HYDROLYSAT DE PROTEINES DE LUZERNE, SON PROCEDE DOBTENTION ET SON UTILISATION

La présente invention concerne un hydrolysat de protéines de luzerne, un procédé pour sa préparation et l'utiieation de l'hydrolysat comme ingrédient alimentaire, comme Ingrédient cosmétique et comme agro-matériau.

Les protéines sont, avec les glucides et les lipides, l'une des trois grandes familles de macronutriments. Il existe un très grand nombre d'acides aminés différents mais seulement vingt sont utilisés par l'organisme des vertébrée pour la fabrication des protéines (acides aminés dits c protéogènes »). Parmi ces 20 acides aminés, 12 peuvent être fabriqués par le corps humain et les 8 autres sont dits essentiels car l'organisme est incapable de les synthétiser. Ces acides aminés doivent par conséquent être apportés par l'alimentation.

La composition en acides aminés des protéines est prise en compte pour évaluer la qualité protéique de notre alimentation. La qualité des sources alimentaires de protéines est presque exclusivement définie par leurs capacités à couvrir les besoins en protéines et en acides aminés essentiels.

Les protéines animales, majoritaires dans l'alimentation des pays industrialisés, proviennent notamment du lait, de l'œuf, des poissons et de la viande. Les ressources disponibles pour produire ces protéines animales, qu'il s'agisse de viande, de produits laitiers ou de poisson, ne sont pas Infinies.

Actuellement, de l'ordre de 70% des protéines végétales produites sont utilisées pour produire des protéines animales avec un rendement moyen particulièrement médiocre, puisqu'il faut entre 4 kg et 15 kg de protéines végétales pour produire 1kg de protéines animales suivant le type d'animal considéré.

Les protéines végétales représentent donc une des sources alternatives aux protéines animales dans l'alimentation humaine. A l'heure actuelle, les sources de protéines d'origine végétales sont essentiellement le soja, les céréales et les légumineuses.

Une diversification et un enrichissement de l'offre actuelle en protéines végétales, monopolisée principalement par le soja, s'avère donc essentiels.

Si les protéines végétales ont la réputation d'être "Incomplètes" car déficientes en l'un ou l'autre des acides aminés essentiels, ce n'est pas le cas des protéines de luzerne [Medigaco sativa) qui sont composées de tous les acides aminés essentiels (tryptophane, lysine, méthionine, phénylalanine, thréonine, valine, leucine et isoleucine). Les protéines de luzerne sont particulièrement intéressantes car elles présentent un aminogramme équilibré composé de tous les acides aminés essentiels, de plus leurs propriétés nutritionnellee sont équivalentes voire supérieures à celles des autres protéines agricoles conventionnelles d'origine végétales (gluten de blé, protéines de soja) ou animales comme les protéines de poisson par exemple.

La demande internationale WO 02/058482 décrit un extrait protéique non hydrolysé obtenu par précipitation des protéines insolubles du jus vert de luzerne. L'extrait protéique décrit dans cette demande, commercialisé sous le nom Luzixine®, se présente sous forme d'une semoule grossière de faible solubilité dans l'eau.

La demande de brevet FR 2 876 389 décrit des hydrolysats de protéines obtenus par hydrolyse enzymatique des protéines solubles du jus vert de luzerne (dites protéines blanches, notamment le RubisCO). Ce procédé, et l'hydrolysat obtenu sont également décrits dans Prévôt D'AMse et al (Enzyme end mlcroblal technoiogy 34 (2004), 380-391). Le procédé décrit dans ces documents Implique les étapes suivantes : le jus vert de luzerne est alcalinisé pour séparer les protéines vertes insolubles des protéines blanches solubles. Ces protéines blanches sont ensuite précipitées à pH acide (4-6), séparées par urtrafiltration et purifiées par diaflltration sur des membranes minérales. La crème protéique obtenue suite à ces étapes est ensuite soumise à une hydrolyse enzymatique et le perméat est décoloré et désalinisé.

Le procédé décrit dans ce document présente cependant l'inconvénient de nécessiter plusieurs étapes préalables à l'étape d'hydrolyse enzymatique pour isoler les protéines blanches du jus vert. En outre, l'hydrolysat de luzerne obtenu par ce procédé a une solubilité dans l'eau très réduite, ce qui limite son utilisation, en particulier dans l'industrie alimentaire.

II existe donc un besoin pour un hydrorysat de luzerne dans lequel tous les acides aminés essentiels sont présents et pour un procédé simplifié par rapport à celui connu de l'art antérieur.

La présente invention vient combler ce besoin. Un premier objectif de la présente invention est un hydrorysat de protéines de luzerne comprenant l'ensemble des acides aminés protéogènes. Un deuxième objectif de la présente invention est un procédé de préparation d'un hydrolysat de protéines de luzerne comprenant une étape d'hydrolyse directe du jus vert de luzerne.

Un troisième objectif de la présente invention est un procédé de préparation d'un hydrolysat de protéines de luzerne comprenant une étape d'hydrolyse d'un coagulum de luzerne comprenant des protéines du jus vert de luzerne.

Un quatrième objectif de la présente invention est un procédé de préparation d'un hydrolysat de protéines de luzerne comprenant l'ensemble des acides aminés protéogènes. Un cinquième objectif de la présente invention est l'utilisation d'un hydrolysat de protéines de luzerne pour la préparation de compositions alimentaires, cosmétiques et d'agromatériaux.

Dans la suite de la description et les revendications, tous les pourcentages sont des pourcentages massiques, sauf indication contraire. Dans la suite de la description et les revendications, le pourcentage d'acides aminés et/ou de peptides et/ou de protéines est défini par rapport à la masse totale de la matière azotée, désigné par NT *6,25, selon la méthode de dosage par Kjeldhal, sauf indication contraire.

Dans la suite de la description, la notion de teneur en matière azotée protéique fait référence au dosage de la matière azotée totale, selon la méthode Kjeldhal, soustrait de la matière azotée minérale, le tout étant multiplié par le facteur 6,25.

Dans la suite de la description et les revendications, le pourcentage de matière sèche est défini par rapport à la masse totale (ou matière brute) du jus vert de luzerne, du coagulum ou de Phydrolysat selon le cas, sauf indication contraire. Dans la suite de la description et les revendications, l'expression « molécules de poids moléculaire inférieure à XX Da » désigne les acides aminés et/ou peptides et/ou protéines, selon la valeur de la masse moléculaire.

Dans la suite de la description et sauf indication contraire, le profil peptique est défini selon la méthode interne ARD par HPLC (colonne Shodex Protein KW-8025) avec détection UV 260 nm et selon une distribution par gamme de masses molaires définie selon le kit de calibration SIGMA 6500-66000 : réf MW-GF-70 kit.. Un premier objet de la présente invention concerne un hydrolysat de protéines de luzerne eoluble dans l'eau, comprenant 20 acides aminés essentiels et non essentiels.

Au sens de la présente invention, on entend par « hydrolysat de protéines de luzerne » un mélange de protéines, d'oligopeptides et de peptides et d'acides aminés libres obtenu par la réduction de la masse moléculaire des protéines contenues dans le jus vert de luzerne.

Le jus vert de luzerne est, au sens de la présente invention, la fraction liquide obtenue par pressage de la luzerne, avantageusement de la luzerne n'ayant pas atteint le stade de floraison. La luzerne est avantageusement fauchée de mars à décembre, de préférence d'avril à mai. De manière non limitative, la luzerne peut appartenir à une variété choisie parmi Aliso, Artemls, Asmera, Félicia, Everest, Neptune, Exquise, Galaxie, Alexis, Prunelle, Salsa, Alicia, Arpège, Alpha, Andela, Concerto, Timbale, Rachat, Verdor et Barmed. Au sens de la présente invention, on entend par « soluble dans l'eau » le fait qu'au moine 95 %, avantageusement au moins 99, de préférence au moins 99,9 % de la poudre est soluble à une concentration de 25 g d'hydrolysat pour 100 g d'eau à 20 ^B C dans l'eau (pH - 7). Dans la présente invention, la solubilité de la poudre est mesurée par la méthode décrite en annexe A de la norme COSEX STAN 295R-2009 : 1 g d'échantillon est placé dans un tube à centrifugation de masse déterminée. 15 mL d'eau sont ajoutés et l'échantillon dissous. La solution est centrifugée pendant 15 minutes à 3000 tours par minutes et le surnageant est éliminé. La centrifugation est répétée deux fois. Le tube est séché à 105°C jusqu'à obtenir une masse constante. Les résultats sont reportés en pourcentage de solide insoluble dans l'eau selon l'équation suivante :

Résidu solide insoluble dans l'eau (%) = (W1 - W0)/ S x 100, où W1 est la masse du tube et du résidu après centrifugation, W0 est la masse du tube à centrifugation et S est la masse de l'échantillon. Le pourcentage de poudre dissoute correspond à 100 - résidu solide insoluble dans l'eau.

Au sens de la présente Invention, on entend par « coagulum obtenu par précipitation des protéines du jus vert de luzerne » la fraction solide obtenue par précipitation des protéines contenues dans le Jus vert par alcalinisation du jus vert à un pH supérieur à 7, notamment de 7 à 8, de préférence de 7,3 à 7,5 et injection de vapeur â une température supérieure à 80°C , notamment à une température d'environ 85°C . Le coagulum, au sens de la présente invention, est donc un mélange de protéines blanches et de protéines vertes de luzerne, contrairement à la demande de brevet FR 2 876 389, dans lequel l'hydrolyse est mise en œuvre sur les protéines blanches de luzerne, contenues dans le filtrat obtenu consécutivement à une étape cfalcalinisation et d'injection de vapeur. La présente invention concerne en particulier des hydrolysats tels que définie ci-dessus, caractérisés en ce qu'au moins 95 %, notamment au moins ΘΘ %, de préférence 99,9 % de l'hydrolysat est soluble dans l'eau à une concentration de 25 g d'hydrolysat pour 100 g d'eau à 20"C (à pH = 7).

Les acides aminés contenus dans l'hydrolysat de luzerne selon la présente invention sont ceux constituant les protéines humaines (dits protéogénes). Les 8 acides aminés protéogénes essentiels sont la valine, la leucme, l'isoleucine, la phénylalanlne, le tryptophane, la méthionine, la thréonine et la lysine. Les 12 acides aminés non-essentiels sont la cystéine, l'acide aspartique, l'acide glutamique, la glycine, l'histidine, la lysine, la méthionine, la proline, l'arginine, la sérine, la valine et la tyrosine. Ils proviennent tous de la luzerne et sont présents dans l'hydrolysat sous forme libre ou en tant que constituants de peptides et de protéines solubles dans l'eau.

Outre leur solubilité dans l'eau, les hydrolysats selon la présente Invention sont faiblement pigmentes.

Au sens de la présente invention, on entend par " faiblement pigmenté » le fait que l'hydrolysat sous forme de poudre est blanchâtre ou très légèrement teinté. Les hydrolysats faiblement pigmentés selon la présente invention comprennent avantageusement moins de 1000 ppm, avantageusement moins de 250 ppm, de préférence moins de 180 ppm, de pigments tels que les xanthophylles, notamment la lutéine, la néoxanthine et la vioiaxanthine par rapport à la masse totale de l'extrait sec de l'hydrolysat.

Les hydrolysats selon la présente invention contiennent de préférence des caroténoïdes (β-carotène) à une teneur inférieure à 220 ppm et des xanthophylles, notamment la lutéine, la néoxanthine et la vioiaxanthine à une teneur totale inférieure à 180 ppm de xanthophylles de l'extrait sec de l'hydrolysat.

Les hydrolysats selon la présente Invention contiennent également de 20 à 950 ppm de chlorophylle de la matière sèche totale, dont 20 à 800 ppm de chlorophylle A et 20 à 800 ppm de chlorophylle B. Dans la présente invention, la teneur en pigments est déterminée selon la méthode suivante : Pour les chlorophylles : [Extraire Pe grammes d'échantillon par une solution d'acétone à 80%, lire les absorbances à 645 et 663 nm sur spectrométre puis calculer les concentrations en chlorophylles A, B et totales à partir des équations suivantes :

- Chlorophylles Totales (en mg/Kg) = 8,02*A663+20,21*A645)*(v7Pe)*1000 - Chlorophylles A (en mg/Kg)= (12,7*663-2,6* 645) *(V Pe)*1000

- Chlorophylles B (en mg/Kg)= (22.9*A645-4,68*A663) *(v7Pe)*1000

Avec A663 : Absorbance à 663 nm ; A645 : Absorbance à 645 nm ; V : Volume soit 0,100 L ; Pe : Prise d'essai de l'échantillon en g.

Pour les xanthophylles (lutéine, violaxanthine et neoxanthrine) et caroténoTdes (B- carotène) : extraire x g d'échantillon par un mélange éther de pétrole- acétone 7/3, mixer le mélange à l'ultraturax, saponifier (par de la potasse méthanolique) le mélange afin de dégrader les chlorophylles et concentrer l'extrait de pigmente. Reprendre l'échantillon dans 10mL d'éthanol et séparer les pigmenta par HPLC.

L'hydrolysat de protéines de luzerne selon la présente Invention peut être sous la forme d'une solution dans l'eau ou sous la forme solide, notamment d'une poudre.

Dans un mode de réalisation, l'hydro lysat de protéines est sous la forme d'une solution aqueuse, par exemple un sirop. Dans ce mode de réalisation, la solution aqueuse contient de 1 à 79 %, notamment de 1 à 60 %, en particulier environ 50 % de matière sèche par rapport à la masse totale de la solution. Avantageusement, ledit hydrolysat sous forme de solution aqueuse est obtenu à l'issue de l'étape d'hydrolyse du procédé décrit ci-après, avant l'étape de séchage. Un tel sirop peut également être obtenu par dissolution de rhydrolysat sous forme solide, notamment d'une poudre dans l'eau.

