SIAMENSIS RGM 2529 Y EXCIPIENTES AGRÍCOLAS; USO DE LA FORMULACIÓN Y MÉTODO PARA PROMOVER EL CRECIMIENTO Y/O AUMENTAR EL RENDIMIENTO DE CULTIVOS Y/O PROTEGERLOS CONTRA ENFERMEDADES Y PLAGAS.

Campo de la invención

La presente invención está dirigida a formulaciones de uso agrícola que contienen bacterias o mezclas de estas, las cuales presentan características de potenciador de crecimiento de cultivos y de control biológico de plagas. La presente invención se enfoca en el área de la biotecnología, particularmente en el desarrollo de productos agrícolas que potencien el crecimiento de los cultivos y eviten y controlen la infección por patógenos en cultivos mediante el uso de formulaciones que contienen una o una mezcla de bacterias con estas características.

Descripción del estado de la técnica

La producción agrícola requiere de medidas sustentables que permitan la reducción y el buen uso del agua, los fertilizantes y los pesticidas, pero que también permitan mantener la calidad del suelo, fortalecer el crecimiento de cultivos y evitar plagas, estas últimas las causantes de grandes pérdidas económicas. Los insumos para la agroindustria a base de microorganismos benéficos han ¡do apareciendo como respuesta a la demanda de mercados mundiales por alimentos de alta calidad, producidos en forma amigable con el medio ambiente, trazables e inocuos (Altier et al. , 2012).

Los productos para la agroindustria de origen biológico son formulados con microorganismos (por ejemplo, bacterias, hongos, virus) o con compuestos activos derivados de microorganismos o de plantas. Todos estos productos se enfocan en mejorar la productividad, calidad, salud de las plantas y características biológicas de los suelos (Altier et al., 2012). En el caso de productos que contienen microorganismos, estos son seleccionados por su capacidad de promover el crecimiento vegetal de forma directa facilitando la absorción de nutrientes por la planta (biofertilizantes) o de forma indirecta contribuyendo al manejo sanitario de enfermedades por plagas de impacto económico (Biocontroladores). Cabe mencionar que muchas de estas cepas que son utilizadas con estos fines pueden presentar características de fertilizantes y/o de biocontroladores (Altier et al., 2012)

Los microorganismos que colaboran en el crecimiento de las plantas son denominados como PGPR, por sus siglas en inglés (Plant Growth Promoting Rhizobacteria). El suelo es un ecosistema que presenta una variedad de microorganismos beneficiosos. La fracción de suelo que presenta este tipo de microorganismos se encuentra donde existe la mayor presencia de raíces (rizosfera) (Chollo et al., 2012). En la rizosfera pueden convivir consorcios bacterianos promotores del crecimiento vegetal de forma directa e indirecta (Mayak et al. 1999), colonizan las raíces o su entorno más cercano y favorecen el crecimiento de las plantas empleando mecanismos de fijación de nitrógeno atmosférico, la solubilización de fosfatos insolubles, secreción de hormonas y enzimas (Glick et al., 1994; Chollo et al., 2012). Estas bacterias pueden clasificarse en tres grupos principales a) aquellas que colonizan el tejido de la planta y forman nodulos (simbióticas), b) aquellas que se hospedan en estructuras internas de la planta (endofiticas), y c) aquellas que se encuentran cerca del sistema radicular de la planta (Chollo et al., 2012).

Múltiples estudios han publicado que las PGPR se asocian con cultivos importantes tales como Oryiza sativa, Triticum spp., Sorghum spp, Sacharum officinarum, Zea mays y pasturas Dentro de las PGPR más referenciadas son Azospirillum sp., Bacillus sp., Rhizobium sp., Burkholderia sp., Enterobacter sp., Azotobacter sp., Erwinia sp., Herbaspirillum sp., Klebsiella sp., Pseudomonas sp. yXanthomonas sp. (Chollo et al., 2012).

Dentro de las bacterias PGPR mencionadas en el párrafo anterior se encuentran aquellas pertenecientes al género Bacillus. Estas bacterias gram positivo son ubicuas, es decir pueden habitar en diferentes nichos ecológicos, incluyendo el suelo (Pignatelli et al., 2009). Las bacterias del género Bacillus que habitan en los suelos pueden tener características de PGPR. Por ejemplo, estas bacterias tienen la capacidad de fijar nitrógeno atmosférico (N2). Enzimas del tipo nitrogenasa pertenecientes a esta bacteria reducen el N2 a amoniaco (NH3), este último es absorbido por la planta. Ademas, estas bacterias juegan un rol importante en la solubilización de fosfatos (P) para que este compuesto pueda estar disponible para las plantas, para ello, las bacterias utilizan enzimas como a fosfatasa, fitasa, hidrolasas entre otras (Hayat et al., 2010). Con respecto a la solubilización de componentes realizado por estas bacterias, también se presenta la solubilización de potasio (K). Este compuesto es necesario para la activación de diversas enzimas de las plantas y animales que tienen como fin participar en el metabolismo energético, como la síntesis de almidón, reducción de nitratos, degradación de azúcares y una de las funcionas más importantes, la fotosíntesis (Etesami et al., 2017)

Además de las características de las bacterias de género Bacillus en la fijación y solubilización de compuestos que favorecen el crecimiento de las plantas, también se presenta la secreción de compuestos con actividad antimicrobiana. Estos compuestos antimicrobianos, son secretados por las bacterias que actúan como antagonistas frente a otras especies patógenas. Estos compuestos son moléculas, particularmente péptidos y polipéptidos de síntesis no ribosomal compuestos por poliquétidos, bacteriocinas y sideróforos, así como compuestos volátiles. En general poseen un amplio espectro de acción (bacterias, hongos) y las cepas de Bacillus presentan una capacidad de control biológico predominante mediante la secreción de estas moléculas, inhibiendo el crecimiento de patógenos en las plantas.

- Bacillus safensis

Descrita como un promotor de crecimiento vegetal y agente de control patógeno, Bacillus safensis es una especie que tiene la capacidad de endofitar y de habitar la rizosfera de las plantas, lo que promueve el crecimiento de estas. Para potenciar el crecimiento de las plantas, B. safensis solubiliza el fosfato (P) del suelo y producción de sideróforo, ácido indol-3-acético y 1-am¡noc¡clopropano-1- carboxilato deaminasa (Yadav et al. 2011 ; Chakraborty et al. 2013; Kavamura et al. 2013). Además, se ha reportado que esta bacteria puede actuar como biocontrolador, presentando efectos antimicóticos, antibacterianos y antivirales en diversos cultivos de manera individual o en compañía de otras bacterias (Sun et al. 2014). - Bacillus siamensis.

Esta bacteria del género Bacillus fue aislada en el año 2010 desde un cangrejo tailandés, denominando a esta cepa como B. siamensis KCTC 13613. Se ha observado que esta cepa tiene la capacidad de inhibir significativamente el crecimiento del micelio de los hongos patógenos de plantas Rhizoctonia solani y Botrytis cinérea, además de presentar actividad antimicrobiana sobre la bacteria gram positiva Micrococcus luteus (Jeong et al., 2012). Por otro lado, se ha observado que B. siamensis puede incrementar significativamente el crecimiento de plántulas de Arabidopsis thaliana sin contacto físico con las plántulas, lo que sugiere que las sustancias volátiles producidas por estas bacterias podrían promover el crecimiento de las plantas (Jeong et al., 2012).

Diversos documentos pertenecientes al estado de la técnica, han publicado las cualidades de los microorganismos, como las bacterias, para potenciar el crecimiento de plantas y para actuar como controladores biológicos sobre otros patógenos que afecten a las plantas. Por ejemplo, en el documento de Haeyoung y colaboradores, publicado en el año 2012, describe una nueva especie de bacteria halófila, perteneciente el género Bacillus, la cual es capaz de producir compuestos antimicrobianos contra patógenos de plantas (particularmente hongos como Rhizoctonia solani y Botrytis cinérea) y promover el crecimiento de estas por emisión de compuestos volátiles. El documento científico publicado por Wu y colaboradores en el año 2015, presenta una revisión de formulaciones de biocontrol que son generadas a partir de bacterias promotoras del crecimiento vegetal, los cuales han demostrado ser una alternativa para el control de patógenos en los cultivos, además de potenciar el crecimiento de la planta.

Se ha descrito que las bacterias del género Bacillus, presentan características que les permiten convivir con las plantas, particularmente en la rizosfera y promover el crecimiento de las plantas. También, se ha descrito que las bacterias del género Bacillus producen compuestos antimicrobianos para que puedan controlar el crecimiento de otros patógenos en plantas. Estas características han sido descritas en documentos como el presentado por Borris R, en el año 2011.

Con respecto a la invención, los documentos Agbaje y colaboradores (2015) y Haeyoung y colaboradores (2012), han descrito las características de B. siamensis y B. safaensis en la promoción del crecimiento de las plantas como el antagonismo de estas en el crecimiento de patógenos.

Con respecto a la invención, se presentan documentos de patente que revelan el uso de microorganismos del género Bacillus, particulamente, B. siamensis y B safensis como agentes potenciadores del crecimiento en plantas y biocontroladores. Tal es el caso de los documentos de patente CN 109468243 y KR 1020190061210, los cuales presentan el uso de B siamensis, particularmente, en el primer documento se divulga el uso de B. siamensis como un agente biocontrolador ya que presenta un antagonismo significativo contra patógenos, en el caso particular de este documento, se presenta la inhibición del crecimiento de que producen la pudrición de tallos y manchas en hojas. Mientras que en el segundo documento se divulga el uso de esta bacteria ya que presenta características de reducción de nitrógeno, por lo que se indica que puede utilizarse para potenciar el crecimiento de plantas o para el tratamiento de aguas.

Los documentos CN109456915 y CN108330092 divulgan el uso de la bacteria B. safensis, como agente potenciador del crecimiento de plantas. En estos documentos se describen las características de esta bacteria como la degradación de fósforo (P) en el suelo. Por otro lado, los documentos KR1020140079201 , CN108865934, CN108330092, CN106119146 describen la utilización de esta bacteria y/o sus cultivos como antagonistas para el crecimiento de patógenos de plantas, como B. cinérea

Descripción detallada de la invención

La presente invención corresponde a una formulación agrícola, la cual se compone de una o dos cepas bacterias que presentan características promotoras del crecimiento en plantas (PGPR) y características de bioprotector y biocontrolador. La formulación puede comprender las bacterias de forma individual o una mezcla de las cepas Bacillus safensis RGM 2450 y Bacillus siamensis RGM 2529. Ambas bacterias son definidas de acuerdo a su número de registro o depósito en el banco microbiano IDA en las fuentes microbianas genéticas chilenas en I NIA, Quilamapu, Chile. Las bacterias de la presente invención son utilizadas mediante una formulación y tienen como característica una función bioestimulante, bioprotectora y biocontroladora.

Otro aspecto de la presente invención se refiere a un biofertilizante que mejora el rendimiento de los cultivos, que comprende a la mezcla de bacterias promotoras del crecimiento en plantas y excipientes agrícolamente aceptables.

Otro aspecto de la presente invención protege dos procesos que optimizan los cultivos agrícolas. En primera instancia, la presente invención protege el bienestar de las plantas. En este sentido, la presente invención tiene como objetivo el aumentar la disponibilidad de elementos que son considerados nutrientes para las plantas, como el nitrógeno (N2), el potasio (K) y el fósforo (P), potenciando su crecimiento. En la presente invención, el aumento de la disponibilidad de nutrientes para las plantas se genera mediante el uso de bacterias presentes de forma natural en el suelo, que presentan la capacidad de solubilizar estos compuestos (K y P) y la fijación de nitrógeno (N2).

