в генерируемом аэрозоле.

170

б Пример 4. Биофизическая стабильность апротинина в аэрозольном составе.

Для тестирования биофизических свойств апротинина используют метод фракционирования белков в полиакриламидном геле в электрическом поле, так

175 называемый электрофорез полипептидов в полиакриламидном геле (ПАГЭ).

Тестированию подвергаются, во-первых, ранние и поздние порции аэрозольного состава одного баллона и, во-вторых, из баллонов, хранившихся 0,5 и 4 года при температуре 18-22 С ⁰ . Для проведения тестирования получают ранние, средние и поздние порций аэрозольного состава, путем сбора указанных фракций, как описано

180 в разделе 3.

Из собранных порций аэрозольного состава отбирают равные аликвоты (15 мкл), которые смешивают с 5 мкл диссоциирующего раствора, содержащего 5%

додецилсульфата натрия (ДСН) и 200 мкМ дитиотреитола (ДТТ), нагревают в течение 10 мин при 70° С и наносят на 3% полиакриламидный фокусирующий гель,

185 приготовленный на 0,12 М трис-HCI (рН 6,8) и 0,1% ДСН. Фокусирующий гель имеет толщину 1 ,2 мм и высоту 1 см. Разделительный гель имел высоту 7 см и содержал 17,5% акриламида, 0,3% метиленбисакриламида, 0,4 М трис-HCI (рН 8,3), 0,1 % ДСН. Фокусирующий и разделительный гели полимеризуют с помощью системы

катализаторов - персульфат аммония (0,05%) и тетраметилэтилен диамина

190 (ТЕМЕД; 0,2%). Буфер для электродов содержал трисгидроксиаминометан (0,03 М), глицин (0,2 М), 0,1 % ДСН и имел рН 8,3, который размещают по 75 мл в анодной и катодной камерах, электрофорезная буферная система по методу Laemmli (1970). Электрофоретическое фракционирование проводят при 70V на пластину ПАГ шириной 8 см в течение 2 часов. После окончания электрофореза полипептиды в

195 геле окрашивают Кумаси Голубым R-350 (0,1 %), который растворяли в смеси вода: этанол: уксусная кислота в соотношении по объему 5:5:1 в течение 2 часов при комнатной температуре. Не связавшуюся краску отмывают из геля в смеси вода: этанол: уксусная кислота с соотношением 88: 5: 7, соответственно. Для сравнения в качестве стандартного образца апротинина используют коммерческий препарат

200 очищенного апротинина, выделенного из легких крупного рогатого скота (фирма

Sigma, США).

На фигуре 1 показаны результаты анализа образцов аэрозольного состава, полученного из баллона сразу после заполнения и после хранения в течение 0,5 и 4 205 лет при комнатной температуре (18-22° С). Первое, как видно, апротинин из

аэрозольного состава ранних и поздних фракций имел типичный профиль электрофоретической подвижности для полипептида с молекулярной массой около 7кД, и полностью соответствовал по электрофоретическим характеристикам стандартного апротинина. Второе, в образцах аэрозоля апротинина не обнаружено

210 высокомолекулярных белковых аггрегатов. Эта высокомолекулярная зона (ВМЗ), соответствующая мол. массе150-250 кДа, показана на фигуре 1 в рамке на вершине разделительного геля. Как видно на рисунке, в зоне аггрегатов не выявлялось заметных количеств белка в образцах, полученных сразу после заполнения баллонов и в образцах из баллонов, хранившихся 4 года. Эти результаты указывают

215 на то, что апротинин в аэрозольном составе сохраняет свои исходные структурные свойства и не формирует аггрегаты в процессе хранения аэрозольного состава и его последующего распыления.

После электрофореза проводят оценку белков в геле методом сканирования геля. Для этого гель окрашивают Кумаси голубым и сканируют в видимом свете при

220 помощи сканера ScanJet 6300. Количественную оценку интенсивности белковых пятен на сканограмме определяют с помощью программы, позволяющей

сканировать оптическую плотность участков. Используя полученные величины интенсивности пятен на электрофореграмме, рассчитывают отношения площадей участков в расчете на единицу площади сканируемой зоны для апротинина и

225 примесных белков в высокомолекулярной зоне, соответствующей молекулярным массам от 150 до 250 кДа. Интенсивность основного пика апротинина (молекулярная масса около 7000 дальтон) принимают за 100 %.

А

230 N = х 100,

В где:

А - оптическая интенсивность высокомолекулярной зоны (ВМЗ);

235 В - оптическая интенсивность пятна апротинина;

N - процент высокомолекулярных примесей.

