Die Erfindung betrifft Substanzen zur Anwendung bei der Therapie oder Diagnose von viralen Infektionen, Infektionskrankheiten und/oder B-Zell-abhängigen Krankheiten, Arznei- und Diagnosemittel, Antikörper, variable Antikörper-Schwerketten-(V _H )-Domänen, variable Antikörper- Leichtketten-(V|_)-Domänen, isolierte Nukleinsäuren, B-Zelllinien und ein Verfahren zur Herstellung von Antikörpern. CEACAM1 (Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 1 ) ist ein humanes Gly- koprotein, welches ebenfalls unter der Bezeichnung CD66a (Cluster of Differentiation 66a) bekannt ist. Es gehört zur der„carcinoembryonic antigen" Gen-Familie. Dieser Familie gehören zwei Untergruppen an, nämlich die Untergruppe der Zelladhäsionsmoleküle, zu welchen das CEACAM1 zählt, sowie die Untergruppe der schwangerschaftsspezifischen Glykoproteine. Es ist bekannt, dass es sich bei CEACAM 1 um ein spezielles Zell-Zell-Adhäsionsmolekül handelt, welches auf Leukozyten, Epithelzellen und Endothelzellen vorhanden ist. Zellen, die CEACAM1 auf ihrer Oberfläche exprimieren, geben dieses aber auch in die Blutbahn ab. Das Glykoprotein vermittelt die Zelladhäsion mittels homophiler oder heterophiler Bindung zu anderen Proteinen der Zelladhäsionsmolekül-Untergruppe. Es ist weiterhin bekannt, dass diverse Zellaktivitäten, wie beispielsweise die Differenzierung und Anordnung von dreidimensionalen Gewebestrukturen, die Angiogenese, die Apoptose, die Tumorsuppression und die Metastase, durch CEACAM1 beeinflusst werden kann.

Die Publikation von Singer et al. („Adhesion Molecule 1 Expression and Carcinoembryonic Anti- gen-Related Cell Signaling in Human, Mouse, and Rat Leukocytes: Evidence for Replacement of the Short Cytoplasmic Domain Isoform by Glycosylphosphatidylinositol-Linked Proteins in Human Leukocytes", Bernhard B. Singer, Inka Scheffrahn, Robert Heymann, Kristmundur Sig- mundsson, Robert Kammerer und Björn Öbrink, The Journal of Immunology (2002), Vol. 168, 5139-5146) beschäftigt sich mit Expressionsuntersuchungen von CEACAM 1 auf Leukozyten von Menschen, Mäusen sowie Ratten. Die Publikation von Greicius et al. („CEACAM 1 is a Potent Regulator of B Cell Receptor Com- plexinduced Activation", Gediminas Greicius, Eva Severinson, Nicole Beauchemin, Björn Öbrink und Bernhard B. Singer, Journal of Leukocyte Biology (2003), Vol. 74, 126-134) erwähnt, dass CEACAM1 das Tumorwachstum von epithelialen Zellen, die Angiogenese, die NK- Zellzytotoxizität sowie die T-Zellzytotoxizität reguliert.

Die Publikation von Chen et al. („Editorial: CEACAM1 : fine-tuned for fine-tuning", Zhangguo Chen, Lanfen Chen und Richard S. Blumberg, Journal of Leukocyte Biology (2009), Vol. 86, 195-197) unterstreicht die Bedeutung von CEACAM1 in Bezug auf Tumorgenese, Angiogenese und Metabolismus. Die Publikation von Lobo et al. („Pivotal Advance: CEACAM1 is a Negative Coreceptor for the B Cell Receptor and Promotes CD19-mediated Adhesion of B Cells in a PI3K-dependent Manner", Elizabeth O. Lobo, Zhifang Zhang und John E. Shively, Journal of Leukocyte Biology (2009), Vol. 86, 205-218) offenbart, dass CEACAM1 ein negativer Rezeptor für den sogenannten B-Zellen-Rezeptor (BCR) darstellt. Die Publikation von Blau et al. („Targeted Disruption of the Ceacam l (MHVR) Gene Leads to Reduced Susceptibility of Mice to Mouse Hepatitis Virus Infection", Dianna M. Blau, Ciaire Tur- bide, Michel Tremblay, Melanie Olson, Stephanie Letourneau, Eva Michaliszyn, Serge Jothy, Kathryn V. Holmes und Nicole Beauchemin, Journal of Virology (2001 ), Vol. 75, 8173-8186) offenbart, dass CEACAM1 -Knockout-Mäuse weniger anfällig für eine Hepatitisinfektion sind. WO 2005/058358 A2 offenbart von CEACAM 1 abgeleitete Fusionsproteine im Zusammenhang von entzündlichen Erkrankungen.

Die US 8,598,322 B2 sowie die WO 2013/054331 A1 offenbaren jeweils Anti-CEACAM1 - Antikörper sowie deren Verwendung zur Behandlung von Krebs.

Die WO 2013/082366 A1 offenbart CEACAM1 -Antikörper für die Tumorbehandlung, insbeson- dere Krebsbehandlung.

Die WO 2013/054331 A1 thematisiert CEACAM1 -Antikörper im Kontext der Behandlung von viralen Infektionen und Krebserkrankungen.

In der WO 2014/022332 A1 wird eine Zusammensetzung beschrieben, welche die Interaktion zwischen TI M3 und CEACAM1 moduliert. Der potentielle Nutzen von CEACAM1 als sogenanntes therapeutisches Target (therapeutische Zielsubstanz) ist somit zwar grundsätzlich erkannt worden. Gleichwohl sind bislang viele Fragen bezüglich einer therapeutischen Verwendbarkeit von CEACAM 1 als Target noch nicht geklärt. Insbesondere gibt es bislang widersprüchliche Daten, ob CEACAM 1 auf B-Zellen exprimiert wird und inwieweit CEACAM1 -bindende Substanzen, insbesondere Antikörper, in der Lage sind, B-Zellen in vitro zu beeinflussen.

Es besteht daher weiterhin ein großer Bedarf an der Entwicklung von therapeutisch wirksamen Substanzen, deren therapeutisches Target CEACAM1 darstellt. Ein entsprechender Bedarf besteht dabei insbesondere für die Indikationsgebiete virale Infektionen, virale Infektionskrankhei- ten sowie B-Zell-abhängige Krankheiten.

Entsprechend lag der vorliegenden Erfindung die Aufgabe zugrunde, therapeutische Substanzen bereitzustellen, welche sich insbesondere für die Therapie von viralen Infektionen, viralen Infektionskrankheiten sowie B-Zell-abhängigen Krankheiten eignen. Weiterhin lag der vorliegenden Erfindung die Aufgabe zugrunde, Substanzen zur Anwendung bei der Diagnose von insbesondere viralen Infektionen, viralen Infektionskrankheiten sowie B-Zell-abhängigen Krankheiten bereitzustellen.

Diese Aufgaben werden erfindungsgemäß gelöst durch eine Substanz gemäß unabhängigem Anspruch 1 , ein Arzneimittel gemäß Anspruch 1 1 , einen Antikörper gemäß unabhängigem Anspruch 12, einen therapeutischen Antikörper gemäß unabhängigem Anspruch 13, eine variable Antikörper-Schwerketten-(V _H )-Domäne gemäß unabhängigem Anspruch 14, eine variable Anti- körper-Leichtketten-(V|_)-Domäne gemäß unabhängigem Anspruch 15, isolierte Nukleinsäuren gemäß den unabhängigen Ansprüchen 16 und 17, eine B-Zelllinie gemäß Anspruch 18 sowie ein Verfahren gemäß Anspruch 19. Bevorzugte Ausführungsformen sind in den abhängigen Ansprüchen 2 bis 9 definiert. Der Wortlaut sämtlicher Ansprüche wird hiermit durch ausdrückli- che Bezugnahme zum Inhalt der vorliegenden Beschreibung gemacht.

Weiterhin werden die der Erfindung zugrundeliegenden Aufgaben durch die in der Beschreibung offenbarten Erfindungsgegenstände gelöst.

Die Erfindung beruht auf den folgenden überraschenden Befunden:

Überraschenderweise konnte festgestellt werden, dass eine Aktivierung von CEACAM 1 in Mäu- sen eine Aktivierung und insbesondere Differenzierung von B-Zellen bewirkt und weiterhin insbesondere eine positive Beeinflussung des Verlaufs von viralen Infektionen sowie Infektions- krankheiten ermöglicht. Als Virusmodelle werden das lymphozytäre Choriomeningitis Virus (LCMV) und das vesikuläre Stomatitis Virus (VSV) verwendet. Das LCMV ist in der Maus nicht zytopathisch. Somit wird der Schaden, der bei einer Infektion entsteht, in erster Linie durch die Immunantwort gegen das Virus verursacht. Damit verhält sich dieses Virus ähnlich wie die schwach zytopathischen Viren Hepatitis-B-Virus (HBV), Hepatitis-C-Virus (HCV) und Humanes Immundefizienz-Virus (HIV) im Menschen. Das vesikuläre Stomatitis Virus ist in der Maus zytopathisch. Es verhält sich daher ähnlich dem Ebola-Virus, Poliovirus, Rabiesvirus, Ebstein-Barr- Virus (EBV), Influenza-Virus, Herpes-Simplex-Virus sowie Cytomegalievirus (CMV).

Weiterhin konnte im Rahmen von Mäuseversuchen überraschenderweise nachgewiesen wer- den, dass eine Inhibierung von CEACAM 1 in vivo die Aktivierung und Differenzierung bzw. Entwicklung von B-Zellen stark inhibiert und insbesondere den Ausbruch einer B-Zellabhängigen Autoimmunität verhindert. Hierzu wurde bei Mäusen eine B-Zell-abhängige Auto- immunität mittels Pristan induziert. Dabei stellte sich heraus, dass eine Inhibierung von CEACAM1 eine Erkrankung der Mäuse verhinderte. Des Weiteren konnte der Erfinder nach- weisen, dass eine Inhibierung von CEACAM 1 zu reduzierten Serum-lgE-Konzentrationen führte.

Der Ausdruck„Expression" umfasst im Sinne der vorliegenden Erfindung alle Prozesse, welche für eine vollständige, d. h. funktionsfähige, Ausprägung des Proteins CEACAM 1 erforderlich sind. So umfasst der Ausdruck„Expression" im Sinne der vorliegenden Erfindung insbesondere die Transkription, die nachfolgende RNA-Prozessierung, die Translation sowie die Proteinreifung, wie beispielsweise Proteinfaltung und posttranslationale Modifikationen, von CEACAM 1 .

Der Ausdruck„Funktion von CEACAM 1 " definiert im Sinne der vorliegenden Erfindung die physiologische Funktion bzw. die physiologischen Funktionen von CEACAM1 , insbesondere dessen Befähigung, die Aktivität und insbesondere Differenzierung von B-Zellen zu beeinflussen. Die im Rahmen der vorliegenden Erfindung offenbarten Antikörper besitzen jeweils eine für Antikörper charakteristische Struktur: Sie weisen jeweils zwei identische schwere Polypeptidketten und zwei identische leichte Polypeptidketten auf, welche durch kovalente Disulfidbindungen zu einer Y-förmigen Struktur miteinander verknüpft sind. Die leichten Ketten bestehen aus jeweils einer variablen Domäne, nachfolgend als variable Antikörper-Leichtketten-(V _L )-Domäne be- zeichnet, und einer konstanten Domäne, nachfolgend als konstante Antikörper-Leichtketten- (Ci_)-Domäne bezeichnet. Die schweren Ketten hingegen haben jeweils eine variable Domäne, nachfolgend als variable Antikörper-Schwerketten-(V _H )-Domäne bezeichnet, und drei konstante Domänen, nachfolgend als konstante Antikörper-Schwerketten-(C _H )-Domänen bezeichnet. Wenn daher im Rahmen der vorliegenden Erfindung von einer variablen Antikörper- Schwerketten-(V _H )-Domäne des Antikörpers oder einer variablen Antikörper-Leichtketten-(V _L )- Domäne des Antikörpers die Rede ist, so bedeutet dies, dass der Antikörper insgesamt zwei variable Antikörper-Schwerketten-(V _H )-Domänen, nämlich eine variable Antikörper- Schwerketten-(V _H )-Domäne pro schwere Kette, bzw. zwei variable Antikörper-Leichtketten-(V _L )- Domänen, nämlich eine variable Antikörper-Leichtketten-(V _L )-Domäne pro leichte Kette, mit den im Folgenden offenbarten Merkmalen aufweist. Entsprechendes gilt sinngemäß, wenn im Folgenden von einer konstanten Antikörper-Leichtketten-(C _L )-Domäne des Antikörpers die Rede ist. Wenn im Folgenden von konstanten Antikörper-Schwerketten-(C _H )-Domänen des Antikör- pers die Rede ist, so sind damit die konstanten Antikörper-Schwerketten-(C _H )-Domänen von beiden schweren Ketten des Antikörpers gemeint.