La présente invention concerne également dans un mode de réalisation particulier un hydrolysat de protéines de luzerne sous forme liquide, notamment sous la forme d'un siro p en solution aqueuse. Ledit hydrolysat sous forme liquide peut en particulier être un sirop caractérisé par un taux de matière sèche variant de 56 à 65 % et en particulier de 56,98 et 64,31% de la masse totale du sirop, dans lequel la proportion de minéraux varie de 3 à 27 % de minéraux, notamment de 4et 21 % de la matière sèche et par une teneur en matière azotée protéique variant de 13 à 90 %, notamment de 21 à 85 % de l'extrait sec. Le sirop peut être caractérisé par sa viscosité. Avantageusement, la viscosité d'un sirop à 63 % de matière sèche est de 100 à 500 cP à 500 s ^-1 et 20 °C. La viscosité à 55°C d'un sirop à 63 % de matière sèche est de 30 à 200 cP à 500 s ^-1 Dans la présente invention, la viscosité est mesurée selon la méthode suivante : dans un bêcher, on prépare environ 10 g d'une solution aqueuse de protéines à 63% (p/p) de matière sèche. La viscosité est ensuite mesurée sur un viscosimètre AR 1000 avec un cône plan.

Dans un mode de réalisation, l'hydrolysat de protéines est sous la forme solide. Ledit solide comprend de 50 à 100 % de matière sèche, notamment de 90 à 99 % de matière sèche, en particulier environ 95 % de matière sèche. Ledit solide est notamment une poudre ou des granules. Typiquement, la poudre est composée de granules ayant un diamètre variant de 5 à 500 μm, notamment de 7 à 330 μηη.

Le diamètre médian des granules constituant la poudre est en particulier de 30 à 75 μπι. dans la présente invention, la granulométrie de la poudre est déterminée par granulométrie laser eur un appareil de type Coulter, Model optique Fraunhofer, LS30, par voie sèche, sans mode de vibration et sur une durée de 30sec. Les résultats peuvent être lus directement sur l'appareil.

Dans les hydrolysats selon la présente invention, la teneur en matière azotée protéique est d'au moins 20 %, notamment d'au moins 40 % de la matière sèche totale. Avantageusement, la teneur en matière azotée protéique varie de 13 à 90 %, notamment de 21 à 85 % de la matière sèche totale.

Au sens de la présente invention, on entend par « matière azotée protéique » l'ensemble des protides, incluant les acides aminés, polypeptides et protéines. Le pourcentage de matière azotée protéfque peut être déterminé selon la méthode de Kjeldhal, par minéralisation des protides avec de l'acide surfurique (H ₂ SO ₄ ) concentré selon la méthodologie suivante :

Détermination de la matière azotée totale : minérallser x grammes d'échantillon durant 2h à 400°C et distiller sur appareil Kjeldahl (Vapodest Gerhardt).

Détermination de l'azote ammoniacal : Distiller x g d'échantillon sur appareil Kjeldahl (Vapodest Gerhardt). Matière azotée protéique : Analyser l'échantillon en azote totale et azote ammoniacal puis calculer la concentration en protéines totales par la formule suivante : (azote totale- azote ammoniacal) x 6,25 et calculer la concentration en protéines insolubles par la formule suivante : protéines totales - protéines solubles. La présente invention concerne également un hydrolysat de protéines de luzerne dans lequel la matière azotée protéique comprend :

• 14 à 73 % de molécules de poids moléculaire inférieur à 300 Da,

• 7 à 22 %. de molécules de poids moléculaire compris entre 300 et 500 Da, • 8 à 17 % de molécules de poids moléculaire compris entre 500 et 1 000 Da,

• 11 à 59 % de molécules de poids moléculaire compris entre 1 000 et 5000 Da,

• 1 à 11 % de molécules de poids moléculaire compris entre 5000 et 10000 Da.

Dans un mode de réalisation particulier, la matière azotée protéique comprend : · 35 à 75 %, notamment environ 46 % de molécules de poids moléculaire inférieur à 300 Da,

• 5 à 10 %, notamment environ 9 % de molécules de poids moléculaire compris entre 300 et 500 Da,

• 7 à 15 %, notamment environ 12 % de molécules de poids moléculaire compris entre 500 et 1 000 Da,

• 8 à 35 %, notamment envion 28 % de molécules de poids moléculaire compris entre 1 000 et 5000 Da, 1 à 5 %, notamment environ 5 % de molécules de poids moléculaire compris entre 5000 et 10 000 Da.Dans la suite de la description, le profil peptique est défini selon la méthode interne du laboratoire InVrvo Lab par HPLC avec détection UV et selon une distribution par gamme de masses molaires, sauf indication contraire- La présente invention concerne également un hydrolysat de protéines de luzerne dans lequel la matière azotée protéique comprend :

• de 7 à 48%, notamment de 11 à 38% de molécules de poids moléculaire inférieur à 300 Da,

• de 3 à 46%, notamment de 5 à 37% de molécules de poids moléculaire compris entre 300 et 500 Da,

• de 7 à 28%, notamment de 11 à 22% de molécules de poids moléculaire compris entre 500 et 1000 Da,

· de 9 à 88%, notamment de 15 à 70% de molécules de poids moléculaire compris entre 1000 et 5000 Da,

• de 0,9 à 10%, notamment de 1 à 8% de molécules de poids moléculaire compris entre 5000 et 10000 Da, notamment pour le jus vert : · de 7 à 23%, notamment de 11 à 18% de molécules de poids moléculaire inférieur à 300 Da,

• de 3 à 11%, notamment de 5 à 9% de molécules de poids moléculaire compris entre 300 et 500 Da, • de 7 à 25%, notamment de 11 à 20% de molécules de poids moléculaire compris entre 500 et 1000 Da,

• de 26 à 88%, notamment de 42 à 70% de molécules de poids moléculaire compris entre 1000 et 5000 Da,

· de 1 à 10%, notamment de 2 à 8% de molécules de poids moléculaire compris entre 5000 et 10000 Da, notamment pour le coagulum:

• de 14 à 48%, notamment de 22 à 38% de molécules de poids moléculaire inférieur à 300 Da,

· de 14 à 46%, notamment de 23 à 37% de molécules de poids moléculaire compris entre 300 et 500 Da,

• de 8 à 28%, notamment de 13 à 22% de molécules de poids moléculaire compris entre 500 et 1000 Da,

• de 9 à 33%, notamment de 15 à 26% de molécules de poids moléculaire compris entre 1000 et 5000 Da,

• de 0,9 à 4%, notamment de 1 à 3% de molécules de poids moléculaire compris entre 5000 et 10000 Da,

De manière avantageuse, le dit hydrolysat de protéines de luzerne comprend les 20 acidee aminés dans les proportions suivantes de la matière azotée protéique : · une teneur en alanine comprise entre 5,9% et 6,6%,

• une teneur en cystine comprise entre 0,9% et 1 ,1%,

• une teneur en acide aspartique comprise entre 12,0% et 13,9%,

• une teneur en acide glutamique comprise entre 10,4% et 11 ,8%,

• une teneur en phénylalanine comprise entre 4,5% et 5,2%,

• une teneur en glycine comprise entre 4,5% et 5,1%,

• une teneur en htetidine comprise entre 1,9% et 2,2%,

• une teneur en isoleucine comprise entre 4,1% et 4,6%,

• une teneur en lysine comprise entre 5,8% et 6,6%,

• une teneur en leuclne comprise entre 6,7% et 7,3%,

• une teneur en méthionine comprise entre 1 ,5% et 1,7%,

• une teneur en proline comprise entre 4,9% et 5,4%,

• une teneur en arginine comprise entre 4,9% et 5,5%,

• une teneur en sérine comprise entre 4,1% et 4,8%,

• une teneur en thréonine comprise entre 4,6% et 5,3%, • une teneur en valine comprise entre 5,3% et 5,9%,

• une teneur en tryptophane comprise entre 1 ,6% et 1,9%,

• une teneur en t rosine comprise entre 3,6% et 4.1 %.

De manière avantageuse, le dit hydrolysat de protéines de luzerne comprend les 20 acides aminés dans les proportions suivantes, en masse de la masse totale de matière azotée protéique :

• une teneur en alanina de 2,8% à 9,5%, notamment de 4,4% à 7,6%

• une teneur en cystlne de 0,2% à 1 ,4%, notamment de 0,3% à 1 , 1 %

• une teneur en acide aspartique de 4,0% à 21 ,3%, notamment de 6,4% à 17,0%

• une teneur en acide glutamique de 4,6% à 17,3%, notamment de 7,3% à 13,8%

• une teneur en phénylalanine de 1 ,9% à 8,2%, notamment de 3,1% à 6,5%

• une teneur en glycine de 2,0% à 7,7%, notamment de 3,3% à 6,2%

· une teneur en histidine de 0,8% à 3,2%, notamment de 1 ,2% à 2,6%

• une teneur en isoleucine comprise de 1,9% à 7,5%, notamment de 3,0% à 6,0%

• une teneur en lysine de 2,2% à 9,2%, notamment de 3,5% à 7,4%

• une teneur en leucine de 3,0% à 12,5%, notamment de 4,9% à 10,0% · une teneur en môthlonine de 0,6% à 2,9%, notamment de 0,9% à 2,3%

• une teneur en praline de 2,0% à 8,4%, notamment de 3,2% à 6,7%

• une teneur en arginine de 1 ,2% à 9,0%, notamment de 1 ,9% à 7,2%

• une teneur en serine de 1 ,7% à 6,6%, notamment de 2,8% à 5,2%

• une teneur en thréonine de 1 ,9% à 7,2%, notamment de 3, 1 % à 5,7% · une teneur en valine de 2,4% à 9,3%, notamment de 3,9% à 7,5%

• une teneur en tryptophane de 0,7% à 2,7%, notamment de 1 ,1 % à 2,2%

• une teneur en tyrosine de 1 ,2% à 6,4%, notamment de 1 ,9% à 5, 1 %

notamment :pour le jus vert

• une teneur en alanine de 2,8% à 9,5%, notamment de 4,4% à 7,6%

• une teneur en cystine de 0,3% à 1 ,4%, notamment de 0,5% à 1 , 1 %

• une teneur en acide aspartique de 5,6% à 21,3%, notamment de 8,9% à 17,0% • une teneur en acide glutamique de 4,6% à 16,5%, notamment de 7,3% à 13,2%

• une teneur en phénylalanine de 1,9% à 7,1%, notamment de 3,1% à 5,7%

• une teneur en glycine de 2,0% à 7,2%, notamment de 3,3% à 5,8%

• une teneur en histidine de 0,8% à 3,0%, notamment de 1 ,2% à 2,4%

• une teneur en isoleucine de 1,9% à 6,6%, notamment de 3,0% à 5,2%

• une teneur en lysine de 2,2% à 8,8%, notamment de 3,5% à 7,0%

• une teneur en leucine de 3,0% à 11 ,6%, notamment de 4,9% à 9,2%

• une teneur en méthionine de 0,6% à 2,3%, notamment de 0,9% à 1 ,9%

• une teneur en proline de 2,0% à 8,4%, notamment de 3,2% à 6,7%

• une teneur en arginine de 1 ,2% à 7,4%, notamment de 1 ,9% à 5,9%

• une teneur en serine de 1 ,8% à 6,6%, notamment de 2,9% à 5,2%

• une teneur en thréonine de 1 ,9% à 6,9%, notamment de 3,1 % à 5,6%

• une teneur en valine de 2,4% à 8,2%, notamment de 3.9% à 6,6%

• une teneur en tryptophane de 0,7% à 2,7%, notamment de 1 , 1 % à 2,2%

• une teneur en tyrostne de 1 ,2% à 5,6%, notamment de 1 ,9% à 4,5% notamment pour le coagulum:

• une teneur en alanine de 2,8% à 8,9%, notamment de 4,5% à 7,2%

• une teneur en cystine de 0,2% à 0,7%, notamment de 0,3% à 0,6 %

• une teneur en acide aspartique de 4,0% à 13,8%, notamment de 6,4% à 11,0%

• une teneur en acide glutamique de 5,5% à 17,3%, notamment de 8,9% à 13,8%

• une teneur en phenylalanine de 2,5% à 8,2%, notamment de 4,1% à 6,5%

• une teneur en glycine de 2,5% à 7,7%, notamment de 3,9% à 6,2%

• une teneur en histidine de 1 ,0% à 3,2%, notamment de 1 ,5% à 2,6%

• une teneur en isoleucine de 2,3% à 7,5%, notamment de 3,6% à 6,0%

• une teneur en lysine de 2,8% à 9,2%, notamment de 4,6% à 7,4%

• une teneur en leucine de 4,0% à 12,5%, notamment de 6,4% à 10,0%

• une teneur en méthionine de 0,9% à 2,9%, notamment de 1 ,5% à 2,3%

• une teneur en praline de 2,4% à 7,9%, notamment de 3,9% à 6,3%

• une teneur en arginine de 2,7% à 9,0%, notamment de 4,4% à 7,2%

• une teneur en serine de 1 ,7% à 5,8%, notamment de 2,8% à 4,6%

• une teneur en thréonine de 2,2% à 7,2%, notamment de 3,4% à 5,7%

• une teneur en valine de 2,9% à 9,3%, notamment de 4,7% à 7,5% • une teneur en tryptophane de 0,8% à 2,7%, notamment de 1 ,2% à 2, 1 %

• une teneur en tyrosine de 2,0% à 6,4%, notamment de 3,2% à 5, 1 %

Les hydrolysats obtenus sur j us vert de luzerne selon la présente invention sont caractérisés par le profil moléculaire de la matière azotée protéique à l'Issue de l'hydrolyse enzymatique.

Dans la suite de la description, le profil peptique est défini selon la méthode interne du laboratoire InVivo Lab par HPLC avec détection UV et selon une distribution par gamme de masses molaires, sauf indication contraire..

La présente invention concerne également un hydrolysat de protéines de luzerne à base de jus vert dans lequel la matière azotée protéique comprend :

• de 7 à 23%, notamment de 11 à 18% de molécules de poids moléculaire inférieur à 300 Da,

· de 3 à 11%, notamment de 5 à 9% de molécules de poids moléculaire compris entre 300 et 500 Da,

• de 7 à 25%, notamment de 11 à 20% de molécules de poids moléculaire compris entre 500 et 1000 Da,

• de 26 à 88%, notamment de 42 à 70% de molécules de poids moléculaire compris entre 1000 et 5000 Da, de 1 à 10%, notamment de 2 à 8% de molécules de poids moléculaire compris entre 5000 et 10000 Da,Dans les hydrolysats selon la présente invention, au moins 55 %, notamment au moins 70 % de molécules de poids moléculaire inférieur à 300 Da sont comprises dans la matière azotée protéique. Dans les hydrolysats selon la présente invention, au moins 65 %, avantageusement au moins 85 % de molécules de poids moléculaire inférieur à 1 000 Da sont comprises dans la matière azotée protéique.

