本発明改善剤は、ケラタン硫酸糖鎖骨格中� ��N-アセチルグルコサミニド結合を加水分解� �るエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ� �酵素(エンド-β-N-アセチルグルコサミニダー� ��型ケラタン硫酸分解酵素)を有効成分とする ことを特徴とするものである。ケラタン硫酸 糖鎖骨格中のN-アセチルグルコサミニド結合� ��加水分解するエンド-β-N-アセチルグルコサ� ��ニダーゼ型酵素は、ケラタナーゼIIとの別� �を持つケラタン硫酸分解酵素であり、それ� �体は公知の物質である(以降、ケラタン硫酸� ��鎖骨格中のN-アセチルグルコサミニド結合� �加水分解するエンド-β-N-アセチルグルコサ� �ニダーゼ型酵素をケラタナーゼIIと略称する )。ケラタナーゼIIは微生物由来の酵素であり 、バチルス属細菌Ks36株(微生物の受託番号:FER M P-10204)が産生することが知られている(必要 であれば特許第2726274号公報を参照のこと。� �降、Ks36株が産生するケラタナーゼIIをKs36ケ� ��タナーゼIIと略称する)。また、至適反応温� ��が50~60℃の熱安定性に優れた耐熱性ケラタ� �ーゼIIも知られており、この酵素はバチルス ・サーキュランスKsT202株(微生物の受託番号:F ERM BP-5285)が産生することが知られている(以� ��、耐熱性ケラタナーゼIIをBcケラタナーゼII� ��略称する)。BcケラタナーゼIIは、ケラタン� �酸を分解して、主に、硫酸化ケラタン硫酸� �糖及びケラタン硫酸四糖を生成することを� �徴とする(必要であれば特許第3734504号、米国 特許第5,840,546号、ヨーロッパ特許第0798376 B1� ��の公報を参照のこと)。また、Bcケラタナー� ��IIは、例えばバチルス・サーキュランスKsT20 2株からクローニングされた耐熱性ケラタナ� �ゼII遺伝子を、大腸菌等の宿主に組み込んで 生産した遺伝子組換え型耐熱性ケラタナーゼ IIであってもよい(必要であれば特開2004-24189� �公報やGenBank: ACCESSION No. AY188989 http://www.ncb i.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?db=nuccore&id=32454884� ��参照のこと。以降、遺伝子組換え型耐熱性� ��ラタナーゼIIをrBCケラタナーゼIIと略称する )。上記特開2004-24189号公報に記載されたrBCケ� ��タナーゼIIの全アミノ酸配列を配列番号1と� ��て添付する。
 Ks36ケラタナーゼIIと、BcケラタナーゼIIは、 ともにエンド-β-N-アセチルグルコサミニダー ゼ型酵素ではあるが、高濃度のケラタンポリ 硫酸(硫酸化度の高いケラタン硫酸)に対する� ��応性、至適pH、pH安定性、至適温度、温度安 定性、および薬剤による阻害の影響等が異な ることから、本質的には異なった酵素である と言える(必要であれば特許第3734504号、米国� ��許第5,840,546号、ヨーロッパ特許第0798376 B1� �の公報を参照のこと)。本発明における神経� ��害に基づく機能不全の改善剤の有効成分と� ��る酵素としては、この2種類の酵素が好適に 挙げられるが、BcケラタナーゼIIが好ましく� �rBCケラタナーゼIIがより好ましい。
 なお、本発明において使用されるケラタナ� ��ゼIIは、ケラタン硫酸糖鎖骨格中のN-アセチ ルグルコサミニド結合を加水分解するエンド -β-N-アセチルグルコサミニダーゼ型酵素であ る限り、上記例示酵素に限定されるものでは なく、その由来、酵素学的性質も限定されな い。

 ケラタナーゼIIは、脊髄損傷に伴う神経� �害や筋萎縮性側索硬化症などの様々な神経� �害に基づく運動神経機能不全や知覚神経機� �不全などを改善するが、この作用はケラタ� �硫酸によるRhoキナーゼ活性化の抑制を介し� �ものである。Rhoキナーゼ(ROCK)は、細胞質に� �在し、結合したGTP(グアノシン三リン酸)を加 水分解する活性を有する低分子量GTPase(グア� �シン三リン酸フォスファターゼ)であり、ア� ��チン骨格系あるいはチューブリンを制御す� ��ことによって細胞の形や運動などの様々な� ��御を行う重要なリン酸化酵素である。この� ��素は1990年代に発見され、Rhoなどのいくつか の細胞内因子によって活性化される。Rhoキナ ーゼシグナル伝達系が活性化されることで、 アクチン骨格系が不活化し、結果的に神経軸 索の伸長が阻害され、成長円錐の崩壊が引き 起こされる。ケラタン硫酸によって誘導され る神経軸索の伸長阻害がRhoキナーゼ活性化を 伴うこと、ケラタナーゼIIの神経障害に基づ� ��機能不全の改善作用がこのRhoキナーゼ活性� ��の抑制を介していることは、今回、本発明� ��らによって初めて見出された知見であり、� ��の知見をもとに、本発明は、Rhoキナーゼシ� ��ナル伝達系の制御をコンセプトとした新規� ��神経障害に基づく機能不全の改善剤を提供� ��る。

