L'invention a pour objet un agent pour la stimulation des réactions de défenses naturelles des plantes, s'agissant tout particulièrement des plantes agronomiquement utiles et des plantes ornementales.

Elle a également pour objet l'utilisation dudit agent pour la stimulation en question et un procédé pour sa mise en oeuvre.

La stimulation des réactions de défenses naturelles des plantes reste toujours un problème des plus actuels et fait l'objet de nombreuses recherches.

Cette stimulation se traduit, dans le cas d'une plante ayant reconnu une agression par un agent pathogène tel qu'un virus, une bactérie, un champignon ou un insecte, par le développement d'un ensemble de modifications biologiques qui confèrent à cette plante un état de résistance permettant de localiser l'agresseur à son site d'attaque.

On connaît des produits appelés éliciteurs qui, mis au contact de la plante, sont capables de stimuler dans celle-ci les mmes réactions de défense que celles que développe la plante quant elle est attaquée par un agent pathogène.

Ces réactions de défense sont de plusieurs types rappelés ci-après : - accumulation d'antibiotiques naturels plus connus sous le nom de phytoalexines (par exemple, dans le cas du tabac, la scopolétine est une phytoalexine émettant une fluorescence bleue sous lumière ultra-violette), - épaississement des parois cellulaires par synthèse de lignine et de protéines de réticulation, - synthèse de protéines de défense du genre des protéines PR (Pathogenesis-Related) qui sont regroupées en différentes familles dont certaines possèdent des activités chitinase (famille PR3) ou glucanase (famille PR2), ou encore des enzymes des voies métaboliques secondaires telles que les orthodiphénol-0-méthyltranférases ou OMT qui sont impliquées dans la synthèse des phytoalexines et dans l'épaississement des parois,

- synthèse de messagers secondaires tels que l'acide salicylique impliqué, notamment dans le cas du tabac, dans la stimulation des isoformes acides des protéines PR et l'éthylène qui est impliqué, notamment dans le cas du tabac, dans la stimulation des isoformes basiques des protéines PR.

Parmi les susdits éliciteurs, on peut citer les oligo B 1-3 glucanes et notamment la laminarine qui élicitent chez diverses plantes agronomiquement utiles les réactions de défense en question ; les réponses maximales sont généralement atteintes lorsque les oligo 13 1-3 glucanes sont mis en oeuvre sous forme de compositions liquides dont la concentration en oligo 13 1-3 glucanes est de l'ordre de 200 mg/1 ; ces réponses se maintiennent à un niveau comparable jusqu'à des concentrations de l'ordre de 4 g/1 ; elles sont obtenues pour des quantités mises en oeuvre par hectare de 4 à 200 g.

Les recherches poursuivies par la Société Demanderesse lui ont déjà permis de montrer dans la demande de brevet français 02 02144 déposée le 20 février 2002 que, dans le cas des ß 1-3 glucanes et notamment de la laminarine qui est un glucane particulier dont le degré de polymérisation est de 20 à 30, de préférence de 23 à 25, il était possible, de façon tout à fait surprenante et inattendue, d'augmenter très sensiblement la faculté de stimulation des réactions de défense naturelles des plantes en les soumettant à une réaction de sulfatation chimique qui, dans le cas de la laminarine est conduite de façon à amener le degré de sulfatation à une valeur égale ou supérieure à 1,9 de préférence de 2 à 2,5.

Tenant compte de la demande toujours croissante de produits diversifiés et efficaces capables de stimuler les réactions de défense naturelles de plantes, la Société Demanderesse a le mérite d'avoir trouvé qu'un autre ß 1-3 glucane particulier, à savoir le curdlan sulfaté répondait à ce problème.

Le curdlan est un ß 1-3 glucane plus particulièrement un polymère du glucose de poids moléculaire élevé.

Il est isolé à partir de la bactérie Alcaligenes faecalis.

Sa formule brute est (C6H1005) dans laquelle n est un nombre entier de 50 à 150 et sa formule développée 1 est comme suit 1

Il se présente sous la forme de poudre pratiquement blanche et n'a pas d'odeur.

Il est utilisé comme agent stabilisant, épaississant, de gélification et autres.