Gemäß einem ersten Aspekt schlägt die Erfindung eine Substanz zur Anwendung bei der Therapie, d.h. Behandlung und/oder Vorbeugung, von viralen Infektionen und/oder viralen Infektionskrankheiten, vorzugsweise beim Menschen oder nichthumanen Tier, vor. Die Substanz kann insbesondere zur Anwendung bei der Impfung gegen virale Infektionskrankheiten vorgesehen sein bzw. zur Impfung gegen virale Infektionskrankheiten verwendet werden.

Die Substanz zeichnet sich besonders dadurch aus, dass sie CEACAM1 , bevorzugt die Expression und/oder Funktion von CEACAM1 , aktiviert.

Vorzugsweise handelt es sich bei dem CEACAM1 um CEACAM1 gemäß SEQ I D Nr. 1 . In einer alternativen Ausführungsform handelt es sich bei dem CEACAM1 um CEACAM 1 gemäß SEQ ID Nr. 2. Das CEACAM 1 gemäß SEQ ID Nr. 2 besitzt im Unterschied zu dem CEACAM1 gemäß SEQ ID Nr.1 eine sogenannte lnterleukin-2 sekretorische Sequenz (IL-2 se- cretory sequence). Diese Sequenz führt dazu, dass das Protein den sekretorischen Weg einschlägt und somit von Zellen sezerniert wird. Ohne diese Modifikation würde das Protein nicht sezerniert werden.

Eine Aktivierung der Expression und/oder Funktion von CEACAM1 durch die erfindungsgemäß vorgesehene Substanz kann in unterschiedlicher weise erfolgen.

Erfindungsgemäß kann es beispielsweise vorgesehen sein, dass die Substanz die Expression von CEACAM1 auf Nukleinsäureebene aktiviert. Weiterhin kann es vorgesehen sein, dass die Substanz die Expression von CEACAM 1 durch Aktivierung eines endogenen CEACAM1 -Promotors aktiviert.

Des Weiteren kann es vorgesehen sein, dass die Substanz die Expression von CEACAM 1 auf mRNA-Ebene aktiviert. Ferner kann es erfindungsgemäß vorgesehen sein, dass die Substanz eine Aktivierung von CEACAM1 auf Proteinebene bewirkt.

In einer weiteren Ausführungsform handelt es sich bei der Substanz um ein Polynukleotid, welches ein Polypeptid bzw. Protein codiert, wobei das Polypeptid bzw. Protein die Expression und/oder Funktion von CEACAM1 aktiviert. Die erfindungsgemäß vorgesehene Substanz bindet bevorzugt, insbesondere unter Ausbildung einer Kreuzvernetzung, an CEACAM1 . Die Kreuzvernetzung führt dazu, dass sich CEACAM1 - Moleküle in der Membran zusammenlagern und durch Interaktion mit sich selbst oder anderen Signalproteinen ihre Wirkung in der Zelle entfalten.

In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei der Substanz um eine gegen CEACAM1 gerichtete Substanz.

Die Substanz kann weiterhin insbesondere gegen Inhibitoren, biologische Vorläufer und/oder Varianten, insbesondere Isoformen, von CEACAM1 gerichtet sein.

Grundsätzlich kann die Substanz ausgewählt sein aus der Gruppe bestehend aus Antisense- RNA, Aptamere, Spiegel-Aptamere, Antikörper, lösliche Bindungspartner, insbesondere lösliche Liganden, von CEACAM1 , löslichen Rezeptoren, siRNA (small interfering RNA), shRNA (small hairpin RNA), siRNA-haltige Partikel (wie siRNA-haltige Calciumphosphat-Partikel), shRNA- haltige Partikel (wie shRNA-haltige Calciumphosphat-Partikel), siRNA-haltige Vesikel (wie siRNA-haltige Liposomen), shRNA-haltige Vesikel (wie siRNA-haltige Liposomen) und Ribozy- me. Bevorzugt liegen die siRNA und shRNA in den siRNA-haltigen Partikel und shRNA-haltigen Partikel verpackt vor.

Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei der Substanz um einen gegen CEACAM1 gerichteten Antikörper (aktivierender Antikörper). Bei dem Antikörper handelt es sich in einer weiteren Ausführungsform um einen murinen Antikörper oder leporinen Antikörper. Mit anderen Worten kann es erfindungsgemäß bevorzugt sein, wenn es sich bei dem Antikörper um einen Kaninchen-Antikörper, Maus-Antikörper oder Ratten-Antikörper handelt, d. h. um einen Antikörper, welcher von einem Kaninchen, einer Maus oder einer Ratte hergestellt worden ist.

Der Antikörper kann insbesondere eine variable Antikörper-Schwerketten-(V _H )-Domäne aufweisen, welche ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus variable Antikörper-Schwerketten- (V _H )-Domäne murinen Ursprungs und variable Antikörper-Schwerketten-(V _H )-Domäne leporinen Ursprungs. Mit anderen Worten kann es erfindungsgemäß insbesondere vorgesehen sein, dass der Antikörper eine variable Antikörper-Schwerketten-(V _H )-Domäne aufweist, welche von einer Maus, einer Ratte oder einem Kaninchen hergestellt worden ist.

Weiterhin kann der Antikörper insbesondere eine variable Antikörper-Leichtketten-(V _L )-Domäne aufweisen, welche ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus variable Antikörper- Leichtkette-(V|_)-Domäne murinen Ursprungs und variable Antikörper-Leichtkette-(V _L )-Domäne leporinen Ursprungs. Mit anderen Worten kann es erfindungsgemäß insbesondere vorgesehen sein, dass der Antikörper eine variable Antikörper-Leichtketten-(V _L )-Domäne aufweist, welche von einer Maus, einer Ratte oder einem Kaninchen hergestellt worden ist.

Zur Verbesserung der Verträglichkeit des Antikörpers kann es in einer weiteren Ausführungsform vorgesehen sein, dass der Antikörper konstante Antikörper-Schwerketten-(C _H )-Domänen humanen Ursprungs und/oder eine konstante Antikörper-Leichtketten-(C _L )-Domäne humanen Ursprungs aufweist.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem Antikörper um einen humanisierten Antikörper. Bei dieser Ausführungsform sind die konstanten Antikörper- Schwerketten-(C _H )-Domäne sowie die konstante Antikörper-Leichtketten-(C _L )-Domäne des An- tikörpers jeweils humanen Ursprungs, wohingegen die variable Antikörper-Schwerketten-(V _H )- Domäne und variable Antikörper-Leichtketten-(V _L )-Domäne des Antikörpers jeweils xenogenen, insbesondere murinen oder leporinen, Ursprungs sind.

Der Antikörper weist vorzugsweise eine variable Antikörper-Schwerketten-(V _H )-Domäne auf, welche ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus variable Antikörper-Schwerketten-(V _H )- Domäne gemäß SEQ ID Nr. 3, variable Antikörper-Schwerketten-(V _H )-Domäne gemäß SEQ ID Nr. 7 und variable Antikörper-Schwerketten-(V _H )-Domäne gemäß SEQ ID Nr. 1 1 . In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform weist der Antikörper eine variable Antikörper- Leichtketten-(V|_)-Domäne auf, welche ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus variable Antikörper-Leichtketten-(V _L )-Domäne gemäß SEQ ID Nr. 5, variable Antikörper-Leichtketten- (V _L )-Domäne gemäß SEQ ID Nr. 9 und variable Antikörper-Leichtketten-(V _L )-Domäne gemäß SEQ ID Nr. 13.

Besonders bevorzugt weist der Antikörper eine variable Antikörper-Schwerketten-(V _H )-Domäne gemäß SEQ ID Nr. 3 und eine variable Antikörper-Leichtketten-(V _L )-Domäne gemäß SEQ I D Nr. 5 auf.

In einer alternativen Ausführungsform weist der Antikörper eine variable Antikörper- Schwerketten-(V _H )-Domäne gemäß SEQ ID Nr. 7 und eine variable Antikörper-Leichtketten- (V _L )-Domäne gemäß SEQ ID Nr. 9 auf.

Gemäß einer weiteren alternativen Ausführungsform weist der Antikörper eine variable Antikör- per-Schwerketten-(V _H )-Domäne gemäß SEQ ID Nr. 1 1 und eine variable Antikörper- Leichtketten-(V _L )-Domäne gemäß SEQ I D Nr. 13 auf. In einer bevorzugten Ausführungsform weist der Antikörper eine variable Antikörper- Schwerketten-(V _H )-Domäne auf, welche durch eine Nukleotidsequenz codiert ist, welche ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus SEQ I D Nr. 4, SEQ I D Nr. 8 und SEQ I D Nr. 12.

Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform weist der Antikörper eine variable Antikörper-Leichtketten (V _L )-Domäne auf, welche durch eine Nukleotidsequenz codiert ist, welche ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nr. 6, SEQ ID Nr. 10 und SEQ I D Nr. 14.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform weist der Antikörper eine variable Antikörper- Schwerketten-(V _H )-Domäne, welche durch eine Nukleotidsequenz gemäß SEQ I D Nr. 4 codiert ist, und eine variable Antikörper-Leichtketten-(V _L )-Domäne, welche durch eine Nukleotidsequenz gemäß SEQ I D Nr. 6 codiert ist, auf. Gemäß einer alternativen Ausführungsform weist der Antikörper eine variable Antikörper- Schwerketten-(V _H )-Domäne, welche durch eine Nukleotidsequenz gemäß SEQ I D Nr. 8 codiert ist, und eine variable Antikörper-Leichtketten-(V _L )-Domäne, welche durch eine Nukleotidsequenz gemäß SEQ I D Nr. 10 codiert ist, auf. Gemäß einer weiteren alternativen Ausführungsform weist der Antikörper eine variable Antikör- per-Schwerketten-(V _H )-Domäne, welche durch eine Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID Nr. 12 codiert ist, und eine variable Antikörper-Leichtketten-(V _L )-Domäne, welche durch eine Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID Nr. 14 codiert ist, auf. Weiterhin handelt es sich bei dem Antikörper vorzugsweise um einen monoklonalen Antikörper.

Bei dem Antikörper kann es sich in einer weiteren Ausführungsform um einen Antikörper handeln, welcher von einer B-Zell-Hybridomlinie (B-Zellklon) produziert wird, welche ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus 6G5J, B3-17 und 18-20.

Gemäß weiteren Ausführungsformen kann es sich bei der erfindungsgemäß vorgesehenen Substanz um einen natürlichen Bindungspartner von CEACAM 1 oder um eine modifizierte Form eines solchen Bindungspartners handeln. Beispielsweise kann die Substanz ausgewählt sein aus der Gruppe bestehend aus lösliches UspA1 Protein von Moraxella catarrhalis, modifiziertes UspA1 Protein von Moraxella catarrhalis, lösliches Opa Protein von Neisseria gonorrhoeae, modifiziertes Opa Protein von Neisseria gonorrhoeae, lösliches variables P5 Protein von Ha- emophilus influenzae, modifiziertes variables P5 Protein von Haemophilus influenzae, modifiziertes Tim3, modifiziertes Glykoprotein des Hepatitisvirus, modifiziertes Salmonella- Oberflächenprotein und modifiziertes Escherichia coli-Oberflächenprotein.

In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei der Substanz um das lösliche Protein UspA1 von Moraxella catarrhalis gemäß SEQ I D Nr. 15. In einer weiteren Ausführungsform handelt es sich bei der Substanz um das lösliche Protein UspA1 von Moraxella catarrhalis, welches durch eine Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID Nr. 16 codiert wird.

In einer weiteren Ausführungsform handelt es sich bei der Substanz um das lösliche Protein Opa von Neisseria gonorrhoeae gemäß SEQ I D Nr. 17. In einer weiteren Ausführungsform handelt es sich bei der Substanz um das lösliche variable Protein P5 von Haemophilus influenzae gemäß SEQ ID Nr. 18.