En segundo lugar, en la presente invención se protege la seguridad de los cultivos mediante la protección contra agentes patógenos. En la presente invención, esta protección está dada ya que las bacterias utilizadas tienen la capacidad de liberar sustancias o moléculas que son perjudiciales para los organismos patógenos. Considerando ambas características (potenciamiento del crecimiento de plantas y protección a patógenos), es que en la presente invención logra aprovechar los mecanismos biológicos de estas bacterias y por consecuencia, reducir o eliminar por completo la aplicación de agroquímicos o fertilizantes necesarios en el suelo, reduciendo el impacto ambiental y humano. De forma particular, las bacterias Bacillus safensis RGM 2450 y Bacillus siamensis RGM 2529 producirían compuestos antimicrobianos contra un amplio espectro de bacterias y hongos. En el caso de B. siamensis RGM 2529 se ha demostrado que esta cepa produciría potencialmente compuestos antimicrobianos con efecto antibacteriano sobre S. aureus ATCC 25923, M. luteus CMCC 28001, B. pumilus CMCC 63202, B. cereus ATCC 14579, B. subtilis ATCC 168, Listeria monocytogenes CICC 21662, Enterococcus faecalis ATCC 29212 y P. fluorescens ATCC 49642, B. thuringiensis, E. coli, Klebsiella pneumoniae, M. xanthus, P. vulgaris, Serratia marcescens, S. aureus, L. pneumophila, L. monocytogenes , P. syringae , R. solanacearum , Xanthomonas axonopodis pv. Glycines, Brevibacillus brevis, Bacillus cereus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, B. pumilus, Bacillus sphaericus, B. subtilis, Clavibacter michiganensis, Micrococcus luteus, Paenibacillus granivorans, Paenibacillus polymyxa. En cuanto a hongos, se incluyen en el alcance del efecto bioprotector de la formulación, Coriolopsis spp. Fusarium sp, Pseudoxylaria sp., Tríchoderma sp., Umbelopsis sp., F. oxysporum f. sp. Capsica, A. niger, B. cinérea, F. solani, Monilia fructigena, Pennicilium expansum, P. italicum, R. solani, Alternaría alternata, A. solani, Aspergillus flavus Botryosphaerica ribis , C. albicans, Cryphonectria parasitica, Colletotrichum acutatum, Colletotrichum gloesporioides, Didymella bryoniae, F. graminearum, F. oxysporum, Ustilago maydis , Monilinia fructicola, Penicillium expansum, Phomopsis gossypii, Phytophthora capsici, Pyricularia grísea, R. solani, Sclerotium rolfsii, S. sclerotiorum, Alternaría solani, Botrytis cinérea, Fusarium graminearum , Fusarium sambucinum , Fusarium oxysporum , Podosphaera fusca , Pythium sulcatum , Pythium ultimum, Rhizoctonia solani, Rhizopus sp., Sclerotinia sclerotiorum.

B. safensis RGM 2450 produciría compuestos antimicrobianos contra Clavibacter michiganense subsp. sepedonicum, Erwinia amylovora, Escherichia coli, Salmonella typhi, Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, Brevibacillus brevis, Bacillus cereus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus pumilus, Bacillus sphaericus, B. subtilis, Micrococcus luteus, Paenibacillus granivorans. También, podría tener un efecto antifúngico sobre hongos tales como Candida albicans, Microcystis aeruginosa, Phytophthora infestans, S. cerevisiae, Aspergillus fumigatus, Candida albicans y F. oxysporum f. sp. Capsica.

Ambas cepas pueden además secretar enzimas como proteasas, serinproteasas, entre otras, para las cuales se ha descrito su efecto antibacteriano y antifúngico. Por tanto, como parte del alcance de la invención, se incluye el efecto bioprotector de las cepas de forma independiente y en conjunto en la formulación contra una gran variedad de hongos y bacterias fitopatógenas.

En un tercer aspecto, la formulación y las bacterias descritas presentan un efecto biocontrolador de fitopatógenos, es decir, tiene por función disminuir el crecimiento de la población de patógenos, en este caso en cultivos y plantas. Se demuestra que las bacterias y la formulación tienen efecto antibacteriano contra Fusarum sp., Phytophthora sp., Collectotrichum sp. y Botrytis sp.

Los resultados obtenidos evaluados en Fusarum sp., permiten señalar que las cepas RGM 2450 y RGM 2529 causaron una inhibición en el crecimiento de 24% y 4% por contacto directo, y 53% y 41 % por ensayo de antibiosis, respectivamente. Por otro lado, la cepa RGM 2450 causó una inhibición del 45% y antibiosis de 41 % al estar en contacto directo con Phytophthora sp., y la cepa RGM 2529 presento una inhibición del 80% y 52% de antibiosis. Tanto para Fusarum sp. y Phytophthora sp. Amabas bacterias inhiben la producción de compuestos volátiles.

En el caso de Collectotrichum sp., la cepa RGM 2450 inhibió un 43% y un 53% para los ensayos de contacto directo y antibiosis, respectivamente; para RGM 2529 se observó una disminución en el halo de crecimiento del patógeno de un 78% por contacto directo, y de un 70% por antibiosis.

Para Botrytis, los ensayos demuestran que las cepas RGM 2450 y RGM 2529 inhiben el crecimiento de este fitopatógeno de forma significativamente mayor que el producto comercial de referencia desprovisto de sus coformulantes (bacteria Bacillus subitillis QST 713), alcanzando un porcentaje de inhibición del 50% tanto al emplear cada cepa RGM por separado, como al hacerlo aplicando la mezcla de ambas.

En otro aspecto de la invención, la mezcla de cepas bacterianas se combina para obtener un biofertilizante en conformidad con los principios de la presente invención, en donde las cepas bacterianas se encuentran en concentraciones preferidas 3,0x10 ⁶ - 4,0x10 ⁹ UFC/g (RGM 2529) y 5,0x10 ⁶ - 4x10 ⁹ UFC/g (RGM 2450).

Otro aspecto de la invención se refiere a un biofertilizante que comprende a la mezcla de bacterias y un excipiente agrícolamente aceptable que tienen por función potenciar el crecimiento de las plantas de cultivo.

En otro aspecto de la invención, el excipiente de uso agrícola y/o agrícolamente aceptable comprende el uso, pero sin limitarse de harina de trigo, fécula de maíz, gelatina, almidón de papa, dioxido de silicio, acido cítrico, bicarbonato, polisorbatos como Tweens, lactosa, lecitina de soya, caseína, carboximetil celulosa o goma de celulosa, esteres de sacarosa, manitol, sorbitanos, F68 plurónico, alginato, goma xantan, PEG (polietilenglicol), sirope de maíz, huevo, leche, glicerol, fructosa, pectinas, aceite mineral, goma de ester, triglicéridos de cadena larga.

En otro aspecto de la invención, un biocontrolador comprende un organismo que inhibe el crecimiento de otro, éste último siendo un organismo patógeno. En un aspecto particular de la invención, el biocontrolador comprende la mezcla de las cepas Bacillus safensis RGM 2450 y Bacillus siamensis RGM 2529.

En otro aspecto de la invención, el biofertilizante/biocontrolador de la presente invención puede tener como portador un suelo pre-empacado, un recubridor de semillas, un polvo, un granulado, un nebulizador, una suspensión o un líquido o cualquiera de las vahantes expuestas encapsuladas.

Es parte del alcance particular de la invención que las cepas Bacillus safensis RGM 2450 y Bacillus siamensis RGM 2529 forman parte de una formulación que puede administrarse como una pastilla de liberación prolongada, un sólido en polvo mojable, como pastilla efervescente, como una resuspensión, emulsión bacteriana o mezclas de estos. Es parte del alcance de la invención la administración de la formulación en conjunto con fertilizantes. Se prefiere, su administración con porcentajes de 0, 33, 66 y 100% de fertilizante.

Las diferentes formas de presentación de la formulación pueden ser administradas a la semilla o en la base del tallo. En el caso de semillas, éstas se impregnan con tampón PBS o similar y se sumergen por completo en la formulación, prefiriéndose una concentración de 10 ⁹ UFC/mL de bacterias. Para la aplicación en la base del tallo de las plantas se prefiere una concentración de 10 ⁸ UFC/mL.

La formulación biofertilizante/biocontrolador es efectiva tanto para plantas que se emplean en el área de la agricultura, así como para la obtención de alimentos de animales y humanos, por ejemplo, frutas y verduras, como para plantas que pueden ser cultivadas con el objetivo simplemente de ser ornamentales. La formulación parte de la presente invención se encuentra enfocado al uso de este en agrocultivos, los cuales pueden comprender, sin limitarse a las especies de tomate (Solanum lycopersicum), banano (Musa paradisiaca), caña de azúcar (Saccharum officinarum), pimientos (Capsicum annuum), papaya (Carica papaya), maíz (Zea mays), sandía (Citrullus lanatus), melones (Cucumis meló), aguacate (Persea americana), café (Coffea arabica), Arvejas (Pisum sativum), frijoles (Phaseolus vulgaris), cañamo (Cannabis sativa), Trigo (Triticum spp), arroz (Oryza sativa), piña (Ananas comosus), Vides (Vitis vinifera), cerezos (Prunus cerasus), manzana (Malus domestica), frutilla (Fragaria ananassa), lechuga (Lactuca sativa), entre otros cultivos.

La formulación agrícola descrita en la presente invención tiene un método de acción, el cual se encuentra dirigido a las plantas de cultivo y a patógenos que afectan a esta, por lo que el contacto directo de este producto con humanos no podría causar ningún daño. Por otro lado, el producto biológico de la presente invención permite una reducción de los gases de efecto invernadero ya que disminuye el uso de agroquímicos tradicionales, representando una alternativa para el reemplazo de estos últimos y permite el cumplimiento de las normas ambientales como las que se establecen en la Organización para la Cooperación y el Desarrollo Económico (OCDE).

Es también parte del alcance de la invención, método para promover el crecimiento y/o aumentar el rendimiento de cultivos y/o protegerlos contra enfermedades y plagas por medio de la administración o aplicación de una cantidad efectiva de la formulación descrita. El método incluye la administración de la formulación agrícola en forma de resuspensión, emulsión, pastilla efervescente, pastilla de liberación prolongada o polvos mojables.

Como parte del método descrito para mejorar el bienestar de las plantas y protegerlas contra enfermedades, la formulación puede ser aplicada por asperjación o inmersión directa de la semilla del cultivo de interés y/o aplicándola en la base del tallo de las plantas. En el caso de la inmersión de semilla, se prefiere una concentración de 10 ⁹ UFC/mL de bacterias. Cuando su aplicación se realiza en la base del tallo de las plantas se prefiere una concentración de 10 ⁸ UFC/mL de bacterias. Los inventores han demostrado que, mediante el método descrito, cuando se aplica la formulación en tomates, se aumenta su capacidad productiva al usar la mezcla de bacterias empleando un 66% de fertilización convencional complementaria. Particularmente, se observó un aumento significativo en el parámetro de peso acumulativo de tomates, superando ampliamente a los tratamientos testigos y la cepa comercial. Respecto del parámetro de concentración de clorofila, en la séptima semana se observaron diferencias significativas para los tratamientos respecto de control. El tratamiento que presentó mejor efecto fue la mezcla de bacterias en presentación de pastilla de liberación prolongada con un 100% de fertilización complementaria, superando los 250 μg/mL de clorofila. La presente invención describe una formulación y método que permiten el aumento de la capacidad de crecimiento de las plantas y de la obtención de mejores cosechas.

Definiciones

Los términos presentados en este documento tienen el mismo significado que se utiliza de forma habitual en el estado de la técnica, a menos que se indique lo contrario. Los términos utilizados en este documento se presentan a continuación:

El término “comprender” (“comprende”, “que comprende”) y las variaciones del mismo, utilizado en la descripción de esta invención, tanto en la memoria descriptiva como en el pliego de reivindicaciones, se deben interpretar en sentido abierto e inclusivo, es decir como “incluyendo, pero no limitando a”.

Cuando se emplea el término “obtenido de”, se hace referencia a que muestra es aislada o derivada de una fuente en particular. De igual forma el término “derivado de”, hace referencia a la fuente de donde proviene la muestra.

Cuando se presenta el término “una realización”, se indica una característica o estructura particular que ha sido descrita en relación con la realización de la invención, en donde se incluye al menos una realización presente en esta, las cuales no necesariamente corresponden a una misma realización o pueden ser combinadas entre ellas.