Le sulfate de curdlan peut tre mis en oeuvre en tant qu'agent éliciteur sous la forme de compositions aqueuses dont la concentration en dérivé sulfaté est du mme ordre de grandeur que celle des agents éliciteurs à base de laminarine sulfatée ; de mme, la quantité de curdlan de sulfate qu'il convient d'appliquer par hectare est elle aussi du mme ordre que celle de laminarine sulfate devant tre appliquée par hectare.

Il s'ensuit que l'agent, conforme à l'invention, de stimulation des réactions de défense naturelles des plantes identifiées plus haut, est constitué par le sulfate de curdlan, dont le degré de sulfatation est de 1 à 2 et plus particulièrement d'environ 1,5, et dont la masse moléculaire déterminée par tamisage est de 32 kilodalton environ et dont le degré de polymérisation est de 50 à 150.

L'invention vise également l'utilisation du sulfate de curdlan en tant qu'agent de stimulation des réactions de défense naturelles des plantes.

Et elle vise enfin un procédé de stimulation des réactions de défense naturelles des plantes caractérisé par le fait que l'on applique sur les plantes à traiter une composition notamment aqueuse comportant, une concentration

WO 2005/082150 PCT/FR2005/000079 efficace de sulfate de curdlan et plus particulièrement d'au moins 10 mg/1, de préférence d'au moins 100 mg/1, et, plus préférentiellement encore, d'au moins 200 mg/1 en sulfate de curdlan de degré de sulfatation de 1 à 2, plus particulièrement de 1,5, cette composition étant appliquée aux cultures à traiter en une quantité suffisante pour apporter une quantité efficace, de préférence de 0,4 à 4 g de sulfate de curdlan par hectare.

La limite supérieure de la concentration en sulfate de curdlan des compositions mises en oeuvre conformément à l'invention n'est pas une donnée critique ; dans la pratique, une concentration supérieure à 200 mg/1 n'apporte aucun bénéfice supplémentaire.

Les travaux dont les résultats sont à la base de l'invention définie ci- dessus apparaissent à la lecture de l'exposé qui suit.

Pour ce qui est tout d'abord de la substance active proprement dite, en l'occurrence le sulfate de curdlan, elle peut tre obtenue de la manière décrite ci- après.

Le curdlan, qui est commercialisé par la société SIGMA ALDRICH Corp., St Louis, Missouri 63178 USA, peut tre préparé par fermentation à partir d'Alcaligenes faecalis.

La sulfatation du curdlan peut tre effectuée par mise en oeuvre des principes du procédé de sulfatation décrit dans la publication suivante : - Alban S, Kraus J, Franz G : Synthesis of laminarin sulfates with anticoagulant activity, Arzneim. Forsch. /drug Res (1992) 42 ; 1005-1008, ou par mise en oeuvre des principes d'un procédé perfectionné de sulfatation de la laminarine qui est décrit dans la thèse de Susanne Alban, soutenue en 1993 à l'Université de Regensburg et portant le titre « Synthese und physiologische Testung neuartiger Heparinoide ».

Ces procédés permettent d'obtenir un sulfate de curdlan hautement substitué, sans dégradation et avec une bonne reproductibilité sous de bonnes conditions du point de vue économique, tout en restant simples.

Pour aboutir à une sulfatation efficace du curdlan sans dégradation des chaînes polysaccharidiques, la réaction de sulfatation doit tre effectuée sous des conditions correspondant à une absence absolue d'eau.

Avant la sulfatation, le curdlan est dissous dans du diméthylformamide ou DMF. De par ses effets alternatifs sur le polysaccharide, le DMF a une influence activante sur la substitution. En effet, l'association du DMF polaire avec les groupes OH conduit à la coupure des liaisons hydrogène intra et inter moléculaires et à la désintégration des structures supérieures.

Pour mettre en oeuvre la réaction de sulfatation, on peut avoir recours avantageusement au complexe SO3-pyridine.

Par suite de la coordination de l'accepteur d'électrons S03 avec le donneur d'électrons pyridine, la réactivité difficilement contrôlable du S03 qui se traduit par des réactions fortement exothermiques entraînant des dégradations, se trouve réduite. Le complexe SO3-pyridine présente par rapport à d'autres complexes l'avantage d'tre ni trop réactif ni trop stable c'est-à-dire trop lent du point de vue réaction.

