НОВООБРАЗОВАНИЙ

Область техники

Изобретение относится к новым лекарственным средствам, которые обладают комплексным антиангиогенным и гипоксия-ориентированным цитотоксическим действием и могут найти применение в качестве средств таргетной терапии солидных злокачественных новообразований.

Предшествующий уровень техники

Проблема разработки эффективных средств для лечения онкологических заболеваний остается высоко актуальной для всего мирового сообщества. Так, в Российской Федерации в настоящее время на учёте с различными онкологическими заболеваниями состоит около 3,3 миллионов больных, нуждающихся в эффективном лечении. Но, несмотря на существенные успехи онкологии последних десятилетий, многие распространенные онкологические заболевания, по-прежнему, с трудом поддаются лечению. Например, рак молочной железы, ежегодно поражающий свыше 65 тысяч женщин в России, становится причиной смерти 35% заболевших, а летальность рака легких, которым ежегодно заболевает около 60 тысяч россиян, достигает 85% ( Каприн А.Д., Старинский В. В., Петрова В. Г. Злокачественные новообразования в России в 2015 году (заболеваемость и смертность) - М.: МНИОИ им. П.А. Герцена - филиал ФГБУ НМИРЦ М3 РФ, 2017).

По мнению многих специалистов, изменение сложившейся картины в лечении онкологических заболеваний возможно лишь с внедрением в клиническую практику эффективных таргетных противоопухолевых средств, в частности антиангиогенных, мишенью воздействия которых являются биохимические и патофизиологические процессы, специфичные для всех злокачественных новообразований или для их определенных видов ( Willett C.G., Duda D.G., di Tomaso E. et al. Complete pathological response to bevacizumab and chemoradiation in advanced rectal cancer. Nat. Clin. Pract. Oncol. 2007. 4(5): 316-21 ; Lein S., Lowman H.B. Therapeutic anti-VEFG antibodies. Handb. Exp. Pharmacol. 2008. 181 : 131-50).

Так, известен регорафениб, ингибитор протеинкиназ, применяющийся в таргетной терапии колоректального рака ( Grothey A., Van Cutsem Е., Sobrero A. et al. Regorafenib monotherapy for previously treated metastatic colorectal cancer (CORRECT): an international, multicenter, randomized, placebo-controlled, phase 3 trial. Lancet. 2013. 381(9863): 303-12).

Недостатком регорафениба, как и других антиангиогенных средств, является прогрессивное ослабевание противоопухолевого эффекта вследствие развития резистентности опухоли к его воздействию. Так, по данным клинических исследований увеличение периода выживания онкологических больных за счет применении антиангиогенных средств не превышает 1 года, а длительное подавление роста опухолей при монотерапии такими препаратами наблюдается крайне редко ( Frandsen S., Корр S., Wehland М. et al. Latest results for anti -angiogenic drugs in cancer treatment. Curr. Pharm. Des. 2016. 22(39): 5927-42).

Известен бевацизумаб, таргетный препарат, содержащий рекомбинантные моноклональные IgGl антитела, для лечения метастатического колоректального, овариального и других видов рака.

Недостатками бевацизумаба являются значительные ограничения к применению, связанные с побочными явлениями (перфорация ЖКТ, трудности при заживлении ран, кровоизлияние, артериальная тромбоэмболия, гипертензивный криз, обратимый лейкоэнцефалопатический синдром, нейтропения и инфекция, нефротический синдром, застойная сердечная недостаточность), а также его неспособность увеличивать общую выживаемость пациентов ( Rossi L., Verrico М., Zaccarelli Е., Papa A., Colonna M., Strudel M., Vici P., Bianco V, Tomao F. Bevacizumab in ovarian cancer: A critical review of phase III studies. Oncotarget. 2017 Feb 14; 8(7): 12389-12405).

Известно «Противоопухолевое средство» по патенту RU 2503450 Cl, ФГБУ МРНЦ Минздравсоцразвития России, 10.01.2014). Средство является эффективным ингибитором NOS, вызывает выраженное подавление роста и метастазирования ряда перевиваемых опухолей животных, обусловленное, главным образом, антиангиогенным, гипоксическим действием, на фоне которого снижается пролиферация и усиливается апоптоз опухолевых клеток. Недостатки: противоопухолевый эффект указанного средства реализуется преимущественно на раннем этапе развития опухоли. Поскольку весь молекулярный аппарат, участвующий в ангиогенезе, остаётся сохранным при действии этого средства, то его «отмена» сопровождается быстрой реваскуляризацией и возобновлением роста опухоли {Филимонова М.В., Южаков В. В., Шевченко Л. И. и др. Экспериментальное исследование противоопухолевой активности нового ингибитора синтаз оксида азота Т1023. Молек. мед. 2015. (1): 61-64).