Cuando se utiliza el término “consistente en”, se indica la enumeración de elementos dentro de una frase, los cuales son obligatorios y no pueden estar presentes en otros elementos. El termino “que consiste esencialmente en” es utilizado para cualquier elemento enumerado después de la frase, este término limita a otros elementos que no interfieren con la actividad o acción específica de la invención.

En otras realizaciones de la invención, el término “método” hace referencia un proceso que permite realizar una tarea u obtener un resultado de un objetivo dado. El término “método preventivo” hace referencia a un proceso o conjunto de estos que permite realizar una tarea u objetivo con el fin de prevenir un hecho futuro. El término “método de tratamiento” comprende al proceso o conjunto de estos que se utilizan para aliviar o curar una enfermedad.

En otras realizaciones de la invención, cuando se hace mención del termino “bienestar” o “bienestar de la planta”, se hacer referencia al estado de la planta en la cual su metabolismo esta funcionando de manera óptima. Por otro lado, cuando se refiere a “capacidad de producción” o “capacidad productiva” se indica como la máxima obtención de bienes, en este caso, sería la máxima obtención de plantas en crecimiento, la máxima capacidad de obtener cosecha, etc. En el caso de “aumento en la capacidad productiva” se hacer referencia al aumento significativo en la cantidad de plantas, o un aumento en la obtención de cosecha o aumento en el crecimiento de las plantas.

Se entiende por “control biológico” a un método para el control de plagas, enfermedades y/o malezas que tiene como finalidad el uso de organismos vivos para el control de crecimiento de otras poblaciones de organismos vivos.

El término “Biocontrolador” se hace referencia a productos de origen no sintético que son utilizados para el control de plagas en cultivos.

Cuando en el documento de hace referencia al termino “bioestimulante” se indica como una sustancia o mezcla de sustancias con o sin microorganismos que puede ser aplicado sobre plantas de cultivo, semillas o raíces. Estas sustancias o mezclas tienen la característica de mejorar aspectos de la planta como la obtención de mejores cosechas, por medio de la estimulación de los procesos biológicos, mejoras en la disponibilidad de nutrientes, mejoras en la absorción de nutrientes, tolerancia al estrés, etc. Al hacer referencia al termino bioprotector , se describe a todo producto o dispositivo que tiene por función proteger las características y funciones de los seres vivos de las agresiones externas a las que pueden estar sometidas. Ejemplo de esto en las plantas, es cuando estas se encuentran sometidas a estrés abiótico.

Cuando se hace referencia a “Organismos para el control biológico”, se refiere a microorganismos que presentan la capacidad de inhibir el crecimiento de otro microorganismo y que son utilizados para el control de plagas o enfermedades.

Cuando se presenta el término “Biofertilizante”, este término hace referencia a un insumo agrícola formulado por lo menos de una bacteria promotora del crecimiento que mejora el rendimiento de los cultivos cuando es aplicado al mismo.

El término “PGPR” corresponde a la abreviación en inglés de “plant growth promoting rhizobacteria” (Rizobacterias promotoras del crecimiento de plantas) y hace referencia a bacterias presentes en la rizosfera las cuales colonizan el sistema radicular de las plantas o su entorno más cercano y potencian el crecimiento de ésta. Cuando se hace referencia al término “Rizobacterias” corresponde a aquellas bacterias presentes en la rizosfera. Cuando se señala que una bacteria tiene actividad PGPR significa que dicha bacteria es capaz de colonizan el sistema radicular de las plantas o su entorno más cercano y potencian el crecimiento de ésta.

Cuando se presenta el término “excipiente”, se hace referencia a toda aquella sustancia que puede ser utilizada sin afectar al principio activo. Cuando se refiere a “excipiente agrícolamente aceptable” se hace referencia a toda aquella sustancia utilizada para generar, producir o fabricar un producto de uso agrícola que contenga un principio activo.

Cuando se hace referencia al término “pastilla” o “tableta”, se indica como una pieza pequeña consistente de un material o ingrediente moldeable, que puede tener diversos tamaños, formas y usos. En otras realizaciones de la invención el término “Pastilla efervescente” hace referencia a una pastilla que dentro de su composición contienen generalmente sustancias ácidas y carbonates o bicarbonatos, que reaccionan rápidamente en presencia de agua con liberación de dioxido de carbono. En otras realizaciones de la invención el termino “pastilla de liberación prolongada” hace referencia a una pastilla que presenta características que permiten la liberación del principio activo de una formulación de una forma lenta, lo que permite extender el efecto de principio activo entre dosis.

En otras realizaciones de la invención, el término “polvo mojable” hace referencia a aquellas sustancias (principios activos y/o excipientes) presentes en una formulación que al mezclarse con agua antes de su aplicación, forman una suspensión.

En otras realizaciones de la invención, el término “resuspensión” hace referencia a la incorporación de material o sustancia la cual se suspende en líquido cuando esta se encuentra como precipitado o como material o sustancia seca.

En otras realizaciones de la invención, el término “emulsión” hace referencia a un líquido de aspecto lechoso que contiene en suspensión pequeñas partículas o gotas de otra sustancia insolubles.

Descripción de las figuras de la invención

Figura 1. Árbol filogenético en base al gen 16S rDNA. Se empleó el método de Neighbor-joining y el modelo K-2 parámetros para determinar la relación filogenética entre el aislado Bacillus sp. con otras especies de Bacillus. Se utilizó como grupo externo Micrococcus luteus DSM 20030T. Los valores de Bootstrap (expresados como porcentajes de 1000 repeticiones) mayores 50% se muestran en los nodos. La barra indica 2 sustituciones por cada 100 nucleótidos. Se destaca los aislados RGM 2450 y RGM 2529 con un círculo negro. Al lado izquierdo de cada cepa tipo (T) se indica el número de acceso para la base de datos de NCBI.

Figura 2. Árbol filogenético en base al análisis de pyrE de la cepa RGM 2450 sp. y de especies tipos relacionadas. Para los análisis marcadores genéticos pyrE. Se empleó el método de Maximum Likelihood y el modelo Tamura-Nei para determinar la relación filogenética entre el aislado RGM 2450 con las cepas tipos de las especies B. safensis, B. pumilus y B. altitudinis. Se utilizó como grupo externo a la cepa B. cereus ATCC 1479T. Los valores de Bootstrap (expresados como porcentajes de 1000 repeticiones) se muestran en los nodos. La barra indica 5 sustituciones por cada 100 nucleotidos. Se destaca la cepa RGM 2450 con un círculo negro.

Figura 3. Árbol filogenético en base al análisis de gyrB de la cepa RGM 2529 y de especies tipos relacionadas. Se empleó el método de Maximum Likelihood y el modelo Tamura-3-parámetros para determinar la relación filogenética entre la cepa RGM 2529 con las cepas tipos. Se utilizó como grupo externo a B. cereus ATCC 14579. Los valores de Bootstrap (expresados como porcentajes de 1000 repeticiones) se muestran en los nodos. La barra indica 5 sustituciones por cada 100 nucleotidos.

Figura 4. Evaluación de la fijación de Nitrógeno (N2) y solubilización de Fósforo (P) de las cepas RGM 2450, RGM 2529 y la cepa comercial QST 713. Se cultivó a las distintas cepas bacterianas en medio Ashby para analizar la fijación de N2, mientras que para evaluar la solubilización de P se aplicó el ensayo en medio Pikovskaya modificado. El brillo de las fotografías fue ajustado en un 60% respecto de la toma original. El control negativo no se muestra en la figura; A) indica ensayos de fijación de nitrógeno, B) indica ensayos de solubilización de Fósforo, mientras que 1) representa los ensayos en la cepa RGM 2450, 2) ensayos sobre cepa RGM 2529 y 3) ensayos con un producto comercial.

Figura 5. Evaluación de la solubilización de Potasio (K) de las cepas RGM 2450, RGM 2529 en comparación con la cepa comercial QST 713. Todas las cepas fueron cultivadas en medio Pikovskaya modificado. A) Placa control sin bacteria; B) Placa cultivada con cepa RGM 2450; C) Placa cultivada con cepa RGM 2529; D) Placa cultivada con cepa de producto comercial QST 713. El brillo de las fotografías fue ajustado en un 60% respecto de la toma original.

Figura 6. Fijación de Nitrógeno para las cepas RGM 2450, RGM 2529 y QST 713 en medio Ashby modificado (sin Nitrógeno). Las cepas fueron cultivadas en un medio Ashby en ausencia de fuentes de N2 para evaluar su capacidad de fijación a través del tiempo. Las líneas representan la evolución en el número de células viables para las cepas RGM 2450 RGM 2529 y QST 713

Figura 7. Actividad antagonista de las cepas RGM 2450, RGM 2529 y la cepa comercial QST 713 contra el fitopatógeno Botrytis sp. A) Actividad antagonista por contacto directo del patógeno con las tres cepas por separado; B) Actividad antagónica por secreción de factores antifúngicos; C) Actividad antagónica por secreción de compuestos volátiles antifúngicos. Los gráficos muestran el diámetro de crecimiento en milímetros (mm) de Botrytis sp, donde 1) corresponde al control (Botrytis sin tratar), 2) corresponde a un producto comercial v/s Botrytis, 3) RGM 2450 v/s Botrytis, 4) RGM 2529 v/s Botrytis. Se expresan los valores promedio junto a su desviación estándar respectiva. Las letras indican que hay diferencias significativas (p-value < 0,05, ANOVA, LSD).

Figura 8. Actividad antagonista de las cepas RGM 2450, RGM 2529 y la cepa comercial QST 713 contra el fitopatógeno Colletotríchum sp. A) Actividad antagonista por contacto directo del patógeno con las tres cepas por separado; B) Actividad antagónica por secreción de factores antifúngicos; C) Actividad antagónica por secreción de compuestos volátiles antifúngicos. Los gráficos muestran el diámetro de crecimiento en milímetros (mm) de Colletotríchum sp, donde 1) corresponde al control (Colletotríchum sin tratar), 2) corresponde a un producto comercial v/s Colletotríchum, 3) RGM 2450 v/s Colletotríchum, 4) RGM 2529 v/s Colletotríchum. Se expresan los valores promedio junto a su desviación estándar respectiva. Las letras indican que hay diferencias significativas (p-value

< 0,05, ANOVA, LSD).

Figura 9. Actividad antagonista de las cepas RGM 2450, RGM 2529 y la cepa comercial QST 713 contra el fitopatógeno Phytophthora sp. A) Actividad antagonista por contacto directo del patógeno con las tres cepas por separado; B) Actividad antagónica por secreción de factores antifúngicos; C) Actividad antagónica por secreción de compuestos volátiles antifúngicos. Los gráficos muestran el diámetro de crecimiento en milímetros (mm) de Phytophthora sp., donde 1) corresponde al control (Phytophthora sin tratar), 2) corresponde a un producto comercial v/s Phytophthora, 3) RGM 2450 v/s Phytophthora, 4) RGM 2529 v/s Phytophthora. Se expresan los valores promedio junto a su desviación estándar respectiva. Las letras indican que hay diferencias significativas (p-value

< 0,05, ANOVA, LSD).

Figura 10. Actividad antagonista de las cepas RGM 2450, RGM 2529 y la cepa comercial QST 713 contra el fitopatógeno Fusarium sp. A) Actividad antagonista por contacto directo del patógeno con las tres cepas por separado; B) Actividad antagónica por secreción de factores antifúngicos; C) Actividad antagónica por secreción de compuestos volátiles antifúngicos. Los gráficos muestran el diámetro de crecimiento en milímetros (mm) de Fusarium sp., donde 1) corresponde al control (Fusarium sin tratar), 2) corresponde a un producto comercial v/s Fusarium, 3) RGM 2450 v/s Fusarium, 4) RGM 2529 v/s Fusarium. Se expresan los valores promedio junto a su desviación estándar respectiva. Las letras indican que hay diferencias significativas (p-value < 0,05, ANOVA, LSD).

Figura 11. Evaluación de actividades de fijación de N2 y solubilización de P y K de la cepa RGM 2450 en los diferentes formatos de formulación. En la figura se presentan los diferentes ensayos en los cuales se evaluó la fijación de nitrógeno (N) y la solubilización de fósforo (P) y potasio (K) de la cepa RGM 2450. Se evalúan diferentes formatos de presentación para la formulación, donde 1) corresponde al control, 2)-3)-4) corresponden a la formulación de pastilla de liberación prolongada sin gelatina, 0,5X de gelatina y 1X de gelatina respectivamente, 5) polvo mojable y 6) pastilla efervescente.