 本発明改善剤または本発明抑制剤(以下、 これらをまとめて本発明薬剤ともいう。)の� �効成分である、Ks36ケラタナーゼIIやBcケラタ ナーゼIIに例示されるケラタナーゼIIは、通� �の非経口酵素製剤と同様に常法によって非� �口製剤に製剤化され、目的とする疾患に応� �た投与経路で哺乳動物(例えばヒト、非ヒト� ��長類、ラット、マウス、ウサギ、ウシ、ウ� ��、ブタ、イヌ、ネコなど)に非経口的に投与 され、当該動物の目的疾患の治療または予防 に使用される。

 非経口製剤としては液体製剤(溶液製剤、 懸濁剤、点眼剤、点鼻薬、脳、髄腔内や皮膚 への局所注入剤等)、固体製剤(凍結乾燥製剤� ��粉末製剤、顆粒製剤、マイクロカプセル、� ��ポソーム、リポスフェア等)、半固体製剤(� �膏等)が挙げられる。例えば、本発明薬剤を� ��体製剤として製造する場合、注射用水、医� ��上許容される添加物もしくは担体、例えば� ��張化剤(塩化ナトリウム、塩化カリウム、グ リセリン、マンニトール、ソルビトール、ホ ウ酸、ホウ砂、ブドウ糖、プロピレングリコ ールなど)、緩衝剤(リン酸緩衝液、酢酸緩衝� ��、ホウ酸緩衝液、炭酸緩衝液、クエン酸緩� ��液、トリス緩衝液、グルタミン酸緩衝液、� ��プシロンアミノカプロン酸緩衝液など)、保 存剤(パラオキシ安息香酸エステル類、クロ� �ブタノール、ベンジルアルコール、塩化ベ� �ザルコニウム、デヒドロ酢酸ナトリウム、� �デト酸ナトリウム、ホウ酸、ホウ砂など)、� ��イオン界面活性剤(例えば、ポリオキシエチ レンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシ エチレン硬化ヒマシ油、ショ糖脂肪酸エステ ル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレ ングリコール)、増粘剤(ポリビニルアルコー� ��など)、安定化・活性保持剤(血清アルブミ� �、ゼラチン、シュークロース、ポリエチレ� �グリコール、デキストラン類、ラクトース� �マルトース、マンニトール、キシリトール� �ソルビトール、イノシトール、エデト酸ナ� �リウム、クエン酸ナトリウム、アスコルビ� �酸など)、pH調整剤(塩酸、水酸化ナトリウム� ��リン酸、酢酸など)、溶解補助剤、酸化防止 剤、容器への吸着を防止するために有効な物 質などを適宜添加した溶液に、医薬的に許容 されるグレードのケラタナーゼIIを溶解また� ��分散することによって製造することができ� ��。また、このような液体製剤を、ケラタナ� ��ゼIIの活性等、薬理学的機能に影響を及ぼ� �ない乾燥方法(凍結乾燥等)で乾燥し、用時溶 解型の固体製剤とすることができる。具体的 な例としては、医薬的に許容されるグレード のケラタナーゼIIを生理食塩液、注射用水、� ��張液、油性液等に溶解もしくは懸濁するな� ��して液体製剤とすることができる。

 以上のごとく製剤化された本発明薬剤を� ��目的疾患、症状の程度、投与対象等に応じ� ��投与方法で投与し、神経障害に基づく機能� ��全を改善、治癒または予防することができ� ��。例えば、神経障害を受けた部位またはそ� ��周辺に局所的に投与する投与方法が挙げら� ��、好ましい。より具体的には、マイクロチ� ��ーブを用いて浸透圧ポンプによってクモ膜� ��腔内(髄腔内)に持続投与することができ、� �のような持続投与法が本発明の目的を考慮� �ると好ましい。