In einer weiteren Ausführungsform handelt es sich bei der Substanz um das lösliche, humane, rekombinante CEACAM1 -Fusionsprotein gemäß SEQ I D Nr. 19. In einer weiteren Ausführungsform handelt es sich bei der Substanz um das lösliche, humane, rekombinante CEACAM1 -Fusionsprotein, welches durch eine Nukleotidsequenz gemäß SEQ I D Nr. 20 codiert wird.

Die viralen Infektionen bzw. Infektionskrankheiten sind vorzugsweise ausgewählt aus der Grup- pe bestehend aus virale Hepatitis, Hepatitis B, Hepatitis C, HIV-Infektion, Aids, Influenza, Poliomyelitis, virusinduzierte Myokarditis, Epstein-Barr-Virus-Infektionen bzw. -Infektionskrankheiten wie Pfeiffer-Drüsenfieber, Herpes simplex, Zytomegalie, Tollwut und Ebola.

Gemäß einem zweiten Aspekt betrifft die Erfindung eine Substanz zur Anwendung bei der The- rapie, d.h. Behandlung und/oder Vorbeugung, von B-Zell-abhängigen Krankheiten, vorzugsweise beim Menschen oder nichthumanen Tier.

Die Substanz zeichnet sich besonders dadurch aus, dass sie CEACAM1 , bevorzugt die Expression und/oder Funktion von CEACAM1 , inhibiert.

Eine Inhibierung der Expression und/oder Funktion von CEACAM1 durch die erfindungsgemäß vorgesehene Substanz kann in unterschiedlicher Weise erfolgen.

Erfindungsgemäß kann es beispielsweise vorgesehen sein, dass die Substanz die Expression von CEACAM1 auf Nukleinsäureebene inhibiert.

Weiterhin kann es vorgesehen sein, dass die Substanz die Expression von CEACAM 1 durch Aktivierung eines endogenen CEACAM1 -Promotors inhibiert. Des Weiteren kann es vorgesehen sein, dass die Substanz die Expression von CEACAM 1 auf mRNA-Ebene inhibiert.

Ferner kann es erfindungsgemäß vorgesehen sein, dass die Substanz eine Inhibierung von CEACAM1 auf Proteinebene bewirkt.

In einer weiteren Ausführungsform handelt es sich bei der Substanz um ein Polynukleotid, welches ein Polypeptid bzw. Protein codiert, wobei das Polypeptid bzw. Protein die Expression und/oder Funktion von CEACAM 1 inhibiert. Bei den B-Zell-abhängigen Krankheiten handelt es sich vorzugsweise um Autoimmunkrankheiten und/oder entzündliche Krankheiten.

Bevorzugt sind die Autoimmunkrankheiten bzw. entzündlichen Krankheiten ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Myasthenia gravis, systemischer Lupus erythematodes, Autoimmunthy- reoiditis, Dermatitis wie atopische Dermatitis und/oder Ekzem, Psoriasis, Sjögren Syndrom, Morbus Crohn, Konjunktivitis, Cholitis ulcerosa, Asthma bronchiale, allergisches Asthma, Lupus erythematodes wie kutaner Lupus erythematodes, Allergien, Morbus Wegener (granulomatöse Polyangiitis), Stevens-Johnson-Syndrom, Sprue, Morbus Basedow, Sarkoidose, primär biliäre Zirrhose, Autoimmunhepatitis, Diabetes mellitus wie Diabetes mellitus Typ 1 und/oder Diabetes mellitus Typ 2, Arthritis wie rheumatoide Arthritis, Osteoarthritis und/oder Psoriasisarthritis, Multiple Sklerose und B-Zell-Lymphom.

Bezüglich weiterer Merkmale und Vorteile der Substanz wird zur Vermeidung von unnötigen Wiederholungen vollständig auf die im Rahmen des ersten Erfindungsaspekts gemachten Ausführungen Bezug genommen. Die dort beschriebenen Ausführungsformen und Vorteile gelten sinngemäß auch für die Substanz gemäß zweitem Erfindungsaspekt.

Gemäß einem dritten Aspekt betrifft die Erfindung ein Arzneimittel, vorzugsweise zur Anwendung bei der Therapie, d.h. Behandlung und/oder Vorbeugung, von viralen Infektionen, viralen Infektionskrankheiten und/oder B-Zell-abhängigen Krankheiten, insbesondere beim Menschen oder nichthumanen Tier. Das Arzneimittel zeichnet sich besonders dadurch aus, dass es wenigstens eine Substanz gemäß erstem und/oder zweitem Erfindungsaspekt enthält.

Bevorzugt enthält das Arzneimittel zusätzlich einen pharmazeutisch verträglichen Trägerstoff. Als geeignete Trägerstoffe kommen grundsätzlich anorganische und/oder organische Trägerstoffe in Frage. Beispielsweise kann der Trägerstoff ausgewählt sein aus der Gruppe bestehend aus Wasser, pflanzliche Öle, Fettverbindungen, Benzylalkohole, Alkylenglykole, Polyethylengly- kole, Glycerintriacetat, Gelatine, Kohlenhydrate wie Laktose und/oder Stärke, Magnesiumstea- rat, Talg, Vaseline und Mischungen davon. Bezüglich geeigneter Trägerstoffe sei beispielhaft auf das Lehrbuch von Bauer et al. (Lehrbuch der Pharmazeutischen Technologie, 6. Auflage, 1999, Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft mbH Stuttgart) sowie auf das Lehrbuch von Rowe et al. (Handbook of Pharmaceutical Excipients, 5. Auflage, 2006, Pharmaceutical Press and American Pharmacists Association) verwiesen, deren Offenbarungsgehalt in Bezug auf die dort beschriebenen Trägerstoffe durch ausdrückliche Bezugnahme zum Inhalt der vorliegenden Beschreibung gemacht wird.

Erfindungsgemäß kann es weiterhin vorgesehen sein, dass das Arzneimittel ferner wenigstens einen Hilfsstoff enthält, welcher beispielsweise ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Gleitstoffe, Konservierungsstoffe, Stabilisierungsstoffe, Resorptionsbeschleuniger, Netzmittel, Emulgatoren, Salze zur Beeinflussung des osmotischen Druckes, Puffersubstanzen, Farbstoffe, Geschmackstoffe, Duftstoffe, weitere Wirkstoffe und Mischungen davon.

Bei dem Arzneimittel kann es sich insbesondere um ein Impfmittel gegen virale Infektionskrankheiten handeln. Bezüglich weiterer Merkmale und Vorteile des Arzneimittels, insbesondere der wenigstens einen Substanz, der viralen Infektionen, viralen Infektionskrankheiten und/oder B-Zell-abhängigen Krankheiten, wird zur Vermeidung von unnötigen Wiederholungen vollständig auf die bisherige Beschreibung Bezug genommen. Die dort in Bezug auf die Substanz beschriebenen Ausführungsformen und Vorteile sowie die dort erwähnten viralen Infektionen, viralen Infektionskrank- heiten und/oder B-Zell-abhängigen Krankheiten gelten sinngemäß auch für das Arzneimittel gemäß drittem Erfindungsaspekt.

Gemäß einem vierten Aspekt betrifft die Erfindung eine Substanz zur Anwendung bei der Diagnose von viralen Infektionen, viralen Infektionskrankheiten und/oder B-Zell-abhängigen Krankheiten, vorzugsweise beim Menschen oder nichthumanen Tier Die Substanz zeichnet sich besonders dadurch aus, dass sie zum Nachweis von CEACAM 1 , bevorzugt zum Nachweis der Expression und/oder Funktion von CEACAM1 , vorgesehen ist bzw. verwendet wird.

Ein Nachweis der Expression und/oder Funktion von CEACAM 1 durch die erfindungsgemäß vorgesehene Substanz kann in unterschiedlicher Weise erfolgen. Erfindungsgemäß kann es beispielsweise vorgesehen sein, dass die Substanz zum Nachweis der Expression von CEACAM1 auf Nukleinsäureebene verwendet wird.

Weiterhin kann es vorgesehen sein, dass die Substanz zum Nachweis der Expression von CEACAM 1 auf mRNA-Ebene verwendet wird. In einer weiteren Ausführungsform handelt es sich bei der Substanz um ein Polynukleotid, welches ein Polypeptid bzw. Protein codiert, wobei das Polypeptid bzw. Protein die Expression und/oder Funktion von CEACAM 1 inhibiert.

In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei der Substanz um eine gegen CEACAM1 gerichtete Substanz.

Besonders bevorzugt ist die gegen CEACAM 1 gerichtete Substanz ein Antikörper. Ein derartiger Antikörper kann im Rahmen von dem Fachmann bekannten Nachweisverfahren, beispielsweise ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay), eingesetzt werden. Im Falle des ELISA wird ein gegen das zu bestimmende Antigen (CEACAM1 ) gerichteter spezifischer Antikörper an ein Trägermaterial, beispielsweise Cellulose oder Polystyrol, gebunden. Auf dem Trägermaterial bilden sich nach einer Inkubation mit einer Probe, welche CEACAM1 als Antigen enthält, Immunkomplexe. In einem nachfolgenden Schritt wird diesen Immunkomplexen ein markierter Antikörper, welcher ebenfalls gegen das Antigen CEACAM1 gerichtet ist, aber zweckmäßigerweise an einer anderen Stelle bindet als der auf dem Trägermaterial gebundene Antikörper, hinzugegeben. Bei diesem markierten Antikörper handelt es sich gewöhnlich um ein Antikörper- Enzym-Konjugat, wobei es sich bei dem Enzym in der Regel um alkalische Phosphatase oder Meerrettichperoxidase handelt. Durch die Zugabe des markierten Antikörpers entstehen letztendlich ternäre Komplexe aus dem Antigen (CEACAM 1 ) und den beiden jeweils gegen das Antigen (CEACAM 1 ) gerichteten Antikörpern. Diese ternären Komplexe lassen sich durch Zugabe von chromogenen Substraten, wie beispielsweise para-Nitrophenol, sichtbar machen. Hieraus kann die Konzentration von CEACAM 1 in der Probe über eine photometrische Bestimmung der Immunkomplex-gebundenen Markerenzyme durch Vergleich mit Standards bekannter Antigen- konzentration ermittelt werden. Ebenso ist es möglich, gegen CEACAM 1 gerichtete Antikörper im Rahmen von ELISPOT-Verfahren einzusetzen. Die in diesem Absatz erwähnten Verfahren sind dem Fachmann hinreichend vertraut, so dass auf weitergehende Ausführungen verzichtet wird.

In einer weiteren Ausführungsform kann es sich bei der Substanz um ein Oligonukleotid handeln, welches beispielsweise mittels der sogenannten Polymerase-Kettenreaktion (PCR) dazu geeignet ist, selektiv bestimmte DNA-Abschnitte von CEACAM 1 zu amplifizieren und auf diese Weise einen vorzugsweise quantitativen Nachweis von CEACAM1 zu erbringen.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform kann es sich bei der Substanz um ein Oligo- oder Polynukleotid handeln, welches mit CEACAM1 unter stringenten Bedingungen hybridisiert. Mit Hilfe von derartigen Oligo- bzw. Polynukleotiden können beispielsweise Southern Blots oder Northern Blots durchgeführt werden, um auf diese Weise den DNA- oder RNA-Gehalt an CEACAM1 nachzuweisen. Auf diese Weise lässt sich beispielsweise auch die Transkriptionsrate von CEACAM 1 untersuchen. Entsprechende Verfahren sind dem Fachmann ebenfalls hinreichend geläufig, so dass auf weiterführende Ausführungen an dieser Stelle ebenfalls verzichtet werden soll.

Bezüglich weiterer Merkmale und Vorteile der Substanz sowie bezüglich möglicher viraler Infektionen, viraler Infektionskrankheiten und/oder B-Zell-abhängigen Krankheiten wird zur Vermeidung von unnötigen Wiederholungen ebenfalls vollständig auf die bisherige Beschreibung Bezug genommen. Die dort in Bezug auf die Substanz beschriebenen Ausführungsformen und Vorteile sowie die dort genannten viralen Infektionen, viralen Infektionskrankheiten und/oder B- Zell-abhängigen Krankheiten gelten sinngemäß auch für die Substanz gemäß viertem Erfindungsaspekt.