Dans les hydrolysats selon la présente invention, au moins 75 %, avantageusement au moins 90 % de molécules de poids moléculaire Inférieur à 10000 Da sont compris dans la matière azotée protéique.

De manière avantageuse, dans les hydrolysats selon la présente invention, au moins 95 % de molécules de poids moléculaire inférieur à 10000 Da sont comprises dans la matière azotée protéique. Selon un mode de réalisation particulier, au moins 95 % de molécules de poids moléculaire inférieur à 10000 Da et au moins 55 %, notamment au moins 70 % de molécules de poids moléculaire inférieur à 300 Da sont comprises dans la matière azotée protéique. Dans les hydrolysats selon la présente Invention, la teneur en sels (ou cendres) est de 1 à 25 % de la matière sèche totale. Parmi les cations constituant ces sels, on trouve par exemple Na ⁺ . NH ₄ ⁺ , K ⁺ , Ca ²⁺ et Mg ²⁺ et parmi les anions constituant ces sels CI-, NO ₃ -, SO ₄ ^2- et ΡΟ ₄ ^2- .

Les proportions en sels minéraux et oligoéléments des hydrolysats selon la présente invention est donnée dans le tableau suivant (par rapport à la masse brute de l'hydrolysat).

De manière inattendue, les hydrolysats selon la présente invention contiennent des quantités élevées de potassium, de calcium, et de magnésium et en fait une source naturelle de ces minéraux.

De manière encore plus inattendue, les hydrolysats selon la présente invention ont également une teneur en sodium fable. La faible teneur en sodium en fait un ingrédient particulièrement recommandé dans le cadre des régimes pauvres en sodium. Le programme national nutrition santé (PNNS) recommande un apport journalier en sel (chlorure de sodium) de 8g chez l'homme adulte et 6,5 g pour la femme et les enfants. L'Organisation Mondiale de la Santé a pour sa part, mis comme objectif un maximum de 5 g de sel. L'utilisation de l'hydrolysat de l'invention permet d'apporter un goût salé dans les aliments où il est utilisé sans notablement être une source de sodium car la note salée provient principalement du potassium présent dans l'objet de l'invention.

La présente invention concerne donc également des hydrolysats tels que définis ci- dessus, dans lesquels la teneur en sodium est inférieure à 5000 mg kg, notamment inférieure à 2500 mg kg et de préférence de 440 mg kg à 2200 mg/kg par rapport à la matière brute.

La présente invention concerne donc également des hydrolysats tels que définis ci- dessus, dans lesquels la teneur en potassium est de 20 000 mg/kg à 70 000 mg/kg, notamment de 22 000 mg/kg à 60000 mg/kg par rapport à la matière brute, la teneur en calcium est de 10 000 mg/kg à 50 000 mg/kg, notamment de 13 000 mg/kg à 40 000 mg/kg et la teneur en magnésium est de 2 000 mg/kg à 5 000 mg/kg, notamment de 3 300 mg/kg à 3 600 mg/kg par rapport à la matière brute

.Selon un mode de réalisation avantageux, I' invention concerne un hydrolysat tel que défini ci-dessus dans lequel la teneur en potassium est de 0 mg/kg â 87 000 mg/kg, notamment de 8 800 mg/kg à 70 000 mg/kg par rapport à la matière brute, la teneur en calcium est de 6 000 mg/kg à 50000 mg/kg, notamment de 9 600 mg/kg à 40000 mg/kg et la teneur en magnésium est de 0 mg/kg â 5400 mg/kg, notamment de 800 mg/kg à 4 300 mg/kg par rapport à la matière brute.

Les hydrolysats selon la présente invention contiennent également du fer, notamment en proportion de 10 à 100 mg / kg, en particulier de 47 à 68 mg/kg.

Les hydrolysats selon la présente invention contiennent également d'autres composants tels que des fibres végétales solubles dans l'eau et des lipides.

Ils contiennent ainsi des sapon!nes, des isoflavones, notamment de 0,001% à 0,015%, en particulier de 0,0102% à 0,0105% (en pourcentage massique par rapport à la masse brute de l'hydrolysat), des phytates, notamment en proportion de 0 à 0,2 %, en particulier de 0,001% à 0,14 % et des L-canavanines, notamment de 0 à 5 mg / kg, en particulier Inférieure à 5 mg / kg.

Dans un mode de réalisation, la teneur en matière azotée protéique est de 25 à 50 %, notamment de 40 à 50 %, de préférence de 45 à 50 % de la matière sèche totale. Dans ce mode de réalisation, l'hydrolysat est avantageusement obtenu par hydrolyse enzymatique du jus vert sans étape d'isolement des protéines préalable à l'étape d'hydrolyse. La teneur en sels (ou cendres) dans l'hydrolysat est de 10 à 20 %, notamment d'environ 15 %.

De manière avantageuse, le dit hydrolysat de protéines de luzerne à base de jus vert comprend les 20 acides aminés dans les proportions suivantes, en masse de la masse totale de matière azotée protéique :

• une teneur en alanine de 2,8% à 9,5%, notamment de 4,4% à 7,6%

• une teneur en cysttne de 0,3% à 1 ,4%, notamment de 0,5% à 1 , 1 %

• une teneur en acide aspartique de 5,6% à 21,3%, notamment de 8,9% à 17,0%

• une teneur en acide glutamique de 4,6% à 16,5%, notamment de 7,3% à 13,2%

• une teneur en phénylalanine de 1 ,9% à 7, 1 %, notamment de 3, 1 % à 5,7%

• une teneur en glycine de 2,0% à 7,2%, notamment de 3,3% à 5,8%

• une teneur en hlstidlne de 0,8% à 3,0%, notamment de 1,2% à 2,4%

• une teneur en isoleucine de 1 ,9% à 6,6%, notamment de 3,0% à 5,2%

• une teneur en lysine de 2,2% à 8,8%, notamment de 3,5% à 7,0%

• une teneur en leucine de 3,0% à 11 ,6%, notamment de 4,9% à 9,2%

• une teneur en méthionine de 0,6% à 2,3%, notamment de 0,9% à 1 ,9%

• une teneur en proline de 2,0% à 8,4%, notamment de 3,2% à 6,7%

• une teneur en arginine de 1 ,2% à 7,4%, notamment de 1 ,9% à 5,9%

• une teneur en sérine de 1 ,8% à 6,6%, notamment de 2,9% à 5,2%

• une teneur en thréonine de 1,9% à 6,9%, notamment de 3,1% à 5,6%

• une teneur en valine de 2,4% à 8,2%, notamment de 3,9% à 6,6%

• une teneur en tryptophane de 0,7% à 2,7%, notamment de 1 , 1 % à 2,2%

• une teneur en tyrosine de 1 ,2% à 5,6%, notamment de 1 ,9% à 4,5%

La présente invention concerne également, dans un premier mode de réalisation particulier, un hydrolysat de protéines de luzerne soluble dans l'eau sous forme solide, comprenant :

• 20 acides aminés, essentiels et non essentiels,

• 90 à 99 % de matière sèche,

• 45 à 50 % de matière azotée protéique par rapport à la matière sèche totale, comprenant au moins 95 % de molécules de poids moléculaire inférieur à 10000 Da et au moins 55 %, notamment au moins 70 % de molécules de poids moléculaire inférieur à 300 Da,

• 10 à 20 %, notamment environ 15 % de la matière sèche totale de sels, ledit hydrolysat étant avantageusement obtenu par hydrolyse enzymatique du j us vert, sans étape d'isolement préalable des protéines.

La présente invention a pour deuxième objet un procédé de préparation d'un hydroiysat de luzerne dans lequel 20 acides aminés, essentiels et non-essentiels, sont présents, notamment un hydroiysat de protéines de luzerne soluble dans l'eau dans lequel 20 acides aminée, essentiels et non-essentiels, sont présents présentant les caractéristiques décrites ci-dessus.

La présente invention concerne en particulier un procédé de préparation d'un hydrolysat de protéines de luzerne comprenant une étape d'hydrolyse enzymatique, mise en œuvre directement sur le jus vert de luzerne obtenu par précipitation des protéines du jus vert de luzerne, notamment pour obtenir un hydrolysat de protéines sous forme liquide.

Avant le pressage, la luzerne est broyée dans des broyeurs à marteau ou dans des broyeurs à attrftion, de préférence à température ambiante. La luzerne broyée est ensuite avantageusement pressée dans une presse à vis de type presse à oléagineux, de préférence sans contrôle de la température. Le jus de pressage constitue le jus vert.

Au sens de la présente invention, on entend par « mise en œuvre directement sur le Jus vert de luzerne » le fait que le jus vert de luzerne ne subit aucun traitement avant l'étape d'hydrolyse. Le jus vert de luzerne n'ayant subi aucun traitement, la proportion de matière sèche qu'il renferme est celle du jus obtenu suite au pressage de la luzerne. La proportion de matière sèche varie typiquement de 8 à 15 %, et est notamment d'environ 10 %.

Lorsque la matière première de l'étape d'hydrolyse (a) est un jus vert de luzerne, celui-ci comprend avantageusement de 4 à 19 %, notamment 7 à 15 %, de matière sèche, ladite matière sèche étant constituée, en masse par rapport à la masse totale de la matière sèche, de :

■ 30 à 45 %, notamment 35 à 40 %, de protéines

• 10 à 20 %, notamment 13 à 17 % de cendres,

• 5000 à 10000 ppm, notamment 6 000 à 8 000 ppm, de Chlorophylle A

· 6 000 à 12000 ppm, notamment 19 000 à 10000 ppm, de chlorophylle B,

• 50 à 200 ppm, notamment 100 à 150 ppm de néoxanthine,

• 100 à 300 ppm, notamment 200 à 300 ppm de violaxanthine,

• 500 à 1 000 ppm, notamment de 600 à 900 ppm, de lutélne, et • 300 à 600 ppm, notamment 400 à 500 ppm, de bêta carotène.

L'étape d' hydrolyse enzymatique peut être mise en œuvre avec toute enzyme capable de couper les liaisons peptldiques des protéines contenues dans le jus vert de luzerne, notamment une protéase ou un mélange de protéases. Le terme c protéase » désigne toute enzyme exogène capable d'hydrolyser ladite matière première. Les protéases peuvent être d'origine fongique, animale ou bactérienne.

Ces enzymes peuvent être des enzymes commerciales tel es que la Protex 6L de chez DuPont®, la Protex 20L de chez DuPont®, la Protex 7L de chez DuPont®, la Protex 51 FP de chez DuPont®, ou encore ΑΡ Conc de chez Dyadic®. La protéase peut être une endoprotéase ou une exoprotéase ou un mélange d'une endoprotéase et d'une exoprotéase.

Les Inventeurs de la présente invention ont mis en évidence que les endoprotéases étaient plus efficaces pour l'hydrolyse des protéines contenues dans le jus vert de luzerne que les exoprotéases. Avantageusement, l'enzyme est donc une endoprotéase. Lorsque l'hydrolysat est destiné à l'alimentation humaine et/ou animale, l'enzyme doit être une protéase dite Food Grade, acceptées par les autorités sanitaires telles que l'Agence Française de Sécurité Sanitaire des Aliments (AFSSA).

Les protéases dites Food Grade répondant à ces critères sont notamment la Protex 6L (endopeptidase de Bacillus licheniformis,) commercialisée par Genencor, la Protex 20L (endopeptidase de Bacillus licheniformis,) commercialisée par Genencor ou AP Conc (endopeptidase de Bacillus licheniformis,) commercialisée par Dyadic. De préférence, il s'agit de rendopeptidase de Bacillus licheniformis Protex 20L commercialisée par Genencor.

L'invention concerne donc, dans un mode de réalisation avantageux, un procédé de préparation d'un hydrorysat de luzerne tel que défini ci-dessus, soluble dans l'eau, comprenant une étape d'hydrolyse enzymatique, avantageusement avec une endoprotéase notamment choisie parmi les endopeptidases de Bacillus licheniformis sur le jus vert de luzerne

L'enzyme utilisée dans l'étape d'hydrolyse doit également avantageusement répondre à un certain nombre de critères.

L'enzyme doit posséder une activité protéolytique permettant la formation d'un hydrolysat comprenant au moins 20 %, avantageusement au moins 40 % de matière protéique azotée par rapport à la masse sèche totale de l'hydrolysat en une durée suffisamment courte pour éviter la fermentation du jus vert et une contamination bactérienne. L'enzyme doit donc avantageusement permettre l'obtention d'un hydrolysat comprenant au moins 20 %, avantageusement au moins 40 % de matière protéique azotée par rapport à la masse sèche totale de l'hydrolysat en au plus 12 heures, notamment au plus 8h, en particulier d'au plus 6 heures, de préférence environ 5 heures.

Typiquement, un hydrolysat selon la présente invention aura un degré d'hydrolyse (DH) variant de 14 à 58% préférentiellement de 25 à 58%.

Dans la présente demande et les figures, le degré d'hydrolyse (DH) est défini (en %) comme le nombre de liaisons peptiques hydrolysées (h) sur le nombre de liaison peptiques totales (htot). La relation entre le DH et la consommation de base est donnée par l'équation suivante (Adler-Nfssen, 1982, 1987) :

où B : Consommation de base (en mL) Nb : normalité de la base (N) a : degré de dissociation moyen des groupements α-aminés htot : nombre total de liaisons peptidiques du substrat protéique (méqv/g protéine) Mp : masse de protéine (N x facteur de Kjeidahl) (g).