Figura 12. Evaluación de actividades de fijación de N2 y solubilización de P y K de la cepa RGM 2529 en los diferentes formatos de formulación. En la figura se presentan los diferentes ensayos en los cuales se evaluó la fijación de nitrógeno (N) y la solubilización de fósforo (P) y potasio (K) de la cepa RGM 2529. Se evalúan diferentes formatos de presentación para la formulación, donde 1) corresponde al control, 2)-3)-4) corresponden a la formulación de pastilla de liberación prolongada sin gelatina, 0,5X de gelatina y 1X de gelatina respectivamente, 5) polvo mojable y 6) pastilla efervescente.

Figura 13. Efecto de las cepas RGM 2450 y/o RGM 2529 en el crecimiento de plántulas de tomate. La evaluación se realizó 21 días después de la inoculación de las semillas en los tratamientos descritos. A) Control; B) Resuspensión de cepa RGM 2450 en solución ¡sotónica; C) Emulsión de cepa RGM 2450; D) Resuspensión de cepa RGM 2529 en suspensión ¡sotónica; E) Emulsión de cepa RGM 2529; F) Resuspensión de la mezcla de cepa RGM 2450 y 2529 en solución ¡sotónica; G) Emulsión de mezclas de cepas RGM 2450 y 2529. Figura 14. Evaluación del crecimiento de plantines de tomates provenientes de semillas inoculadas con bacterias. La evaluación se realizó 21 días después de la inoculación de las semillas en los tratamientos descritos. A) Evaluación de la biomasa húmeda; B) Evaluación biomasa seca; C) Evaluación del largo del brote; D) Evaluación del largo de la raíz; E) Evaluación del número de hojas verdaderas. Letras distintas indican que hay diferencias significativas entre los tratamientos (p-value < 0,05, ANOVA, LSD).

Figura 15. Actividad antagonista de las cepas PGPR contra B. cinérea en ensayos realizados en bayas de uvas. La foto es una toma representativa de la actividad de las cepas RGM 2450, RGM 2529, la mezcla de ambas y la cepa comercial QST 713. A) indica las bayas inoculadas con B. cinérea y B) indica las bayas sin inocular con B. cinérea. La fotografía fue tomada tras incubar las unidades experimentales durante 72 horas a 25°C. y alta humedad.

Figura 16. Superficie de respuesta de peso acumulado de frutos de tomate. En el eje Y se encuentra el peso acumulado (g) en X tratamientos y Z las semanas. Los colores representan las distintas superficies cubiertas de acuerdo con los g alcanzados en cada tratamiento.

Figura 17. Cuantificación de clorofila total con respecto a cada tratamiento. Las barras representan los valores promedio. Los bigotes representan las desviaciones estándar y las letras la prueba LSD (a=0,05).

Figura 18. Agrupamiento que participa en la síntesis y transporte de la microcina plantazolicina. Se compara el agrupamiento génico de la cepa RGM 2450 con el agrupamiento génico de la cepa B. pumilus ATCC 7061 y B. venelenzis FZB42 que participan en la síntesis de plantazolicina.

Figura 19. Predicción de agrupamiento génico que codifica sintetasa de péptido no ribosomal y de otras enzimas que participarían en la síntesis de bacilibactina. A) Agrupamiento génico que codifican a las enzimas que participan en la síntesis de bacilibactina y de genes adyacentes que participan en funciones de transporte y regulación. B). Esquema que gráfica la función de las enzimas en la síntesis de bacilibactina y rol de este compuesto. La bacilibactina es sintetizada por un sistema de ensamblaje NRPS (DhbACEBF) y secretada hacia el espacio extracelular. La bacihbactina quela el hierro con una afinidad muy alta, y el complejo férrico-bacilibactina resultante se importa nuevamente al citosol a través del sistema FeuABC-YusV y se hidroliza mediante la esterasa BesA para liberar hierro, que produce tres monómeros de bacilibactina (2,3 -dihidroxibenzoato-Gly- Thr). El hierro liberado sirve como cofactor enzimático.

Figura 20. Predicción de agrupamiento génico que codifica a NRPS que participaría en la síntesis de ciclolipopéptido. A) genes que codifican NRPS y su vecindario génico. B) predicción de la sintetasa de péptidos no ribosomal codificada por los genes biosintéticos junto con los aminoácidos que son reconocidos por sus dominios de adenilación. Cal, dominio Co-enzyme A ligasa, Ag, ácido graso; X, aminoácido indentificado; val, valina; ¡le, isoleucina; leu, leucina; asp, aspartato; glu, ácido glutámico. Predicción parcial de molécula sintetizada por NRPS.

Figura 21. Organización de agrupamiento génico que participaría en la síntesis de ciclolipopéptido en cepas del género Bacillus sp. A) Organización de agrupamiento génico en cepas cercanas filogenéticamente a la cepa RGM 2450. B) Comparación de agrupamiento génico de la cepa RGM 2450 con el de la cepa B. licheniformis DSM 13 que participa en la síntesis del ciclolipopéptido de lichensina.

Figura 22. Predicción de agrupamiento génico que codifica a NRPS que participaría en la síntesis de bacilisina. A) se ¡lustran los genes que participan en la síntesis y transporte del péptido bacilisina. B) estructura de bacilisina. C) Organización génica del agrupamiento génico en otras cepas cercanas filogenéticamente a la cepa RGM 2450.

Figura 23. Agrupamiento génico acnABCD que codifica la amilociclina. A) agrupamiento génico que codifica a la amilociclina en la cepa RGM 2529. B) Presencia del agrupamiento génico en cepas de especies PGPR.

Figura 24. Agrupamiento génico DhbACEBF de la cepa RGM que 2529 que participa en la síntesis de bacilibactina. En la proximidad del vecidaho génico de amilociclina se detectó el agrupamiento génico DhbACEBF de 13.034 pb que participa en la síntesis y ensamblaje del sideróforo bacilibactica. Figura 25. Agrupamiento genico que participaría en la síntesis de surfactina. A) Organización de agrupamiento génico de surfactina en la cepa RMG 2529. B) Agrupamiento génico de surfactina en cepas cercanas filogenéticamente a la cepa RGM 2529.

Figura 26. Agrupamiento génico que participaría en la síntesis de fengicina.

A) Organización de agrupamiento génico de fengicina en la cepa RMG 2529. B) agrupamiento génico de fengicina en cepas cercanas filogenéticamente a la cepa RGM 2529. C) estructura de fengicina.

Figura 27. Agrupamiento génico que participaría en la síntesis de bacilomicina D. A) Organización de agrupamiento génico de bacilomicina D en la cepa RMG 2529. B) agrupamiento génico de bacimilocina D en cepas cercanas filogenéticamente a la cepa RGM 2529.

Figura 28. Agrupamiento génico que participaría en la síntesis de bacilaeno.

A) Organización de agrupamiento génico de bacilaeno en la cepa RMG 2529. B) agrupamiento génico de bacilaeno en cepas cercanas filogenéticamente a la cepa RGM 2529.

Ejemplos de aplicación

Ejemplo 1. Caracterización de las cepas bacterianas RGM 2450 y RGM 2529.

En este ejemplo de aplicación se presenta la caracterización de las cepas bacterianas RGM 2450 y RGM 2529, principios activos de la formulación descrita en la presente invención. Se describe la caracterización molecular y su caracterización desde el punto de vista de su capacidad de fijación de nitrógeno y solubilización de fósforo y potasio, capacidad de producción de fitohormonas (IAA). Se evalúa también su capacidad de control de patógenos.

1.1 Caracterización molecular

Extracción de ADN y amplificación de genes 16s, pyrE y rpoB.

Se realizó la extracción de DNA de las cepas RGM 2450 y RGM 2529. Se amplificaron los marcadores genéticos: rRNA 16S y pyrE para la cepa RGM 2450, y rRNA 16S y rpoB para la cepa RGM 2529. La reacción de amplificación de cada marcador genético constó de 25 a 50 ng de ADN de la cepa, 1X de DreamTaq Green PCR Master Mix, 400 pMol de cada partidor (Tabla 1) y agua Millipura libre de nucleasas en un volumen final de reacción de 50 μL. El perfil térmico de la amplificación consistió en una desnaturalización inicial a 95 °C por 2 min, seguido de 35 ciclos de amplificación (desnaturalización a 98°C por 30 s, alineamiento a 55 °C por 30 s y una extensión a 72 °C por 45 s) y una extensión final a 72 °C por 5 min. Los productos de PCR se visualizaron mediante electroforesis en gel de agarosa al 1% y tinción con GeIRed 1X. La banda correspondiente al tamaño esperado se cortó y purificó con Zymo Clean Kit (Qiagen, Hilden, Alemania) bajo las instrucciones del fabricante. El fragmento purificado de esta reacción se envió a secuenciar al centro de secuenciación Macrogen. Se secuenció cada marcador en la dirección sentido y anti-sentido, empleando los partidores de la Tabla 1. Se ensambló las secuencias sentido y anti-sentido obtenidas de la secuenciación de los marcadores genéticos de las cepas empleando el programa Vector NTI.

Tabla 1. Secuencias de partidores utilizados para amplificar los genes involucrados en la caracterización molecular de las cepas RGM 2450 y RGM 2529.

Partidor Composición del partidor Gen Blanco Referencias

27F AGAGTTTGATCMTGGCTCAG rRNA 16S Weisburg et al., 1990

1492R TACGGYTACCTTGTTACGACTT rpoBF GTTGGCTTCATGACTTGGGA rpoB Fan et a/., 2017 rpoBR ACGTTCCATACCTAAACTTTG pyrEF AGACCGTTTCTTCCATCCA pyrE pyrER CACCTATTACAAATCAAAGC Liu et al., 2013

Análisis de identidad y filogenia de las especies. Se comparó la secuencia de los marcadores de las cepas RGM 2450 y RGM 2529 con las secuencias tipo de las especies de los grupos bacterianos a las cuales pertenecen (Tabla 2). Primero, se verificó la identidad de las cepas RGM 2450 y 2529 empleando el marcador genético 16S rRNA para determinar el género y grupo bacteriano al cual pertenecen, para posteriormente emplear los marcadores específicos pyrE y rpoB para corroborar las especies particulares de RGM 2450 y RGM 2529, respectivamente. El análisis del gen 16S rRNA indicó que la cepa RGM 2450 pertenece al grupo B. pmilus, en tanto RGM 2529 pertenece al grupo B. amyloliquefaciens. Tabla 2. Identidad nucleotídica entre las cepas RGM 2450 y RGM 2529 con bacterias de la especie B. pumilus y B. amyloliquefaciens. En paréntesis junto a cada especie, se encuentra su ID de acceso en la base de datos NCBI. Luego, se realizaron análisis filogeneticos en base a los marcadores secuenciados empleando el software MEGA 6.0.6. (Figuras 1 , 2 y 3). Para ello, se alinearon las secuencias de los marcadores genéticos de RGM 2450 y RGM 2529 junto con las secuencias de las cepas de referencia empleando la opción MUSCLE. Posteriormente, se determinó la historia evolutiva empleando un método estadístico (Máximo Likehood/Neighbor-joining) y un modelo de sustitución nucleotídica (modelo Kimura-2-parámetros/Tamura-Nei/Tamura-3-parametros), considerando una distribución Gamma para modelar diferencias de la tasa de variación entre sitios. Se sustentó la hipótesis de las relaciones filogenéticas empleando 1000 réplicas de bootstrap. Los árboles filogenéticos grafican claramente los resultados expuestos en la Tabla 2, indicando que la cepa RGM 2450 comparte un ciado taxonómico con la cepa bacteriana B. safensis FO-036b (bootstrap de 100%) (Fig. 2), en tanto RGM 2529 se encuentra en el mismo ciado que con B. siamensis KCTC 13613 ^T (bootstrap de 99 %) (Fig. 3).

