CAMPO TÉCNICO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se a composições agrícolas para a promoção do crescimento vegetal compreendendo ácido indolacético (AIA) de origem biológica e/ou sintética com fotoestabilidade aumentada, bem como o processo de produção e uso da mesma.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

A produção de hormônios vegetais por bactérias é um dos principais fatores responsáveis por promover o crescimento de plantas. Os fitormônios (auxinas, citocininas, giberelinas, etileno e ácido abscísico) são substâncias orgânicas que desempenham funções na regulação do crescimento em plantas (Raven et al., 2001). A principal auxina de ocorrência natural é denominada de ácido indolacético (AIA) e possui grande potencial para uso como regulador de crescimento vegetal. Diversos microrganismos, como bactérias e fungos no solo e/ou associados às plantas, sintetizam hormônios de crescimento idênticos aos encontrados nas plantas, dentre eles o ácido indolacético (AIA). O uso de composições agrícolas compreendendo hormônios vegetais, tais como AIA, é, portanto, desejável para promover o crescimento de plantas de cultivo.

Em plantas, o AIA microbiano produzido por bactérias do gênero Azospirillum spp., Alcaligenes faecalis, Klebsiella sp., Enterobacter sp., Xanthomonas sp., Pseudomonas spp., Bacillus spp., Herbaspirillum seropedicae, Rhizobium spp. e Bradyrhizobium spp. tem sido relacionado ao estímulo de crescimento vegetal (Patten e Glick, 1996; Idris et al., 2007; Kochar et al., 2011 ; Shao et al., 2015). Acredita-se que um microrganismo pode selecionar uma rota em particular para a biossíntese de AIA, dentre as várias que possui, de acordo com o ambiente. Relata-se também a existência de mais de uma rota para a síntese de AIA em muitas bactérias, sendo a maioria delas a via dependente de triptofano (Patten e Glick, 1996). A indução da biossíntese de AIA através de vias dependentes de triptofano é bem conhecida e estudada (Tullio et al., 2019; lamada et al., 2017). A produção de ácido indolacético por meio da fermentação de Azospirillum é descrita, por exemplo, em CN 104975052.

Embora a molécula de AIA apresente uma estabilidade relativamente elevada frente a fatores físicos tais como temperatura e pH do meio de cultivo (Hiratsuka et al.,1989), a fotodegradação do fitormônio constitui um dos maiores impedimentos com relação ao uso de composições agrícolas compreendendo AIA (Dunlap e Robacker, 1988; Stasinopoulos e Hangarter, 1990 e Hiratsuka et al.,1989). A degradação por luz chega a reduzir até 90% o AIA sintetizado, dependendo do comprimento de onda e intensidade.

Portanto, permanece uma necessidade na técnica por composições agrícolas contendo o fitormônio AIA com fotoestabilidade aumentada, de forma que o composto possa se manter estável e ativo por maiores períodos de tempo após aplicação da composição a uma cultura de plantas em escala comercial.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A Figura 1 mostra a concentração do AIA sintético e AIA biológico em diferentes tempos de exposição à luz UV, submetidos ao processo de estabilização sob condições específicas de temperatura e pressão. Evidência da participação das melanoidinas na fotoestabilidade do composto.

A Figura 2 demonstra a concentração de AIA biológico sob diferentes tempos de estabilização e exposição à luz UV. DESCRIÇÃO DA PRESENTE INVENÇÃO

A presente invenção ensina que, surpreendentemente, é possível obter uma composição para aplicação agrícola composta por ácido indolacético (AIA) com fotoestabilidade aumentada por meio da combinação de AIA com pigmentos do tipo melanoidinas na referida composição. O AIA utilizado nas composições e métodos da presente invenção pode ser de origem biológica e/ou sintética.

Conforme será demonstrado no presente documento, a estabilização mediante a combinação de pigmentos do tipo melanoidina e AIA confere fotoproteção ao AIA de origem biológica e/ou sintética.

Em uma modalidade, a presente invenção fornece uma composição compreendendo uma combinação de AIA com pigmentos do tipo melanoidinas. Uma composição da presente invenção pode opcionalmente conter aditivos, ou veículos agricolamente aceitáveis, tais como aditivos para tratamento de sementes e sulco de semeadura, protetores celulares para tanques de pulverização, condicionadores de solo, adjuvantes de caídas, polímeros para recobrimento de sementes, polímeros para recobrimentos de grânulos de adubos químicos ou orgânicos, fertilizantes sólidos, fertilizantes líquidos utilizados em formulações para produtos foliares, ativadores de endósporos, entre outras finalidades.