Gemäß einem fünften Aspekt betrifft die Erfindung ein Diagnosemittel, vorzugsweise zur Anwendung bei der Diagnose von viralen Infektionen, viralen Infektionskrankheiten und/oder B- Zell-abhängigen Krankheiten, insbesondere beim Menschen oder nichthumanen Tier.

Das Diagnosemittel zeichnet sich besonders dadurch aus, dass es wenigstens eine Substanz gemäß erstem und/oder zweitem Erfindungsaspekt enthält.

Bezüglich weiterer Merkmale und Vorteile des Diagnosemittels, insbesondere der wenigstens einen Substanz, der viralen Infektionen, viralen Infektionskrankheiten und/oder B-Zell- abhängigen Krankheiten, wird ebenfalls vollständig auf die bisherige Beschreibung Bezug genommen. Die dort in Bezug auf die Substanz beschriebenen Ausführungsformen und Vorteile sowie die dort genannten viralen Infektionen, viralen Infektionskrankheiten und/oder B-Zellabhängigen Krankheiten gelten sinngemäß auch für das Diagnosemittel gemäß fünftem Erfindungsaspekt. Gemäß einem sechsten Aspekt betrifft die Erfindung einen gegen CEACAM 1 gerichteten Antikörper.

Der Antikörper zeichnet sich besonders dadurch aus, dass er eine variable Antikörper- Schwerketten-(V _H )-Domäne, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus variable Antikörper- Schwerketten-(V _H )-Domäne gemäß SEQ ID Nr. 3, variable Antikörper-Schwerketten-(V _H )- Domäne gemäß SEQ I D Nr. 7 und variable Antikörper-Schwerketten-(V _H )-Domäne gemäß SEQ ID Nr. 1 1 , und/oder eine variable Antikörper-Leichtketten-(V _L )-Domäne, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus variable Antikörper-Leichtketten-(V _L )-Domäne gemäß SEQ ID Nr. 5, variable Antikörper-Leichtketten-(V _L )-Domäne gemäß SEQ ID Nr. 9 und variable Antikörper- Leichtketten-(V|_)-Domäne gemäß SEQ I D Nr. 13, aufweist.

Der Antikörper weist in einer bevorzugten Ausführungsform eine variable Antikörper- Schwerketten-(V _H )-Domäne gemäß SEQ ID Nr. 3 und eine variable Antikörper-Leichtketten- (V _L )-Domäne gemäß SEQ ID Nr. 5 auf.

In einer alternativen Ausführungsform weist der Antikörper eine variable Antikörper- Schwerketten-(V _H )-Domäne gemäß SEQ ID Nr. 7 und eine variable Antikörper-Leichtketten- (V _L )-Domäne gemäß SEQ ID Nr. 9 auf. In einer weiteren alternativen Ausführungsform weist der Antikörper eine variable Antikörper- Schwerketten-(V _H )-Domäne gemäß SEQ ID Nr. 1 1 und eine variable Antikörper-Leichtketten- (V _L )-Domäne gemäß SEQ I D Nr. 13 auf.

Bei dem Antikörper handelt es sich in einer bevorzugten Ausführungsform um einen murinen Antikörper oder leporinen Antikörper. Mit anderen Worten ist es erfindungsgemäß bevorzugt, wenn es sich bei dem Antikörper um einen Maus-Antikörper, Ratten-Antikörper oder Kaninchen- Antikörper handelt, d. h. um einen Antikörper, welcher von einer Maus, einer Ratte oder einem Kaninchen hergestellt worden ist.

Insbesondere kann die variable Antikörper-Schwerketten-(V _H )-Domäne ausgewählt sein aus der Gruppe bestehend aus variable Antikörper-Schwerketten-(V _H )-Domäne murinen Ursprungs und variable Antikörper-Schwerketten-(V _H )-Domäne leporinen Ursprungs. Mit anderen Worten kann es erfindungsgemäß insbesondere vorgesehen sein, dass die variable Antikörper- Schwerketten-(V _H )-Domäne von einer Maus, einer Ratte oder einem Kaninchen hergestellt worden ist.

Weiterhin kann insbesondere die variable Antikörper-Leichtketten-(V _L )-Domäne ausgewählt sein aus der Gruppe bestehend aus variable Antikörper-Leichtketten-(V _L )-Domäne murinen Ursprungs und variable Antikörper-Leichtketten-(V _L )-Domäne leporinen Ursprungs. Mit anderen Worten kann es erfindungsgemäß insbesondere vorgesehen sein, dass die variable Antikörper- Leichtketten-(V|_)-Domäne von einer Maus, einer Ratte oder einem Kaninchen hergestellt worden ist. Zur Verbesserung der Verträglichkeit des Antikörpers kann es in einer weiteren Ausführungsform vorgesehen sein, dass der Antikörper eine konstante Antikörper-Schwerketten-(C _H )- Domäne humanen Ursprungs und/oder eine konstante Antikörper-Leichtketten-(C _L )-Domäne humanen Ursprungs aufweist. Gemäß einer weiteren Ausführungsform handelt es sich bei dem Antikörper um einen humanisierten Antikörper. Bei dieser Ausführungsform sind die konstante Antikörper-Schwerketten- (C _H )-Domäne sowie die konstante Antikörper-Leichtketten-(C _L )-Domäne des Antikörpers jeweils humanen Ursprungs, wohingegen die variable Antikörper-Schwerketten-(V _H )-Domäne und variable Antikörper-Leichtketten-(V|_)-Domäne des Antikörpers jeweils xenogenen, insbesondere murinen oder leporinen, Ursprungs sind.

Weiterhin handelt es sich bei dem Antikörper vorzugsweise um einen monoklonalen Antikörper.

Bei dem Antikörper kann es sich insbesondere um einen Antikörper handeln , welcher von einer B-Zell-Hybridomlinie (B-Zellklon) produziert wird, welche ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus 6G5J, B3-17 und 18-20. Bei dem Antikörper handelt es sich weiterhin vorzugsweise um einen Antikörper zur Anwendung in der Medizin.

Grundsätzlich kann es sich bei dem Antikörper um einen diagnostischen und/oder therapeutischen Antikörper handeln. Entsprechend kann der Antikörper zur Anwendung bei der Diagnose und/oder Therapie, d.h. Behandlung und/oder Vorbeugung, von Krankheiten vorgesehen sein. Grundsätzlich kann es sich bei dem Antikörper um einen Antikörper zur Anwendung bei der Diagnose von viralen Infektionen, viralen Infektionskrankheiten, B-Zell-abhängigen Krankheiten und/oder Tumoren handeln.

Vorzugsweise handelt es sich bei dem Antikörper um einen Antikörper zur Anwendung bei der Therapie, d.h. Behandlung und/oder Vorbeugung, von Krankheiten. Besonders bevorzugt ist der Antikörper zur Anwendung bei der Therapie, d.h. Behandlung und/oder Vorbeugung, von viralen Infektionen, viralen Infektionskrankheiten, B-Zell-abhängigen Krankheiten und/oder Tumoren vorgesehen. Mit anderen Worten handelt es sich bei dem Antikörper gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform um einen Antikörper zur Anwen- dung bei der Therapie, d.h. Behandlung und/oder Vorbeugung, von viralen Infektionen, viralen Infektionskrankheiten, B-Zell-abhängigen Krankheiten und/oder Tumoren.

Bei den Tumoren kann es sich grundsätzlich um benigne Tumore oder maligne Tumore handeln. Vorzugsweise handelt es sich bei den Tumoren um maligne Tumore. Die maligne Tumore können dabei insbesondere ausgewählt sein aus der Gruppe bestehend aus Karzinome, Melanome, Piastome, Lymphome und Sarkome.

Die Karzinome können ausgewählt sein aus der Gruppe bestehend aus Analkarzinom, Bronchialkarzinom, Lungenkarzinom, Endometriumkarzinom, Gallenblasenkarzinom, hepatozelluläres Karzinom, Hodenkarzinom, kolorektales Karzinom, Larynxkarzinom, Speisenröhrenkrebs, Magenkarzinom, Mammakarzinom, Nierenkarzinom, Ovarialkarzinom, Pankreastumor, Pharynx- karzinom, Prostatakarzinom, Schilddrüsenkarzinom und Cervixkarzinom.

Die Sarkome können ausgewählt sein aus der Gruppe bestehend aus Angiosarkom, Chondrosarkom, Ewing-Sarkom, Fibrosarkom, Karposi-Sarkom, Lipo-Sarkom, Leiomyosarkom, malig- nes fibröses Histiozytom, neurogenes Sarkom, Osteosarkom und Rhabdomyosarkom.

Bezüglich weiterer Merkmale und Vorteile des Antikörpers, insbesondere möglicher viraler Infektionen, viraler Infektionskrankheiten und/oder B-Zell-abhängigen Krankheiten, zu deren Diagnose und/oder Therapie der Antikörper verwendet bzw. eingesetzt werden kann, wird zur Vermeidung von unnötigen Wiederholungen ebenfalls vollständig auf die bisherige Beschrei- bung Bezug genommen.

Gemäß einem siebten Aspekt betrifft die Erfindung einen weiteren, gegen CEACAM 1 gerichteten Antikörper.

Der Antikörper zeichnet sich besonders dadurch aus, dass er eine variable Antikörper- Schwerketten-(V _H )-Domäne, welche durch eine Nukleotidsequenz codiert ist, welche ausge- wählt ist aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nr. 4, SEQ ID Nr. 8 und SEQ ID Nr. 12, und/oder eine variable Antikörper-Leichtketten-(V _L )-Domäne, welche durch eine Nukleotidsequenz codiert ist, welche ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus SEQ I D Nr. 6, SEQ I D Nr. 10 und SEQ I D Nr. 14, aufweist. Besonders bevorzugt weist der Antikörper eine variable Antikörper-Schwerketten-(V _H )-Domäne, welche durch eine Nukleotidsequenz gemäß SEQ I D Nr. 4 codiert ist, und eine variable Antikör- per-Leichtketten-(V|_)-Domäne, welche durch eine Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID Nr. 6 codiert ist, auf. In einer alternativen Ausführungsform weist der Antikörper eine variable Antikörper- Schwerketten-(V _H )-Domäne, welche durch eine Nukleotidsequenz gemäß SEQ I D Nr. 8 codiert ist, und eine variable Antikörper-Leichtketten-(V _L )-Domäne, welche durch eine Nukleotidsequenz gemäß SEQ I D Nr. 10 codiert ist, auf.

In einer weiteren alternativen Ausführungsform weist der Antikörper eine variable Antikörper- Schwerketten-(V _H )-Domäne, welche durch eine Nukleotidsequenz gemäß SEQ I D Nr. 12 codiert ist, und eine variable Antikörper-Leichtketten-(V _L )-Domäne, welche durch eine Nukleotidsequenz gemäß SEQ I D Nr. 14 codiert ist, auf.

Bei dem Antikörper handelt es sich in einer bevorzugten Ausführungsform um einen murinen Antikörper oder leporinen Antikörper. Mit anderen Worten ist es erfindungsgemäß bevorzugt, wenn es sich bei dem Antikörper um einen Maus-Antikörper, Ratten-Antikörper oder Kaninchen- Antikörper handelt, d. h. um einen Antikörper, welcher von einer Maus, einer Ratte oder einem Kaninchen hergestellt worden ist.

Insbesondere kann die variable Antikörper-Schwerketten-(V _H )-Domäne ausgewählt sein aus der Gruppe bestehend aus variable Antikörper-Schwerketten-(V _H )-Domäne murinen Ursprungs und variable Antikörper-Schwerketten-(V _H )-Domäne leporinen Ursprungs. Mit anderen Worten kann es erfindungsgemäß insbesondere vorgesehen sein, dass die variable Antikörper- Schwerketten-(V _H )-Domäne von einer Maus, einer Ratte oder einem Kaninchen hergestellt worden ist.