Количество белка в высокомолекулярной зоне не превышает 3%.

240 Пример 5. Иммунологическая стабильность апротинина в аэрозольном составе.

Иммунологические свойства апротинина в аэрозольном составе тестируют по его взаимодействию со специфическими антителами по методу «вестерн блот». 245 Исследуют три образца: стандартный апротинин (фирма Sigma, США) и

аэрозольный состав из баллона, хранившегося 0,5 и 4 года при температуре 20-22 градуса Цельсия. После электрофореза а ПАГе белки из геля переносят на нитроцеллюлозную протрановую мембрану с диаметром пор 0,45 микрон (фирма Shleiher & Schull, Германия) и далее адсорбированный на мембране белок

250 тестируют по взаимодействию со специфическими к апротинину антителами.

Взаимодействие на мембране апротинина с антителами идентифицируют методом усиленной хемилюминесценции с помощью коньюгата пероксидазы со вторичным анти-видовым антителом. В качестве субстрата на пероксидазу используют коммерческий препарат фирмы Pierce (США) и его свечение регистрируют на

255 рентгеновской пленке Kodak (США). Первое, фигура 2 показывает, что апротинин стандарта и обоих исследованных образцов аэрозольного состава хорошо взаимодействует с антителами против апротинина, что подтверждает его

иммунологическую стабильность в аэрозольном составе. Второе, после 4-ех годичного хранения аэрозольного состава апротинин сохраняет способность

260 реагировать со специфическими анти-апротининовыми антителами. Этот результат показывает, что апротинин сохраняет нативную иммунологическую структуру при хранении аэрозольного состава в течение 4 лет.

Пример 6. Сохранение антипротеазной активности апротинина в аэрозольном составе.

265

Антипротеазную активность аэрозольного состава проверяют по его способности ингибировать гидролитическую функцию трипсина. Для этого

устанавливают стандартное количество стандартного препарата трипсина (Sigma; США), которое расщепляет хромогенный субстрат L-ZAPA (Z-Arg-pNA; ВАСНЕМ,

270 Швейцария) с образованием нитроанилида (NA) с интенсивностью желтого

окрашивания около 0,8 единиц при длине волны 405 нм (ОП405). Это количество составляет около 100 нг трипсина при общем объеме реакционной смеси 150 мкл. Далее это количество трипсина в объеме 50 мкл смешивают с серийными

разведениями образцов аэрозольного состава (объем 50 мкл) и инкубируют 30 мин

275 при температуре 20°С для связывания апротинина с трипсином и его

ингибирования. После этого в смесь вносят субстрат L-ZAPA (25 мкл раствора с концентрацией 1 мг/мл), инкубируют 15 мин при 20°С и гидролитическую реакцию останавливают добавлением 25 мкл 1М раствора соляной кислоты и измеряют оптическую плотность при 405 нм для определения остаточной активности трипсина

280 (показано на фигуре 3). Для расчета молярного соотношения трипсина и

апротинина, при котором происходит 50% ингибирование трипсина, определяют концентрации белка трипсина и апротинина в исходных растворах. Для определения концентрации белка апротинина используют стандартную методику

Брэдфорда, в которой в качестве стандарта берут бычий сывороточный альбумин

(Sigma, США) и кумаси голубой G-250 (Sigma, США). Учитывая фактор разведения тестируемого аэрозольного состава, при котором отмечалось 50% снижение оптической плотности ОП405 высвободившегося субстратного нитроанилида, рассчитывают молярное соотношение трипсин/апротинин.

Кривые титрования апротинина в аэрозольном составе сразу после

приготовления баллонов и через 4 годового хранения приведены на фигуре 3. Как показывают исследования, 50% ингибирование трипсина наблюдается с исходным веществом апротинина при молярном соотношении трипсин/апротинин=1/1. При тестировании аэрозольного состава наблюдается сходная анти-трипсиновая активность апротинина и 50% ингибирование (на фигуре 4 показано стрелкой) также регистрируется при молярном соотношении трипсин/апротинин=1/1. Таким образом, это тестирование показывает, что апротинин остается стабильным в аэрозольном составе и устойчиво сохраняет антипротеазную активность на уровне исходного апротинина в процессе хранения в течение 4 лет.