Прототипом патентуемого изобретения является «Вазоконстрикторное средство» (RU 2475479 С1, ФГБУ МРНЦ Минздравсоцразвития России, 20.02.2013) с общей структурной формулой -

NH

(CH ₃ ) ₂ CHCON=C

. HBr

SR

где R= (СН ₃ ) ₂ СН;

- гидробромид 1-изобутаноил-2-изопропилизотиом� �чевины (далее - соединение Т1023). Соединение Т1023 является эффективным ингибитором NOS, вызывает выраженное вазоконстрикторное действие, способное создавать гипоксию в биологических тканях, в том числе в тканях опухоли.

Недостатком прототипа является снижение его противоопухолевой эффективности в отдаленные сроки после воздействия, что проявляется развитием гипоксической резистентности экспериментальных неоплазий: прогрессивным снижением активности апоптоза опухолевых клеток, ослаблением ингибирования роста опухолей и усилением их рецидивирующего роста.

Технический результат изобретения заключается в создании нового противоопухолевого средства, обладающего большей продолжительностью и выраженностью противоопухолевого действия, а также способного подавлять (или тормозить) развитие резистентности неоплазий.

Проведенные нами исследования подтверждают мнение ряда авторов, что одним из перспективных путей для преодоления гипоксической резистентности неоплазий является применение дихлорацетата в виде соли натрия (соединение Na- ДХА), который является ингибитором PDK1 и обладает свойствами гипоксия- ориентированного цитотоксина. В ряде экспериментальных работ показана способность соединения Na-ДХА подавлять развитие гипоксической резистентности опухолей на фоне терапии некоторыми фармакопейными антиангиогенными средствами ( Кобляков В. А. Гипоксия и гликолиз как возможные объекты противоопухолевого воздействия. Успехи молек. онкол. 2014, 2: 44-49; Duan Y., Zhao X, Ren W. et al. Antitumor activity of dichloroacetate on C6 glioma cell: in vitro and in vivo evaluation. Onco. Targets Ther. 2013. 6: 189-98; Kumar A., Kant S., Singh S. Antitumor and chemosensitizing action of dichloracetate implicates modulation of tumor microenvironment: A role of reorganized glucose metabolism, cell survival regulation and macrophage differentiation. Toxicol. Appl. Pharmacol. 2013. 273(1): 196- 208; Kumar K, Wigfield S, Gee HE, et al. Dichloroacetate reverses the hypoxic adaptation to bevacizumab and enhances its antitumor effects in mouse xenografts. J. Mol. Med. (Berl). 2013. 91(6): 749-58).

Раскрытие изобретения

Авторами показана целесообразность и перспективность совмещения Na- ДХА и соединения Т1023 с получением нового средства для таргетной терапии злокачественных новообразований. Средство содержит в качестве действующего вещества дихлорацетат 1-изобутаноил-2-изопропилизотиом� �чевины (далее в тексте - соединение Т1084) со структурной формулой:

При дозах действующего вещества 10-100 мг/кг оно обладает NOS- ингибирующей и PDK1 -ингибирующей активностью, и оказывает антиангиогенное и гипоксия-ориентированное цитотоксическое действие. Содержит 0,1-10% действующего вещества в составе растворов для инъекций или инфузий или содержит 1-50 мг действующего вещества в составе твердых лекарственных форм.

Технический результат - реализация в одном средстве обоих видов фармакологической активности - NOS-ингибирующего, антиангиогенного и гипоксия-ориентированного цитотоксического действия. Лучший вариант осуществления изобретения

Химический синтез соединения Т1084, которое получают из соединения Т1023, токсикологические свойства и противоопухолевая активность, а также достижение заявленного технического результата подробно описаны ниже.

1. Получение соединения Т1023

Смесь 6 г (40 ммоль) изобутаноилтиомочевины, 9,8 г (80 ммоль) изопропилбромида и 15 мл сухого ацетонитрила в запаянной ампуле нагревают на кипящей водяной бане в течение 20 часов. Растворитель упаривают, остаток отфильтровывают и перекристаллизовывают из 4-метил-2-пентанона. Выход 3,6 г (33%).