Cette activité protéolytique permettant la formation d'un hydrolysat comprenant au moins 20 %, avantageusement au moins 40 % de matière protéique azotée par rapport à la masse sèche totale de l'hydrolysat en une durée suffisamment courte pour éviter la fermentation du jus vert et une contamination bactérienne doit avantageusement être obtenue à une température inférieure à la température de coagulation des protéines contenues dans le jus vert de luzerne. Avantageusement, l'enzyme doit donc avoir une activité protéolytique à une température inférieure à 80 °C, notamment inférieure à 60°C, de préférence à une température d'environ 55°C.

L'enzyme doit en outre posséder une activité protéolytique permettant la formation d'un hydrolysat tel que défini ci-dessus comprenant au moins 20 %, avantageusement au moins 40 % de matière protéique azotée par rapport à la masse sèche totale de l'hydrolysat en une durée suffisamment courte pour éviter la fermentation du jus vert et une contamination bactérienne à un pH inférieur au pH de coagulation des protéines contenues dans le jus vert de luzerne. Avantageusement, l'enzyme dort donc également avoir une activité protéolytique à un pH inférieur à 9,5, notamment à un pH inférieur à 9, de préférence à un pH d'environ 8.

Dans un mode de réalisation avantageux, l'enzyme est donc une endoprotéase permettant l'obtention d'un hydrolysat tel que défini ci-dessus comprenant au moins 20 %, avantageusement au moins 40 % de matière protéique azotée par rapport à la masse sèche totale de l'hydrolysat en au plus 8h, notamment au plus 6 heures, de préférence 5 heures, à un pH inférieur à 9, notamment d'environ 8 et à une température inférieure à 60°C , notamment d'environ 55°C .

Une enzyme permettant la mise en œuvre du procédé dans ces conditions présente notamment des avantages économiques notables. Le pH du jus vert de luzerne étant proche de 5,5, une quantité réduite de base est ajoutée au jus vert de luzerne ou au coagulum pour la mise en œuvre de la réaction. La température de mise en œuvre de cette étape d'hydrolyse étant relativement peu élevée et le temps nécessaire pour obtenir un hydrolysat comprenant au moins 20 %, avantageusement au moins 40 % de matière protéique azotée par rapport à la masse sèche totale de l'hydrolysat étant relativement court, le procédé est donc moins énergivore.

L'étape d'hydrolyse enzymatique est réalisée avec une quantité aussi faible que possible d'enzyme par rapport à la matière sèche contenue dans le jus vert. La concentration en protéases dépend de la concentration en protéines de la matière première. La concentration en enzymes est avantageusement de 0,01 à 10 %, avantageusement de 0,03 à 1,75% par rapport à la masse de la matière première. La proportion d'enzyme correspond à la masse d'enzyme par rapport à la masse de jus vert. Lorsque la proportion est de 0,25 %, cela signifie donc que l'on emploie 2,5 g d'enzyme pour 1 kg de jus vert.

Préférentiellement, la proportion d'enzyme est de 0,25% pour le jus vert. Une proportion de 0,25 % correspond à 2,5 g d'enzyme pour 1 kg de jus vert.

La proportion d'enzyme nécessaire peut également être définie en termes d'activité enzymatique (DU / 100 g). Dans ce cas, la concentration en enzymes est avantageusement de 120000 à 840000 DU pour 100g de substrat) par rapport au poids de la matière première. Préférentiellement, la proportion d'enzyme est de 0,25% pour ie jus vert (sort environ 100000 DU pour 100g de jus

Dans la présente invention, l'activité en DU est celle donnée par le fournisseur de ladite enzyme. Elle est basée sur l'habilité d'une protéase à cliver les p-nitroanilldes provenant d'un substrat synthétique. Le résultat est une augmentation de l'absorbance à 405nm. Cette augmentation d'absorbance est directement reliée à l'activité protôasique, par le biais d'une courbe étalon établie avec un standard. Si 1mL d'une solution enzymatique à 2% donne une différence d'extinction de 0,400 dans les conditions de l'essai (substrat : caséine, pH 8,5 ; 40°C), la préparation enzymatique a une activité de 1000 DU. De manière préférée, le ratio protéines / enzyme est d'environ 10/1.

Les ratios ci-dessus sont exprimés en masse. Un ratio de 10/1 correspond donc à 10 g de protéines pour 1 g d'enzyme.

L'étape d'hydrolyse enzymatique est avantageusement mise en œuvre à pH constant, avantageusement de 7 à 10, notamment de 7,5 à 8,5, par addition d'une base au cours de la réaction d'hydrolyse. La base peut être notamment un hydroxyde, par exemple de calcium, de potassium ou de sodium ou l'ammoniaque. Avantageusement, la base est l'ammoniaque.

L'utilisation de l'ammoniaque permet de réduire la quantité de sels dans le produit final car celui-ci est éliminé lors de l'étape de purification. De manière surprenante, les Inventeurs de la présente invention ont également mis en évidence que l'ammoniaque conduisait à une cinétique d'hydrolyse améliorée par rapport à celle observée avec la soude, toutes les autres conditions réactlonnelles étant identiques.

L'étape d'hydrolyse enzymatique est suivie d'une étape d'inactivation de l'enzyme. Cette étape peut notamment être mise en œuvre par traitement thermique du milieu réactionnel à une température et pendant une durée permettant la dénaturation de l'enzyme. Avantageusement, ladite étape d'inactivation est mise en œuvre à une température d'au moins 85°C , notamment d'environ 90°C . La durée de ce traitement thermique varie en fonction de la quantité et de la nature de l'enzyme. Typiquement el e est de 5 à 30 minutes, en particulier d'environ 10 minutes. Après l'inactivation de l'enzyme, le milieu d'hydrolyse est soumis à une séparation solide / liquide afin de séparer les protéines hydrolysées solubles des protéines insolubles.

Dans la présente Invention, on entend par « milieu d'hydrolyse » la suspension obtenue à l'issue de la réaction d'hydrolyse contenant la matière sèche initialement présente dans le Jus vert et l'enzyme, dénaturée ou non. Les Inventeurs ont en effet mis en évidence que la centrifugation du milieu d'hydrolyse conduisait à la formation d'un culot contenant les pigments et les matières insolubles dans l'eau. Les protéines solubles contenues dans le surnageant peuvent donc être isolées de manière simple et économique pour donner un hydroiysat sous forme liquide qui peut être concentré, par exemple sous forme d'un sirop, ou séché pour conduire à un hydrolysat sous forme solide.

Au sens de la présente invention, on entend donc par « culot » la matière non soluble isolée à l'issue de l'étape de séparation solide / liquide et contenant donc la matière non soluble dans l'eau.

Au sens de la présente invention, on entend par < hydrolysat sous forme liquide » le surnageant obtenu à l'issue de l'étape de séparation solide / liquide.

Cette étape de séparation solide / liquide peut être mise en œuvre selon des méthodes classiques pour l'Homme du Métier. L'hydrolysat sous forme liquide peut, de manière avantageuse, être séparé des solides par séparation dynamique, en particulier par centrifugation et/ou décantation.

De manière très inattendue, un hydrolysat de protéines de luzerne soluble dans l'eau, comprenant 20 acides aminés, essentiels et non essentiels peut donc être obtenu par simple séparation solide / liquide, telle que la décantation de la réaction d'hydrolyse, notamment par centrifugation, sans étapes impliquant des traitements complexes telles que la chromatographie sur colonne échangeuse d'ions ou l'uKrafiltration. L'hydrolysat sous forme liquide peut subir une étape de concentration afin d'augmenter la quantité de matière sèche dans ledit hydrolysat sous forme liquide.

L' hydrolysat sous forme liquide peut être utilisé tel quel ou bien être séché. Le séchage peut être une lyophilisation ou un séchage de la solution, éventuellement concentrée par atomlsatlon. Lorsque le séchage est réalisé par atomisation, une étape de filtration supplémentaire peut être mise en œuvre afin d'éliminer les éventuelles particules susceptibles de boucher les buses de la tour d'atomisation.

La présente invention concerne également un procédé de préparation d'un hydrolysat sous forme liquide, d'un hydrolysat sous forme liquide concentré ou d'un hydrolysat sous forme solide, en particulier sous forme pulvérulente, à partir du jus vert de luzerne.

Dans un premier mode de réalisation, la présente invention concerne un procédé (I) de préparation d'un hydrolysat de protéines de luzerne sous forme liquide tel qu'un sirop, comprenant les étapes de : a) hydrolyse enzymatique du jus vert de luzerne pour obtenir un milieu d'hydrolyse contenant des protéines de luzerne solubles et l'enzyme, b) inactivation de l'enzyme, notamment â une température d'au moins 85 °C, de préférence 90 °C, pour obtenir un milieu d'hydrolyse dans lequel l'enzyme est désactivée,

c) séparation des fractions solide / liquide du milieu d'hydrolyse dans lequel l'enzyme est désactivée, notamment par méthode de séparation centrifuge notamment par décantation, voire centrifugation, pour obtenir un hydrolysat sous forme liquide et un culot,

d) éventuellement concentration de l'hydrolysat sous forme liquide pour obtenir un hydrolysat sous forme liquide concentré tel qu'un sirop.

Dans un second mode de réalisation, la présente invention concerne un procédé (II) de préparation d'un hydrolysat de protéines de luzerne sous forme solide, notamment sous forme pulvérulente tel que défini cl-dessus, comprenant les étapes de : a) hydrolyse enzymatique du jus vert de luzerne pour obtenir un milieu d'hydrolyse contenant des protéines de luzerne solubles et l'enzyme, b) inactivation de l'enzyme, notamment à une température d'au moins 85°C, de préférence 90 °C, pour obtenir un milieu d'hydrolyse dans lequel l'enzyme est désactivée,

c) séparation des fractions solide / liquide du milieu d'hydrolyse dans lequel l'enzyme est désactivée, notamment par méthode de séparation centrifuge notamment par décantation, voire centrifugation, pour obtenir un hydrolysat sous forme liquide et un culot,

d) éventuellement concentration de l'hydrolysat pour obtenir un hydrolysat sous forme liquide concentré tel qu'un sirop,

e) séchage de l'hydrolysat sous forme liquide, éventuellement concentré, notamment par atomisation, pour obtenir un hydrolysat de protéines de luzerne sous forme solide.

La présente invention concerne également un procédé (Ib) de préparation d'un hydrolysat de protéines de luzerne sous forme d'un liquide tel qu'un sirop, comprenant les étapes de : a) hydrolyse enzymatique du jus vert de luzerne pour obtenir un milieu d'hydrolyse contenant des protéines de luzerne solubles et l'enzyme, b) inactivation de l'enzyme, notamment à une température d'au moins 85 °C, de préférence 90 °C, pour obtenir un milieu d'hydrolyse dans lequel l'enzyme est désactivée,

c) séparation des fractions solide / liquide du milieu d'hydrolyse dans lequel l'enzyme est désactivée, notamment par méthode de séparation centrifuge notamment par décantation, voire centrifugation, pour obtenir un hydrolysat sous forme liquide et un culot,

d) éventuellement concentration de l'hydrolysat sous forme liquide pour obtenir un hydrolysat sous forme liquide concentré tel qu'un sirop.

La présente invention concerne également un procédé (lib) de préparation d'un hydrolysat de protéines de luzerne sous forme solide, en particulier sous forme pulvérulente, tel que défini ci-dessus, comprenant les étapes de : a) hydrolyse ertzymatique du jus de luzerne pour obtenir un milieu d'hydrolyse contenant des protéines de luzerne solubles et l'enzyme,

b) inactivation de l'enzyme, notamment à une température d'au moins 85 °C, de préférence 90 °C. pour obtenir un milieu d'hydrolyse dans lequel l'enzyme est désactivée,

c) séparation des fractions solide / liquide du milieu d'hydrolyse dans lequel l'enzyme est désactivée, notamment par méthode de séparation centrifuge notamment par décantation, voire centrifugation, pour obtenir un hydrolysat sous forme liquide et un culot,

d) éventuellement concentration de l'hydrolysat sous forme liquide pour obtenir un hydrolysat sous forme liquide concentré tel qu'un sirop,

e) séchage de l'hydrolysat sous forme liquide, éventuellement concentré, notamment par atomisation, pour obtenir un hydrolysat de protéines de luzerne sous forme solide, en particulier sous forme pulvérulente.

Dans un troisième mode de réalisation particulier, la présente invention concerne un procédé tel que défini ci-dessus de préparation d'un hydrolysat de luzerne sous forme liquide tel qu'un sirop, comprenant les étapes de : a) hydrolyse ertzymatique à pH constant du j us vert de luzerne pour obtenir un milieu d'hydrolyse contenant des protéines de luzerne solubles, l'enzyme possédant une activité protéolytique permettant la formation d'un hydrolysat comprenant au moins 20 %, avantageusement au moins 40 % de matière protéique azotée par rapport à la masse sèche totale de l'hydrolysat en au plus 6 heures, de préférence environ 5 heures, à une température inférieure à 60°C , de préférence à une température d'environ 55 °C, à un pH inférieur à 9, de préférence à un pH d'environ 8„ l'enzyme étant avantageusement une endoprotéase, le ratio (masse protéique contenue dans le jus vert) / enzyme étant de de 5/1 à 151 , notamment d'environ 10/1 , le pH étant maintenu constant par l'ajout d'une base, de préférence l'ammoniaque, b) inactivatlon de l'enzyme, notamment à une température d'au moins 85 °C, de préférence 90°C, pendant au moins 10 minutes,

c) séparation des fractions solide / liquide du milieu d'hydrolyse dans lequel l'enzyme est désactivée, notamment par méthode de séparation centrifuge notamment par décantation, voire centrifugation, pour obtenir un hydrolysat sous forme liquide et un culot,

d) éventuellement concentration de l'hydrolysat sous forme liquide pour obtenir un hydrolysat sous forme liquide concentré tel qu'un sirop.