Пример 7. Сохранение активности ингибиторов протеаз в трех-Фазной 300 водно-глицероло-спиртовой смеси, смешанной с пропеллентом

Водный раствор ингибиторов протеаз, содержащий либо полипептидный апротинин, леупептин (олигопептид: acetyl-Leu-Leu-Arg-aldehyde (Sigma, США)), либо белковый альфа1 -антитрипсин (Boehringer, Германия) с концентрацией 1 мг сухого вещества

305 на мл раствора, последовательно смешивают с водным раствором 99% раствора глицерола (FisherBiotech, США) и 96% этанола медицинской квалификации. Далее смешивали полученные трех-компонентные смеси с пропеллентом 134А при температуре -27 град С, при которой пропеллент находится в жидком состоянии в объемном соотношении 13% смеси и 87% пропеллента. После смешивания смесь

310 выставляли при температуре 20° С и оставляли до полного испарения пропеллента.

Остаток смеси, содержащий ингибитор протеаз, исследуют на наличие

антипротеазной активности. Тестируют два диапазона соотношения ингредиентов, А и Б. После инкубации в течение 1 часа при 20° С определяют антипротеазную активность по ингибированию гидролитической активности трипсина.

315 Гидролитическую активность трипсина определяют по способности расщеплять

хромогенный субстрат L-zapa (фирма ВАСНЕМ, Швейцария) по методике,

описанной выше в примере 6. Положительной реакцией ингибирования считают результат, при котором в пробе с тестируемым образцом ингибитора определяют

ю уменьшение оптического сигнала свободного нитроанилида на 15% и более по 320 сравнению с контрольной пробой трипсина без ингибитора. Установлено, что при смешивании белковых и полипептидных ингибиторов протеаз с аэрозольной четырех-фазной водно-глицероло-спирто-пропелле� �тной смесью их активность сохраняется.

Таблица 4. Активность ингибиторов протеаз в аэрозольной смеси

325

Пример 8. Сохранение противовирусной активности апротинина в аэрозольном составе.

330 Для тестирования антивирусных свойств аэрозольного состава использовали критерий расщепления вирусного белка HA0 и его ингибирования апротинином при размножении вируса гриппа человека A/Puerto Rico/34 (H1 N1 ) и A Aichi/2/68 (H3N2) в куриных эмбрионах. 9-дневные куриные эмбрионы заражали путем введения вируса в аллантоисную полость эмбриона в количестве около 1000 вирусных частиц. Сразу

335 после заражения в аллантоисную полость эмбриона дополнительно вводили

исследуемый аэрозольный состав. После 24 часов инкубации эмбрионов при 37°С получали аллантоисную жидкость из куриных эмбрионов и исследовали количество накопившегося синтезируемого инфекционного вируса и белковый состав вируса. Чтобы доказать антивирусное действие аэрозольного состава исследовали

340 белковый состав вируса, синтезируемого в куриных эмбрионах в присутствии

аэрозольного состава. Образцы аллантоисной жидкости (АЖ) подвергали 2-ух этапному центрифугированию для очистки вирусных частиц. Для осаждения клеточных обломков образцы АЖ центрифугировали при 4000 об/мин в течение 30 мин. и далее 3 мл осветленной АЖ центрифугировали в ультрацентрифуге Spinko

345 L7-50 (ротор SW 55.1) при 27000 об/мин в течение 2,5 часов в пробирке объемом 5,5 мл, на дно которой подслаивали 2 мл 18% раствора сахарозы, приготовленного на фосфатном буфере (ФБ: 10 мМ Na2HPO4/NaH2PO4 рН 7,2; 2,7 мМ KCI; 137 мМ NaCI). При центрифугировании вирус проходил слой сахарозы и оседал на дно пробирки (препарат вируса), тогда как загрязняющие белки оставались в

350 надосадочной жидкости. Полипептиды вирусных осадков подвергали электрофорезу в ПАГе, по методу Laemmli (1970), описанному выше в разделе 3, и анализировали техникой вестерн-блот (ВБ) с антителами к белку НА. С этой целью белки из геля переносили на нитроцеллюлозную мембрану (Protran; Shleiher & Schull, Германия) в буфере для полусухого переноса белков (0,05 М трис; 0,01 М глицин; рН 9,7; 0,01 %

355 ДСН; 17,5% этанол). Перенос проводили при 0,8 тА на см2 мембраны в течение 1 часа. После переноса мембрану насыщали в течение ночи в 3% растворе

обезжиренного молока коров и далее инкубировали в течение 1 часа при

температуре 20° С в ФБ, содержащем 0,5% БСА и антитела морской свинки против вирусного белка НА, и образованные на мембране иммунные комплексы

360 идентифицировали с помощью пероксидазного коньюгата против иммуноглобулина свинки («Pierce»; США) методом усиленной хемилюминесценции (ECL) с ECL- субстратом (« Pierce; США).