Weiterhin kann insbesondere die variable Antikörper-Leichtketten-(V _L )-Domäne ausgewählt sein aus der Gruppe bestehend aus variable Antikörper-Leichtketten-(V _L )-Domäne murinen Ursprungs und variable Antikörper-Leichtketten-(V _L )-Domäne leporinen Ursprungs. Mit anderen Worten kann es erfindungsgemäß insbesondere vorgesehen sein, dass die variable Antikörper- Leichtketten-(V|_)-Domäne von einer Maus, einer Ratte oder einem Kaninchen hergestellt worden ist. Zur Verbesserung der Verträglichkeit des Antikörpers kann es in einer weiteren Ausführungsform vorgesehen sein, dass der Antikörper eine konstante Antikörper-Schwerketten-(C _H )- Domäne humanen Ursprungs und/oder eine konstante Antikörper-Leichtketten-(C _L )-Domäne humanen Ursprungs aufweist.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform handelt es sich bei dem Antikörper um einen humanisierten Antikörper. Bei dieser Ausführungsform sind die konstante Antikörper-Schwerketten- (C _H )-Domäne sowie die konstante Antikörper-Leichtketten-(C _L )-Domäne des Antikörpers jeweils humanen Ursprungs, wohingegen die variable Antikörper-Schwerketten-(V _H )-Domäne und variable Antikörper-Leichtketten-(V|_)-Domäne des Antikörpers jeweils xenogenen, insbesondere murinen oder leporinen, Ursprungs sind.

Weiterhin handelt es sich bei dem Antikörper vorzugsweise um einen monoklonalen Antikörper. Bei dem Antikörper kann es sich insbesondere um einen Antikörper handeln, welcher von einer B-Zell-Hybridomlinie (B-Zellklon) produziert wird, welche ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus 6G5J, B3-17 und 18-20.

Bei dem Antikörper handelt es sich weiterhin vorzugsweise um einen Antikörper zur Anwendung in der Medizin. Grundsätzlich kann es sich bei dem Antikörper um einen diagnostischen und/oder therapeutischen Antikörper handeln. Entsprechend kann der Antikörper zur Anwendung bei der Diagnose und/oder Therapie, d.h. Behandlung und/oder Vorbeugung, von Krankheiten vorgesehen sein.

Grundsätzlich kann es sich bei dem Antikörper um einen Antikörper zur Anwendung bei der Diagnose von viralen Infektionen, viralen Infektionskrankheiten, B-Zell-abhängigen Krankheiten und/oder Tumoren handeln.

Vorzugsweise handelt es sich bei dem Antikörper um einen Antikörper zur Anwendung bei der Therapie, d.h. Behandlung und/oder Vorbeugung, von Krankheiten.

Besonders bevorzugt ist der Antikörper zur Anwendung bei der Therapie, d.h. Behandlung und/oder Vorbeugung, von viralen Infektionen, viralen Infektionskrankheiten, B-Zell-abhängigen Krankheiten und/oder Tumoren vorgesehen. Mit anderen Worten handelt es sich bei dem Antikörper gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform um einen Antikörper zur Anwendung bei der Therapie, d.h. Behandlung und/oder Vorbeugung, von viralen Infektionen, viralen Infektionskrankheiten, B-Zell-abhängigen Krankheiten und/oder Tumoren. Bezüglich weiterer Merkmale und Vorteile des Antikörpers, insbesondere möglicher viraler Infektionen, viraler Infektionskrankheiten, B-Zell-abhängigen Krankheiten und/oder Tumoren, zu deren Diagnose und/oder Therapie der Antikörper eingesetzt bzw. verwendet werden kann, wird zur Vermeidung von unnötigen Wiederholungen ebenfalls vollständig auf die bisherige Be- Schreibung Bezug genommen.

Gemäß einem achten Aspekt betrifft die Erfindung eine variable Antikörper-Schwerketten-(V _H )- Domäne eines gegen CEACAM1 gerichteten Antikörpers.

Die variable Antikörper-Schwerketten-(V _H )-Domäne ist ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Antikörper-Schwerketten-(V _H )-Domäne gemäß SEQ ID Nr. 3, variable Antikörper- Schwerketten-(V _H )-Domäne gemäß SEQ ID Nr. 7 und variable Antikörper-Schwerketten-(V _H )- Domäne gemäß SEQ ID Nr. 1 1 .

Die variable Antikörper-Schwerketten-(V _H )-Domäne ist in einer bevorzugten Ausführungsform murinen oder leporinen Ursprungs. Mit anderen Worten ist es erfindungsgemäß bevorzugt, wenn die variable Antikörper-Schwerketten-(V _H )-Domäne von einer Maus, einer Ratte oder ei- nem Kaninchen hergestellt worden ist.

Der Antikörper ist vorzugsweise ein monoklonaler Antikörper.

Bezüglich weiterer Merkmale und Vorteile der variablen Antikörper-Schwerketten-(V _H )-Domäne sowie des Antikörpers wird zur Vermeidung von unnötigen Wiederholungen ebenso vollständig auf die bisherige Beschreibung Bezug genommen. Die dort in Bezug auf die variable Antikör- per-Schwerketten-(V _H )-Domäne sowie den Antikörper beschriebenen Ausführungsformen sowie Vorteile gelten sinngemäß auch für die variable Antikörper-Schwerketten-(V _H )-Domäne gemäß achtem Erfindungsaspekt.

Gemäß einem neunten Aspekt betrifft die Erfindung eine variable Antikörper-Leichtketten-(V _L )- Domäne eines gegen CEACAM1 gerichteten Antikörpers. Die variable Antikörper-Leichtketten-(V _L )-Domäne ist ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus variable Antikörper-Leichtketten-(V _L )-Domäne gemäß SEQ ID Nr. 5, variable Antikörper- Leichtketten-(V|_)-Domäne gemäß SEQ ID Nr. 9 und variable Antikörper-Leichtketten-(V _L )- Domäne gemäß SEQ ID Nr. 13. Die variable Antikörper-Leichtketten-(V _L )-Domäne ist in einer bevorzugten Ausführungsform murinen oder leporinen Ursprungs. Mit anderen Worten ist es erfindungsgemäß bevorzugt, wenn die variable Antikörper-Leichtketten-(V _L )-Domäne von einer Maus, einer Ratte oder einem Kaninchen hergestellt worden ist. Der Antikörper ist vorzugsweise ein monoklonaler Antikörper.

Bezüglich weiterer Merkmale und Vorteile der variablen Antikörper-Leichtketten-(V _L )-Domäne sowie des Antikörpers wird zur Vermeidung von unnötigen Wiederholungen ebenso vollständig auf die bisherige Beschreibung Bezug genommen. Die dort in Bezug auf die variable Antikör- per-Leichtketten-(V|_)-Domäne sowie den Antikörper beschriebenen Ausführungsformen und Vorteile gelten sinngemäß auch für die variable Antikörper-Leichtketten-(V _L )-Domäne gemäß neuntem Erfindungsaspekt.

Gemäß einem zehnten Aspekt betrifft die Erfindung eine isolierte Nukleinsäure, welche für eine variable Antikörper-Schwerketten-(V _H )-Domäne eines gegen CEACAM 1 gerichteten Antikörpers codiert. Bei der Nukleinsäure sowie dem Antikörper handelt es sich vorzugsweise um eine humane

Nukleinsäure bzw. humanen Antikörper. Der Antikörper ist vorzugsweise ein monoklonaler Antikörper.

Die Nukleinsäure weist eine Nukleotidsequenz auf oder besteht aus einer Nukleotidsequenz, welche ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nr. 4 und SEQ I D Nr. 8 und SEQ I D Nr. 12.

Bezüglich weiterer Merkmale und Vorteile der Nukleinsäure wird zur Vermeidung von unnötigen Wiederholungen ebenfalls vollständig auf die bisherige Beschreibung Bezug genommen. Die dort insbesondere in Bezug auf die variable Antikörper-Schwerketten-(V _H )-Domäne sowie den Antikörper beschriebenen Ausführungsformen und Vorteile gelten sinngemäß auch für die Nuk- leinsäure gemäß zehntem Erfindungsaspekt.

Gemäß einem elften Aspekt betrifft die Erfindung eine isolierte Nukleinsäure, welche für eine variable Antikörper-Leichtketten-(V _L )-Domäne eines gegen CEACAM 1 gerichteten Antikörpers codiert. Bei der Nukleinsäure sowie dem Antikörper handelt es sich vorzugsweise um eine humane Nukleinsäure bzw. humanen Antikörper. Der Antikörper ist vorzugsweise ein monoklonaler Antikörper.

Die Nukleinsäure weist eine Nukleotidsequenz auf oder besteht aus einer Nukleotidsequenz, welche ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nr. 6, SEQ I D Nr. 10 und SEQ I D Nr. 14.

Bezüglich weiterer Merkmale und Vorteile der Nukleinsäure wird zur Vermeidung von unnötigen Wiederholungen ebenfalls vollständig auf die bisherige Beschreibung Bezug genommen. Die dort insbesondere in Bezug auf die variable Antikörper-Leichtketten-(V _L )-Domäne sowie den Antikörper beschriebenen Ausführungsformen und Vorteile gelten sinngemäß auch für die Nukleinsäure gemäß elftem Erfindungsaspekt.

Gemäß einem zwölften Aspekt betrifft die Erfindung eine Hybridomzelle, welche einen Antikörper gemäß sechstem oder siebtem Erfindungsaspekt produziert.

Die Hybridomzelle ist vorzugsweise durch Fusion von B-Lymphozyten, welche aus einem ge- gen CEACAM1 immunisierten Versuchstier stammen und gegen CEACAM 1 gerichtete Antikörper produzieren, und Myelomzellen gebildet. Das Versuchstier kann ausgewählt sein aus der Gruppe bestehend aus Maus, Ratte, Kaninchen und Ziege. Unter Myelomzellen werden allgemein Zellen (Plasmazellen) einer aus einem Myelom (Plasmazytom) eines Tieres gewonnenen Zelllinie verstanden. Die Myelomzellen können im Rahmen der vorliegenden Erfindung aus dem Myelom einer Maus, einer Ratte, eines Kaninchens oder einer Ziege gewonnen sein.

Bevorzugt handelt es sich bei den Myelomzellen um Zellen der Maus-Myelom-Zelllinie NS1/0.

Die Hybridomzelle gehört vorzugsweise zu einer B-Zell-Hybridomlinie (B-Zellklon), welche ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus 6G5J, B3-17 und 18-20.

Bezüglich weiterer Merkmale und Vorteile der Hybridomzelle wird zur Vermeidung von unnöti- gen Wiederholungen ebenfalls vollständig auf die bisherige Beschreibung Bezug genommen. Die dort insbesondere in Bezug auf den Antikörper beschriebenen Ausführungsformen und Vorteile geltend sinngemäß auch für die Hybridomzelle gemäß zwölftem Erfindungsaspekt. Gemäß einem dreizehnten Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines gegen CEACAM 1 gerichteten Antikörpers, insbesondere eines Antikörpers gemäß sechstem oder siebtem Erfindungsaspekt.

Das Verfahren weist die folgenden Schritte auf: a) Fusionieren von B-Zellen, welche aus einem gegen ein Antigen immunisierten Versuchstier stammen, und Myelomzellen unter Ausbildung von Hybridomzellen, b) Selektieren der Hybridomzellen, c) Isolieren von Hybridomzellen, welche gegen das Antigen gerichtete Antikörper produzieren. Gegenüber gattungsgemäßen Verfahren zeichnet sich das erfindungsgemäße Verfahren besonders dadurch aus, dass das Antigen ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus CEACAM1 gemäß SEQ I D Nr. 1 , CEACAM 1 gemäß SEQ I D Nr. 2, ein Fragment, insbesondere Epitop, der SEQ I D Nr. 1 und ein Fragment, insbesondere Epitop, der SEQ ID Nr. 2.

In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem Antigen um CEACAM 1 gemäß SEQ ID Nr. 1 oder ein Fragment, insbesondere Epitop, davon.

In einer alternativen Ausführungsform handelt es sich bei dem Antigen um CEACAM 1 gemäß SEQ ID Nr. 2 oder ein Fragment, insbesondere Epitop, davon.

Bei dem Versuchstier handelt es sich in einer bevorzugten Ausführungsform um eine Maus, eine Ratte, ein Kaninchen oder eine Ziege. Die Verwendung einer Maus als Versuchstier ist erfindungsgemäß jedoch besonders bevorzugt.

Die B-Zellen können mit Zellen einer aus einem Myelom einer Maus, einer Ratte, eines Kaninchens oder einer Ziege gewonnenen Zelllinie fusioniert werden.