 本発明薬剤の投与量、投与期間は、目的疾� ��、投与対象の動物種、年齢や体重、症状の� ��度、健康状態などの条件によって医師等の� ��療専門家によって適宜設定されるべきもの� ��、特に限定はされない。すなわち、障害部� ��におけるRhoキナーゼの活性化を抑制し、あ� ��いはグリア性瘢痕におけるケラタン硫酸プ� ��テオグリカンのケラタン硫酸鎖を分解する� ��に有効な量および期間であればよい。
 脊髄損傷のモデルにおいて、ラット(体重:0. 3キログラム/脳脊髄液量:0.3 mL)における本発� ��改善剤の一日当たりの髄腔内投与量は、ケ� ��タナーゼIIの酵素単位として約1.5マイクロ� �ニット(μU)(0.000025 U/200 μL)~30ミリユニット(m U)、好ましくは約0.3 mU(0.005 U/200 μL)~10 mU、� ��も好ましくは約3.0 mU(0.05 U/200 μL)である。 ここで、カッコ内のU/200 μLは濃度を表し、� �濃度の酵素液剤を1日あたり、12 μL投与する 。
 これを、ラットの体重を0.3キログラムとし� ��脳脊髄液量を0.3 mLとして、ヒト成人(体重:6 0キログラム/脳脊髄液量:150 mL)に換算すると� ��体重換算で約200倍、硬膜内へ直接投与する� ��とを考慮して、脳脊髄液量で換算すると約5 00倍となる。したがって、ヒト成人(平均的な 体重60キログラム/平均的な脳脊髄液量150 mL)� ��の投与量は、以下の通りとなる。
 体重換算の場合、一日当たりの髄腔内投与� ��として、約0.3 mU~6000 mU、好ましくは約60 mU ~2000 mU、最も好ましくは約600 mUである。
 また、脳脊髄液量換算の場合、一日当たり� ��髄腔内投与量は、約0.75 mU~15000 mU、好まし� ��は約150 mU~5000 mU、最も好ましくは約1500 mU� ��ある。
 したがって、上記の換算法を総合的に考慮� ��ると、一日当たりの髄腔内投与量は、約0.3� �mU~15000 mU、好ましくは約60 mU~5000 mU、最も� �ましくは約600 mU~1500 mUである。
 投与期間は、損傷部位におけるケラタン硫� ��プロテオグリカンの発現量、有害事象の発� ��等の可能性を考慮し、症状に応じて医師等� ��医療専門家が決定すべきことではあるが、� ��の目安としては、持続投与においては受傷� ��約8週間まで、好ましくは約4週間まで、よ� �好ましくは約2週間までである。投与開始時� ��は、受傷直後乃至受傷後3日から一週間経過 後程度であることが好ましい。
 なお、有効成分であるケラタナーゼIIの好� �しい比活性は、約2 U/mgタンパク質以上なの� ��、上記の一日当たりの髄腔内投与量は、酵� ��タンパク質重量としては、約0.3 mUは約0.15� �イクログラム(μg)以下、15000 mUは約7500 μg以 下、60 mUは約30 μg以下、5000 mUは約2500 μg以 下、600 mUは約300 μg以下、1500 mUは約750 μg� �下に相当する。なお、酵素量1ユニット(1 U)� ��、サメ軟骨由来のケラタンポリ硫酸を基質� ��し、37℃で10分間反応させたときに、1分間� �1 μmolのガラクトースに相当する還元末端を 生成する酵素量として定義される(必要であ� �ば特開2004-24189号公報を参照のこと)。

 なお、本発明薬剤の単位製剤当たりの酵� ��量または濃度は上記投与量に応じて設定さ� ��るが、製剤は必ずしも投与時の酵素量また� ��濃度とする必要はなく、例えば、投与直前� ��るいは投与時に、希釈液によって有効かつ� ��全な濃度に希釈してもよい。したがって、� ��発明はこのような希釈液と、上記本発明薬� ��との組み合わせによるキットも提供する。

 本発明薬剤は人体等への投与を目的した� ��薬品であるため、有効成分であるケラタナ� ��ゼIIは医薬的に許容されるグレードのもの� �あり、エンドトキシン、核酸、プロテアー� �等の本酵素産生微生物に由来する不純物が� �力除かれたものであることが好ましい。エ� �ドトキシン、核酸、プロテアーゼは通常の� �析法で検出限界以下であることが好ましく� �例えば、エンドトキシン量は、生化学工業(� ��)製のトキシカラー(登録商標)システムを用� ��て測定した場合、5.0 pg/100 U以下であるこ� �が望ましい。また、核酸はスレッシュホー� �ド法(DNA測定装置:スレッシュホールド(モレ� �ュラーデバイス社製))で測定した場合、検出 限界以下であることが望ましい。プロテアー ゼは、FITC-カゼインを基質として測定した場� ��、全蛋白量に対して0.1%以下であることが好 ましい。