Профиль полипептидов HA0 (мол. вес 75 kD) и НА1 (мол. вес 55 kD) в препаратах вируса показан на фигуре 4. Следует иметь в виду, что полипептид HA0

365 входит в состав неинфекционных вирионов, тогда как НА1 делает вирионы

инфекционными. Переход НА0- НА1 осуществляется трипсиновыми протеазами куриного эмбриона, на которые направлено действие апротинина. Как видно на фигуре 4, в эмбрионах, не обработанных аэрозольным составом, в составе вируса выявлялся в активный НА1 (около 95%), что указывало на образование

370 инфекционного вируса в таких эмбрионах. Напротив, в вирусе из эмбрионов,

обработанных аэрозольным составом, преобладал нерасщепленный HA0 (около 50%), что показало преимущественное накопление неинфекционного вируса в этих эмбрионах. Эти результаты, показывают, что апротинин в аэрозольном составе сохраняет свою антипротеазную функцию и после 4-ех летнего хранения и

375 блокирует активацию вируса гриппа посредством ингибирования расщепления

НА0-НА1.

Для оценки влияния аэрозольного состава на репродукцию вируса сравнивали урожай инфекционного вируса в куриных эмбрионах, обработанных и не

обработанных аэрозольным составом. Тестировали аэрозольный состав,

380 хранившийся 5 месяцев и 4 года при комнатной температуре (18-22°С). Урожай

вируса определяли по общепринятой методике титрования инфекционного вируса методом инфекционных фокусов в клеточной культуре МДСК. Каждый образец аэрозольного состава вводили в 3 эмбриона и исследовали урожай вируса

независимо в каждом из эмбрионов. Результаты приведены в таблице 5. Как видно,

385 оба образца аэрозольного состава из баллонов оказывали выраженное вирус- ингибирующее действие и снижали в 100 и более раз накопление инфекционного вируса. Важно отметить, что вирус-ингибирующая активность аэрозольного состава, хранившегося 4 года, была равна таковой исходного образца аэрозольного состава перед хранением. Эти результаты доказывают, что аэрозольный состав обладает

390 антивирусной активностью по ингибированию размножения инфекционного вируса и эта активность состава сохраняется на высоком исходном уровне в течение, по крайней мере, 4 лет хранения.

Таблица 5. Ингибирование вируса гриппа аэрозольным составом

(*) 9-дневные куриные эмбрионы заражали вирусом гриппа введением в аллантоисную полость эмбриона около 1000 вирионов и дополнительно вводили 75 мкл аэрозольного состава, полученного через 0,5 и 4 года после хранения при температуре 20 град. С. Берут по 5 эмбрионов на один образец 400 состава. После 24 часов инкубации эмбрионов при 37°С отбирали аллантоисную жидкость (АЖ) из куриных эмбрионов и определяют количество синтезированного инфекционного вируса методом титрования инфекционных фокусов в культуре клеток МДСК. Количество вируса рассчитывают по количеству вирусных частиц на мл аллантоисной жидкости (средние значения ±σ). В качестве контрольного брали эмбрионы, которые заражали вирусом гриппа без введения аэрозольного 405 состава.

Пример 9. Профиль дисперсности при распылении аэрозольного состава.

410 Определение проводят микроскопически после выпуска аэрозоля на стекло.

Аэрозольный баллон встряхивают и распыляют 1 дозу на чистое сухое

обезжиренное предметное стекло, расположенное перпендикулярно направлению распыления на расстоянии 6 см от выходного отверстия распылительной насадки. Определение величины влажных частиц осуществляют с помощью микроскопа при

415 450-кратном увеличении сразу после напыления аэрозоля на стекло. Диаметр

частиц определяют с помощью прозрачной матрицы, имеющей размеченную сетку. Подсчет проводят на 10 полях зрения (фигура 5). Измерение проводят 3 раза из одного баллона на разных сроках выпуска аэрозоля, в испытании используют 3 баллона, рассчитывают распределение частиц по фракциям с определенным

420 диапазоном по диаметру частиц в процентах от общего количества частиц на стекле в поле зрения.

Литературные источники

425 1. Патент РФ 2054180 «Способ лечения вирусных респираторных инфекций, аэрозоль для его осуществления» приоритет 21 августа 1991 г.

2. Ganderton D, Lewis D, Davies R, Meakin B, Brambilla G, Church T. 2002. Modulite: a means of designing the aerosols generated by pressurized metered dose

430 inhalers. Respir Med. 96 Suppl D:S3-8.

3. Moscona A. 2005. Oseltamivir resistance - disabling our influenza defenses. N Engl J Med. 353(25):2633-6.

435 4. Trautschold I., Werle E., Zickgraf-Rudel G. 1967. Trasylol. Biochem. Pharmacol. 16:

59-72.