1.2 Solubilización de fósforo y potasio y Capacidad de fijación de nitrógeno

En el caso de la evaluación de la solubilización de fosfato, se creció las cepas RGM 2450 y RGM 2528 en 5 mL de medio líquido LB por 16 h (30°C y 200 rpm). Se adicionó 10 μL del cultivo en el medio agar Pikovskaya (0,3 g/L de NaCI; 0,3 g/L de MgSO ₄ -7H ₂ O; 0,03 g/L de MnSO ₄ -4H ₂ O; 0,3 g/L de KCI; 0,5 g/L (NH ₄ ) ₂ SO ₄ ; 0,03 g/L de FeSO ₄ 7H ₂ O; 2 g/L de Ca ₃ (PO4) ₂ ; 10 g/L de glucosa; 0,5 g/L de extracto de levadura; 15 g/L de agar. Ajustar a pH 7,0 (Vázquez et al., 2000). Se incubó por 7 días a 30°C. La aparición de un halo transparente alrededor de la colonia bacteriana indicó la capacidad de solubilizar fosfato. El ensayo se realizó en triplicado.

Para la evaluación de la solubilización de potasio, se creció las cepas RGM 2450 y RGM 2528 en 5 mL de medio líquido LB por 16 h (30°C y 200 rpm). Se adicionó 10 μL del cultivo en el medio agar Pikovskaya modificado (0,3 g/L de NaCI; 0,3 g/L de MgSO ₄ -7H ₂ O; 0,03 g/L de MnSO ₄ -4H ₂ O; 2 g/L de KNO ₃ ; 0,5 g/L (NH ₄ ) ₂ SO ₄ ; 0,03 g/L de FeSO ₄ 7H ₂ O; 0,5 g/L de Ca ₃ (PO4) ₂ ; 10 g/L de glucosa; 0,5 g/L de extracto de levadura; 15 g/L de agar. Ajustar a pH 7,0 (Vázquez et al., 2000). Se incubó por 14 días a 30°C. La aparición de un halo alrededor de la colonia bacteriana indicó la capacidad de solubilizar potasio. Para determinar la capacidad de fijación de nitrógeno, se creció las cepas RGM 2450 y RGM 2528 en 5 mL de medio líquido LB por 16 h (30°C y 200 rpm). Se centrifugó por 5 min a 3500 g y lavó 3 veces con tampón PBS estéril (8 g/L de NaCI, 0.2 g/l KCI, 1.44 g/L Na ₂ HPO ₄ , 0,24 g/L KH ₂ PO ₄ , ajustar a pH 7,4). Finalmente, se resuspendió en 3 mL de solución PBS y se adicionó 10 μL de la suspensión en medio Ashby (10 g/L de glucosa; 0,2 g/L de KH ₂ PO ₄ ; 0,2 g/L de MgSO ₄ ; 0,2 g/L de NaCI; 0,2 g/L de CaSO ₄ ; 5 g/L CaCO ₃ ) e incubó por 7 días a 30°C (Rao, 1999; Velázquez-Gurrola y Ramos-Alegría, 2015). El crecimiento de la cepa indicó la capacidad de fijar nitrógeno atmosférico. El ensayo se realizó en triplicado.

En cuanto a la solubilización de P, la cepa RGM 2450 presenta una habilidad similar a la cepa del producto comercial que incluye la cepa de Bacillus subtilis QST 713, en tanto RGM 2529 exhibe un halo de mayor rango que demuestra su capacidad superior para realizar esta labor (Fig. 4). Por otra parte, se observa que ambas cepas tienen habilidad para la solubilización de K in vitro por el cambio de color en el medio (Fig. 5).

La cepa RGM 2450 tuvo el mayor efecto en la fijación de N ₂ , presentando incluso mejor crecimiento en medio Ashby modificado.

Para el ensayo de fijación de N ₂ (Fig. 6), se observa que la cepa RGM 2450 creció significativamente mejor en comparación a las cepas RGM 2529 y QST 713 tras 24 horas del experimento, demostrando que su habilidad en la fijación de este elemento es mayor.

1.3 Capacidad de producción de fitohormonas (AIA).

Se determinó la capacidad de las cepas RGM 2450, RGM 2529 para producir la fitorhormona ácido indolacético. Para esto, se crecieron las cepas RGM 2450, RGM 2529 y B. subtilis QST 713 en 5 mL de medio LB a 30°C y 200 rpm. Luego de 16 h de incubación, se midieron la turbidez de los cultivos a λ600 y se inoculó una alícuota (turbidez λ600 = 1 ,0-1 , 2) de cada cepa en medios de cultivo de LB suplementado con triptófano 1000 μg/mL (SIGMA ALDRICH). La concentración de AIA relativa en los sobrenadantes de los cultivos se determinó por el método de Salkowski (Patten y Glick, 2002; Yang et al., 2007). Se recogieron muestras de

1.5 mL y se centrifugaron a 3000 g por 10 min. Se tomó una alícuota de 1 mL de sobrenadante y se mezcló vigorosamente con 4 mL de reactivo de Salkowski (150 mL de H2SO4 concentrado, 250 mL de H2O destilada, 7,5 mL de FeCI3 x 6H2O 0,5 M) y se incubó por 20 min a temperatura ambiente. La formación de coloración indicó la presencia de AIA, que se cuantificó por medición de absorbancia a 535 nm. Se efectuó 1 curva de calibrado preparadas con diluciones seriadas de solución stock de AIA en medio medio LB a un rango de concentración de 0,7 y

12.5 μg/mL.

Tabla 3. Concentración de IAA en cultivos bacterianos RGM 2450, RGM 2529 y QST 713. El ensayo se realizó en medios de cultivo LB que contenían triptófano 1 mg/mL. Las distintas letras representan diferencias significativas entre los tratamientos (p-value < 0,05, ANOVA, Tukey).

Cepa Absorbancia A = 535 Concentración relativa de IAA [mg/mL]

RGM 2450 0,21 ± 0,01 0,0079 ± 0,0006 ^a

RGM 2529 0,21 ± 0,01 0,008 ± 0,001 ^a

QST 713 0,24 ± 0,01 0,0105 ± 0,0009 ^b

Los resultados expuestos en la tabla 3 demuestran que las cepas RGM 2450 y RGM 2529 son capaces de producir IAA en las condiciones entregadas por el medio. No hubo una diferencia significativa al comparar las concentraciones producidas por ambas cepas. Sin embargo, al contrastarlas con la cepa comercial QST 713, las dos produjeron significativamente una menor cantidad de esta fitohormona: alrededor de un 20% menos transcurridas 48 horas de crecimiento. Cabe destacar que altas concentraciones de IAA pueden generar inhibición del crecimiento de las plantas y deformación en el tejido vegetal.

1.4 Capacidad de control de patógenos. Se crecieron las cepas RGM 2450 y RGM 2529 en medio de cultivo LB por 16 h. Se adicionó una alícuota de 100 μL de este cultivo a una placa de agar LB y se esparció con el asa de Drigalsky por toda la superficie del agar. Paralelamente, se retiró un disco de 6 mm de diámetro del borde de un cultivo de una cepa de Botrytis resistente, crecidas en agar PDA por 7 días. El disco fue depositado en el centro de una placa de agar PDA, para evaluar la inhibición de los fitopatógenos por contacto directo.

Para determinar la inhibición por producción de compuestos volátiles, la placa de agar de LB inoculada con una cepa de Bacillus se dispuso en la parte superior de la placa inoculada con el hongo fitopatógeno. Las placas unidas se sellaron con 4 vueltas de papel Parafilm.

Se realizó el mismo procedimiento, empleando el hongo fitopatógeno Colletotrichum. Se dejo incubando a temperatura ambiente por 7 días.

El porcentaje de inhibición del crecimiento del micelio de los patógenos evaluados por compuestos volátiles y no volátiles se calculó según la fórmula de PGI:

PGI = ((C - T)/ C x 100)

Donde PGI = inhibición del crecimiento del patógeno (%); C = Crecimiento diametral del patógeno (controlar); T = Crecimiento diametral del patógeno (tratado).

De acuerdo con el diseño experimental, se realizaron los análisis de varianza ANDEVA basado en la prueba de F, con un comparador de p-value = 0,05 para determinar el efecto de la exposición de los nemátodos a los extractos de proteínas recombinantes. Finalmente, se determinaron las diferencias estadísticas significtivas a través de la prueba de LSD, p-value = 0,05.

Tabla 4. Evaluación cuantitativa del efecto causado por las cepas RGM 2450 y RGM 2529 en el crecimiento de Botrytis sp. Los valores se expresan en porcentajes (%) de comparación en la medición del halo de crecimiento del patógeno respecto del grupo control, junto a su desviación estándar respectiva.

Los resultados muestran que el efecto antagonista de la cepa RGM 2450 contra Botrytis sp. provocó una inhibición cercana al 79% al entrar en contacto directo con el patógeno, un 46% por antibiosis, y de un 79% por producción de compuestos volátiles; la cepa RGM 2529, por su parte, exhibió un 86%, 62% y 84% de inhibición al exponerse al mismo hongo para los ensayos por contacto directo, antibiosis y producción de compuestos volátiles, respectivamente (Tabla 4 y Figura 7).

Tabla 5. Evaluación cuantitativa del efecto causado por las cepas RGM 2450 y RGM 2529 en el crecimiento de Colletotríchum sp. Los valores se expresan en porcentajes (%) de comparación en la medición del halo de crecimiento del patógeno respecto del grupo control, junto a su desviación estándar respectiva.

Por otro lado, para Colletotríchum sp. los porcentajes de inhibición observados para RGM 2450 fueron de un 43% y un 53% para los ensayos de contacto directo y antibiosis, respectivamente; para RGM 2529 se observó una disminución en el halo de crecimiento del patógeno de un 78% por contacto directo, y de un 70% por antibiosis. No se apreció ningún efecto inhibitorio en el caso de los compuestos volátiles por parte de ambas cepas (Tabla 5 y Figura 8).

Tabla 6. Evaluación cuantitativa del efecto causado por las cepas RGM 2450 y RGM 2529 en el crecimiento de Phytophthora sp. Los valores se expresan en porcentajes (%) de comparación en la medición del halo de crecimiento del patógeno respecto del grupo control, junto a su desviación estándar respectiva.

En el caso de las pruebas contra el patógeno Phytophthora sp., la cepa RGM 2450 causó una inhibición del 45% por contacto directo y un fuerte efecto por antibiosis de un 41 %. En tanto, la cepa RGM 2529 mostró un efecto de inhibición de 80% por contacto directo y 52% al tratarse por antibiosis. No se exhibió inhibición del crecimiento por producción de compuestos volátiles en ningún caso (Tabla 6 y Figura 9).

Tabla 7. Evaluación cuantitativa del efecto causado por las cepas RGM 2450 y RGM 2529 en el crecimiento de Fusarium sp. Los valores se expresan en porcentajes (%) de comparación en la medición del halo de crecimiento del patógeno respecto del grupo control, junto a su desviación estándar respectiva. Finalmente, para Fusarium sp., las cepas RGM 2450 y RGM 2529 causaron una inhibición en el crecimiento de 24% y 4% por contacto directo, y 53% y 41 % por ensayo de antibiosis, respectivamente. No se exhibió inhibición por producción de compuestos volátiles para ninguna de las cepas (Tabla 7 y Figura 10).

Ejemplo 2. Preparación de formulaciones que comprenden las cepas RGM 2450 y RGM 2529 con actividad PGPR para diferentes formatos de presentación y administración

La formulación de la presente invención puede ser presentada y administrada como una formulación en pastillas de liberación prolongada, en polvos mojables y como pastillas efervescentes

2.1 Formulación de pastillas de liberación prolongada.

Se realizaron 3 formulaciones para la generación de pastillas de liberación prolongada con el fin de determinar dosificación en la secreción y preservación de la viabilidad. La primera formulación estuvo constituida por 28,6% de harina de trigo, 28,6% de fécula de maíz y 42,8% de cultivo bacteriano. La segunda formulación consistió 30,4% de harina de trigo, 30,4% de fécula de maíz, 38,2% de cultivo bacteriano y 1 % de gelatina al 13% (0,5X gelatina).