Т _пл 129-13ГС. Спектр ПМР (DMSO-d ₆ ) 6 1,1 (д, 6Н) ; 1,36 (д, 6Н); 2,73 (м, 1Н); 4,1 (м, 1Н); 10,9 (ушир.т, 2Н).

Вычислено, %: С 35,69; Н 6,37; N 10,41 C ₈ H ₁₆ N ₂ OS HBr

Найдено, %: С 35,76; Н 6,51; N 10,45

В результате получен гидробромид 1 -изобутаноил-2-изопропилизотиомо чевины.

2. Получение соединения Т1084

1,3 г гидробромида 1-изобутаноил-2-изопропилизотиом� �чевины растворяют в 10 мл воды, по каплям добавляют концентрированный водный раствор аммиака до pH 8 и экстрагируют дважды диэтиловым эфиром (2x10 мл). Сушат безводным Na ₂ S0 ₄ , а затем упаривают. Выход основания 0,7 г.

Растворяют основание в 5 мл диэтилового эфира и добавляют к нему раствор 0,5 г дихлоруксусной кислоты в 3 мл диэтилового эфира. Охлаждают. Выделившийся осадок отфильтровывают и перекристаллизовывают из гексана. Выход 0,8 г (68%).

T™ 67-69°С.

Вычислено, %: С 37,86; Н 5,72; N 8,83 C ₈ Hi ₆ N ₂ 0S C ₂ H ₂ Cl ₂ 0 ₂

Найдено, %: С 37,91 ; Н 6,09; N 9,04

В результате получают дихлорацетат 1 -изобутаноил-2-изопропилизотиомо чевины (соединение Т1084).

3. Определение токсичности соединения Т1084

Токсичность соединения Т1084 исследована на самцах белых беспородных мышей по тесту «острой» токсичности в возрасте 2-2,5 месяца с массой тела 22-25 г при однократном внутрибрюшинном введении (Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Часть первая / под ред. А.Н. Миронова - М.: Гриф и К, 2012). Рабочие растворы Т1084 изготавливали на основе 0,9% асептического раствора хлорида натрия (Дальхимфарм, РФ). Наблюдение за животными осуществляли в течение 14 суток. Расчет показателей «острой» токсичности проводили путем пробит-анализа по методу Литчфильда-Уилкоксона.

Результаты этих исследований показали, что, как и Т1023, соединение Т1084 по ГОСТ 12.1.007-76 относится к третьему классу токсичности и опасности (умеренно токсично). Показатель его средней смертельной дозы (ЛД50) составил для мышей 447±9 мг/кг (Табл. 1).

Таблица 1 - Показатели «острой» токсичности соединений Т1084 и Т1023 для аутбредных мышей при однократном внутрибрюшинном введении

Примечание. * - ранее полученные показатели «острой» токсичности Т1023

Сопоставление показателей «острой» токсичности соединения Т1084 с соответствующими показателями для Т1023, полученными ранее на таких же животных и при таком же способе введения, показывает, что их различие в молярном выражении не превышает 10%. Это свидетельствует, что изменение солеобразующей кислоты с гидробромида на дихлорацетат значимо не изменяет токсичность солей 1-изобутаноил-2-изопропилизотиом� �чевины, а отличия, наблюдаемые в показателях «острой» токсичности соединений Т1023 и Т1084 при выражении в мг/кг, практически полностью определяются различиями молекулярного веса этих соединений.

Ниже приведены результаты исследования активности полученного соединения Т1084 на двух моделях: солидной карциномы Эрлиха (КЭ) и модели рака шейки матки.

4. Противоопухолевая активность соединения Т1084 на модели солидной карциномы Эрлиха (КЭ)

Целью эксперимента являлось сравнительное изучение влияния соединений Т1023, Na-ДХА (ДХА в виде натриевой соли) и Т1084 при их хроническом применении на рост солидной КЭ у мышей. Исследование выполнено на 81 самке мышей-гибридов F (СВА х C ₅₇ Bl/6j) в возрасте 2-2,5 месяцев с массой тела 19-22 г, распределенных методом рандомизации в 4 экспериментальные группы: контрольную и три опытные, по 20- 21 особи в каждой. Всем животным трансплантировали КЭ по методике, описанной в Руководстве по проведению доклинических исследований лекарственных средств (2012). Контрольные животные в дальнейшем не получали каких-либо экспериментальных воздействий. Животным опытных групп с 6-х по 20-е сутки роста КЭ проводили ежедневое внутрибрюшинное (в/б) введение, соответственно, Т1023, и Т1084 в эквимолярных дозах: Т1023 - 60 мг/кг; Na-ДХА - 33,6 мг/кг; Т1084 - 70,7 мг/кг. Растворы Т1023 и Т1084 изготавливали на основе 0,9% асептического раствора хлорида натрия (Дальхимфарм, РФ), растворы Na-ДХА изготавливали на основе воды для инъекций (Дальхимфарм, РФ). Противоопухолевые эффекты изучали по методике, описанной в Руководстве по проведению доклинических исследований лекарственных средств (2012).