Uma composição de acordo com a presente invenção pode ser acondicionada em uma embalagem adequada conhecida na técnica. Preferencialmente pode ser utilizada uma bolsa e/ou frascos plásticos sem a necessidade de troca de oxigénio do produto final. O acondicionamento do produto apresentado pela presente invenção dispensa a necessidade de proteção luminosa, por apresentar fotoestabilidade. Preferencialmente, o volume envasado pode conter aproximadamente 1 - 20 L e pode ser estocado em ambientes refrigerados, ou à temperatura ambiente, compreendendo a faixa de aproximadamente 10 - 35°C. A presente invenção fornece ainda métodos de preparação de uma composição agrícola de AIA com fotoestabilidade aumentada através da combinação do AIA com melanoidinas. Em uma modalidade específica da presente invenção, a combinação de AIA com pigmentos do tipo melanoidinas é realizada por meio da submissão de uma mistura compreendendo AIA e fontes de nitrogénio e açúcares redutores a condições de temperatura e pressão que promovem a conversão das fontes de nitrogénio e açúcares redutores em pigmentos do tipo melanoidinas através da reação de Maillard. Em uma modalidade alternativa, o AIA e os pigmentos do tipo melanoidinas são combinados após a formação dos referidos pigmentos pela reação de Maillard.

O termo “fontes de nitrogénio” inclui, porém não está limitado a, aminoácidos, peptídeos e proteínas de origem biológica ou sintética conhecidos na técnica e misturas ou extratos biológicos contendo os mesmos.

O termo “açúcares redutores” inclui, porém não está limitado a, qualquer açúcar capaz de atuar como agente redutor porque possui um grupo aldeído livre ou um grupo cetona livre conhecidos na técnica e misturas ou extratos biológicos contendo os mesmos.

Em uma modalidade preferencial da presente invenção, a mistura compreendo o referido AIA e as referidas fontes de nitrogénio e açúcares redutores é obtida por meio da fermentação de bactérias produtoras de AIA, em meio de cultura contendo triptofano. O caldo obtido a partir da referida fermentação contém AIA produzido pelas bactérias e fontes de nitrogénio e açúcares redutores oriundos do meio de cultura fermentado. Após a referida fermentação, o caldo é submetido a condições de temperatura e pressão que promovem a conversão das fontes de nitrogénio e açúcares redutores em pigmentos do tipo melanoidinas através da reação de Maillard, de forma que os pigmentos do tipo melanoidina conferem fotoproteção ao AIA da composição. O termo “bactérias produtoras de AIA” inclui, porém não está limitado a, bactérias do gênero Azospirillum spp., Alcaligenes faecalis, Klebsiella sp., Enterobacter sp., Xanthomonas sp., Herbaspirillum seropedicae, Rhizobium spp. e Bradyrhizobium spp. (Patten e Glick, 1996). Preferencialmente a bactéria produtora de AIA é Azospirillum brasilense.

Sendo assim, uma modalidade específica preferencial da presente invenção inclui um método de produção em escala industrial de uma composição para uso agrícola compreendendo as etapas de fermentação de uma cultura compreendendo uma ou mais estirpes de bactérias produtoras de AIA e triptofano, para a biossíntese de ácido indolacético (AIA); e estabilização sob condições de temperatura e pressão que promovem a conversão das fontes de nitrogénio e açúcares redutores em pigmentos do tipo melanoidina através da reação de Maillard.

A presente invenção fornece ainda uma composição produzida pelo método da presente invenção, bem como o uso da mesma.

Vantajosamente, em uma modalidade preferencial, a presente invenção permite a obtenção de uma composição agrícola de AIA com fotoestabilidade aumentada obtida apenas por rotas biológicas e livre de insumos sintéticos. A presente invenção fornece também modalidades preferenciais que incluem parâmetros adicionais para o método de produção de uma composição agrícola de AIA em escala industrial, tais como parâmetros de pressão, temperatura, oxigenação (volume de ar e agitação) e meios de cultura para a fermentação de bactéria produtora de AIA que permitem a produção de elevadas concentrações de AIA.