Vorzugsweise werden die B-Zellen mit Zellen der Maus-Myelom-Zelllinie NS1/0 fusioniert.

Der Schritt a), d. h. die Zellfusion, kann mit Hilfe von Polyethylenglykol (PEG) durchgeführt wer- den. Hierzu werden die B-Zellen und Myelom-Zellen zusammen in eine wässrige, polyethyl- englykolhaltige Fusionslösung gegeben und zentrifugiert. Da das Wasser weitgehend durch PEG gebunden wird, werden die Zellmembranen in engen Kontakt zueinander gebracht, wodurch eine spontane Fusion der Zellmembranen erreicht wird.

Alternativ kann der Schritt a) unter Einwirkung von elektrischer Spannung, d. h. als sogenannte Elektrofusion, vorgenommen werden. Bei der Elektrofusion werden mittels elektrischer Pulse die Zellmembranen lokal„aufgeschmolzen", wodurch eine Verschmelzung der Zellmembranen erreicht wird. Um die Fusion zu unterstützen, kann die Zugabe von geringen Mengen an PEG vorgesehen sein.

Die B-Zellen und die Myelom-Zellen werden in einer weiteren Ausführungsform in einem Verhältnis von 5:1 fusioniert (B-Zellen zu Myelom-Zellen). Der Schritt b) wird in einer bevorzugten Ausführungsform unter Verwendung eines selektiven Mediums, in welchem nur Hybridomzellen überlebensfähig sind, durchgeführt. Als selektives Medium wird vorzugsweise das sogenannte HAT-Medium verwendet. Das HAT-Medium enthält die chemischen Substanzen Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin. Hypoxanthin stellt eine Vorstufe für essentielle Moleküle (Purine) dar, die für den Aufbau der Desoxyribonukleinsäure (DNA) benötigt werden. Zu dessen Umwandlung ist allerdings das Enzym HGPRT (Hypo- xanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferanse) notwendig. Da bei der Fusion eine Myelom- Zelllinie verwendet wird, der eben dieses Enzym fehlt oder bei der es in inaktiver Form vorliegt, sind einzelne Myelom-Zellen in diesem Medium somit nicht überlebensfähig. Milzzellen besitzen hingegen HGPRT, sind für sich aber nicht überlebensfähig und sterben im Kulturmedium rasch ab. Einzig Hybridomzellen können kultiviert werden, da sie die Immortalität der Myelom-Zellen sowie die HGPRT-Gene der Milzzellen besitzen. Aminopterin dient allein der Blockierung anderer Purin-Synthesewege. Da dadurch auch das essentielle Thymidin nicht mehr de novo hergestellt werden kann, muss es dem Medium beigegeben werden.

Der Schritt c) wird vorzugsweise mittels ELISA (Enzyme-Iinked immunosorbant assay)-Test oder Durchflusszytometrie durchgeführt.

In einer weiteren Ausführungsform werden die isolierten Hybridomzellen expandiert. Auf diese Weise wird sichergestellt, dass eine ausreichend große Anzahl an Hybridomzellen zur Verfügung steht, welche den gegen CEACAM1 gerichteten Antikörper produzieren.

Bezüglich weiterer Merkmale und Vorteile des Verfahrens, insbesondere der Hybridomzellen, des Antigens sowie des Antikörpers, wird vollständig auf die bisherige sowie auf die im Beispielteil gemachten Ausführungen Bezug genommen. Die dort insbesondere in Bezug auf die Hyb- ridomzelle, das Antigen sowie den Antikörper beschriebenen Ausführungsformen und Vorteile gelten sinngemäß auch für das Verfahren gemäß dreizehntem Erfindungsaspekt.

Die in der allgemeinen Beschreibung sowie in den Patentansprüchen genannten Sequenzen (Aminosäuresequenzen und Nukleotidsequenzen) entsprechen den im beigefügten Sequenz- Protokoll offenbarten Sequenzen.

Beispielteil

1.1 Figurenbeschreibungen

Die Figuren zeigen schematisch:

Fig. 1A: repräsentative Durchflusszytometrie Histogramme von wuchernden B-Zellen aus

Wildtyp-(WT) oder CEACAM1 -/- Mäusen (CEACAM1 -Knockout-Mäusen), die unbehandelt (graue Fläche), mit anti-CEACAM1 Antikörper, LPS oder mit rekombinantem Maus-CD40-Ligand in Kombination mit Maus-IL-4 (schwarze Linie) für 48 Stunden behandelt wurden. DAPI-Zellen sind gezeigt (n = 6).

Fig. 1 B: Absolute Anzahl lebender Zellen B (DAPI-) zu angegebenen Zeitpunkten (n = 3);

aus der Milz sortiert, nach der Behandlung mit oder ohne rekombinantem Maus-

CD40-Ligand in Kombination mit Maus I L-4 (n = 3).

Fig. 1 C: Repräsentative Histogramme und statistische Analyse der Annexin-V+ B-Zellen, die mit rekombinantem Maus-CD40-Ligand in Kombination mit Maus I L-4 stimuliert oder unstimuliert belassen wurden, nach 48 Stunden (DAPI- B Zellen sind gezeigt, n = 6). Fig. 1 D: Prozentsatz der DAPI+ B-Zellen aus der Milz von WT und CEACAM1 -/- Mäusen nach der Aktivierung mit rekombinantem Maus-CD40-Ligand in Kombination mit Maus-IL-4 in Anwesenheit oder Abwesenheit von Btk Inhibitor Ibrutinib kultiviert für 48 Stunden durch FACS-Analyse bestimmt (n = 6 ). * P <0,05; ** P <0,01 ; und *** P <0,001 (Student-t-Test).

Die in den Figuren 1A bis 1 D grafisch dargestellten Ergebnisse zeigen, dass CEACAM1 das Überleben von B-Zellen in vitro fördert.

Fig. 2A: Schema der Entwicklung, Reifung und Migration von B-Zellen in Knochenmark, Blut,

Lymphknoten und Milz. Die durchgezogenen Pfeile zeigen den wahrscheinlichen Entwicklungsweg. Die gestrichelten Pfeile zeigen einen noch in der Diskussion befindlichen Entwicklungsweg. Die punktierten Pfeile zeigen die Differenzierung nach der Antigen-Stimulation. Der„Strich-Punkt Pfeil" zeigt angenommene Entwicklungswege. Fig. 2B-E: Gesamtzahl der B-Zell-Subpopulationen von Wildtyp (WT) und CEACAM1 -/- Mäusen, gemessen mittels Durchflusszytometrie im Knochenmark (b, n = 6), im Blut (c, n = 4), Lymphknoten (d, n = 4) und in der Milz (e, n = 10). Marker siehe Methoden.

Die in den Figuren 2A bis 2D grafisch dargestellten Ergebnisse zeigen, dass die Expression von CEACAM1 die B-Zell-Differenzierung und das Überleben der B- Zellen in vivo fördert.

Fig. 3: Gesamtzahl der B1 a und B2 B-Zell-Subpopulationen (B1 a, CD19lowCD5int; B2,

CD19highCD5neg) und T-Zellen aus Wildtyp-(WT) und CEACAM1 -/- Mäuse, gemessen mittels Durchflusszytometrie in der Bauchhöhle (n = 6). ^* P <0,05 (Student- t-Test); ns = nicht signifikant.

Die in Figur 3 grafisch dargestellten Ergebnisse zeigen, dass die Expression von CEACAM1 die B1 B-Zellen verändert.

Fig. 4: Menge der Serum Immunglobuline in naiv-Wildtyp (WT) und CEACAM1 -/- Mäusen

(n = 8 pro Genotyp). ^** P <0,01 ; und ^*** P <0,001 (Student-t-Test).

Die in Figur 4 grafisch dargestellten Ergebnisse zeigen eine vorteilhafte Beeinflussung der Serum-Immunglobuline durch CEACAM1 .

Fig. 5A: Prozent von WT x Vi10 B-Zellen und CEACAM1 -/- x Vi10 B-Zellen, die adoptiv in

WT-Mäusen (1 x 10 ⁷ pro Maus) am Tag -1 übertragen wurden und die mit 2 x 10 ⁶ PFU VSV (Vesikuläres Stomatitis Virus) am Tag 0 infiziert wurden. Analyse Tag 3 nach Infektion (n = 3). Fig. 5B,C: Gesamt VSV neutralisierende Antikörper und neutralisierende IgG-Antikörper in WT und CEACAM1 -/- Mäusen nach intravenöser Infektion mit 2 ^χ 10 ⁶ PFU VSV (B, n = 6-9 pro Gruppe) und / oder nach der intravenösen Infektion mit 2 ^χ 10 ⁸ PFU von UV- inaktivierten VSV (C, n = 8-9 pro Gruppe). Fig. 5D: VSV neutralisierende Antikörperantwort und neutralisierende IgG-Antikörper in Seren von WT und CEACAM 1 -/- Mäusen, die 1 10 ⁷ VSV-spezifische B-Zellen (Vi10) am Tag -1 erhalten hatten und dann mit 2 ^χ 10 ⁶ PFU VSV am Tag 0 infiziert wurden (n = 7-9 pro Gruppe). Fig. 5E: VSV-Titer in verschiedenen Organen von WT und CEACAM1 -/- Mäuse nach intravenöser Infektion mit 2 x 10 ⁶ PFU VSV analysiert 8 Tage nach Infektion (n = 6 pro Gruppe).

Fig. 5F: Überleben von WT und CEACAM1 -/- Mäusen nach intravenöser Infektion mit 2

10 ⁶ PFU VSV (n = 9-12 pro Gruppe). Fig. 5G: Überleben von WT und CEACAM1 -/- Mäusen, die unbehandelt waren oder adoptiv mit 1 x 10 ⁷ VSV-spezifischen B-Zellen (Vi10) am Tag -1 behandelt wurden und am Tag 0 mit 2 x 10 ⁶ PFU VSV infiziert wurden (n = 4-9). * P <0,05; ** P <0,01 ; und *** P <0,001 (Student-t-Test).

Die in den Figuren 5A bis 5G grafisch dargestellten Ergebnisse zeigen, dass eine Aktivierung von CEACAM 1 für eine Infektion mit VSV essentiell ist.

Fig. 6: Anti-VSV-spezifische IgM-und IgG-Antikörper in Wildtyp (WT) und CEACAM1 -/- Mäusen nach intravenöser Infektion mit 2 ^χ 10 ⁶ PFU von VSV (n = 4-7 pro Gruppe). * P <0,05; ** P <0,01 ; und *** P <0,001 (Student-t-Test). Daten, die für zwei Experimente sind (Mittelwert ± SEM). Die in Figur 6 grafisch dargestellten Ergebnisse zeigen, dass CEACAM 1 für eine

Anti-VSV spezifische Ig-Produktion essentiell ist.

Fig. 7A: LCMV (lymphozytäres Choriomeningitis Virus) Glykoprotein-spezifische IgG- Antikörper im Serum von Wildtyp (WT) und CEACAM 1 -/- Mäusen nach intravenöser Infektion mit 200 PFU LCMV-WE (n = 3-6 pro Gruppe). Fig. 7B: Leber Virustiter von WT und CEACAM1 -/- Mäusen 10 Tage nach intravenöser Infektion mit 2 x 10 ⁶ PFU LCMV-WE (n = 3 pro Gruppe). *** P <0,001 (Student-t-Test).

Die in Figur 7A und 7B grafisch dargestellten Ergebnisse zeigen, dass eine Aktivierung von CEACAM1 die LCMV-abhängige B-Zell-Aktivierung erhöht. Fig. 8A: Milz VSV-Titer von WT oder CEACAM1 -/- Mäuse 7 h nach intravenöser Infektion mit 2 x 10 ⁶ PFU von VSV (n = 6 pro Genotyp). ** P <0,01 (Student-t-Test).

Fig. 8B: Interferon-alpha levels im Serum von WT oder CEACAM1 -/- Mäusen 2 und 4 Stunden nach intravenöser Infektion mit 2 10 ⁸ PFU von VSV.

Die in den Figuren 8A und 8B grafisch dargestellten Ergebnisse zeigen mangelhafte Randzonen, Replikation und Interferon-Induktion in CEACAM1 -/- Mäusen.

Fig. 9: Anzahl Autoantikörper-bindender Zellen auf Lebergewebsschnitten, die mit Serum von WT und CEACAM1 -/- Mäusen 100 Tage nach intraperitonealer Injektion mit 500 L Pristan, und fluoreszierendem anti-mouse IgG behandelt wurden (n = 3-5).