La tercera formulación consistió en 32,6% de harina de trigo, 32,6% de fécula de maíz, 32,8% de cultivo bacteriano y 2% de gelatina al 13% (1X gelatina). Para la formulación la fécula se esterilizó en seco a 180°C por 30 min y la gelatina se resuspendió en una proporción 1 :8. Las formulaciones se dosificaron en capsulas de 0,62 g con 1 ,4 cm de diámetro y 0,6 cm de grosor. Se conservaron a 4°C por 16 h, posteriormente se deshidrataron a 40°C por 2 h. Las pastillas se depositaron sobre 50 μL de agua en los medios de cultivo Ashby, Pikovskaya y Pikovskaya modificado y se incubaron a 25° C por 14 días. Adicionalmente, se realizó el recuento de bacterias presentes en las formulaciones mediante el maceramiento y resuspensión de la formulación en 50 mL de agua destilada estéril.

2.2 Formulación de polvos mojables.

Para la formulación de polvo mojable se mezcló 17% de almidón de papa con 14,6% de dióxido de silicio y 68,4% de cultivo bacteriano. Se pesó 1g del producto y se resuspendió en 100 mL de agua destilada estéril, se adicionó 20 μL de la suspension en los medios de cultivos Ashby, Pikovskaya y Pikovskaya modificado y se incubaron a 30°C por 7 días. Adicionalmente, se realizó el recuento de bacterias presentes en las formulaciones.

2.3 Formulación de pastillas efervescentes.

Para la formulación de las pastillas efervescentes se mezcló 30% de ácido cítrico con 66,6% de bicarbonato y 3,4% de cultivo bacteriano, y a medida que se adicionó el cultivo se procedió a homogenizar mezclando los componentes. La mezcla resultante se dispuso en moldes circulares de 35 mm de diámetro y 0,5 mm de profundidad, generándose 6 pastillas de 4,7 g. Se disolvieron en 100 mL de agua destilada estéril y 20 μL de esta solución se depositaron en los medios de cultivos Ashby, Pikovskaya y Pikovskaya modificado y se incubaron a 30° C por 7 días. Adicionalmente, se realizó el recuento de bacterias presentes en las formulaciones.

Tabla 8. Recuentos de células viables presentes en las distintas formulaciones. Los datos corresponden a los valores en unidades formadoras de colonias (UFC) por gramo de formulación promedio, junto a su respectiva desviación estándar, al realizar el ensayo por triplicado.

Células viables (UFC/g de formulación) Cepa RGM 2450 Cepa RGM

2529

Pastilla sin gelatina 1 ,0*10 ⁷ ± 2*10 ⁶ 6*10 ⁶ ± 2*10 ⁶

Pastilla con 0.5X gelatina 2,6*10 ⁷ ± 6*10 ⁶ 7*10 ⁶ ± 3*10 ⁶

Pastilla con 1X gelatina 8*10 ⁶ ± 1*10 ⁶ 1 ,2*10 ⁷ ± 1*10 ⁶

Polvo mojable 4*10 ⁸ ± 1*10 ⁸ 4*10 ⁷ ± 3*10 ⁷

Pastilla efervescente 5,3*10 ⁶ ± 6*10 ⁵ 3,4*10 ⁶ ± 6*10 ⁶

De acuerdo con lo expuesto en la tabla 8, el número de células viables para las cinco diferentes formulaciones estuvo entre 3,4*10 ⁶ - 4*10 ⁸ UFC/g y fue igual o superior al número de células viables presentes en el producto líquido comercial Serenade® (1 ,4*10 ⁷ UFC/g), que incluye la cepa QST 713, utilizada previamente como control comparativo. Las formulaciones fueron, ademas, analizadas para evaluar que posean las mismas características evaluadas anteriormente para la fijación de nitrógeno, y la solubilización de fósforo y potasio. En el caso de la bacteria RGM 2450 (Fig. 11), esta mantiene su capacidad de fijar nitrógeno, pero es incapaz de solubilizar P al probarse en pastillas de liberación prolongada, mientras que la solubilización de K no se aprecia con claridad. El efecto en la fijación de nitrógeno no fue perceptible con tanta facilidad en el caso de las demás formulaciones, por lo que no puede confirmarse que la cepa mantenga sus habilidades al incorporarse en un polvo mojable o pastilla efervescente.

Por otro lado, la cepa RGM 2529 (Fig. 12) fue capaz de crecer para el caso de las pastillas de liberación prolongada, principalmente por el efecto propio de la formulación en el medio, más que por una actividad biológica particular de la bacteria. No hubo un efecto en la solubilización de P ni de K. En los polvos mojables y la pastilla efervescente, las condiciones exhibidas fueron ¡guales a la del control, por lo que se confirma que la capacidad de solubilización de la cepa se mantiene al menos en estas dos formulaciones.

Ejemplo 3. Uso de formulaciones que comprenden las cepas RGM 2450 y RGM 2529 como bioestimulantes/bioprotectores de plantas.

3.1 Estudio del efecto bioestimulante in vitro.

Se aplicaron distintos tratamientos a semillas de tomate esterilizadas en las siguientes resuspensiones bacterianas y emulsiones: (i) resuspensión de cepa RGM 2450, (¡i) resuspensión de cepa RGM 2529, (i¡¡) mezcla de ambas cepas en una proporción 1 :1 , (iv) emulsión de cepas RGM 2450, (v) emulsión de cepa RGM 2529, (vi) mezcla de la emulsión de cepas en una proporción 1 :1.

Para preparar la resuspensión de bacterias en una solución de NaCI, se inoculó una colonia de la cepa RGM 2450 y RGM 2529, cada una por separado en 5mL de medio LB, para generar los preinóculos de los respectivos cultivos. Se incubaron los preinóculos a 30°C a 200 rpm, hasta llegar a una turbidez de 1 ,0 (X = 600 nm). Posteriormente, se inocularon matraces con medio LB con una alícuota de preinóculo al 1% (es decir 800 μL de preinóculo en 80 mL de cultivo). Se crecieron las cepas RGM 2450 y RGM 2529 por 20 h en medio LB a 30°C. Una alícuota de 25 mL de cada cultivo se centrifugó a 2500 g por 10 minutos. Posteriormente, se eliminó el sobrenadante y se resuspendieron las células en una solución ¡sotónica de 0,9% de NaCI. La centrifugación, descarte del sobrenadante y resuspensión en solución de 0,9% de NaCI se realizó 3 veces para eliminar residuos del medio de cultivo. Finalmente, se resuspendieron las células en una solución de 0,9% NaCI suplementado con 0,01 % Tween 20. La concentración de células viables de la resuspensión de la cepa RGM 2450 y RGM 2529 en la solución ¡sotónica de NaCI fue de 4,7 x 10 ⁹ (± 8 x 10 ⁸ ) y 1 ,8 x 10 ⁸ (± 5 x 10 ⁷ ) UFC/mL, respectivamente. La concentración celular de la cepa RGM 2529 está subestimada debido a la formación de agregados filamentosos (Informe 5), que impiden determinar con exactitud la cantidad de células presentes, por los que se utilizó el mayor valor de UFC/mL que se pude obtener por lote. La concentración celular que se empleó fue en base a la concentración de UFC/mL presentes en los productos comerciales registrados en Chile como bioestimulante, TRIBAC BIO (1 x 10 ⁹ UFC/mL, empresa ANASAC) y TIFI (2 x 10 ⁸ UFC/g, empresa In pacta).

Para la emulsión bacteriana descrita, ésta se preparó en dos fases. En la primera fase, en un tubo se adicionó 5,33 mL de aceite y 0,22 mL de Tween 20. Se agitó el tubo durante 1 minuto en vortex. En la segunda fase se agregó 0,47 mi de glicerol, 3,75 mi de Silwet y 5 mi de la suspensión bacteriana del tratamiento anterior con una concentración 20 veces mayor y se agitó durante 1 minuto en vortex. Luego se mezcló el contenido de ambos tubos y se agitó durante 1 minuto. Se tomó una alícuota de la mezcla homogenizada y se resuspendió en 9 mi de agua destilada estéril para la obtención de la emulsión bacteriana diluida.

Para aplicar los tratamientos, se emplearon entre 20 a 25 semillas por tratamiento incluido el control. Las semillas que se trataron con resuspensiones bacterianas se incubaron con las células bacterianas por 45 min en agitación orbital suave (100 rpm). Las semillas que se trataron con la emulsión bacteriana se embebieron por 5 min en la emulsión diluida. Las semillas del tratamiento control se trataron con 0,9% de NaCI. Las semillas de cada tratamiento se sembraron en almacigueras de germinación que contenían una mezcla de 1 : 1 (v:v) turba autoclavada: vermiculita y se incubaron a 25°C ± 2°C con un fotoperiodo de 16 h de luz y 8 h de oscuridad (Mena-Violante y Olalde-Portugal, 2007; Vaikuntapu et al., 2014; Cordero et al., 2018). A los 21 días de incubación se evaluaron los siguientes parámetros: biomasa húmeda, biomasa seca, longitud de la raíz, longitud del brote, longitud del brote del tomate y número de hojas verdaderas (Mena-Violante y Olalde- Portugal, 2007; Vaikuntapu et al., 2014; Cordero et al., 2018). Para determinación de la biomasa seca, se incubaron las plántulas de tomate a 80°C por 48 h, luego de la incubación se esperó a que alcanzaran la temperatura ambiente y se determinó su masa. Los resultados de la determinación de los parámetros de crecimiento de las réplicas por cada tratamiento se indica en las tablas suplementarias presentes en el anexo del informe.

De acuerdo con el diseño experimental, se realizaron los análisis de varianza AN DEVA basado en la prueba de F, con un comparador de p-value = 0,05 para determinar el efecto de los tratamientos experimentales con respecto al control. Finalmente, se determinaron las diferencias estadísticas significativas a través de la prueba de LSD, p-value = 0,05.

Tabla 9. Impacto del uso de las cepas RGM 2450 y/o RGM 2529 en el desarrollo y crecimiento de semillas de tomate. Los valores de biomasa seca y húmeda están expresados en gramos (g) mientras que el largo de brotes y raíces se expresan en milímetros (mm). En paréntesis se indica la desviación estándar para cada parámetro.

Tabla 10. Comparación porcentual de los parámetros de crecimiento de las semillas de tomate. Los valores se expresan en porcentajes (%) de diferencia entre las plantas tratadas con distintas formulaciones de RGM 2450 y/o RGM 2529 versus el grupo control (sin tratar).

Las plántulas de las semillas tratadas con las resuspensiones y emulsiones bacterianas después de 21 días de crecimiento presentaron un incremento significativo en la biomasa húmeda y seca con respecto al tratamiento control (Tablas 9 y 10; Figuras 13 y 14). La biomasa húmeda de los tratamientos experimentales mostró un aumento entre un 19 a 103 %, mientras que la evaluación de la biomasa seca indicó un incremento entre un 19 a 63%. En cuanto a la longitud del brote, solo las mezclas de las cepas presentaron un incremento significativo, entre un 16 y 26%, los otros tratamientos no presentaron diferencias significativas con respecto al control.

Las plántulas de las semillas inoculadas con los tratamientos experimentales, exceptuando el tratamiento de incubación de semillas con la suspensión de la cepa RGM 2450, presentaron un incremento significativo de la longitud de la raíz, entre un 15 y 42% con respecto el control. En la evaluación del número de hojas verdaderas, los tratamientos de mezclas de cepas junto con el tratamiento de resuspensión de la cepa RGM 2529 presentaron diferencias significativas con respecto al control.

Cabe destacar que las semillas inoculadas con mezcla de las cepas RGM 2450 y RGM 2529 en la solución de NaCI (0,9%) presentaron el mayor incremento de la biomasa húmeda, seca, longitud del brote, longitud de raíz y hojas verdades, obteniendo un 103%, 63%, 26%, 36% y 13%, respectivamente, con respecto al tratamiento control.