Результаты этого эксперимента показали, что при использованных схемах введения и дозах Т1023 и Na-ДХА оказывали сходное влияние на развитие КЭ (Табл. 2).

Таблица 2 - Влияние соединений Т1023, Na-ДХА и Т1084 в эквимолярных дозах на рост солидной карциномы Эрлиха у самок мышей F _\ (СВА х C _5-7 BI/6J)

Примечания. Показатели объема нормированы на исходный объем опухолей перед началом воздействий на 6-е сутки роста. ’ и - статистически достоверное различие (р < 0,05) по Q-критерию Данна с контрольной группой (7), с группой, получавшей Т1023 (2), и с группой, получавшей Na-ДХА (5). В группах п = 20-21. Практически в течение всего срока наблюдения действие этих соединений сопровождалось статистически достоверным противоопухолевым эффектом. Максимальный противоопухолевый эффект развивался к концу первой недели применения Т1023 и Na-ДХА, и проявлялся торможением роста КЭ примерно на 40%. Но в последующем противоопухолевая эффективность соединений Т1023 и Na-ДХА прогрессивно снижалась и на поздних сроках индекс ТРО составлял 21- 24% (около 50% от максимальной эффективности).

Начальные этапы развития противоопухолевого эффекта соединения Т1084 были подобны действию Т1023. Но нарастание противоопухолевого действия Т1084 было более продолжительным и достигало максимума к 10-м суткам от начала его применения. И в эти сроки противоопухолевый эффект Т1084 на уровне статистической тенденции (р = 0,12) на 20-25% превышал эффекты Т1023 и Na- ДХА. А в дальнейшем динамика противоопухолевого действия соединения Т1084 качественно отличалась от действия Т1023 и Na-ДХА. Если на поздних сроках торможение роста КЭ под влиянием Т1023 и Na-ДХА прогрессивно ослабевало, то действие Т1084 подавляло адаптацию опухоли к такому воздействию и поддерживало до конца наблюдения стабильное торможение роста опухоли на уровне 45-50% (90-100% от максимальной эффективности). И при этом на поздних сроках противоопухолевый эффект Т1084 статистически достоверно превосходил эффекты Т1023 и Na-ДХА.

Это отражает способность соединения Т1084 реализовать оба вида фармакологической активности - NOS-ингибирующее, антиангиогенное и гипоксия-ориентированное цитотоксическое действие.

5. Противоопухолевая активность соединения Т1084 на модели рака шейки матки

Целью эксперимента являлось сравнительное изучение влияния соединений Т1023, Na-ДХА и Т1084 при их хроническом применении на рост рака шейки матки (РШМ-5) у мышей.

Исследование выполнено на 74 самках мышей-гибридов Fi (СВА х Cs ₇ Bl/6j) в возрасте 2-2,5 месяцев с массой тела 19-22 г, распределенных методом рандомизации в 4 экспериментальные группы: контрольную и три опытные, по 18- 20 особей в каждой. Всем животным трансплантировали РШМ-5 в область латеральной поверхности правого бедра путем подкожного введения 2-10 ⁶ опухолевых клеток в 0,1 мл суспензии на основе среды 199 (Пан-Эко, РФ). Контрольные животные в дальнейшем не получали каких-либо экспериментальных воздействий. Животным опытных групп с 7-х по 21-е сутки роста РШМ-5 проводили ежедневое внутрибрюшинное введение Т1023, Na-ДХА и Т1084 в эквимолярных дозах - 60, 33,6 и 70,7 мг/кг, соответственно. Противоопухолевые эффекты изучали по методике, описанной в Руководстве по проведению доклинических исследований лекарственных средств (2012).

Результаты этого эксперимента показали, что использованная экспериментальная неоплазия была слабо чувствительна к действию Т1023 и Na- ДХА (Табл. 3). Кратковременный статистически достоверный противоопухолевый эффект развивался к 3-м суткам после начала применения соединений Т1023 и Na- ДХА, и проявлялся торможением роста РШМ у мышей этих групп на 30-35%.