Dans un quatrième mode de réalisation particulier, la présente invention concerne un procédé tel que défini ci-dessus de préparation d'un hydrolysat de luzerne sous forme solide, en particulier sous forme pulvérulente, comprenant les étapes de : a) hydrolyse enzymatique à pH constant du j us vert de luzerne pour obtenir un milieu d'hydrolyse contenant des protéines de luzerne solubles, l'enzyme possédant une activité protéolytique permettant la formation d'un hydrolysat comprenant au moins 20 %, avantageusement au moins 40 % de matière protéique azotée par rapport à la masse sèche totale de l'hydrolysat en au plus 6 heures, de préférence environ 5 heures, à une température inférieure à 60°C , de préférence à une température d'environ 55 °C, à un pH inférieur à 9, de préférence à un pH d'environs, l'enzyme étant avantageusement une endoprotéase, le ratio (masse protéique contenue dans le jus vert) / enzyme étant de 5/1 à 15/1 , notamment d'environ 10/1, le pH étant maintenu constant par l'ajout d'une base, de préférence l'ammoniaque,

b) inactivation de l'enzyme, notamment à une température d'au moins 85 °C, de préférence 90 °C, pendant au moins 10 minutes,

c) séparation des fractions solide / liquide du milieu d'hydrolyse dans lequel l'enzyme est désactivée, notamment par méthode de séparation centrifuge notamment par décantation, voire centrifugation, pour obtenir un hydrolysat sous forme liquide et un culot,

d) éventuellement concentration de l'hydrolysat sous forme liquide pour obtenir un hydrolysat sous forme liquide concentré tel qu'un sirop,

e) séchage de l'hydrolysat sous forme liquide, éventuellement concentré, notamment par atomisation, pour obtenir un hydrolysat sous forme solide, en particulier sous forme pulvérulente. Un troisième objet de la présente invention concerne un hydrolysat de protéines susceptible d'être obtenu par l'un des procédés décrits ci-dessus.

Un quatrième objet de la présente invention concerne l'utilisation d'un hydrolysat de protéines de luzerne soluble dans l'eau, comprenant 20 acides aminés, essentiels et non essentiels tel que décrit ci-dessus.

Un cinquième objet de la présente invention concerne l'utilisation d'un hydrolysat de protéines de luzerne susceptible d'être obtenu par l'un des procédés décrits ci-dessus.

La présente invention concerne en particulier l'utilisation d'un hydrolysat de protéines de luzerne soluble dans l'eau, comprenant 20 acides aminés, essentiels et non essentiels tel que décrit ci-dessus ou d'un hydrolysat de protéines susceptible d'être obtenu par l'un des procédés décrits ci-dessus, dans une composition alimentaire.

La composition alimentaire peut être à usage humain ou animal.

Dans un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne donc l'utilisation d'un hydrolysat de protéines de luzerne soluble dans l'eau, comprenant 20 acides aminés, essentiels et non essentiels tel que décrit ci-dessus ou d'un hydrolysat de protéines susceptible d'être obtenu par l'un des procédés décrits ci-dessus en substitution ou en complément de protéines animales et/ou végétales à destination de l'alimentation humaine.

Les hydrolysate selon la présente invention peuvent notamment être utilisés en substitution ou en complément de protéines animales et/ou végétales dans des produits tels que des barres de céréales, des compléments alimentaires destinés aux sportifs, des pâtisseries, des sucreries, des desserts lactés, en compléments dans des produits camées ou en substituts aux protéines d'origine animales, par exemple dans des substituts de viandes. Dans un autre mode de réalisation particulier, la présente invention concerne donc l'utilisation d'un hydrolysat de protéines de luzerne soluble dans l'eau, comprenant 20 acides aminés, essentiels et non essentiels tel que décrit ci-dessus ou d'un hydrolysat de protéines susceptfcle d'être obtenu par l'un des procédés décrits ci-dessus en substitution ou en complément de protéines animales et/ou végétales à destination de PaHmentation animale.

Les hydrolyeats selon la présente invention peuvent notamment être utilisés en substitution ou en complément de protéines animales et/ou végétales dans des produits destinés au pet food, à l'alimentation du bétail ou à l'aquaculture, notamment en substitution ou en complément de protéines animales et ou végétales.

Les hydrolysats selon la présente invention sont caractérisés par un pouvoir moussant et un pouvoir émulsrfiant très élevés. Le pouvoir émuleifiant des hydrolysats selon la présente invention, notamment à pH4, varie de 50 à 75 %, notamment de 65 à 75 %, et est d'environ 70 %. Le pouvoir moussant des hydrolysats selon la présente invention varie de 20 à 300. Certains hydrolysats ont un pouvoir moussant de l'ordre de 2Θ0 et une stabilité de l'émulsion de près de 80 %. Lesdits hydrolysats peuvent donc être employés pour la préparation d'émulsions alimentaires. La présente invention concerne également l'utilisation d'un hydrolysat de protéines de luzerne solubie dans l'eau, comprenant les 20 acides aminés protéogônes, essentiels et non essentiels tel que décrit ci-dessus ou d'un hydrolysat de protéines susceptible d'être obtenu par l'un des procédés décrits ci-dessus, en tant qu'agromatériaux, par exemple des colles végétales ou en tant que liant en substitution de résines toxiques. La présente invention concerne également l'utilisation d'un hydrolysat de protéines de luzerne solubie dans l'eau, comprenant 20 acides aminés, essentiels et non essentiels tel que décrit ci-dessus ou d'un hydrolysat de protéines susceptible d'être obtenu par l'un des procédés décrits ci-dessus, en tant qu'ingrédient dans les compositions cosmétiques.

Grâce à leur faible teneur en sodium et leur teneur élevée en sels minéraux tels que le calcium, le magnésium et le potassium, les hydrolysats selon la présente invention peuvent être utilisés en tant que source de sels minéraux dans des comprimés à usage alimentaire, ou en tant qu'ingrédient dans les produits alimentaires utilisés dans les régimes alimentaires pauvres en sodium.

Les hydrolysats selon la présente invention peuvent également être, en raison de leur note salée, utilisés en tant qu'exhausteurs de goût.

La présente invention concerne donc également l'utiïsation d'un hydrolysat selon la présente invention, notamment cf un hydrolysat dans lequel la teneur en potassium est de 5 500 mg/kg à 87 000 mg/kg, notamment de 8 800 mg kg à 69 600 mg/kg par rapport à la matière brute, la teneur en calcium est de 6 000 mg/kg à 50 000 mg/kg, notamment de 9 600 mg/kg à 40 000 mg/kg et la teneur en magnésium est de 495 mg/kg à 5 400 mg/kg, notamment de 792 mg/kg à 4320 mg/kg par rapport à la matière brute en tant qu'exhausteur de goût, en particulier en tant que substitut au sel (NaCI), de préférence dans des produits alimentaires destinés à des régimes hyposodés. Dans la suite de la description, le profil peptique est défini selon la méthode interne du laboratoire InVivo Lab par HPLC avec détection UV et selon une distribution par gamme de masses molaires, sauf indication contraire..

Dans un autre mode de réalisation, la teneur en matière azotée protéique est de 55 à 80 %, notamment de 65 à 80 %, en particulier de 75 â 80 %. Dans ce mode de réalisation, l'hydrolysat est avantageusement obtenu à partir d'un coagulum dee protéines du Jus vert La teneur en sels (ou cendres) dans l'hydrolysat est de 1 â 10 %, notamment d'environ 6 %.

Les hydrolysats obtenus sur coagulum de luzerne selon la présente invention sont caractérisés par le profil moléculaire de la matière azotée protéique à l'issue de l'hydrolyse enzymatique. La présente invention concerne également un hydrolysat de protéines de luzerne à base de coagulum dans lequel la matière azotée protéique comprend :

• de 14 à 48%, notamment de 22 à 38% de molécules de poids moléculaire inférieur à 300 Da,

• de 14 à 46%, notamment de 23 à 37% de molécules de poids moléculaire compris entre 300 et 500 Da,

• de 8 à 28%, notamment de 13 à 22% de molécules de poids moléculaire compris entre 500 et 1000 Da,

· de 9 à 33%, notamment de 15 à 26% de molécules de poids moléculaire compris entre 1000 et 5000 Da,

• de 0,9 à 4%, notamment de 1 à 3% de molécules de poids moléculaire compris entre 5000 et 10000 Da,

• De manière avantageuse, ledit hydrolysat de protéines de luzerne à base de coagulum comprend les 20 acides aminés dans les proportions suivantes de la matière azotée protéique : une teneur en alanine de 2,8% à 8,9%, notamment de 4,5% à 7,2% une teneur en cystine de 0,2% à 0,7%, notamment de 0,3% à 0,6 % une teneur en acide aspartique de 4,0% à 13,8%, notamment de 6,4% â 11,0%

une teneur en acide glutamique de 5,5% à 17,3%, notamment de 8,9% à 13,8% • une teneur en phénylalanine de 2,5% à 8,2%, notamment de 4,1% à 6,5%

• une teneur en glycine de 2,5% à 7,7%. notamment de 3,9% à 6,2%

• une teneur en histlcflne de 1,0% à 3,2%, notamment de 1 ,5% à 2,6%

• une teneur en isoleucine de 2,3% à 7,5%, notamment de 3,6% à 6,0% · une teneur en lysine de 2,8% à 9,2%, notamment de 4,6% à 7,4%

• une teneur en leucine de 4,0% à 12,5%, notamment de 6,4% à 10,0%

• une teneur en méthionine de 0,9% à 2,9%, notamment de 1 ,5% à 2,3%

• une teneur en proline de 2,4% à 7,9%, notamment de 3,9% à 6,3%

• une teneur en arginine de 2,7% à 9,0%, notamment de 4,4% à 7,2%

· une teneur en serine de 1 ,7% à 5,8%, notamment de 2,8% à 4,6%

• une teneur en thréonine de 2,2% à 7,2%, notamment de 3,4% à 5,7%

• une teneur en valine de 2,9% à 9,3%, notamment de 4,7% à 7,5%

• une teneur en tryptophane de 0,8% à 2,7%, notamment de 1,2% à 2,1%

• une teneur en tyrosine de 2,0% à 6,4%, notamment de 3,2% à 5, 1 %, Dans un mode de réalisation, l'hydrolysat de protéines est sous la forme solide. Ledit solide comprend de 50 à 100 % de matière sèche, notamment de 90 à 99 % de matière sèche, en particulier environ 95 % de matière sèche. Ledit solide est notamment une poudre ou des granules. Typiquement, la poudre est composée de granules ayant un diamètre variant de 5 à 700 μιτι, notamment de 200 à 500 μm. Le diamètre médian des granules constituant la poudre est en particulier de 200 à 500 um. dans la présente invention, la granulométrie de la poudre est déterminée par granulométrie laser sur un appareil de type Coulter, Model optique Fraunhofer, LS30, par voie sèche, sans mode de vibration et sur une durée de 30sec. Les résultats peuvent être lus directement sur l'appareil. Les proportions en sels minéraux et ollgoèléments des hydrolysats selon la présente invention avec est donnée dans le tableau suivant (par rapport à la masse brute de l'hydrolysat).

De manière inattendue, les hydrolysats selon la présente invention contiennent des quantités élevées de potassium, de calcium, et de magnésium et en fait une source naturelle de ces minéraux. De manière encore plus inattendue, les hydrolysats selon la présente invention ont également une teneur en sodium faible. La faible teneur en sodium en fait un ingrédient particulièrement recommandé dans le cadre des régimes pauvres en sodium. Le programme national nutrition santé (PNNS) recommande un apport journalier en sel (chlorure de sodium) de 8g chez l'homme adulte et 6,5 g pour la femme et les enfants. L'Organisation Mondiale de la Santé a pour sa part, mis comme objectif un maximum de 5 g de sel. L'utilisation de l'hydrolysat de l'invention permet d'apporter un goût salé dans les aliments où il est utilisé sans notablement être une source de sodium car la note salée provient principalement du potassium présent dans l'objet de l'invention.

La présente invention concerne également dans un deuxième mode de réalisation particulier, un hydrolysat de protéines de luzerne soluble dans l'eau sous forme solide, comprenant :

• 20 acides aminés, essentiels et non essentiels,

• 90 à 99 % de matière sèche, • 32 à 90 % de matière azotée protéique par rapport à la matière sèche, comprenant au moins 95 % de molécules de poids moléculaire inférieur à 10000 Da et au moins 7 %, de molécules de poids moléculaire inférieur à 300 Da,

• 1 à 10 %, notamment environ 6 % de la matière sèche totale de sels. l'hydrolysat étant avantageusement obtenu par hydrolyse enzymatique d'un coagulum des protéines du jus vert.

La présente invention a pour deuxième objet un procédé de préparation d'un hydrolysat de luzerne dans lequel 20 acides aminés, essentiels et non-essentiels, sont présents, notamment un hydrolysat de protéines de luzerne soluble dans l'eau dans lequel 20 acides aminés, essentiels et non-essentiels, sont présents présentant les caractéristiques décrites ci-dessus.

La présente invention concerne en particulier un procédé de préparation d'un hydrolysat de protéines de luzerne comprenant une étape d'hydrolyse enzymatique, mise en œuvre sur un coagulum obtenu par précipitation des protéines du jus vert de luzerne, notamment pour obtenir un hydrolysat de protéines sous forme liquide.

Avant le pressage, la luzerne est broyée dans des broyeurs à marteau ou dans des broyeurs à attrition, de préférence à température ambiante. La luzerne broyée est ensuite avantageusement pressée dans une presse à vis de type presse à oléagineux, de préférence sans contrôle de la température. Le jus de pressage constitue le jus vert. Au sens de la présente invention, on entend par « coagulum obtenu par précipitation des protéines du jus vert de luzerne * la fraction solide obtenue par précipitation des protéines contenues dans le jus vert par aicallnisatlon du Jus vert à un pH supérieur à 7, notamment de 7 à 8, de préférence de 7,3 à 7,5 et injection de vapeur à une température supérieure à 80°C , notamment à une température d'environ 85°C . Le coagulum, au sens de la présente invention, est donc un mélange de protéines blanches et de protéines vertes de luzerne, contrairement à la demande de brevet FR 2 876 389, dans lequel l'hydrolyse est mise en œuvre sur les protéines blanches de luzerne, contenues dans le filtrat obtenu consécutivement à une étape d'alcalinlsation et d'injection de vapeur.