3.2 Estudio del efecto bioprotector in vitro.

Se lavaron 200 bayas de uva con detergente al 0,1% y luego de 15 minutos de lavado, se descartó el agua con detergente y se procedió a la desinfección de las bayas con hipoclorito de sodio (NaCIO ₃ ) a una concentración final de 0,5%. Se incubaron las bayas con esta solución de desinfección durante 3 minutos, posteriormente se enjuagaron con agua destilada estéril y se depositaron en toalla absorbente dentro de campana de flujo laminar para la eliminación del exceso de agua. Tras esto, se dispusieron 4 bayas por pocilios, en donde cada pocilio correspondía a una repetición que contenía 4 unidades experimentales (bayas). Los tratamientos consistieron en la inoculación de 2 μL de la Resuspensión celular de B. safensis RGM 2450 (10 ¹⁰ UFC/mL), B. siamensis RGM 2529 (10 ⁶ UFC/mL), una mezcla de ambas cepas, fungicida comercial Serenade®(Bayer), y agua. Después de 24 horas de la inoculación con cada tratamiento, se adicionó 2 μL de Resuspensión de esporas de B. cinérea (10 ⁶ UFC/mL). La inoculación se realizó sobre el orificio que se realizó a la baya con la punta de una jeringa.

En un segundo ensayo, se aplicaron los mismos tratamientos, pero se evaluó la capacidad del producto comercial sin los excipientes contenidos en su formulación. Para esto, se centrifugó 1 mL de producto a 5000 g por 10 minutos y descartando el sobrenadante, para obtener el compuesto bacteriano activo (cepa B. subtillis QST 713). El pellet se resuspendió con 1 mL de agua destilada para obtener una suspensión celular. Posteriormente, se utilizaron 2 μL de esta solución para inocular las unidades experimentales correspondientes.

Después de la inoculación con B. cinérea, se incubaron las bayas de ambos ensayos durante 72 horas a 25°C y alta humedad, para luego evaluar el cualitativamente el daño producido por el fitopatógeno en los frutos (Figura 15 y Tabla 11).

Tabla 11. Evaluación de la actividad antagonista de las cepas PGPR contra

B. cinérea en bayas de uva. Los diámetros se expresan como el diámetro de lesión promedio, junto a su desviación estándar, para los resultados obtenidos de repetir el ensayo por cuadruplicado.

Los ensayos muestran una inhibición en el crecimiento del fitopatógeno significativamente mayor por parte de las cepas RGM 2450 y RGM 2529, en comparación con el producto comercial desprovisto de sus coformulantes (solo la bacteria Bacillus subitillis QST 713), alcanzando un porcentaje de inhibición del 50% tanto al emplear cada cepa RGM por separado, como al hacerlo aplicando la mezcla de ambas.

Ejemplo 4. Prueba de campo de la actividad PGPR de las cepas Bacillus safensis RGM 2450 y Bacillus siamensis RGM 2529: cultivo de tomate en invernadero

El objetivo de este ejemplo de aplicación es evaluar el efecto de la inoculación de las cepas Bacillus safensis RGM 2450 y Bacillus siamensis RGM 2529, por separado y en conjunto sobre parámetros productivos en plantas de tomates bajo condiciones de invernadero. En particular, se evalúa el efecto de formulaciones en los formatos de administración en polvo mojable, pastilla efervescente y pastilla de liberación prolongada de las cepas RGM 2450 y RGM 2529.

Para la preparación inicial de los cultivos de las bacterias B. safensis RGM 2450 y B. siamensis RGM 2529, se realizó fermentación por lote alimentado en biorractores (Applikon (Applikon Biotechnology a) de tanque agitado hasta 5L de operación.

Los concentrados microbianos obtenidos fueron cosechados y conservados a 4°C en botellas de pyrex estériles (Duranâ) de 2L. Los concentrados fueron muestreados mensualmente durante 5 meses manteniendo su viabilidad promedio en el orden de 10 ⁹ UFC/mL. Estos concentrados fueron utilizados para inocular semillas y preparar las distintas formulaciones: Pastilla de Liberación Prolongada (PLP), Pastilla Efervescente (PE) y Polvo Mojable (WP, por sus siglas en ingles). Además, las distintas formulaciones fueron utilizadas en conjunto a distintas concentraciones de fertilizantes de liberación prolongada para determinar el efecto de las bacterias sobre el cultivo de tomate.

Para facilitar el entendimiento, se exponen de forma secuencial las etapas del ensayo, dividiéndose en las siguientes etapas: inoculación de semillas y trasplante (4.1), fertilización diferenciada (4.2), preparación de formulaciones (5.3), aplicación de formulaciones a las plantas (4.4), diseño de experimentos (4.5), manejo de las plantas (4.6) y determinación de parámetros de interés productivo en cultivos de tomate: determinación de la longitud, peso y tomates, y determinación de clorofila (4.7). Finalmente, los resultados del ensayo serán expuestos en el punto 4.8.

4.1. Inoculación de semillas y trasplante.

Las semillas utilizadas en este ensayo fueron de la variedad Roma VF (VitaÓ). Previo a su inoculación, éstas fueron desinfectadas con hipoclorito de sodio al 2% por 3 min, y luego lavadas 5 veces con agua destilada estéril para retirar el desinfectante. Todos los tratamientos fueron inoculados con bacteria desde semilla (a excepción del testigo). Las bacterias fueron lavadas de los coadyuvantes que pudiesen existir en el medio de cultivo en el cual crecieron que pudiesen interactuar con la planta y dar resultados alterados por la presencia de nutrientes. Los lavados fueron realizaron 3 veces con tampón PBS (137 mM NaCI, 2,7 mM KCI, 10 mM Na2HPO4, 1 ,8 mM KH2PO4, pH = 7,2) estéril junto con la posterior centrifugación a 5000 rpm x 5 min, descartando el sobrenadante luego de cada centrifugación. Los pellets fueron resuspendidos en tampón PBS quedando ambas cepas a una concentración de 10 ⁹ UFC/mL. Posteriormente, las semillas fueron embebidas en tampon con las bacterias por 40 min en agitación a 200 rpm. En el caso del control comercial, se pusieron las semillas en solución con la misma concentración que las cepas de interés, 10 ⁹ UFC/mL. Luego de la inoculación, las semillas fueron sembradas superficialmente en el sustrato de composición 2:1 :1 de turba, perlita y compost respectivamente, en almácigos de 110 mm de profundidad y 5x5 cm de área superficial en invernadero. Posteriormente, las plántulas resultantes fueron trasplantadas a macetas de 5L. El ensayo fue realizado en un invernadero de bioseguridad de 8 x 9 m (ancho x largo) con riego automático y temperatura controlada de 25°C±5.

4.2 Fertilización diferenciada.

En los ensayos se utilizó el fertilizante Multicote Agri® (12m) de ANASAC. Este fue adicionado y homogenizado con el sustrato (descrito previamente). Además, el fertilizante fue añadido en diferentes concentraciones descritos en la Tabla 12, para cuantificar la respuesta (peso y calibre) de la interacción fertilización- microorganismo.

Tabla 12. Distintos porcentajes de fertilización utilizados por cada planta. El 100% de fertilización corresponde a la dosis de aplicación según lo indicado por el fabricante.

4.3 Preparación de formulaciones

Las formulaciones fueron realizadas según la Tabla 13 donde se exponen ingredientes y concentraciones para la preparación de las distintas formulaciones bacterianas propuestas. Para la determinación de las masas y volúmenes se consideró que la densidad de las bacterias en el medio de cultivo líquido (caldo microbiano) es igual a 1 g/mL. Para llegar a la concentración de UFC/g de producto indicada, fue necesario diluir o concentrar las bacterias, según se requiera. Esto se realizó en proporción con sus ingredientes, para que cada 100g de formulado quede con una concentración de 2*10 ¹⁰ UFC.

Se prepararon formulaciones del producto tipo polvo mojable (WP), formulaciones para pastillas de liberación prolongada (PLP) y para pastilla efervescente (PE).

Tabla 13. Ingredientes y concentraciones para la preparación de las distintas formulaciones bacterianas propuestas.

4.4 Aplicación de formulaciones a las plantas La aplicación de las bacterias fue realizada en los formatos de formulaciones ya descritas: PLP, PE y WP. Las aplicaciones se realizaron en la base del tallo de la planta en la maceta de 5L.

Las formulaciones PE y WP fueron disueltas en agua para ser aplicadas en no más de 10 mL por maceta, equivalente a 10 ⁸ UFC/planta (también para el control comercial). La PLP se introdujo en el sustrato en la base de la planta, entre el tallo y el gotero del riego automático y su fue concentración también fue equivalente a 10 ⁸ UFC/planta. Las aplicaciones de las formulaciones fueron realizadas a los 60 d desde el inicio de cultivo.

4.5 Diseño de experimentos El experimento fue diseñado con las formulaciones PLP, PE y WP, más un control comercial y testigo junto con 4 dosis de fertilización diferenciada (Tabla 13), lo que resultó en un total de 44 tratamientos (Tabla 14), con 3 repeticiones cada uno alcanzando 132 macetas en total. Se realizó una sola evaluación en su etapa de producción al final del cultivo. Las evaluaciones fueron el peso de tomate acumulado a la séptima semana de cultivo junto a su calibre y clorofila del follaje.

Tabla 14. Tabla de tratamientos. Los porcentajes corresponden a las fertilizaciones de Multicote Agri en combinación con las formulaciones (PLP, PE y WP) y las bacterias RGM 2529, RGM 2450 y su Mezcla (1 :1). 4.6 Maneio de las plantas

Las plantas fueron manejadas realizando las siguientes aplicaciones y técnicas:

1. Aplicación calcio: debido a los requerimientos nutricionales de calcio por parte de la variedad utilizada. En total, se realizaron 4 aplicaciones de Ultrasol® Calcium, añadiendo 0,8g/ planta en cada aplicación.

2. Corte apical: a los 100 días se cortó el ápice de todas las plantas, con fin de frenar el crecimiento vegetativo y comenzar con el desarrollo y maduración de frutos.

3. Desbrote: Se realizó desbrote de todas las plantas en la medida que estos eran detectados. 4. Deshoje: a los 120 días de cultivo se cortaron con tijeras todas las hojas por debajo del primer racimo, dejando solo 1 hoja (la más cercana) debajo de éste. Esto, ayuda a la circulación de aire entre las plantas y a mejorar el calibre de los frutos.

4.7 Determinación de parámetros de interés productivo en cultivos

Se determinaron o definieron 2 parámetros generales de interés productivo: 1. longitud, peso y tomates (número) y 2. concentración de clorofila. Los protocolos para cada caso se describen a continuación:

1 . Determinación longitud, peso y tomates (número)

Los tomates fueron evaluados midiendo su peso húmedo inmediatamente después de cosechados en balanza digital. El calibre fue medido con un pie de metro en su diámetro longitudinal y ecuatorial. Los valores fueron registrados en plantillas de trabajo que posteriormente fueron pasados a la base de pesos acumulativos y promedios de diámetros (ecuatorial y longitudinal). Los resultados fueron tabulados y graficados como superficie de respuestas en Excel (Office 365) y analizados estadísticamente con la prueba LSD (a=0,05) en el programa Statgraphic Centurion XVI (Statgraphics Technologies, Inc, EEUU).

2. Determinación de Clorofila La clorofila fue medida retirando las 3 primeras hojas verdaderas que vienen por debajo del ápice de cada planta. De éstas se retiró un segmento desde el centro de la hoja, pegado a la nervadura central, sin contar ésta última hasta completar 80 mg de hojas según la metodología propuesta por Wellburn (1994). Para la cuantificación de clorofila A y B: las hojas recolectadas se congelaron y almacenaron a -20°C, luego para cada cuantificación, se agregaron 0,5 mi de dimetilsulfóxido (DMSO, EMSIIRE®) a 80 mg de hojas pulverizadas en nitrógeno líquido en un microtubo cubierto con papel de aluminio. La solución se homogenizó con Vortex. Luego se agregaron 0,5 mi adicionales de DMSO, y la mezcla se incubó en un baño de agua a 65°C durante dos horas, seguido de incubación a temperatura ambiente durante 20 minutos. Finalmente, el contenido se centrifugó para evitar interferentes por sólidos en suspensión, y la absorbancia se midió utilizando un espectrofotómetro (Bioware WPA). El contenido de clorofila se calculó utilizando las siguientes fórmulas (Wellburn 1994): Formula 1 : Clorofila a (μg mL-1) = 12.47 * A665.1 - 3.62 * A649.1 Formula 2: Clorofila b (μg mL-1) = 25.06 * A649.1 - 6.5 * A665.1

4.8 Resultados del ensayo

De forma general, los tratamientos mostraron efectos cualitativos y cuantitativos.