Таблица 3 - Влияние Т1023, Na-ДХА и Т1084 в эквимолярных дозах на рост рака шейки матки РШМ-5 у самок мышей Fj (СВА х C ₅₇ Bl/6j)

Примечания. Показатели объема нормированы на исходный объем опухолей перед началом воздействий на 7-е сутки роста. ¹ ' ² и ³ - статистически достоверное различие (р < 0,05) по Q-критерию Данна с контрольной группой (7), с группой, получавшей Т1023 (2), и с группой, получавшей Na-ДХА (3). В группах п = 18-20.

Но в последующем неоплазия стремительно приобретала практически полную резистентность к действию этих соединений. Уже через 5-7 суток от начала применения Т1023 и Na-ДХА ингибирование роста РШМ-5 резко ослабевало, и до конца наблюдения их противоопухолевые эффекты полностью отсутствовали даже на уровне статистической тенденции.

В то же время, к действию Т1084 использованная экспериментальная опухоль была вполне чувствительной, и противоопухолевые эффекты этого соединения были существенно более выраженными и стабильными в сравнении с эффектами Т1023 и Na-ДХА. К 3-5-м суткам от начала применения Т1084 торможение роста РШМ достигало 45%. И в последующем, до конца курса инъекций Т1084 (по 21-е сутки) значимой адаптации опухоли к действию Т1084 не наблюдалось - ингибирование роста РШМ стабильно сохранялось на уровне 35-40% (80-90% от максимальной эффективности). Причем, противоопухолевое действие соединения Т1084 на РШМ-5 было не только стабильным, но и долгосрочным - как показано в Табл. 3, статистически достоверный эффект сохранялся и в течение последующих 5 суток после окончания применения Т1084.

Доказательство достижения технического результата

Технический результат патентуемого изобретения заключается в обеспечении более выраженного и стабильного противоопухолевого эффекта соединения Т1084 в сравнении с аналогами - гидробромидом 1 -изобутаноил-2- изопропилизотиомочевины (соединение Т1023) и натрия дихлорацетатом (соединение Na-ДХА), а также в подавлении (или торможении) развития резистентности неоплазий.

В приведенном эксперименте (см. п.4) установлено, что сочетанное применение ингибитора NOS соединений Т1023 и Na-ДХА сопровождается более выраженным и стабильным противоопухолевым действием на солидную КЭ мышей и подавляет развитие резистентности карциномы к действию Т1023 и Na-ДХА. Полученный результат свидетельствует, что два однонаправленных (противоопухолевых) вида фармакологической активности - ХОБ-ингибирующее антиангиогенное действие Т1023 и PDK1 -ингибирующее гипоксия- ориентированное цитотоксическое действие ДХА, способны к фармакодинамическому синергическому взаимодействию. И в этой связи, сочетание этих видов фармакологической активности, реализуемых по различным механизмам, является перспективным подходом для разработки эффективных комплексных средств и методов таргетной терапии онкологических заболеваний. В токсикологических исследованиях установлено (см. п.З), что замена солеобразующей кислоты с гидробромида (Т1023) на дихлорацетат (Т1084) не изменяет «острую» токсичность солей 1-изобутаноил-2-изоприлизотиомоч� �вины, и, формально, не повышает риски негативных эффектов в случае применения Т1084 в качестве лекарственного средства. При этом в исследованиях на двух опухолевых моделях - солидной карциноме Эрлиха (см. п. 4) и раке шейки матки РШМ-5 (см. п.5) у мышей соединение Т1084 проявляло существенно более выраженную и стабильную противоопухолевую активность в сравнении с Т1023 и Na-ДХА. На обеих опухолевых моделях хроническое воздействие Т1023 и Na-ДХА сопровождалось развитием резистентности опухолей к их действию.

В целом, на обеих использованных опухолевых моделях действие соединения Т1084 качественно воспроизводило эффекты, наблюдавшиеся при сочетанном применении рассмотренных соединений Т1023 и Na-ДХА. Следовательно, соединение, содержащее в качестве действующего вещества дихлорацетат 1-изобутаноил-2-изопропилизотиом� �чевины, можно рассматривать как комбинированное средство таргетной терапии злокачественных новообразований, что открывает новые возможности для разработки более эффективных фармакологических противоопухолевых средств.