 本発明改善剤は、脊髄および脳を含む中� ��神経(CNS)系または末梢神経系の急性障害、� �急性障害または慢性障害に基づく機能不全� �改善、治癒または予防に使用される。本発� �改善剤の対象疾患としては、中枢神経の挫� �、外傷性脳損傷、その他の脳損傷、脳卒中� �筋萎縮性側索硬化症(ALS)、多発性硬化症(MS)� �腕神経叢損傷、ambliophia、脊髄損傷、アルツ� ��イマー病、パーキンソン病を含む神経損傷� ��神経変性疾患又は神経機能不全が挙げられ� ��が、これに限定されるものではない。脊髄� ��傷は、交通事故、墜落、挫傷、銃創、およ� ��その他の傷害によってもたらされたニュー� ��ンの挫滅などの疾患および外傷性損傷を含� ��。本発明改善剤を投与することにより、治� ��対象(患者)の運動神経機能不全(運動神経の� ��能不全、障害、麻痺に基づく四肢体幹運動� ��能障害など)や、アロデニアや痛覚過敏反応 に基づく疼痛に代表される神経因性疼痛等の 知覚神経機能不全(知覚神経の機能不全、障� �、麻痺に基づく神経過敏、異常感覚、手足� �痺れ、顔面神経麻痺など)において臨床的な� ��善が得られる。