Le coagulum doit être suspendu dans l'eau avant l'étape d'hydrolyse et amené à un pH approprié pour la réaction d'hydrolyse. La proportion de coagulum dans l'eau est avantageusement de 10 à 20 %, en particulier d'environ 15 %. Lorsque la proportion de matière sèche est inférieure à 10 %, une quantité d'eau importante doit être éliminée lors des étapes de purification de l'hydrolysat entraînant ainsi des coûts plus Importants. Lorsque la proportion de matière sèche est supérieure à 20 %, la viscosité est trop élevée, la régulation du pH est très difficile et l'hydrolyse est moins efficace à conditions équivalentes.

Le coagulum contenant une proportion moindre de sels (ou cendres}, il est avantageux de l'utiliser pour la préparation d'hydrolysats contenant une proportion moindre de sels (ou cendres), notamment inférieure à 10 % de la matière sèche de l'hydrolysat.

Lorsque la matière première de l'étape d'hydrolyse (a) est un coagulum obtenu par précipitation des protéines contenues dans le jus vert de luzerne, celui-ci comprend avantageusement, avant d'être suspendu dans de l'eau, 23 à 7Θ %, notamment 37 à 64 %, de matière sèche, ladite matière sèche étant constitué, en masse par rapport à la masse totale de la matière sèche, de :

• 17 à 84 %, notamment 28 à 67 %, de protéines

• 4 à 28%, notamment 7 à 23 % de cendres,

• 3 100 à 22500 ppm, notamment 5080 à 18 000 ppm, de Chlorophyl e A

• 1 900 à 8 200 ppm, notamment 3 000 à 7000 ppm, de chlorophylle B,

« 0 à 1500 ppm, notamment 50 à 400 ppm de néoxanthine,

• 0 à 1 500 ppm, notamment 50 à 400 ppm de violaxanthlne,

« 100 à 7 000 ppm, notamment de 500 à 1 000 ppm, de lutéine, et

• 100 à 4 000 ppm, notamment 500 à 1 500 ppm, de béta carotène.

Ledit coagulum obtenu par précipitation des protéines contenues dans le jus de luzerne est donc remis en suspension dans de l'eau, avantageusement à une teneur en matière sèche de 10 à 20 %, notamment d'environ 15 %, avant l'étape d'hydrolyse.

L'étape d'hydrolyse enzymatique peut être mise en œuvre avec toute enzyme capable de couper les liaisons peptidiques des protéines contenues dans le jus vert de luzerne ou le coagulum, notamment une protéase ou un mélange de protéases. Le terme c protéase » désigne toute enzyme exogène capable d'hydrolyser ladite matière première. Les protéases peuvent être d'origine fongique, animale ou bactérienne.

Ces enzymes peuvent être des enzymes commerciales telles que la Protex 6L de chez DuPont®, la Protex 20L de chez DuPont®, la Protex 7L de chez DuPont®, la Protex 51 FP de chez DuPont®, ou encore l'AP Conc de chez Dyadic®. La protéase peut être une endoprotéase ou une exoprotéase ou un mélange d'une endoprotéase et d'une exoprotéase. Les Inventeurs de la présente invention ont mis en évidence que les endoprotéases étaient plus efficaces pour l'hydrolyse des protéines contenues dans le coagulum que les exoprotéases. Avantageusement, l'enzyme est donc une endoprotéase.

Lorsque l'hydrolysat est destiné à l'alimentation humaine et/ou animale, l'enzyme doit être une protéase dite Food Grade, acceptées par les autorités sanitaires telles que l'Agence Française de Sécurité Sanitaire des Aliments (AFSSA).

Les protéases dites Food Grade répondant à ces critères sont notamment la Protex 6L (endopeptidase de Bacillus licheniformis,) commercialisée par Genencor, la Protex 20L (endopeptidase de BacilIus licheniformis,) commercialisée par Genencor ou AP Conc (endopeptidase de Bacillus licheniformis,) commercialisée par Dyadic. De préférence, il s'agit de l'endopeptidase de Bacillus licheniformis Protex 20L commercialisée par Genencor.

L'invention concerne donc, dans un mode de réalisation avantageux, un procédé de préparation d'un hydrolysat de luzerne tel que défini ci-dessus, soluble dans l'eau, comprenant une étape d'hydrolyse enzymatique, avantageusement avec une endoprotéase notamment choisie parmi les endopeptidases de Bacillus licheniformis sur un coagulum obtenu par précipitation des protéines du jus vert de luzerne.

L'enzyme utilisée dans l'étape d'hydrolyse doit également avantageusement répondre à un certain nombre de critères. L'enzyme doit posséder une activité protéolytique permettant la formation d'un hydrolysat comprenant au moins 20 %, avantageusement au moins 40 % de matière protéique azotée par rapport à la masse sèche totale de l'hydrolysat en une durée suffisamment courte pour éviter la fermentation du coagulum et une contamination bactérienne. L'enzyme doit donc avantageusement permettre l'obtention d'un hydrolysat comprenant au moins 20 %, avantageusement au moins 40 % de matière protéique azotée par rapport à la masse sèche totale de l'hydrolysat en au plus 12 heures, notamment au plus 8h, en particulier d'au plus 6 heures, de préférence environ 5 heures.

Typiquement, un hydrolysat selon la présente invention aura un degré d'hydrolyse (DH) variant de 10 à 58% préférentiellement de 14 à 58%. Dans la présente demande et les figures, le degré d'hydrolyse (DH) est défini (en %) comme le nombre de liaisons peptiques hydrolysées (h) sur le nombre de liaison peptiques totales (htot). La relation entre le DH et la consommation de base est donnée par réquation suivante (Adler-Nissen, 1982, 1Θ87) :

où B : Consommation de base (en ml Nb : normalité de la base (N) a : degré de dissociation moyen des groupements α-aminés Mot : nombre total de liaisons peptidiques du substrat protéique (méqv/g protéine) Mp : masse de protéine (N x facteur de Kjeldahl) (g).

Cette activité protéolytique permettant la formation d'un hydrolysat comprenant au moins 20 %, avantageusement au moins 30 % de matière protéique azotée par rapport à la masse sèche totale de l'hydrolysat en une durée suffisamment courte pour éviter la fermentation du coagulum et une contamination bactérienne doit avantageusement être obtenue à une température inférieure à la température de coagulation des protéines contenues dans le coagulum. Avantageusement l'enzyme doit donc avoir une activité protéolytique à une température inférieure à 80°C , notamment inférieure à 60°C , de préférence à une température d'environ 55 °C.

L'enzyme doit en outre posséder une activité protéolytique permettant (a formation d'un hydrolysat tel que défini ci-dessus comprenant au moins 20 %, avantageusement au moins 40 % de matière protéique azotée par rapport à la masse sèche totale de l'hydrolysat en une durée suffisamment courte pour éviter la fermentation du coagulum et une contamination bactérienne à un pH inférieur au pH de coagulation des protéines contenues dans le coagulum. Avantageusement, l'enzyme doit donc également avoir une activité protéolytique à un pH inférieur à 9,5, notamment à un pH inférieur à 9, de préférence à un pH d'environ 8.5.

Dans un mode de réalisation avantageux, l'enzyme est donc une endoprotéase permettant l'obtention d'un hydrolysat tel que défini ci-dessus comprenant au moins 20 %, avantageusement au moins 30 % de matière protéique azotée par rapport à la masse sèche totale de l'hydrolysat en au plus 8h, notamment au plus 6 heures, de préférence 5 heures, à un pH inférieur à Θ, notamment d'environ 8.5 et à une température inférieure à 60°C , notamment d'environ 55°C.

L'étape d'hydrolyse enzymatique est réalisée avec une quantité aussi fable que possible d'enzyme par rapport à la matière sèche contenue le coagulum. La concentration en protéases dépend de la concentration en protéines de la matière première. La concentration en enzymes est avantageusement de 0,01 à 10 %, avantageusement de 0,03 à 1,75% par rapport à la masse de la matière première. La proportion d'enzyme correspond à la masse d'enzyme par rapport à la masse de coagulum. Lorsque la proportion est de 0,25 %, cela signifie donc que l'on emploie 2,5 g d'enzyme pour 1 kg de jus vert ou de coagulum.

Préfêrentiellement, la proportion d'enzyme est de 0,42% pour le coagulum.

La proportion d'enzyme nécessaire peut également être définie en termes d'activité enzymatique (DU / 100 g). Dans ce cas, la concentration en enzymes est avantageusement de 120000 à 840 000 DU pour 100g de substrat) par rapport au poids de la matière première.

Préfêrentiellement, la proportion d'enzyme est 0,42% pour le coagulum soit environ 185000 DU pour 100g de coagulum dilué). Dans la présente invention, l'activité en DU est celle donnée par le fournisseur de ladite enzyme. Elle est basée sur l'habilité d'une protéase à civer les p-nitroanllldes provenant d'un substrat synthétique. Le résultat est une augmentation de l'absorbance à 405nm. Cette augmentation crabsorbance est directement reliée à l'activité protéaslque, par le biais d'une courbe étalon établie avec un standard. Si 1mL d'une solution enzymatique à 2% donne une différence d'extinction de 0,400 dans les conditions de l'essai (substrat : caséine, pH 8,5 ; 40°C), la préparation enzymatique a une activité de 1000 DU.

Lorsque le coagulum est le substrat, le ratio protéines / enzyme varie de 5/1 à 130/1, notamment de 10/1 à 100/1, en particulier de 20/1 à 60/1.

De manière préférée, le ratio protéines / enzyme est d'environ 60/1. Les ratios ci-dessus sont exprimés en masse. Un ratio de 60/1 correspond donc à 60 g de protéines pour 1 g d'enzyme.

L'étape d'hydrolyse enzymatique est avantageusement mise en œuvre à pH constant, avantageusement de 7 à 10, notamment de 7,5 à 8,5, par addition d'une base au cours de la réaction d'hydrolyse. La base peut être notamment un hydroxyde, par exemple de calcium, de potassium ou de sodium ou l'ammoniaque. Avantageusement, la base est l'ammoniaque.

L'utilisation de l'ammoniaque permet de réduire la quantité de sels dans le produit final car celui-ci est éliminé Ions de l'étape de purification. De manière surprenante, les Inventeurs de la présente invention ont également mis en évidence que l'ammoniaque conduisait à une cinétique d'hydro lyse améliorée par rapport à celle observée avec la soude, toutes les autres conditions réactionnelles étant identiques. L'étape cf hydrolyse enzymatique est suivie d'une étape dlnactivation de l'enzyme. Cette étape peut notamment être mise en œuvre par traitement thermique du milieu réactionnel à une température et pendant une durée permettant la dénaturation de l'enzyme. Avantageusement, ladite étape d'inactivation est mise en œuvre à une température d'au moins 85°C , notamment d'environ 90°C . La durée de ce traitement thermique varie en fonction de la quantité et de la nature de l'enzyme. Typiquement elle est de 5 à 30 minutes, en particulier d'environ 10 minutes.

Après l'inactivation de l'enzyme, le milieu d'hydrolyse est soumis à une séparation solide / liquide afin de séparer les protéines hydrolysées solubles des protéines insolubles. Dans la présente invention, on entend par « milieu d'hydrolyse » la suspension obtenue à l'issue de la réaction d'hydrolyse contenant la matière sèche initialement présente dans le coagulum et l'enzyme, dénaturée ou non.

Les Inventeurs ont en effet mie en évidence que la centrifugation du milieu d'hydrolyse conduisait à la formation d'un culot contenant les pigments et les matières Insolubles dans l'eau. Les protéines solubles contenues dans le surnageant peuvent donc être isolées de manière simple et économique pour donner un hydrolysat sous forme liquide qui peut être concentré, par exemple sous forme d'un sirop, ou séché pour conduire à un hydrolysat sous forme solide.

Au sens de la présente invention, on entend donc par « culot » la matière non soluble isolée à l'issue de l'étape de séparation solide / liquide et contenant donc la matière non soluble dans l'eau.

Au sens de la présente invention, on entend par « hydrolysat sous forme liquide > le surnageant obtenu à l'issue de l'étape de séparation solide / liquide.

Cette étape de séparation solide / liquide peut être mise en œuvre selon des méthodes classiques pour l'Homme du Métier. L'hydrolysat sous forme liquide peut, de manière avantageuse, être séparé des solides par séparation dynamique, en particulier par centrifugation et/ou décantation.

De manière très inattendue, un hydrolysat de protéines de luzerne soluble dans l'eau, comprenant 20 acides aminés, essentiels et non essentiels peut donc être obtenu par simple séparation solide / liquide, telle que la décantation de la réaction d'hydrolyse, notamment par centrifugation, sans étapes impliquant des traitements complexes telles que la chromatographie sur colonne echangeuse d'ions ou l'ultrafiltration. L'hydrolysat sous forme liquide peut subir une étape de concentration afin d'augmenter la quantité de matière sèche dans ledit hydrolysat sous forme liquide. L" hydrolysat sous forme liquide peut être utilisé tel quel ou bien être séché. Le séchage peut être une lyophilisation ou un séchage de la solution, éventuellement concentrée par atomisation. Lorsque le séchage est réalisé par atomisation, une étape de filtration supplémentaire peut être mise en œuvre afin d'éliminer les éventuelles particules susceptibles de boucher les buses de la tour d'atomisation.