En raison du fait que le degré de sulfatation obtenu est proportionnel à l'excès molaire en réactif de sulfatation et étant donné que l'on cherche à obtenir un degré de substitution supérieur à 1, on met avantageusement en oeuvre une concentration de 6 moles de SO3-pyridine par mole de glucose.

Pour garantir l'absence d'eau, on peut travailler sous atmosphère d'argon.

De plus, dès le début de la réaction on ajoute de la pyridine au réactif de sulfatation et ce, en quantité équimolaire, en vue de capter directement l'acide sulfurique qui pourrait se former par réaction du complexe S03-pyridine avec l'eau. Tant la concentration du curdlan que celle du réactif de sulfatation doivent tre aussi élevées que possible, la solubilité du polysaccharide et du réactif de sulfatation, étant limitants. Pour éviter au début de la réaction un refroidissement du mélange qui pourrait entraîner des problèmes de solubilité et pour obtenir une substitution la plus régulière possible, la solution du complexe S03-pyridine dans le DMF pourrait ne pas tre ajoutée en une seule fois mais de manière continue pendant une durée de 4 heures.

WO 2005/082150 PCT/FR2005/000079 La réaction de sulfatation peut tre effectuée à une température de 20 à 60°C, de préférence d'environ 40°C. Des températures plus élevées entraînent une substitution plus efficace mais, également, une dégradation des chaînes.

Après l'addition du réactif de sulfatation, on continue à agiter le mélange pendant 6 heures à 60°C. A cette température, il se produit une substitution supplémentaire sans dégradation des chaînes.

Le surnageant du mélange est séparé par décantation. Le résidu est dissous dans 2,5 M de NaOH puis mélangé avec 10 fois son volume d'éthanol à 99%. Le précipité qui se produit à une température de 4-8°C pendant la nuit est isolé puis dissous dans de la soude diluée (solution de pH d'environ 9). La solution est dialysée pour enlever les sels et les molécules de bas poids moléculaire grâce une membrane de type Spectrapor à seuil de coupure 1000 D puis amenée à un pH de 7,0 par addition de NaOH et ensuite lyophilisée. Le sulfate de curdlan résultant se présente sous forme de sel de sodium.

Le poids moléculaire de la macromolécule est déterminé en tant que volume hydrodynamique par chromatographie sur gel avec mise en oeuvre d'un système dit « Fast Protein Liquid Chromatography » ou FPLC commercialisé par la Société Pharmacia. La détection du profil d'élution (éluant : 0, 1M NaCI avec 0,05% d'azide de sodium, 30ml/h) à l'aide d'un dispositif connu sous la marque Superdex 75HR10/30 (domaine de séparation 3-70kd) est effectuée par la mesure de l'indice de réfraction. Le sulfate de curdlan correspond à un pic étroit symétrique ; la largeur de ce pic est la mme pour le curdlan non sulfaté et pour le curdlan sulfaté ce qui suggère que la longueur de la chaîne reste la mme. Le poids moléculaire relatif est déterminé à l'aide d'une courbe standard avec des pullulans (polymère standard : 5800-853000 d, Polymer Laboratories, Separation Science Division). Par suite de la présence des groupes sulfates fortement hydratés, le volume hydrodynamique est supérieur à la masse moléculaire réelle.

Le degré de sulfatation est déterminé par voie de titration conductimétrique de l'acide libre du polysaccharide sulfaté en utilisant de la soude 0, 1N, ou par chromatographie ionique après hydrolyse en utilisant un système HPLC. La première méthode présente l'avantage d'tre également

WO 2005/082150 PCT/FR2005/000079 propre à des recherches relatives à la stabilité (la consommation de soude s'accroît lorsque des groupes sulfates sont éliminés) alors que la méthode HPLC nécessite moins de substance et peut tre automatisée. A titre de contrôle, il est possible de déterminer la teneur en soufre par analyse élémentaire.