Fig. 10: Menge von Virus in unterschiedlichen Organen von Wildtyp-(WT) oder CEACAM1 -/- Mäusen nach Infektion mit 200 PFU des chronischen lymphozytären Choriomenin- gitis Virusstammes (LCMV-Docile), gemessen 10 Tage nach Infektion (n = 3).

Fig. 1 1 A: Menge von Virus in Blut von Wildtyp-(WT) oder CEACAM1 -/- Mäusen, die mit Kontrollantikörper oder anti-CEACAM1 Antikörper (200μg Tag -1 ) behandelt wurden und zusätzlich am Tag 0 mit 2x10 ⁴ PFU des chronischen lymphozytären Choriomeningi- tis Virusstammes (LCMV-Docile) infiziert wurden (n = 6).

Fig. 1 1 B: Alanin-Aminotransferase (Biomarker für Leberschaden) im Serum von Wildtyp-(WT) oder CEACAM1 -/- Mäusen, die mit Kontrollantikörper oder anti-CEACAM1 Antikörper (200μg Tag -1 ) behandelt wurden und zusätzlich am Tag 0 mit 2x10 ⁴ PFU des chronischen lymphozytären Choriomeningitis Virusstammes (LCMV-Docile) infiziert wurden (n = 6).

Fig. 12: Menge von Virus in unterschiedlichen Organen von Wildtyp-(WT) Mäusen (gemessen Tag 60), die am Tag 0 mit 2x10 ⁶ PFU des chronischen lymphozytären Choriomeningitis Virusstammes (LCMV-Docile) infiziert wurden und zusätzlich am Tag 16 unbehandelt blieben oder mit anti-CEACAM1 Antikörper (200μg) behandelt wurden (n = 3-4).

1.2 Methoden und Materialien:

1.2.1 Mäuse: CeacamT -Mäuse wurden auf dem genetischen Hintergrund von C57BL/6 gehalten (mindestens 8-mal und bis zu 16-mal rückgekreuzt) und wurden homozygot gezüchtet. VM 0/CD45.1 - Mäuse, die einen VSV-spezifischen B-Zellenrezeptor als Transgen exprimieren, wurden für Zelltransferuntersuchungen verwendet, und Mäuse, die das CD45.1 -Transgen exprimieren, wurden zur Rekonstitution von Knochenmark verwendet. In allen Untersuchungen wurden sechs bis acht Wochen alte und gleichgeschlechtliche Mäuse verwendet. Alle Tiere wurden in belüfteten Einzelkäfigen gehalten. Bei den Überlebensexperimenten wurde der Gesundheitszustand der Mäuse zweimal täglich überprüft. Die Tierversuche wurden mit Genehmigung vom Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz Nordrhein-Westfalen (Recklinghausen, Deutschland) und gemäß dem deutschen Tierschutzgesetz oder gemäß den Institutsrichtlinien des Ontario Cancer Institute of the University Health Network und der McGill University, USA durchgeführt. Tiere, die schwere Krankheitssymptome oder Paralyse zeigten oder während einer VSV- Infektion beträchtlichen Gewichtsverlust erlitten, wurden aus dem Experiment genommen und für die statistische Analyse als Todesfälle gezählt. 1.2.2 Virus-Assays und Plaque-Assays:

Vesikuläre Stomatitis virus (VSV), Stamm Indiana (VSV-IND, Mudd-Summers-Isolat) wurde ursprünglich von Prof. D. Kolakofsky (Universität Genf, Schweiz) erhalten. Das Virus wurde auf BHK-21 -Zellen mit einer Infektionsmultiplizität (MOI) von 0,01 vermehrt. Die VSV-Konzentration wurde wie beschrieben bestimmt, und wurde dann in der Plaquetechnik auf Vero-Zellen aus- plattiert (Fink, K. et al.„Early type I interferon-mediated Signals on B cells specifically enhance antiviral humoral responses." European journal of immunology (2006), 36, 2094-2105.). Mäuse wurden intravenös mit VSV in den angegebenen Dosen infiziert. Virustiter wurden mit einem Plaque-Assay gemessen. Für dieses Assay wurden Organe in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), das 2 % fötales Kälberserum (FKS) enthält, zerkleinert, 1 :3 über 12 Stufen ein- gestellt und auf Vero-Zellen ausplattiert. Nach einer 2-stündigen Inkubation bei 37 °C wurde ein Überschichtungsmedium (Overlay) zugegeben und das Virus-Präparat nochmals bei 37 °C inkubiert. Die Plaques wurden 24 h später mittels Anfärbung mit Kristallviolett ausgezählt.

Der Stamm des lymphozytären Choriomeningitis Virus LCMV-WE wurde ursprünglich von F. Lehmann-Grube (Heinrich Pette Institut, Hamburg, Deutschland) erhalten und in L929-Zellen, MC57-Zellen oder beiden vermehrt. Mäuse wurden intravenös in der angegebenen Dosis infiziert. LCMV-Virustiter wurden durch ein Plaque-Assay auf MC57- Fibroblasten wie zuvor beschrieben nachgewiesen (Battegay, M. et al.„Quantification of lymphocytic choriomeningitis virus with an immunological focus assay in 24- or 96- well plates." J Viral Methods (1991 ), 33, 191 -198.). Kurz gesagt, zerkleinerte Organe wurden mit MC57-Zellen wie oben beschrieben ausplattiert und bei 37 °C inkubiert. Der Stamm des lymphozytären Choriomeningitis Virus LCMV-Docile wurde ursprünglich von F. Lehmann-Grube (Heinrich Pette Institut, Hamburg, Deutschland) erhalten und in L929-Zellen, MC57-Zellen oder beiden vermehrt.

Das Influenza A Virus wurde von der Arbeitsgruppe Westendorf, Universität Duisburg-Essen erhalten.

Nach einer Inkubation von 3 h bei 37 °C wurde ein Überschichtungsmedium zugegeben und das Virus-Präparat nochmals bei 37 °C inkubiert. Die Plaques wurden 72 h später mittels Anfärbung mit LCMV-NP (Nukleoprotein des LCMV) ausgezählt. Die Zellen wurden fixiert (mit 4 % Formaldehydlösung), permeabilisiert (mit 1 % Triton-X-Lösung), blockiert (mit 10 % FKS in phosphatgepufferter Salzlösung PBS) und mit anti-LCMV-NP-Antikörper (hausintern hergestellt) angefärbt. Als sekundärer Antikörper wurde ein mit ECL (Enhanced Chemolumine- scence) konjugierter anti-Kaninchen-lgG-Antikörper (anti-rabbit-IgG antibody) verwendet. Plaques wurden durch eine Farbreaktion nachgewiesen (0,2 M Na ₂ HP0 ₄ + 0,1 M Citronensäure + 30 % H ₂ 0 ₂ + o-Phenylendiamindihydrochlorid), wobei alle Chemikalien von Sigma-Aldrich bezogen wurden.

1.2.3 Test auf neutralisierende Antikörper:

Serum wurde vorverdünnt (1 :40). Das Komplementsystem wurde bei 56°C 30 min lang inaktiviert. Um eine IgG-Kinetik aufzunehmen, wurden verdünnte Proben mit 2- Mercaptoethanol (0,1 M) behandelt, um IgM zu entfernen. Serum wurde 1 :2 über 12 Stufen eingestellt und wurde mit 1 x 10 ³ Plaque bildenden Einheiten (PFU, Plaque Forming Units) des VSV inkubiert. Nach 90 Minuten Inkubation bei 37 °C wurde das Virus-Serum-Gemisch auf Vero-Zellen ausplattiert. Nach einer Stunde wurde ein Überschichtungsmedium zugegeben und die Mischung wurde nochmals 24 h lang bei 37 °C inkubiert. Die Plaques wurden durch Anfärbung mit Kristallviolett ausgezählt. Antikör- pertiter sind als 2- oder 3-fache Verdünnungsstufen (-log ₂ und -log ₃ )-fache Vorverdünnung (d.h. x40) dargestellt.

1.2.4 Kultur von B-Zellen:

Milzpräparate von Mäusen des Wildtyps (WT) und Ceacam 7 ^"A -Mäusen wurden in MACS- Puffer (1 % FKS und 0,8 % 0,5 M EDTA) zur magnetaktivierten Zellsortierung homogenisiert. B220 ⁺ -B-Zellen wurden durch positive Selektion mit CD45R-konjugierten Magnetpartikeln (MACS Miltenyi Biotech) isoliert. Mittels Durchflusszytometrie wurde bestätigt, dass die Reinheit der B220 ⁺ -Zellen über 95 % betrug. Für Proliferationsversuche wurden die Zellen mit 5 μΜ Carboxyfluoresceinsuccinimidylester (CFSE) markiert, und es wurden 2 x 10 ⁵ Zellen pro Vertiefung in 96-Lochplatten in Zellkulturmedium RPMI 1640 unter Zusatz von 10 % LPS-freiem FKS (ohne Lipopolysaccharid), 1 % Antibiotika und 0,1 % 50 mM 2-Mercaptoethanol kultiviert. Danach wurden sie mit anti-CEACAM1 -Antikörper (20 μg ml, Klon CC1 ; überlassen von Dr. Kathryn V. Holmes, University of Colorado, Denver, USA) oder rekombinantem Maus-CD40- Liganden (1 μg ml) in Kombination mit Maus-I L4 (10 ng/ml; R&D Systems) oder LPS (10 ng/ml; Sigma Aldrich) 48 h lang behandelt. Ebenso wurden für Inhibitionsexperimente gereinigte B- Zellen (wie oben beschrieben) in dem oben beschriebenen Medium mit rekombinantem Maus- CD40-Liganden (1 μg ml) in Kombination mit Maus-I L4 (10 ng/ml; R&D Systems) kultiviert und mit 10 μΜ Ibrutinib (Seileck) behandelt. Als Kontrolle wurden gleiche Mengen an DMSO (Dime- thylsulfoxid), das zum Lösen von Ibrutinib verwendet wird, in Vertiefungen gegeben. Der Zelltod wurde durch Anfärbung mit 4',6-Diamidin-2-phenylindol (DAPI ; Life Technologies) gemessen. Für Überlebensexperimente wurden B-Zellen wie zuvor angegeben kultiviert und die Zellen wurden mit Annexin-V (BD Biosciences) danach mit DAPI angefärbt. Zu angegebenen Zeitpunkten wurden die Proliferation und das Überleben durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) bestimmt. Für Zellsignalexperimente wurden Splenozyten in VLE-DMEM (Very Low Endotoxin-DMEM) unter Zusatz von 10 % LPS-freiem FKS und 1 % Antibiotika dissoziiert und mit anti-CEACAM1 -Antikörper (Klon CC1 , 20 μς/ιτιΙ,; K. Holmes) und anti-IgM-Antikörper (10 μg/ml) (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.) über unterschiedliche Zeitdauern bei 37 °C behandelt. 1 .2.5 Durchflusszytometrie:

Periphere Blutzellen wurden angefärbt mit Antikörpern anti-Ly6G (RB6-8C5), anti- CDU 5 (AFS98), anti-CD45R (B220; RA3-6B2), anti-CD90.2 (30-H 1 2), anti-CEACAM 1 (CC1 ; mit korrespondierender Isotyp-Kontrolle anti-lgG1 [M 1 -14D1 2]), anti-lgD (1 1 - 26c), anti-CD93 (AA4.1 ), anti-CD1 9 (1 D3) (alle von eBioscience) und anti-lgM (11/41 ; BD Biosciences). Isol ierte Knochenmarkzellen wurden in FACS-Puffer (0,5 M EDTA, 0, 1 % Natriumazid , 1 % FKS in PBS) suspendiert und inkubiert mit Antikörpern anti- CD45R (B220; RA3-6B2), anti-lgD (1 1 -26c), anti-lgM (11-41 ), anti-CEACAM 1 (CC1 ), anti-CD24 (M 1 /69) (alle von eBioscience), anti-CD43 (1 B-1 1 ) und anti-BP1 (6C3) (von BioLegend). Leistenlymphknoten wurden in FACS-Puffer disaggregiert und die Zellen wurden angefärbt auf Antikörper anti-CD45R (B220; RA3-6B2), anti-CD1 9 (1 D3), anti- lgD (1 1 -26c) (alle von eBioscience) und anti-lgM (11/41 ) (BD Biosciences). Milzen wurden in FACS-Puffer dissoziiert und Splenozyten wurden inkubiert mit Antikörpern anti- CD45R (B220; RA3-6B2), anti-CD 1 9 (1 D3), anti-CD93 (AA4.1 ), anti-CD21 /35 (8D9), anti-CD23 (B3B4), anti-lgD (1 1 -26c), anti-CEACAM 1 (CC1 ), anti-CD45.1 (A20), anti- CD45.2 (1 04) (alle von eBioscience) und anti-lgM (11/41 ) (BD). Humane periphere Blut- proben wurden angefärbt mit Antikörpern anti-lgD (IA6-2) und anti-CD27 (M-T271 ) (beide von BD Biosciences) und Antikörper anti-CEACAM 1 (mAB, B3-1 7) (von Dr. Singer, Essen). Peritoneale B-Zellen wurden angefärbt auf Antikörper anti-CD1 9 (1 D3), anti-CD45R (B220; RA3-6B2), anti-lgM (11/41 ) (alle von eBioscience) und anti-CD5 (53- 7.3) (BD Biosciences) und anti-CD43 (1 B-1 1 ) (von BioLegend). Tote Zellen wurden durch Anfärben mit Propidiumiodid (PI , eBioscience) und/oder DAPI diskriminiert und wurden von allen Analysen außer Blutanalysen ausgeschlossen . Für Zellsignalexperimente wurden Zellen gemäß der Herstellerangaben fixiert und permeabilisiert (BD Phosflow, BD Biosciences). Die Zellen wurden mit Antikörper anti-Btk (pY223)/ltk (pY1 80) (BD Phosflow) angefärbt. Alle Antikörper wurden 1 : 1 00 zu ihrer Ausgangskonzentration in FACS-Puffer verdünnt. Zur quantitativen Bestimmung der Gesamtzellzahlen wurden FACS-Partikel verwendet (BD Biosciences). Alle angefärbten Zellen wurden auf einem Durchflusszytometer vom Typ LSRI I oder FACSFortessa (BD Biosciences) analysiert, und die Daten wurden mit Flowjo-Software analysiert. 1.2.6 Gatingstrategie zum Identifizieren von Untergruppen von B-Zellen

Herkunft B-Zelluntergruppe Marker

Knochenmark unreif, neugebildet B220 ⁺ CD43 ^" lgD ^"/low lgM ⁺ reif rezirkulierend, follikulär (FO) B220 ⁺ CD43 ^" lgD ^high IgM ^"

Blut unreif, neugebildet B220 ⁺ lgD ^"/l0W lgM ⁺ reif rezirkulierend, follikulär (FO) B220 ⁺ lgD ^high IgM ^" nativ-ähnlich B220 ⁺ CD93 ^high lgD ^" IgM ^"

Lymphknoten unreif, neugebildet B220 ⁺ CD19 ⁺ lgD ^"/low lgM ⁺ reif rezirkulierend, follikulär (FO) B220 ⁺ CD19 ⁺ lgD ^high IgM ^"

Milz Marginalzone (MZ) B220 ⁺ CD19 ⁺ CD93 ^"/|0W CD21/35 ^high CD23 ^" follikulär (FO) B220 ⁺ CD19 ⁺ CD93 ^"/|0W CD21/35 ^int CD23 ⁺ transitional T1 B220 ^" CD19 ^" CD93 ⁺ CD23 ^" lgM ^high transitional T2 B220 ^" CD19 ^" CD93 ⁺ CD23 ⁺ lgM ^high transitional T3 B220 ^" CD19 ^" CD93 ⁺ CD23 ⁺ lgM ^l0W Tabelle 1 : Gatingstrategie zum Identifizieren von Untergruppen von B-Zellen

1.2.7 LCMV-Glykoprotein GP1 -spezifische IgG-Messungen:

Der Nachweis des LCMV-Glykoprotein GP1 -spezifischen IgG durch ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) wurde schon beschrieben (Recher, M. et al.„Deliberate rem oval of T cell help improves virus-neutralizing antibody production." Nature immunology (2004), 5, 934- 942.). Kurz gesagt, flachbödige 96-Lochplatten Nunc Immuno Plates (Thermo Scientific) wurden mit anti-human IgG (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc) ENREF 60 in Beschich- tungspuffer (0,1 M Na ₂ C0 ₃ + 0,1 M NaHC0 ₃ ; pH 9,6) über Nacht bei 4 °C beschichtet. Am nächsten Tag wurden die Platten mit einem Waschpuffer (PBS mit 0,05 % Tween20) gewa- sehen und 2 Stunden lang eine Blockierung unspezifischer Bindung mit 2 % FKS in PBS vorgenommen. Die Platten wurden mit LCMV Gp-Fc Überstand (hausintern hergestellt) 3 Stunden lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die Platten wurden gewaschen und mit vorverdünntem (1 :20) Serum über 12 Vertiefungen mit Verdünnungen von 1 :3 in aufeinanderfolgenden Vertiefungen eingestellt. Nach einer Inkubation von 90 Minuten wurden die Platten mit HRP- konjugiertem (Horseradish Peroxidase) anti-Maus-lgG-Antikörper (Sigma) inkubiert. Nach einer Stunde Inkubation wurden die Platten wie nachfolgend beschrieben entwickelt.

1.2.8 ELISA-Messungen:

Zum Nachweis von VSV-spezifischen anti-IgG- und anti-IgM-Antikörpern wurden flachbödige 96-Lochplatten Nunc Immuno Plates (Thermo Scientific) mit Baculovirus VSV-GP (Lang, K.S. et al.„MyD88 protects from lethal encephalitis during infection with vesicular Stomatitis virus." European journal of immunology (2007), 37, 2434-2440.) in Beschichtungspuffer 0,1 M NaC0 ₃ (0,1 M Na ₂ C0 ₃ + 0,1 M NaHC0 ₃ ; pH 9,6) über Nacht bei 4 °C beschichtet. Am nächsten Tag wurden die Platten mit einem Waschpuffer (PBS mit 0,05 % Tween20) gewaschen und 1 bis 2 Stunden lang eine Blockierung unspezifischer Bindung mit 2 % FKS in PBS vorgenom- men. Die Platten wurden einmal gewaschen und mit vorverdünntem (1 :15) Serum über 12 Vertiefungen mit Verdünnungen von 1 :3 in aufeinanderfolgenden Vertiefungen eingestellt. Die Platten wurden bei Raumtemperatur 2 h lang inkubiert. Die Platten wurden mit Waschpuffer gewaschen und mit HRP-konjugiertem anti-Maus-lgG-Antikörper (Sigma) oder anti-Maus-IgM- Antikörper (Sigma) 30 bis 60 min lang inkubiert. Die Platten wurden gewaschen und mit 1X TMB Substratlösung (eBioscience) im Dunkeln inkubiert, wonach 10 % H ₂ S0 ₄ -Lösung zugegeben wurde, um die Farbreaktion zu unterbrechen. Die optische Dichte wurde bei 450 nm gemessen (FLUOstar Omega, BMG LABTECH). Es wurden verschiedene Immunglobulin-Isotypen und -Untertypen in naivem Serum von WT-Mäusen und Ceacam 7 ^"A -Mäusen gemessen, wie es beschrieben wurde (Recher, M. et al.„B cell-intrinsic deficiency of the Wiskott-Aldrich Syndrome protein (WASp) causes severe abnormalities of the peripheral B-cell compartment in mice." Blood (2012), 1 19, 2819-2828.)-

1.2.9 Bildung von Maus-anti-Human-CEACAM1 -Antikörper:

Weibliche Mäuse im Alter von 8 bis 10 Wochen wurden in drei Stufen mit humanem CEACAM1 - Fe (50 μg I 90 μΙ in PBS) gemischt mit Gerbu Adjuvans MM (60 μΙ) immunisiert (idealerweise an Tag 0, Tag 14 und Tag 21 ; intraperitoneal (i.p.) die erste, subkutan (s.c.) die zweite und dritte Immunisierung). Die Menge der ersten Immunisierung war die doppelte Menge aller nachfolgenden Immunisierungen. Eine Woche nach der dritten Immunisierung wurde den Mäusen zur Serumgewinnung Blut entnommen. Um zu testen, ob der Titer ausreichend war, wurde ein ELI- SA oder eine Durchflusszytometrieanalyse durchgeführt. Der Titer von Tag 0 bis Tag 21 war in der Regel 100 bis 1000-fach erhöht. Mäuse mit ausreichendem Titer wurden geboostet mit 25 μg humanem CEACAM1 -Fc, gelöst in sterilem PBS ohne Adjuvans i.v. und i.p., vier Tage bevor die Mäuse getötet wurden und die Splenozyten (Milzzellen) gewonnen wurden.

Die Mäuse wurden durch Genickbruch getötet und die Milz wurde unter aseptischen Bedingun- gen entfernt. Die Milz wurde durch ein 70 μηη Nylon-Zellsieb gequetscht. Splenozyten wurden in ein 50 ml Falcon-Röhrchen überführt und dreimal mit DMEM-Medium, das keine Additive (z.B. FKS) enthält, gewaschen. Parallel wurde die Fusionspartner-Zelllinie (die Maus-Myelom- Zelllinie NS1/0) ebenfalls in DMEM gewaschen. Danach wurden Splenozyten und Myelomzellen in einem Verhältnis von 5:1 gemischt und bei 2000 U/min 5 min lang zentrifugiert. Dann wurde der Überstand entfernt und das Zellpellet wurde zur Fusion verwendet. Dazu wurde 1 ml PEG langsam zu dem Zellpellet zugegeben und vorsichtig innerhalb von 1 min vermischt. Danach wurde PEG sehr langsam mit warmen DMEM, nach dem folgenden Protokoll, verdünnt: 1 min = 1 ml, 1 min = 1 ml, 1 min = 1 ml, 1 min = 1 ,5 ml, 1 min = 1 ,5 ml, 1 min = 2,5 ml, 1 min = 2,5 ml, 1 min = 5 ml, 1 min = 5 ml, 1 min = 5 ml, 1 min = 5 ml, 1 min = 5 ml, 1 min = 5 ml. Dann wurden die fusionierten Zellen zentrifugiert (10 min bei 800 U/min) und der Überstand wurde vorsichtig entfernt. Dann wurde das Zellpellet resuspendiert (8 ml HAT-Medium pro 10 ⁷ NS/1/0-Zellen) und die Zellen wurden in flachbödigen 96-Loch-Zellkulturplatten zur HAT- Selektion ausplattiert. Das Medium wurde jeden dritten Tag entfernt. Nach 10 bis 14 Tagen, wenn Zellklone sichtbar waren und das Medium durch die pH-Verschiebung gelb wurde, wur- den Überstände auf sekretierte anti-human-CEACAM1 -Antikörper mittels Durchflusszytometrie und ELISA getestet. Positive Zellklone wurden subkloniert (= monoklonal), weiter getestet und für eine mAb-Produktion verwendet. Anschließend wurden mAbs vom Zellkulturüberstand (beispielsweise 500 ml) über Protein G- Sepharose-Säulen (Säulenchromatographie) gereinigt, durch pH-Verschiebung unter Verwendung von 0, 1 M Glycin-Puffer (pH 2,5) eluiert und gegen sterile PBS dialysiert. Steril-filtrierte mAb-Lösung wurde verwendet, um die Ig-Konzentration durch Messung der OD ₂ 80nm zu be- stimmen und die Konzentration wurde unter Verwendung der Formel OD ₂ 80nm/1 ,36 = x mg/ml berechnet.

1.2.10 Statistische Analyse:

Daten wurden als Mittelwerte ± S. E.M . (Statistischer Standardfehler des Mittels) ausgedrückt. Der Student t-Test wurde eingesetzt, um statistisch signifikante Differenzen zwischen Gruppen zu erfassen . Signifikante Differenzen zwischen verschiedenen Gruppen wurden durch einfaktorielle Varianzanalyse (one-way ANOVA, Analysis of Variance) mit Post-Hoc-Tests nach Bonferroni oder Dunnett erfasst. Das Überleben wurde mit Log-Rank-Tests (Mantel-Cox-Tests) vergl ichen . Das statistische Signifikanzniveau wurde bei P < 0,05 festgelegt.