La présente invention concerne également un procédé de préparation d'un hydrolysat sous forme liquide, d'un hydrolysat sous forme liquide concentré ou d'un hydrolysat sous forme solide, en particulier sous forme pulvérulente, à partir d'un coagulum obtenu par précipitation des protéines du jus vert de luzerne. Dans un premier mode de réalisation, la présente invention concerne un procédé (I) de préparation d'un hydrolysat de protéines de luzerne sous forme liquide tel qu'un sirop, comprenant les étapes de : e) hydrolyse enzymatique du coagulum obtenu par précipitation des protéines du jus vert de luzerne pour obtenir un milieu d'hydrolyse contenant des protéines de luzerne solubte s et l'enzyme,

f) inactivation de l'enzyme, notamment à une température d'au moins 85 °C, de préférence 90°C , pour obtenir un milieu d'hydrolyse dans lequel l'enzyme est désactivée,

g) séparation des fractions solide / liquide du milieu d'hydrolyse dans lequel l'enzyme est désactivée, notamment par méthode de séparation centrifuge notamment par décantation, voire centrifugation, pour obtenir un hydrolysat sous forme liquide et un culot,

h) éventuellement concentration de l'hydrolysat sous forme liquide pour obtenir un hydrolysat sous forme liquide concentré tel qu'un sirop. Dans un second mode de réalisation, la présente invention concerne un procédé (II) de préparation d'un hydrolysat de protéines de luzerne sous forme solide, notamment sous forme pulvérulente tel que défini ci-dessus, comprenant les étapes de : f) hydrolyse enzymatique du coagulum obtenu par précipitation des protéines du jus vert de luzerne pour obtenir un milieu d'hydrolyse contenant des protéines de luzerne solubles et l'enzyme,

g) inactivation de l'enzyme, notamment à une température d'au moins 85 °C, de préférence 90°C , pour obtenir un milieu d'hydrolyse dans lequel l'enzyme est désactivée,

h) séparation des fractions solide / liquide du milieu d'hydrolyse dans lequel l'enzyme est désactivée, notamment par méthode de séparation centrifuge notamment par décantation, voire centrifùgation, pour obtenir un hydrolysat sous forme liquide et un culot,

i) éventuellement concentration de l'hydrolysat pour obtenir un hydrolysat sous forme liquide concentré tel qu'un sirop,

j} séchage de l'hydrolysat sous forme liquide, éventuellement concentré, notamment par atomisation, pour obtenir un hydrolysat de protéines de luzerne sous forme solide.

La présente Invention concerne également un procédé (la) de préparation d'un hydrolysat de protéines de luzerne sous forme d'un liquide tel qu'un sirop, comprenant les étapes de : a) hydrolyse enzymatique d'un coagulum obtenu par précipitation des protéines du jus vert de luzerne, notamment de composition tel que défini ci-dessus, pour obtenir un milieu d'hydrolyse contenant des protéines de luzerne soluWes et l'enzyme,

b) inactivation de l'enzyme, notamment à une température d'au moins 85 °C, de préférence 90°C, pour obtenir un milieu d'hydrolyse dans lequel l'enzyme est désactivée,

c) séparation des fractions solide / liquide du milieu d'hydrolyse dans lequel l'enzyme est désactivée, notamment par méthode de séparation centrifuge notamment par décantation, voire centrifùgation, pour obtenir un hydrolysat sous forme liquide et un culot

d) éventuellement concentration de l'hydrolysat sous forme liquide pour obtenir un hydrolysat sous forme liquide concentré tel qu'un sirop.

La présente invention concerne également un procédé (Ma) de préparation d'un hydrolysat de protéines de luzerne sous forme solide, en particulier sous forme pulvérulente, tel que défini ci-dessus, comprenant les étapes de : a) hydrolyse enzymatique d'un coagulum obtenu par précipitation des protéines du jus vert de luzerne pour obtenir un milieu d'hydrolyse contenant des protéines de luzerne solubles et l'enzyme,

b) inactivation de l'enzyme, notamment à une température d'au moins 85°C, de préférence 90 ^* C, pour obtenir un miDeu d'hydrolyse dans lequel l'enzyme est désactivée,

c) séparation des fractions solide / liquide du milieu d'hydrolyse dans lequel l'enzyme est désactivée, notamment par méthode de séparation centrifuge notamment par décantation, voire centrifùgation, pour obtenir un hydrolysat sous forme liquide et un culot, d) éventuellement concentration de Γ hydrolysat sous forme liquide pour obtenir un hydrolysat sous forme liquide concentré tel qu'un sirop,

e) séchage de l'hydrolysat sous forme liquide, éventuellement concentré, notamment par atomisation, pour obtenir un hydrolysat de protéines de luzerne sous forme solide, en particulier sous forme pulvérulente.

Lorsque l'étape d'hydrolyse est mise en œuvre sur un coagulum obtenu par précipitation des protéines du jus vert de luzerne, le procédé défni ci-dessus comprend en outre les étapes permettant de préparer ledit coagulum de : a) pressage de la luzerne, pour obtenir un jus vert de luzerne et un tourteau de luzerne,

b) alcalinisation du jus vert de luzerne et injection de vapeur pour coaguler les protéines contenues dans fe jus de luzerne,

c) décantation des protéines coagulées pour obtenir le coagulum,

d) éventuellement séchage du coagulum pour obtenir un coagulum riche en matière sèche,

e) mise en suspension du coagulum, éventuellement séché pour obtenir un coagulum en suspension dans l'eau, avantageusement à une teneur en matière sèche de 10 à 20 %, notamment d'environ 15 %.

Dans un premier mode de réalisation particulier, la présente invention concerne un procédé tel que défini ci-dessus de préparation d'un hydrolysat de luzerne sous forme liquide tel qu'un sirop, comprenant les étapes de : a) hydrolyse enzymatique d'un coagulum obtenu par précipitation des protéines contenues dans le jus de luzerne, en suspension dans de l'eau, avantageusement à une teneur en matière sèche de 10 à 20 %, notamment d'environ 15 %, pour obtenir un milieu d'hydrolyse contenant des protéines de luzerne solubles, l'enzyme possédant une activité protéolyttque permettant la formation d'un hydrolysat comprenant au moins 20 %, avantageusement au moins 40 % de matière protôique azotée par rapport à la masse sèche totale de l'hydrolysat en au plus 6 heures, de préférence environ 5 heures, à une température inférieure à 60 °C, de préférence à une température d'environ 55°C , à un pH constant, notamment Inférieur à 9, de préférence à un pH d'environ 8,5, l'enzyme étant avantageusement une endoprotéase, le ratio (matière protélque contenue dans le Jus vert) / enzyme étant de 20/1 à 60/1 , de préférence d'environ 60/1 , le pH étant maintenu constant par l'ajout d'une base, de préférence l'ammoniaque, b) inactivation de l'enzyme, notamment à une température d'au moins 85 °C, de préférence 90°C , pendant au moins 10 minutes,

c) séparation des fractions solide / liquide du milieu d'hydrolyse dans lequel l'enzyme est désactivée, notamment par méthode de séparation centrifuge notamment par décantation, voire centrtfugatton, pour obtenir un hydrolysat sous forme liquide et un culot,

d) éventuellement concentration de l'hydrolysat sous forme liquide pour obtenir un hydrolysat sous forme liquide concentré tel qu'un sirop.

Dans un deuxième mode de réalisation particulier, la présente invention concerne un procédé tel que défini ci-dessus de préparation d'un hydrolysat de luzerne sous forme solide, notamment sous forme pulvérulente, comprenant les étapes de : a) hydrolyse enzymatique d'un coagulum obtenu par précipitation des protéines contenues dans le jus vert de luzerne, en suspension dans de l'eau, avantageusement à une teneur en matière sèche de 10 à 20 %, notamment d'environ 15 %, pour obtenir un milieu d'hydrolyse contenant des protéines de luzerne solubles, l'enzyme possédant une activité protéolytique permettant la formation d'un hydrolysat comprenant au moins 20 %, avantageusement au moins 40 % de matière protéique azotée par rapport à la masse sèche totale de l'hydrolysat en au plus 6 heures, de préférence environ 5 heures, à une température inférieure à 60°C , de préférence à une température d'environ 55°C , à un pH constant, notamment inférieur à 9, de préférence à un pH d'environ 8,5, l'enzyme étant avantageusement une endoprotéase, le ratio (matière azotée contenue dans le jus vert) / enzyme étant de 20/1 à 60/1, de préférence d'environ 60/1 , le pH étant maintenu constant par rajout d'une base, de préférence l'ammoniaque,

b) inactivation de l'enzyme, notamment à une température d'au moins 85°C , de préférence 90°C , pendant au moins 10 minutes,

c) séparation des fractions solide / liquide du milieu d'hydrolyse dans lequel l'enzyme est désactivée, notamment par méthode de séparation centrifuge notamment par décantation, voire centrifugation, pour obtenir un hydrolysat sous forme liquide et un culot,

d) éventuellement concentration de l'hydrolysat sous forme liquide pour obtenir un hydrolysat sous forme liquide concentré,

e) séchage de l'hydrolysat sous forme liquide, éventuellement concentré, notamment par atomisation, pour obtenir un hydrolysat sous forme solide, en particulier sous forme pulvérulente. Un troisième objet de la présente invention concerne un hydrolysat de protéines susceptible d'être obtenu par l'un des procédés décrits ci-dessus.

Un quatrième objet de la présente invention concerne l'utilisation d'un hydrolyeat de protéines de luzerne soluble dans l'eau, comprenant 20 acides aminés, essentiels et non essentiels tel que décrit ci-dessus.

Un cinquième objet de la présente invention concerne l'utilisation d'un hydrolyeat de protéines de luzerne susceptible d'être obtenu par l'un des procédés décrits ci-dessus.

La présente invention concerne en particulier l'utilisation d'un hydrolyeat de protéines de luzerne soluble dans l'eau, comprenant 20 acides aminés, essentiels et non essentiels tel que décrit ci-dessus ou d'un hydrolyeat de protéines susceptible d'être obtenu par l'un des procédés décrits ci-dessus, dans une composition alimentaire.

La composition alimentaire peut être à usage humain ou animal.

Dans un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne donc l'utilisation d'un hydrolysat de protéines de luzerne soluble dans l'eau, comprenant 20 acides aminés, essentiels et non essentiels tel que décrit ci-dessus ou d'un hydrolysat de protéines susceptible d'être obtenu par l'un des procédés décrits ci-dessus en substitution ou en complément de protéines animales et/ou végétales à destination de l'alimentation humaine.

Les hydrolysats selon la présente invention peuvent notamment être utilisés en substitution ou en complément de protéines animales et/ou végétales dans des produits tels que des barres de céréales, des compléments alimentaires destinés aux sportifs, des pâtisseries, des sucreries, des desserts lactés, en compléments dans des produits carnées ou en substituts aux protéines d'origine animales, par exemple dans des substituts de viandes. Dans un autre mode de réalisation particulier, la présente invention concerne donc l'utilisation d'un hydrolysat de protéines de luzerne soluble dans l'eau, comprenant 20 acides aminés, essentiels et non essentiels tel que décrit ci-dessus ou d'un hydrolysat de protéines susceptible d'être obtenu par l'un des procédés décrits ci-dessus en substitution ou en complément de protéines animales et/ou végétales à destination de l'alimentation animale.

Les hydrolysats selon la présente invention peuvent notamment être utilisés en substitution ou en complément de protéines animales et/ou végétales dans des produits destinés au pet food, à l'alimentation du bétail ou à l'aquaculture, notamment en substitution ou en complément de protéines animales et/ou végétales.

Les hydrolysats selon la présente invention sont caractérisés par un pouvoir moussant et un pouvoir émulslflant très élevés. Le pouvoir émulsifiant des hydrolysats selon la présente Invention, notamment à pH4, varie de 50 à 75 %, notamment de 65 à 75 %, et est d'environ 70 %. Le pouvoir moussant des hydrolysats selon la présente invention varie de 20 à 300. Certains hydrolysats ont un pouvoir moussant de l'ordre de 290 et une stabilité de l'émulsion de près de 80 %. LesdKs hydrolysats peuvent donc être employés pour la préparation d'émulsions alimentaires. La présente invention concerne également l'utilisation d'un hydrolysat de protéines de luzerne soluble dans l'eau, comprenant les 20 acides aminés protéogènes, essentiels et non essentiels tel que décrit ci-dessus ou d'un hydrolysat de protéines susceptible d'être obtenu par l'un des procédés décrits ci-dessus, en tant qu'agromatériaux, par exemple des colles végétales ou en tant que liant en substitution de résines toxiques. La présente invention concerne également l'utilisation d'un hydrolysat de protéines de luzerne soluble dans Peau, comprenant 20 acides aminés, essentiels et non essentiels tel que décrit ci-dessus ou d'un hydrolysat de protéines susceptible d'être obtenu par l'un des procédés décrits ci-dessus, en tant qu'ingrédient dans les compositions cosmétiques.

Grâce à leur faible teneur en sodium et leur teneur élevée en sels minéraux tels que le calcium, le magnésium et le potassium, les hydrolysats selon la présente invention peuvent être utilisés en tant que source de sels minéraux dans des comprimés à usage alimentaire, ou en tant qu'ingrédient dans les produits alimentaires utilisés dans les régimes alimentaires pauvres en sodium.

Les hydrolysats selon la présente invention peuvent également être, en raison de leur note salée, utilisés en tant qu'exhausteurs de goût.

La présente invention concerne donc également l'utilisation d'un hydrolysat selon la présente invention, notamment d'un hydrolysat dans lequel la teneur en potassium est de 5 500 mg/kg à 87 000 mg/kg, notamment de 8 800 mg/kg à 69 600 mg/kg par rapport à la matière brute, la teneur en calcium est de 6 000 mg/kg à 50 000 mg/kg, notamment de 9 600 mg/kg à 40 000 mg/kg et la teneur en magnésium est de 495 mg/kg à 5400 mg/kg, notamment de 792 mg/kg à 4320 mg/kg par rapport à la matière brute en tant qu'exhausteur de goût, en particulier en tant que substitut au sel (NaCI), de préférence dans des produits alimentaires destinés à des régimes hyposodés. La Figura 1 représente les résultats des essais d'hydrolyse enzymatique sur le jus vert de luzerne avec les protéases dites Food Grade Protex 6L commercialisée par Genencor, Protex 20L commercialisée par Genencor ou AP Conc (endopeptidase de Bacillus llcheniformis) commercialisée par Dyadic à un ratio enzyme / matière protéique de 1/10, à une température de 55°C et à pH = 8 maintenu par addition de soude en fonction du temps, mesuré sur une durée de 300 minutes.

La Figura 2 représente les résultats des essais d'hydrolyse enzymatique sur le jus vert de luzerne avec les protéases dites Food Grade Protex 6L commercialisée par Genencor, Protex 20L commercialisée par Genencor ou AP Conc (endopeptidase de Bacillus licheniformis) commercial sée par Dyadic à un ratio enzyme / matière protéique de 1/10, à une température de 55°C et à pH = 9,5 maintenu par addition de soude en fonction du temps, mesuré sur une durée de 300 minutes.

La Figura 3 représente les résultats des essais d'hydrolyse enzymatique sur le jus vert de luzerne avec la protéase Protex 20L commercialisée par Genencor à un ratio enzyme / matière protéique de 1/10, à une température de 55°C et à pH = 8 en fonction du temps, mesuré sur une durée de 300 minutes avec de la soude ou de l'ammoniaque.