Il est de plus possible de contrôler l'homogénéité de la sulfatation et la répartition des groupes sulfate sur les différentes positions dans la molécule de glucose par une forme modifiée de l'analyse de méthylation suivie d'un examen GC-MS (à savoir Chromatographie Gaz, Spectrométrie de Masse). La sulfatation est pratiquement totale, c'est-à-dire presque tous les groupes hydroxyle en position 6 sont sulfatés. Lors de la substitution des groupes OH secondaires, il n'y a pas de différence significative entre la sulfatation des groupes en position 2 et celle des groupes en position 4.

Le degré de sulfatation obtenu en procédant comme indiqué ci-dessus est de 1 à 2 plus particulièrement d'environ 1,5.

Le degré de polymérisation du sulfate de curdlan ainsi obtenu est de 50 à 150, plus précisément de 75 à 125.

Dans le cadre des susdits travaux, on a examiné la stimulation des réactions de défenses naturelles obtenue dans les plantes agronomiquement utiles et ornementales, et notamment dans le cas du tabac, en procédant au traitement desdites plantes par utilisation du curdlan sulfaté.

On a mis en oeuvre le curdlan sulfaté et à titre de comparaison la laminarine sulfatée du lot H11-S décrite dans le brevet 02 02 144 ainsi que l'eau.

Le traitement a été appliqué à des plantes entières, la variété de plante retenue étant Nicotiana tabacum cv. Samsun H qui porte le gène N.

On a traité des plantes entières par des compositions aqueuses comportant respectivement soit du curdlan sulfaté, soit de la laminarine sulfatée correspondant à la fraction H11-S, toutes deux à la concentration de 200 mg/1.

Le traitement consiste à infiltrer les susdites compositions aqueuses de curdlan sulfaté et de la fraction Hl 1-S dans le mésophylle des feuilles des plantes traitées.

L'infiltration est réalisée en perçant la feuille de tabac avec une aiguille puis en appliquant perpendiculairement au plan de la feuille une seringue contenant la solution à injecter. Immédiatement après l'injection, la zone d'infiltration, visible en éclairant la feuille par la face inférieure est délimitée à l'aide d'un stylo feutre.

Avec le curdlan sulfaté on observe une stimulation des réactions de défense similaires à celles décrites dans le susdit brevet français 02 02144 pour la fraction H 11-S ; ces réactions se sont traduites par une synthèse de protéines appelés protéines PR aux propriétés antimicrobiennes (figure 1), et par une synthèse d'un antibiotique appelé scopolétine (figure 2).

Du point de vue symptomatologique, on constate que les tissus infiltrés par le curdlan sulfaté présentent, tout comme les tissus infiltrés par la fraction H11-S, une dépigmentation légère. Celle-ci se traduit par une perte de la couleur verte au niveau des zones infiltrées.

Des tests de protection ont également été effectués. Le pathosystème utilisé est, comme indiqué plus haut, celui du tabac (Nicotiana tabacum cv Samsun H portant le gène N) et le virus de la mosaïque du tabac (VMT) L'inoculation du VMT à ces plants de tabac conduit à la formation de lésions nécrotiques.

Chaque lésion représente un site unique infectieux.

La résistance se mesure alors soit par une absence (ou diminution) du nombre des lésions, soit par une réduction de la taille des lésions.

Le protocole suivi pour mener cette expérimentation et les résultats obtenus sont décrits en rapport avec les figures 3 (réduction de la taille des lésions) et 4 (réduction du nombre des lésions).

On a mis en évidence que les tissus préalablement infiltrés par le curdlan sulfaté, présentent moins de lésions que les tissus traités par de l'eau ; la réduction du nombre des lésions est de l'ordre de 70 %.

Ces lésions sont plus petites (0,43 mm + 0,19) que celles des tissus infiltrés par l'eau (1,61 mm + 0,35) ; la réduction de la taille des lésions est de l'ordre de 75 %.

WO 2005/082150 PCT/FR2005/000079 Cette réduction de près de 70% du nombre de lésions et de près de 75% de la taille des lésions indique une très forte protection contre le VMT dans les zones infiltrées par le curdlan sulfaté.

Cette protection contre le VMT est presque aussi bonne que celle observée dans des tissus traités de la mme façon par une solution de la fraction H11-S, également à une concentration de 200, ug. mL l.

Plus particulièrement, on a déterminé le nombre et mesuré la taille (exprimée en mm) des lésions provoquées par le virus de la Mosaïque du tabac (VMT) dans les zones infiltrées respectivement par l'eau et par le curdlan sulfaté.