Como será entendido pelo técnico no assunto, diferentes estirpes de bactéria produtora de AIA, preferencialmente Azospirillum brasilense, poderão ser empregadas, bem como diferentes parâmetros de cultura e fermentação podem ser combinados com a presente invenção. Em uma modalidade preferencial, a presente invenção fornece um processo de produção de uma composição agrícola compreendendo as etapas de:

(a) fermentação de uma cultura compreendendo uma ou mais estirpes de bactéria produtora de AIA e triptofano para a biossíntese de ácido indolacético (AIA); e

(b) estabilização sob condições de temperatura e pressão que promovem a conversão das fontes de nitrogénio e açúcares redutores em pigmentos do tipo melanoidina através da reação de Maillard.

Surpreendentemente, a fotoestabilidade do AIA em uma composição de acordo com a presente invenção é obtida por meio da combinação com melanoidinas, sem os quais a utilização do bioproduto na agricultura seria impossibilitada devido à degradação do mesmo pela luz. Os pigmentos acima descritos são capazes de filtrar a luz que incide sobre o produto final protegendo o fitormônio AIA, seja ele biossintetizado através da rota induzida por triptofano ou de origem sintética.

Em uma modalidade preferencial da presente invenção, os pigmentos melanoidina são oriundos de um processo conhecido como reação de Maillard. Esta reação apresenta três estágios, de acordo com a intensidade, sendo que no mais avançado ocorre a polimerização de compostos amino com fragmentos de açúcares em pigmentos castanhos, melanoidinas (Van Boekel, 1998). Nas concretizações envolvendo o uso de uma mistura consistindo em um caldo obtido por meio da fermentação de bactérias produtoras de AIA, essa reação ocorre após a referida fermentação, convertendo as fontes de nitrogénio e açúcares redutores, inseridos ao longo do processo fermentativo, nos pigmentos que garantem a estabilidade do AIA. Isso faz com que os elevados índices do fitormônio no produto final permaneçam com elevada estabilidade, mesmo em condições de irradiação luminosa, no interior da embalagem na qual o produto é armazenado e comercializado, ou na aplicação agrícola em sementes, sulco de plantio, irrigação ou via foliar, ambientes sob elevada incidência de comprimentos de onda UV, sem prejudicar sua eficiência agronómica.

Em uma modalidade específica, a bactéria produtora de AlA éAzospiríilum sp., mais preferencialmente Azospirillum brasilense. Em uma modalidade preferencial, uma ou mais estirpes de A. brasilense são selecionadas do grupo consistindo em Ab-V5, Ab-V6, Sp6, Sp7, Sp245, Cd, 8-1, Az39. Em uma modalidade ainda mais preferencial, são utilizadas ambas as estirpes Ab-V5 e Ab-V6. Em uma modalidade preferencial, a estabilização do fitormônio é realizada no ambiente do fermentador. Preferencialmente, o processo de estabilização é realizado por aproximadamente 15 a 120 minutos, a uma temperatura de aproximadamente 100 °C a aproximadamente 130 °C. Preferencialmente, a estabilização do produto é realizada a uma pressão de aproximadamente 0,5 - 2,0 Kgf/cm ² .

Em uma modalidade preferencial, de acordo com a presente, invenção a fermentação da cultura de A. brasilense por batelada, ou batelada alimentada, ocorre por aproximadamente 18 - 96 horas.

Em uma modalidade preferencial, o método da presente invenção compreende a expansão sequencial (escalonamento) da cultura de A. brasilense para inoculação da cultura de fermentação. Preferencialmente, a expansão sequencial é iniciada em volumes de 100 ml_, que serve de inoculo para cerca de 10 L. Esses, por sua vez, são inoculados em cerca de 180 L, que, por fim, são transferidos para reatores contendo cerca de 2.000 L.

Em uma modalidade preferencial, as culturas das estirpes de A. brasilense são expandidas em frascos de cerca de 100 ml_ por incubação em agitador orbital a cerca de 80 rpm a cerca de 150 rpm. O tempo de incubação é de preferencialmente cerca de 18 horas a cerca de 96 horas. Preferencialmente, as estirpes de A. brasilense são então cultivadas em balões de aço inoxidável contendo cerca de 10 L de meio de cultura. O tempo de incubação é de preferencialmente cerca de 18 a cerca de 96 horas com vazão de ar de cerca de 0,25 Nm ³ /h a cerca de 1 ,0 Nm ³ /h (=0,41 - 1,66 vvm).

Em uma modalidade preferencial, a temperatura de cultura para multiplicação das estirpes de A. brasilense de acordo com a presente invenção é de cerca de 22 °C a cerca de 38 °C.