5. Kido H, Okumura Y, Yamada H, Le TQ, Yano M. Proteases essential for human influenza virus entry into cells and their inhibitors as potential therapeutic

440 agents. Curr Pharm Des. 2007;13(4):405-14. Review. PubMed PMID: 17311557.

6. Laemmli UK. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 1970 Aug 15;227(5259):680-5. PubMed PMID: 5432063. Краткие пояснения к фигурам

Фигура 1. Структурная стабильность апротинина в аэрозольном составе. Эквивалентные количества аэрозольного состава стандартного апротинина, и образцов аэрозольного состава, хранившегося 0,5 и 4 года, подвергали электрофорезу в 15% ПАГе. После электрофореза гели окрашивали Кумаси голубым R350 и окрашенные гели фотографировали в обычном свете. В качестве маркерных белков с известным мол. весом использовали смесь фирмы Fermentas (Латвия).

Фигура 2. Иммунологическая стабильность апротинина в аэрозольном составе.

Образцы аэрозольного состава, хранившегося 0,5 и 4 года подвергали электрофорезу в 15% ПАГе и анализировали техникой вестерн-блот (ВБ) с антителами к белку апротинина. Количество белка в аэрозольном составе, нанесенное на дорожку геля, указано на фигуре под дорожками. Для

регистрации белков, реагирующих с антителами к апротинину, использовали методику усиленной хемилюминесценции (ECL) с пероксидазным субстратом фирмы Pierce ( США). Позитивные белковые компоненты показаны на рисунке в виде черных зон. В качестве маркерных белков с известным мол. весом (позиции на мембране показаны стрелками) использовали смесь фирмы Fermentas (Латвия).

Фигура 3. Антипротеазная активность аэрозольного состава.

Различные количества аэрозольного состава в объеме 50 мкл, полученного через 0,5 и 4 года после хранения при температуре 220С, смешивали с 50 мкл 0,15 М фосфатного буфера (ФБ), содержащего 100 нг трипсина, и

инкубировали в течение 30 мин при температуре 200С. После этого в смесь вносили 25 мкл субстрата L-zapa (1 мг/мл), инкубировали 30 мин при 200С и реакцию останавливали добавлением 25 мкл 1М раствора гидрохлористой кислоты. Остаточную активность трипсина в пробе определяли по

интенсивности окрашивания (ОП) высвободившегося нитроанилида, которую измеряли при 405 нм. По оси ординат отложены средние значения ОД405 по трем независимым измерениям; по оси абсцисс показаны количества белка апротинина в одной пробе. Фигура 4. Ингибирование протеолиза вирусного белка НА0-*НА1

аэрозольным составом.

9-дневные куриные эмбрионы заражают вирусом гриппа введением в аллантоисную полость эмбриона около 1000 вирионов и дополнительно

485 вводят 75 мкл аэрозольного состава ранних и поздних фракций. Тестируют два образца аэрозольного состава, полученного через 0,5- и 4-летнего хранения в аэрозольных баллонах при температуре 20° С. После 24 часов инкубации эмбрионов при 37°С отбирают аллантоисную жидкость (АЖ) из куриных эмбрионов, из который выделяют вирус и тестируют профиль белков

490 HA0 и НА1 в его составе. Полипептиды вируса подвергают электрофорезу в

ПАГе и тестируют техникой вестерн-блот (ВБ) с антителами к белку НА. На фигуре приведены пробы, полученные из 5 индивидуальных эмбрионов. Под фигурой указаны количественные данные соотношения белков НА0/НА1 в вирусном препарате, которые получены при сканировании сигналов на

495 мембране и расчета площадей пиков с помощью программы TINA.

Суммарное содержание НА0+НА1 принято за 100%.

Фигура 5. Профиль дисперсности частиц, генерируемых из аэрозольного состава.

500 Аэрозольный состав, приготовленный согласно прописи (1) в таблице 1,

распыляли из баллона открытием клапана на поверхность обезжиренного стекла, расположенного на расстоянии 4,5 см от выпускного отверстия баллона. Диаметр капель на стекле определяли с помощью светового микроскопа при увеличении 400 по микронной сетке, нанесенной на стекле. По

505 оси абсцисс показаны диапазоны диаметра частиц: 1 (0,5-10 мкм), 2 (10-50 мкм), 3 (50-100 мкм), 4 (100-1000 мкм). По оси ординат показано долевое содержание фракций данного диаметра в % от общего содержания частиц в аэрозоле.