Sur les feuilles de plants de tabac (N tabacum cv Samsun H), deux zones sont infiltrées d'une part avec de l'eau, d'autre part avec une solution de curdlan sulfaté (200ug. L'').

Huit jours après l'infiltration, le VMT est inoculé sur les feuilles traitées.

Sept jours après l'inoculation du VMT, les lésions au niveau des zones préalablement infiltrées par l'eau ou le curdlan sulfaté sont dénombrées et leur taille est mesurée à l'aide d'un micromètre.

Les résultats résultent de la figure 3 pour ce qui est de la taille des lésions et de la figure 4 pour ce qui est du nombre des lésions.

Par ailleurs, au niveau des tissus infiltrés avec le curdlan sulfaté, on observe une fluorescence bleue sous lumière U. V.

Cette fluorescence est due à l'accumulation de scopolétine.

On a mesuré la quantité de scopolétine produite après traitement de feuilles de tabac (N tabacum cv Samsun H) par l'eau, par la fraction HI 1 S (200gg. mL"') et par le curdlan sulfaté (20011g. mL'').

Des échantillons de tissus non traités (NT) servant de contrôle du lot de plantes ont été également analysés.

Les tissus infiltrés ont été prélevés 3 jours après traitement pour doser la scopolétine par HPLC ; le résultat est exprimé en microgrammes par gramme de matière fraîche ou MF.

Les résultats enregistrés résultent de la figure 2.

WO 2005/082150 PCT/FR2005/000079 Ils montrent que la scopolétine s'accumule aussi fortement dans le cas de la composition à base de Ho 1 S que dans le cas de la composition à base de curdlan sulfaté. Ceci indique, concernant la scopolétine considérée comme un antibiotique, une mme capacité, s'agissant de la préparation à base de curdlan sulfaté et de la préparation à base de H 11 S, à induire un pouvoir anti-microbien.

On a de plus analysé par Western Blot (méthode décrite dans Baillieul F., de Ruffray P., Kauffmann S., « Molecular cloning and biologial activity of a-, (3- and y-megaspermin, three elicitins secreted by Phytophthora megasperma H20 », Plant Physiology (2003) 131,155-166) les protéines PR acides et basiques après traitement des feuilles de tabac (N tabacum cv Samsun H) par de l'eau (contrôle du traitement) par la fraction Hll-S (200pg. mL~l) et par le curdlan sulfaté (200pg. mL).

Des échantillons de tissus non traités (NT) servant de contrôle du lot de plantes ont été également analysés.

Les tissus infiltrés ont été prélevés 3 jours après traitement pour réaliser l'analyse par le Western Blot.

Les résultats de ces analyses résultent de la figure 1 qui montre l'induction des isoformes basiques des protéines PR1, PR2, PR3 et PR5 ainsi que celles des isoformes basiques des protéines PR1, PR2, PR3 et PR5 dans le cas des plantes infiltrées d'une part avec la composition ayant une concentration de 200 mg/1 en H11 S et d'autre part avec la composition ayant une concentration de 200 mg/1 en curdlan sulfaté. L'intensité de l'expression des protéines est proportionnelle à l'intensité des taches. Les traitements avec Hl 1 S ou le curdlan sulfaté induisent un niveau similaire d'expression des isoformes acides et basiques des protéines PR1, PR2, PR3 et PR5.

Ces résultats indiquent que la préparation de curdlan sulfaté induit un effet similaire d'induction de l'expression des isoformes acides et basiques des protéines PR1, PR2, PR3 et PR5. Ces protéines ayant des propriétés anti- microbiennes, ceci montre, comme dans le cas de la mesure de la scopolétine, que les préparations de Ho 1 S et de curdlan sulfaté présentent un mme pouvoir d'induire un état anti-microbien chez la plante.

Des expériences complémentaires montrent que les formes acides des protéines PR sont induites par le signal secondaire"acide salicylique"alors que les formes basiques sont induites par le signal secondaire"éthylène" Cela signifie que le traitement avec le curdlan sulfaté ou H11-S induit chez le tabac la production de ces deux signaux secondaires de défense.