Em uma modalidade preferencial, as estirpes Ab-V5 e Ab-V6 de A. brasilense são inoculadas juntas no processo de escalonamento a partir dos 180 L de cultivo descrito para a presente invenção. Para isso, em uma modalidade preferencial, após o cultivo das estirpes em dois balões de aço inoxidável de cerca de 10 L, os referidos balões são inoculados em tanques contendo cerca de 180 L de meio de cultura, incubadas por cerca de 18 a cerca de 96 horas. A vazão de ar é, preferencialmente, de cerca de 1 ,25 a cerca de 3,0 Nm ³ /h (= 0,1 - 0,25 vvm).

Em uma modalidade preferencial, a etapa de fermentação é conduzida com temperatura de cerca de 22 °C a cerca de 38 °C. A vazão de ar é de preferencialmente cerca de 1,0 Nm ³ /h a cerca de 2,5 Nm ³ /h (= 0,0085 - 0,021 vvm). A pressão é preferencialmente de cerca de 0,5 a cerca de 1 ,2 kgf/cm ³ . A agitação é preferencialmente de cerca de 40 hz a cerca de 45 hz. A etapa de fermentação é preferencialmente conduzida durante cerca de 18h a cerca de 96h.

Em uma modalidade preferencial, o meio de cultura utilizado para escalonamento da cultura de A. brasilense e/ou de fermentação para a escala dos 100 ml_ é o meio NFb (Dõbereiner, 1995). Para as demais escalas de produção, 10, 180 e 2000 L, em uma modalidade preferencial, utiliza-se o meio de cultivo descrito na tabela 1. Em uma modalidade alternativa, a presente invenção fornece uma composição agrícola de AIA com fotoestabilidade aumentada obtenível por um método de acordo com a presente invenção como descrito acima .

Em uma modalidade alternativa, a presente invenção fornece ainda o uso da composição agrícola de acordo com a presente invenção para aplicação em culturas agrícolas como promotor do crescimento vegetal ou produto bioquímico. Preferencialmente o uso é para aplicação em sementes, no sulco de plantio, irrigação ou via foliar, por pulverização.

Em uma modalidade alternativa, a presente invenção fornece o uso do fitormônio AIA fotoestabilizado, de acordo com a presente invenção, para a preparação de uma composição agrícola para otimizar o crescimento de uma cultura agrícola e/ou aumentar o rendimento de uma cultura agrícola.

Em uma modalidade alternativa, a presente invenção fornece planta, parte de planta e/ou semente revestidas pela composição obtida de acordo com a presente invenção.

EXEMPLOS

Exemplo 1 - Escalonamento da cultura

Estirpes Ab-V5 e Ab-V6 de Azospirillum brasilense são inoculadas separadamente em frascos contendo 100 mL de meio de cultura NFb (Dõbereiner, 1995), incubados em agitador orbital de 80-150 rpm, à 22- 38 ^° C por aproximadamente 18-96 horas. A próxima etapa de escalonamento consiste da inoculação de balões de aço inoxidável contendo 10 L de meio cultura (Tabela 1), na qual as estirpes são cultivadas separadamente e incubadas por aproximadamente 18 - 96 horas, com vazão de ar 0,25-1 ,0 Nm ³ /h (=0,41 - 1 ,66 vvm) e temperatura aproximadamente de 22-37 ^° C. Decorrido esse tempo, cada cultura é inoculada em tanques contendo 180 L de meio de cultura e incubados por aproximadamente18 - 96 horas, com vazão de ar 1 ,25-3,0 Nm ³ /h (= 0,1 - 0,25 vvm) e temperatura variando de 22-38 ^° C. Tabela 1. Meio de cultura utilizado para o crescimento da Azospirillum brasilense, estirpes Ab-V5 e Ab-V6

Tabela 2. Solução estoque de micronutrientes e quantidade necessária para 1 L de solução final de micronutrientes

Exemplo 2 - Fermentação em biorreator

Para o crescimento em fermentador de 2.000 L, é utilizado o meio de cultura contendo o aminoácido triptofano como informado na Tabela 1. Os parâmetros de crescimento do A. brasilense em fermentadores de 2.000 L são: pressão de 0,5 - 1 ,2 kgf/cm ³ , agitação variando de 40 - 45 hz, à 22 - 38 °C e vazão de ar 1,0 - 2,5 Nm ³ /h (= 0,0085 - 0,021 vvm), por 18 - 96 h. Exemplo 3 - Estabilização

Decorridos 18 - 96 h de fermentação é realizado o processo de estabilização dos metabólitos por meio da esterilização do meio de cultivo contendo microrganismos por aproximadamente de 15 - 120 minutos, 100 - 130 °C e 0,5 a 2,0 Kgf/cm ² de pressão.