 なお、本発明薬剤を、脊髄損傷等の神経障� ��における改善効果が知られている他の薬剤� ��併用して治療を行うことも可能である。
 例えば、このような薬剤としてはコンドロ� ��チン硫酸プロテオグリカンを分解する作用� ��有する、コンドロイチナーゼを有効成分と� ��る薬剤が挙げられる。
 コンドロイチナーゼは、コンドロイチン硫� ��を脱離的に不飽和二糖に分解する脱離酵素� ��ある。現在入手可能な酵素を以下に列記す� ��。
・コンドロイチナーゼABC(Proteus vulgaris由来/� �化学バイオビジネス(株)販売)
・コンドロイチナーゼAC I(Flavobacterium heparinu m由来/生化学バイオビジネス(株)販売))
・コンドロイチナーゼAC II(Arthrobacter aurescens 由来/生化学バイオビジネス(株)販売))
・コンドロイチナーゼAC II(Flavobacterium sp. Hp  102由来)
・コンドロイチナーゼB(Flavobacterium heparinum由 来/生化学バイオビジネス(株)販売))
・コンドロイチナーゼC(Flavobacterium sp. Hp 102 由来)
・コンドロイチナーゼAC(組み換え体、Flavobact erium heparinum由来/IBEX Technologies Inc.販売)
・コンドロイチナーゼB(組み換え体、Flavobacte rium heparinum由来/IBEX Technologies Inc.販売)
 コンドロイチナーゼABC(Chondroitinase ABC)〔EC  4.2.2.20又はEC 4.2.2.4〕は、コンドロイチン硫� �を含むグリコサミノグリカンのN-アセチルヘ キソサミニド結合を脱離反応的に切断して、 非還元末端にδ4-ヘキスロン酸残基を持つ不� �和二糖を主に生成する酵素で、哺乳動物軟� �由来のコンドロイチン硫酸A(コンドロイチン -4-硫酸を多く含む)、鮫軟骨由来のコンドロ� �チン硫酸C(コンドロイチン-6-硫酸を多く含む )および哺乳動物皮膚由来のコンドロイチン� �酸B(デルマタン硫酸)の分解を強力に触媒し� �ヒアルロン酸の分解に対しては弱く触媒す� �酵素であり、コンドロイチン硫酸プロテオ� �リカンのコンドロイチン硫酸側鎖中のコン� �ロイチン硫酸A、デルマタン硫酸、及びコン� ��ロイチン硫酸Cも分解する(Yamagata, T. et al.,  J.Biol. Chem., 243: 1523-1535(1968)、Hamai A. et al ., J. Biol. Chem. 272:9123-9130(1997))。本酵素は、 動物組織からムコ多糖類を除去したり、組織 中のムコ多糖を同定したりするための研究用 試薬として、プロテウス・ブルガリス(Proteus� �vulgaris)等の細菌の産生する酵素商品が、コ� �ド番号:100330(Chondroitinase ABC(Proteus vulgaris))及 びコード番号:100332(Chondroitinase ABC Protease Fre e(Proteus vulgaris))として生化学バイオビジネス (株)から試薬として市販されているほか、よ� ��高純度(単一タンパク質で、エンドトキシン 、核酸、夾雑タンパク質等を含まない)に精� �され、比活性が極めて高い酵素が椎間板ヘ� �ニア治療剤として臨床試験が行われ、生体� �対する作用が十分に解明されているため、� �り好ましい。特に日本特許第3980657号、米国� ��許第6,184,023号、米国特許第5,773,277号、米国� ��許第5,763,205号等に記載の高純度かつ比活性� ��高いコンドロイチナーゼABCが最も好ましい� ��なお、上記コンドロイチナーゼABCは、下記� ��別称の酵素と同一酵素である。
・コンドロイチナーゼABC Type1
・Chondroitin ABC endolyase 1
・Chondroitin ABC lyase I
・Chondroitin sulfate endolyase
・Chondroitin ABC eliminase
 また、上記コンドロイチナーゼABC活性を持� ��物質の遺伝子はクローニングされており、� ��のタンパク質のアミノ酸配列及びそれをコ� ��ドするDNAの塩基配列も同定されている(米国 特許第5,578,480号、特表2007-520447(WO2004/103299))。 代表的なアミノ酸配列としては、米国特許第 5,578,480号に記載されているものが挙げられる 。このアミノ酸配列は、1021個のアミノ酸残� �からなるが、アミノ酸:1-24はシグナル配列を 構成し、成熟タンパク質は997個のアミノ酸残 基からなる(アミノ酸:25-1021)。また、他の代� �的なアミノ酸配列としては、アミノ酸配列� �ータベース(UniProtKB/Swiss-Prot:Entry name CABC_PROV U、Primary accession number P59807、Protein name Chon droitin ABC endolyase 1 [Precursor])に記載されて� �るものが挙げられる。このアミノ酸配列も� �1021個のアミノ酸残基からなるが、米国特許� ��5,578,480号に記載されているアミノ酸配列と� ��2個のアミノ酸が相違する(694番:Q→E、738番:D →N)。さらに、米国特許出願公開第2006/0233782� ��のSEQ ID NO: 1に記載されたアミノ酸配列は� ��成熟タンパク質のものであるため、997個の� ��ミノ酸残基からなるが、米国特許第5,578,480� ��に記載されているアミノ酸配列のアミノ酸: 25-1021の範囲では、4個のアミノ酸が相違する( 154番:A→T、295番:I→T、694番:Q→E、738番:D→N)� �すなわち、米国特許第5,578,480号に記載され� �いるアミノ酸配列を基準として、少なくと� �4個のアミノ酸(例えば、154番、295番、694番、 738番)を他のアミノ酸に置換したものであっ� �も、同等のコンドロイチナーゼABC活性を持� �酵素と見なすことができる。
 さらに、本発明改善剤を製剤化した薬剤を� ��神経因性疼痛における改善効果が知られて� ��る他の薬剤と併用して治療を行うことも可� ��である。例えば、このような薬剤としては� ��下記例示のような、NSAIDsやオピオイド、鎮� ��補助薬が挙げられる。オピオイド鎮痛薬と� ��ては、モルヒネ、フェンタニル、オキシコ� ��ン、リン酸コデイン、ペチジン、ブプレノ� ��フィン、トラマドール、ペンタゾジン、ブ� ��ルファノールなどが挙げられる。また、鎮� ��補助薬としては、抗うつ剤である三環系(ア ミトリプチン、ノルトリプチン等)、四環系(� ��トラミド)、SSRI(パロキセチン、フルボキサ� ��ン)、SNRI(ミルナシプラン)、抗痙攣薬として は、カルバマゼピン、ラモトリジン、ゾニサ ミド、バルブロ酸、クロナゼパム等、抗攣縮 薬としてバクロフェン等、抗不整脈薬として 、リドカイン、メキシレチン等、NMDA受容体� �抗薬として、ケタミン、デキストロメトル� �ァン、アマンタジン、イフェンプロジル等� �ワクシニアウイルス接種家兎炎症皮膚抽出� �含有製剤としてノイロトロピンが挙げられ� �。また、最近注目されている、Caチャンネル ブロッカー(α2δサブユニットに結合する)で� �るガバペンチン(抗痙攣剤)とプレガバリンが 挙げられる。また、抗炎症作用を有する薬剤 、例えばコハク酸メチルプレドニゾロンナト リウム、デキサメタゾン、ベタメサゾン等の ステロイド剤やRhoキナーゼ阻害剤であるファ スジルと併用してもよい。