Desde el punto de vista cualitativo, para los distintos tratamientos de la mezcla de bacterias, se observó un patrón robusto con abundante masa foliar y menor tamaño de la planta. No fueron evaluados el peso fresco, peso seco y longitud de la planta en este ensayo debido a que todos los tratamientos fueron desbrotados, deshojados y les fue removido el ápice principal para detener su crecimiento apical y favorecer la maduración de los frutos.

En cuanto al calibre de los tomates, hasta la séptima semana de cosecha, los calibres no poseen diferencia estadística significativa entre la mayoría de los tratamientos, diferenciándose solo en algunos tratamientos extremos, p. Ej. Testigo vs Mezcla. El promedio de los calibres se encuentra entre 40 a 50 mm.

El parámetro de peso acumulativo de tomates por tratamiento presentó diferencias estadísticas significativas entre la mayoría de los tratamientos hasta la séptima semana de cosecha. El tratamiento que presentó una respuesta con diferencia estadística significativa con respecto a todos los otros tratamientos fue la Mezcla WP de bacterias con 66% de fertilización con un pico que supera los 900 g superando ampliamente a los tratamientos testigos y comercial (figura 16).

Finalmente, cuando se determinó la concentración de clorofila (μg/mL) en la séptima semana de cosecha se observaron diferencias estadísticas significativas entre la mayoría de los tratamientos. El tratamiento que presentó una respuesta con diferencia estadística significativa con todos los otros tratamientos fue la Mezcla PLP 100% de fertilización, superando los 250 μg/mL de clorofila (figura 17).

Ejemplo 5. Estudio de predicción de compuestos y enzimas antimicrobianas de Bacillus safensis RGM 2450 y Bacillus siamensis RGM 2529

Se secuenció, ensambló y analizó el genoma de Bacillus safensis RGM 2450 y Bacillus siamensis RGM 2529.

Mediante análisis bioinformático se identificaron y predijeron genes que participan en la síntesis de diferentes péptidos ribosomales y no ribosomales.

En la tabla 15 se presentan los resultados obtenidos para B. safensis RGM 2450 respecto de los compuestos antimicrobianos que secretaría B. y potenciales fitopatógenos blancos. En la tabla 16 se describen las potenciales enzimas que secretaría.

B. safensis RGM 2450 tiene la capacidad de producir compuestos antimicrobianos como microcinas.

De acuerdo con el análisis cuando se compara el agrupamiento génico de la cepa RGM 2450 con el agrupamiento génico de la cepa B. pumilus ATCC 7061 y B. venelenzis FZB42 que participan en la síntesis de plantazolicina, es posible determinar que la cepa RGM 2450 presenta 11 de los 12 genes del agrupamiento génico pzn que participan en la síntesis y transporte de la microcina plantazolicina (Fig. 18). Se ha descrito que esta microcina tiene actividad antibacteriana contra bacterias tales como Brevibacillus brevis, Bacillus cereus, Bacillus licheniformis, otras especies de Bacillus, Micrococcus luteus, Paenibacillus granivorans (tabla 15). B. safensis RGM 2450 tiene la capacidad de producir el peptido no ribosomal bacilibactica. De acuerdo con el análisis del genoma de RGM 2450 se predijo el agrupamiento génico DhbACEBF (Fig. 19A) que participa en la síntesis y ensamblaje del sideróforo bacilibactica junto con los genes que participan en el transporte (FeuABC-YusV) y en la hidrólisis del sideróforo para la liberación del Fe+3 (Fig 19B). Bacillibactina ha sido reconocido previamente por presentar actividad inhibitoria contra el hongo F. oxysporum f. sp. Capsica (tabla 15).

Con el análisis, se predijo también la potencial producción de ciclolipopéptido. Particularmente, se predijo un agrupamiento génico de 46.673 pb que consta de 5 genes biosintéticos que codifican proteínas modulares que conforman una sintetasa de péptido no ribosomal (Fig. 20A). En base a la predicción bioinformática la sintetasa de péptido ribosomal esta codificada por 5 genes de los cuales el gen 1 (10.707 pb) codifica una proteína multimodular que participarían en la síntesis de un péptido de 3 aminoácidos (leucina-leucina-glutamina), el gen 2 (10.701 pb) codifica la síntesis de un segundo modulo que participa en la síntesis de un péptido de tres aminoácidos (leucina-ácido aspártico- X (no se pudo predecir)), el gen 3 participa en la adición del aminoácido isoleucina, el gen 4 presenta dos módulos que permitiría la adición del aminoácido valina y de una molécula de acetil CoA, la cual podría participar en la delación del péptido. El gen 5 presenta dos módulos que participan en la adición de otro aminoácido (X) y de un ácido graso (Fig 20B y 20C), antecedentes que sugieren que la potencial estructura que se podría formar es un ciclolipopéptido.

Luego, para definir que moléculas podrían corresponder a este potencial ciclolipopéptido que produciría la cepa RGM 2450 se realizó la búsqueda y comparación del agrupamiento génico en otras cepas secuenciadas, observándose un alto grado de conservación (sintenia) en las especies B. safensis y B. pumilus, sugiriendo que cumple un rol importante en el metabolismo secundario (Fig. 21A). Aunque parte de los genes presentan homología con el agrupamiento que participa en la síntesis del surfactante lichensina descrita en B. licheniformis DSM 13 (Fig. 21 B).

Cuando se realizó la predicción de la síntesis del antibiótico bacilisina mediante el análisis bioinformático se identificaron los genes que fueron parte del agrupamiento génico bacABCDE que participa en su síntesis (Fig. 22A). Este compuesto es un antibiótico dipéptido que consiste en un residuo de L-alanina que está unido un aminoácido no proteinógeno, L-anticapsina (Fig 22B). El agrupamiento génico que participa en la síntesis de bacilisina como su vecindario génico se encuentran altamente conservados en Bacillus cercanas filogenéticamente a B. safensis (Fig 22C).

Además, B. safensis RGM 2450 puede potencialmente secretar diversas enzimas tales como proteasas, metaloproteasas, lipasas, entre otros (tabla 16).

Tabla 15. Compuestos que secretaría B. safensis RGM 2450 y potenciales fitopatógenos blancos. Tabla 16. Potenciales enzimas que secretaria B. safensis RGM 2450.

Por su parte, B. siamensis RGM 2529 secretaría bacteriocinas tales como amilociclicina. En base al análisis del genoma de la cepa RGM 2529, se predijo el agrupamiento génico acnABCDEF de 4.170 pb que participarían en la síntesis, maduración y autoprotección del péptido antimicrobiano (bacteriocina) amilociclicina (Fig. 23A). El agrupamiento génico acnABCDEF que codifica aminociclina ha sido encontrado en cepas de la especie Bacillus amylolíquefacíens y B. velezensis que ha sido ampliamente descritas por su actividad PGPR (Fig 23B). En la literatura se ha descrito que amilociclicina tiene actividad antibacteriana contra Brevibacillus brevis, Bacillus cereus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, B. pumilus, Bacillus sphaericus, B. subtilis, Clavibacter michiganensis, Micrococcus luteus, Paenibacillus granivorans y Paenibacillus polymyxa (tabla 17)

A partir de los análisis, se demuestra que B. siamensis RGM 2529 presenta el agrupamiento génico DhbACEBF que participa en la síntesis de bacilibactina (figura 24), un sideróforo con actividad antifúngica contra F. oxysporum f. sp. Capsica (tabla 17). Presenta también, los 4 genes (surfAA, surfAB, surfAC y surfAD) que participan en la biosíntesis y ensamblaje de los aminoácidos que componen la surfactina (figura 25A). Según el análisis del agrupamiento génico de surfactina en cepas cercanas filogeneticamente a la cepa RGM 2529 (figura 25B), al comparar el homólogo de surfAB de B. velezensis ZB42 con el de RGM 2529 se obtiene un 94,95% de identidad y 73% de cobertura. Mientras, el gen surfAC codifica una sintetasa de péptido ribosomal que consta de 1 módulos que participan en el ensamblaje de leucina. Al comparar el homólogo de surfAC de B. amyloliquefaciens ZB42 con el de RGM 2529 se obtiene un 94,95% de identidad y 100% de cobertura. Finalmente, el gen surfAD codifica a una tioesterasa. Al comparar el homólogo de surfAD de B. velezensis ZB42 con el de RGM 2529 se obtiene un 95,36% de identidad y 100% de cobertura.

En el caso de fengicina, un compuesto descrito previamente como antifúngico, también se predijo un agrupamiento génico de 49.465 pb que participaría en la síntesis de este lipopéptido. Este agrupamiento génico está constituido por 5 genes (fenA, fenB, fenC, fenD y fenF) que codifican a las sintetasas de péptido no ribosomal que ensamblan este ciclolipopéptido junto con otros genes que participan en su modificación estructural (Fig 25A). Este agrupamiento génico se ha encontrado en cepas pertenecientes a las especies B. amyloliquefaciens, B. velezensis y B. siamensis (Fig 25B). El ensamblaje de los aminoácidos por sintetasas da origen a un ciclodecapeptido que junto con la acción de la enzima ligasa de ácidos grasos (Acetil CoA ligasa de ácidos grasos de cadena larga) forman un ciclolipopéptido (figura 26C).

Contiguo al agrupamiento génico que participa en la síntesis de fengicina se encontró el operón bamABCD que participa en la síntesis de otro lipopéptidos bacilomicina D (Fig 27A). Este operón abarca 37.696 pb y ha sido descrito en las especies B. amyloliquefaciens, B. velezensis y B. siamensis (Fig 27B).

Se ha descrito que bacilomicina D puede eliminar hongos de diferentes géneros y especies, entre ellos Alternaría alternata, Alternaría solani, Botrytis cinérea, Aspergillus flavus' Botryosphaerica ribis, C. albicans, Cryphonectria parasitica, Colletotrichum acutatum, Colletotrichum gloesporioides, Didymella bryoniae, Fusarium graminearum, Fusarium sambucinum, Fusarium oxysporum, Podosphaera fusca , Pythium sulcatum , Pythium ultimum, Rhizoctonia solani, R hizo pus sp., Sclerotinia sclerotiorum, Ustilago maydis , Monilinia fructicola, Penicillium expansum, Phomopsis gossypii, Phytophthora capsici, Pyricularia grísea, R. solani, Sclerotium rolfsii Sclerotinia sclerotiorum (tabla 17).

Se predijo también un agrupamiento génico 72.346 pb (Fig. 28A) que codifica un híbrido entre una poliquétido sintasa y una sintetasa de péptido no ribosomal (PKS-NRPS) que participa en la producción del antibiótico bacillaeno, un inhibidor de la síntesis de proteínas procariotas. La bacilano sintasa de la cepa RGM 2529 se compone de 13 módulos PKS y 3 módulos NRPS al igual que las descritas en velezensis FZB42 y Bacillus subtilis 168 (Fig 28B).

Por lo tanto, B. siamensis RGM 2529 puede producir potencialmente el compuesto antibacteriano y antifúngico bacilaeno, para el cual se ha descrito tiene potencial de acción contra bacterias tales como B. thuríngiensis, E. coli, Klebsiella pneumoniae, M. xanthus, P. vulgaris, Serraría marcescens, S. aureusy). En el caso de hongos, se ha descrito que bacilaeno presenta actividad inhibitoria contra Coriolopsis spp. Fusarium sp, Pseudoxylaria sp., Trichoderma sp., Umbelopsis sp (tabla 17).

Finalmente, B. siamensis RGM 2529 también sería capaz de secretar enzimas del tipo proteasa, lipasa, lactonasa y celulasa (tabla 18).

Tabla 17. Compuestos que secretaría B. siamensis RGM 2529 y potenciales fitopatógenos blancos.

Tabla 18. Potenciales enzimas que secretaría B. siamensis RGM 2529. Bibliografía:

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