Exemplo 4 - Fotoestabilidade

Para a validação da formulação que garante a fotoestabilidade do fitormônio ácido indolacético foram realizados dois procedimentos. No primeiro ensaio foram comparados: i) o AIA sintético com água (sem a proteção das melanoidinas); ii) o AIA sintético com o mesmo meio de cultura utilizado no processo de produção de AIA biológico da presente invenção e iii) o AIA biológico; sendo que todas as amostras passaram pelo processo de esterilização a 121°C por aproximadamente 1 hora, conforme reivindicado para a estabilização dos compostos indólicos devido à produção de melanoidinas através da reação de Maillard. Decorrido esse período necessário para o processo de estabilização, foram avaliadas as concentrações de AIA utilizando o reagente de Salkwolski, de acordo com a metodologia proposta por Glickmann e Dessaux (1994).

Os resultados apresentados no gráfico 1 demonstram que o AIA sintético sem o processo de estabilização reivindicado é completamente degradado após 4 horas de exposição à luz UV. Na primeira hora de exposição a fotodegradação já atinge 74,5%. Entretanto, quando avaliado o AIA produzido biologicamente por Azospirillum brasilense encontrou-se maior estabilidade, uma vez que a redução da concentração deste composto foi menor comparado com AIA sem estabilização (diluído em água), especialmente após 1 , 2 e 4 horas de exposição à luz UV com apenas 0,7%, 17,2% e 29,1% de degradação respectivamente. Do mesmo modo, quando adicionamos o AIA sintético na formulação apresentada na solução técnica, seguido da etapa de estabilização, obtivemos o mesmo comportamento, de fotoproteção à luz UV. Isso demonstra a surpreendente capacidade dos pigmentos produzidos através da reação de Maillard, as melanoidinas, na proteção do fitormônio ácido indolacético de origem biológica e sintética da fotodegradação. Leasure e colaboradores (2013) reportaram a dificuldade da utilização do ácido indolacético em plantas devido a elevada taxa de fotodegradação, evidenciando a importância da solução prática reivindicada para a viabilização da utilização agrícola em escala comercial do AIA, um potente promotor de crescimento vegetal, de origem natural, capaz de contribuir com a sustentabilidade do agronegócio.

No segundo procedimento (Gráfico 2), foram avaliados diferentes tempos do processo de estabilização da formulação com o AIA biológico, variando entre 15 minutos, 1 hora e 1h 30 minutos, a fim de avaliar o papel da concentração de melanoidinas na fotoproteção.

Assim como encontrado para o primeiro ensaio, o processo de estabilização do fitormônio AIA foi eficaz e aumentou a estabilidade do composto frente a radiação luminosa ultra-violeta. Nota-se ainda que, a exposição do composto indólico a diferentes tempos do processo de estabilização promove a fotoproteção em uma relação diretamente proporcional, ou seja, quanto maior o tempo do processo, maior a estabilidade obtida, especialmente quando o processo de estabilização do AIA biológico foi de 1h e 30 minutos, proporcionando alta estabilidade do AIA sintetizado por Azospirillum brasilense. O efeito surpreendente no incremento da estabilidade do AIA foi confirmado aplicando-se o teste de médias Scott-Knott (p<0,05) com diferenças significativas em todos os tempos de exposição à luz ultravioleta testados no presente ensaio. É importante salientar que embora ocorra 54,85% da fotodegradação do AIA biológico sem realizar o processo de estabilização, a proteção parcial do AIA biológico ocorre devido ao processo da esterilização do meio de cultura antes do cultivo dos microrganismos. Os resultados obtidos demonstram a efetividade dos pigmentos produzidos durante o processo de estabilização, melanoidinas, apresentados pela solução técnica no aumento da estabilidade do fitormônio AIA submetido à radiação luminosa. Essa solução proporciona diversas possibilidades para aplicação do composto promotor do crescimento vegetal e contribui com a sustentabilidade agrícola, fundamental para o equilíbrio socioambiental, sendo positivamente impactado por soluções inovadoras e aplicáveis, que entregam incrementos para as culturas de importância e não degradam o ambiente.