La Figure 4 représente les résultats des essais d'hydrolyse enzymatique sur le jus vert de luzerne avec la protéase Protex 20L commerciai sée par Genencor à différents ratios enzyme / matière protéique, à une température de 55°C et à pH = 8 en fonction du temps, mesuré sur une durée de 300 minutes avec de l'ammoniaque.

La Figura 5 représente les résultats des essais d'hydrolyse enzymatique sur le coagulum suspendu dans l'eau à 10 % de matière sèche avec la protéase Protex 20L commercialisée par Genencor à différents ratios enzyme / matière protéique, à une température de 55°C et à pH = 8 en fonction du temps, mesuré sur une durée de 300 minutes avec de l'ammoniaque.

La Figure 6 représente les résultats des essais d'hydrolyse enzymatique sur ie coagulum suspendu dans l'eau à différents taux de matière sèche avec la protéase Protex 20L commercialisée par Genencor à différents ratios enzyme / matière protéique, à une température de 55°C et à pH = 8 en fonction du temps, mesuré sur une durée de 300 minutes avec de l'ammoniaque.

La Figure 7 représente les rendements de production à partir du jus vert de luzerne ou du coagulum obtenu par précipitation des protéines du jus vert de luzerne. La Figura 8 représente la composition en matière sèche, en cendres (ou sels) et en protéines d'un hydrolysat préparé à partir du jus vert de luzerne ou du coagulum obtenu par précipitation des protéines du jus vert de luzerne.

La Figure 9 représente la répartition massique de la taille en Dalton des acides aminés, protéines et peptides dans différents hydrolysats réalisés au laboratoire selon la présente invention et suivant la méthode analytique ARD.

La Figure 9 bis représente la répartition massique de la taille en Dalton des acides aminés, protéines et peptides dans différents hydrolysats réalisé au stade pilote selon la présente invention et suivant la méthode analytique In Vivo Lab.

La Figure 10 représente l'aminogramme d'une poudre de peptides selon la présente invention en comparaison avec le lait demi-écrémé et le concentré de protéines de luzerne commercialisé sous la dénomination Luzixine® (CPL). La Figure 11 représente la proportion de matière insoluble d'un essai de solubilisation de 25 % de protéines de jus vert de luzerne (JV), d'un hydrolysat de protéines de jus vert de luzerne (poudre JV) ou d'un hydrolysat d'un coagulum (poudre coagulum).

Exemples : Matière première Issue de la luzerne

La matière première peut-être le jus vert de luzerne ou le coagulum de luzerne (tableau 1).

Le jus vert présente une matière sèche entre 8 et 13%, une concentration en protéines entre 28 et 35% de la matière sèche, une teneur en minéraux entre 15 et 19% de la matière sèche, une concentration en chlorophylles totales entre 6000 et 11000ppm de la matière sèche, une concentration en carotônoides (B-carotène) entre 200 et 500ppm de la matière eèche et une concentration en xanthophylles (lutéine, néoxanthine et violaxanthine) entre 600 et 1200ppm de la matière sèche.

La décantation centrifuge permet l'élimination d'une partie de l'eau et des minéraux contenue dans le jus vert. Le coagulum ainsi obtenu se trouve ainsi enrichi en protéines. Le coagulum présente donc une matière sèche plus importante que le jus vert entre 46 et 53%, une teneur en protéines entre 35 et 56% de la matière sèche et une teneur en minéraux entre 9 et 19% de la matière sèche. De même que le jus vert le coagulum est riche en pigments de type chlorophylles, xanthophylles et caroténoTdes.

Exemple 1 : Choix de l'enzyme Les essais ont permis d'identifier trois enzymes particulièrement efficaces pour effectuer la réaction d'hydrolyse enzymatlque du jus vert et du coagulum. Il s'agit de la Protex 6L, de la Protex 20L et de la protéase AP conc.

L'hydrolyse enzymatique a été étudiée avec ces trois enzymes à un ratio enzyme / matière protéique de 1/10 à 55 °C et à des pH de 8 et 9,5. Les résultats sont présentés dans les Figures 1 et 2.

A pH = 9,5, qui correspond au pH optimal de fonctionnement de l'enzyme, le degré d'hydrolyse dépasse les 30 %.

A pH = 8, le degré d'hydrolyse est inférieur de plus de 5 %. Compte tenu de la quantité de NaOH nécessai re pour atteindre un tel pH, l'hydrolysat obtenu contient une proportion de sels très importante.

Un pH de 8 est donc préférable pour minimiser la quantité de sels dans l'hydrolysat de protéines.

Exemple 2 : Choix de la base L'hydrolyse enzymatique a été évaluée avec deux basée différentes, la soude et l'ammoniaque, à la température de 65°C , pH = 8 et avec un ratio matière protéique / enzyme de 1/10.

Les résultats sont présentés dans la Figure 3. L'ammoniaque, dont l'utilisation avait initialement été envisagée pour réduire la quantité de sels dans l'hydrolysat s'avère la base de choix pour réaliser la réaction d'hydrolyse enzymatique. L'ammoniaque permet en effet d'améliorer le rendement de l'hydrolyse de plus de 5 % à pH = 8, qui n'est pas le pH optimum de fonctionnement de l'enzyme.

Exemple 3 : Choix du ratio matière protéique / enzyme pour le Jus vert et le coagulum

Une série d'essais a été effectuée pour déterminer la dose optimale d'enzyme pour l'hydrolyse des protéines du jus vert. Le pH a été fixé à 8 et la température à 55°C. Six doses (rapport massique enzyme substrat protéique) ont été testées.

Les résultats sont présentés dans la Figure 4. Le degré d'hydrolyse varie entre 18% et 28% en fonction de la dose d'enzyme utilisée. Le rapport enzyme substrat de 1/10 permet d'obtenir la meilleure hydrolyse (28%). Une perte de 3 points de degré d'hydrolyse est observée avec la dose d'enzymes juste inférieure de 1/15. La dose la plus faible de 1/90 entraine une perte de 10 points de DH. Le rapport enzyme/substrat pour l'hydrolyse du jus vert est donc de préférence de 1/10. Une série d'essais a été également été effectuée pour déterminer la dose optimale d'enzyme pour l'hydrolyse du coagulum. Le pH a été fixé à 8, la température à 55"C et le coagulum a été remis en solution à 10%MS. Cinq doses (rapport massique enzyme substrat) ont été testées.

Les résultats sont présentés en figure 5. Une dose entre 1/20 et 1/60 permet d'obtenir un degré d'hydrolyse de 23%. Une dose plus faible entre 1/130 et 1/250 permet l'hydrolyse de 17% des protéines du coagulum de luzerne. La dose optimale d'enzyme est donc un rapport enzyme/substrat de 1/60.

Cette dose inférieure à celle nécessaire pour l'hydrolyse du jus vert s'explique certainement par la présence moindre d'impuretés dans le coagulum, impuretés pouvant être à l'origine d'une inhibition de l'enzyme. Exemple 4 : Choix du taux de matière sèche dans le coagulum

Afin d'étudier la concentration en substrat, quatre concentrations en matière sèche ont été testées. L'ensemble des hydrolyses a été effectué à pH = 8, 55 °C et avec un rapport massique enzyme/substrat protéique de 1/25 (excès d'enzymes). Les résultats sont présentés dans la Figure 6.

La viscosité du coagulum à 25% MS est trop importante, la régulation du pH est très difficile. Cette concentration pourrait ne pas être traitée industriellement car les transferts de chaleur et de matière (alcali) ne seraient pas gérables.

Les meilleurs résultats d'hydrolyse sont obtenus avec un coagulum à 15%MS, dans ces conditions te degré d'hydrolyse est de 29%. A 20%MS, le degré d'hydrolyse diminue de 6 points (cf figure 13). La concentration en matière sèche optimale du coagulum pour son hydrolyse est de 15%MS.

Exemple S : Traitement de la réaction d'hydrolyse Suite à l'hydrolyse, le produit obtenu est un mélange de protéines non solubles, de peptidee solubles, de pigments (chlorophylles et xanthophylles) et de sels. Par simple décantation du produit d'hydrolyse, un culot de couleur verte se forme.

L'ensemble du jus vert ou du coagulum hydrolysé a donc été centrifugé pendant 15 min à 4080G et à 4°C. L'analyse de ce culot montre qu'il contient des protéines et des pigments.

La technique la plus simple et la moins coûteuse permettant de séparer les peptides solublee des protéines restées insolubles et des pigments est donc la centrifugation. Exemple 6 : Séchage de l'hydrolyeat

Après l'étape de séparation, le produit peut ensuite subir des opérations pour être facilement transportable à moindre coût, conservable et formulable (Incorporable dans des préparations alimentaires par exemple). Pour l'aspect conservation et transport à moindre coût, il faut réduire l'humidité du produit donc le concentrer. Pour l'aspect formulation, la forme poudre (à condition qu'elle soit soluble) est appréciée en agro- alimentaire car elle permet une incorporation facile dans la totalité des produits. En tenant compte de l'ensemble de ces contraintes, les deux opérations unitaires à ajouter au procédé sont la concentration par évaporation et l'atomisation.

Les rendements des procédés à partir du jus vert ou du coagulum sont présentée dans le tableau 3 et dans la Figure 7.

En termes de rendement, il est préférable de mettre en œuvre le procédé à partir du jus vert de luzerne.

La composition physico-chimique des poudres de peptides du jus vert et de coagulum a également été déterminée. Les compositions sont données dans le tableau 4bls. Les proportions des composants d'intérêt (protéines et minéraux) dans les hydrolysats sont données dans la Figure 8.

m Le profil peptidique dee poudres a également été étudié par SDS Page. Les profils peptidiques (suivant la méthode analytique ARD), des productions laboratoire, sont identiques pour trois des lots testés. Seul un lot de coagulum (production 2) a un profil légèrement différent, explicable par une étape d'hydrolyse incomplète. Les résultats sont présentés sur la Figure 9.

Les peptldes de taille inférieure à 100 Da représentent 70% des peptides des quatre lots de poudres testés. L'autre taille de peptides représentant 20% des peptides, ont une taille entre 1000 et 500 Da. Peu de peptides ont une taille supérieure à 5000 Da, représentant 5% des peptides ayant une talle entre 5000 et 60000 Da. Les hydrolysats de protéines contiennent donc une grande partie de peptides facilement assimilables et sont donc parfaitement adaptés à l'alimentation humaine et animale.

Le profil peptidique (suivant la méthode analytique INZO), des productions pilote, a également été déterminé. Les résultats sont présentés en Figure 9bls.

L'aminogramme des poudres a également été déterminé afin de confirmer la présence de l'ensemble des acides aminés protéogènes et leurs proportions dans l'hydroiysat.

Les résultats sont présentés dans la Figure 10.

Les hydrolysats de protéines de luzerne selon la présente invention contiennent bien les huit acides aminés essentiels, mais aussi les vingt acides aminés protéogènes.

(Exemple comparatif : Hydrolyse acide chimique du coagulum de luzerne Dans un pot shott de 250 ml, 10g de coagulum sont ajoutés à 90g d'eau osmosée ét ajusté à pH à 5 avec de l'acide sulfurique 1 N. Le pot fermé est placé dans un baln-marie à sec 2h à 70°C. Le pot est ensuite refroidi à température ambiante et centrifugé dans une centrifugeuse de type RC12BP+ (thermoscientJfic) à 4000G pendant 5 min. 2 phases sont obtenues, le culot (la phase inférieure) et la phase liquide (phase supérieure). La phase liquide (surnageant) est récupérée et analysée.

L'hydrolyse acide détruit le tryptophane et transforme en acide les fonctions amides de ia glutamine et de l'asparagine pour donner du glutamate et de l'aspartate.

L'analyse chimique du surnageant obtenu est le suivant :

• le profil peptidique (suivant la méthode analytique ARD): - entra i et 10% de molécules de poids moléculaire compris entre 10000 et 5000 Da - entre 40et 60% de molécules de poids moléculaire compris entre 5000 et 1 000 Da

- entre 40 et 60% de molécules de poids moléculaire compris entre 1 000 et 500 Da

- entre 10 et 21% de molécules de poids moléculaire compris entre 500 et 300 Da

- entre 4 et 30% de molécules de poids moléculaire inférieur à 300 Da. · la teneur en matière azotée protéique ((Nt - Nammo) x 6,25) est comprise entre 10 et 15% de l'extrait sec

• la teneur en minéraux est comprise entre 40 et 50% sur l'extrait sec

• la teneur en chlorophylles est comprise entre 100ppm et 500ppm de l'extrait sec

• la teneur en caroténoîdes (β-carotône) est comprise entre 1 ppm et 20ppm de l'extrait sec · la teneur en xanthophylles (lutéine, néoxanthine et violaxanthine) est comprise entre 1ppm et 100ppm de l'extrait sec

L'hydrolyse chimique en milieu acide conduit à un produit dans lequel la matière sèche azotée représente une proportion moindre. En outre, on observe une forte hausse des cendres. Exemple 7.1 : Etude de la solubilité des poudres

La méthode choisie est la norme COSEX STAN 295 -2009 (Appendice A). La méthode décrite à l'Appendice A dans la Loi sur les nonnes alimentaires en vigueur en Corée améliore la « méthode officielle AOAC 950.66 ».

La solubilité des poudres a été testée une fois celles-ci remise en solution dans de l'eau osmosée à une concentration massique allant de 1 % jusqu'à 25%. Cette concentration de 25% a été choisie car elle mime les concentrations en protéines maximales retrouves dans les produits alimentaires.

La solubilité de ces poudres a été comparée à celle du jus vert atomisé et remis en solution dans de l'eau (alimentaire) également à une concentration massique de 25%. Ces poudres sont remises en solution entre 1 et 25% massique dans de l'eau osmosée.

La solution est centrifugée à 4000G 5min.

Des pesées et analyses de matière sèche, d'azote total et d'azote ammoniacal sont réalisées sur la solution et le surnageant. Le calcul du pourcentage de solubilité des protéines est le suivant : quantité (azote total - azote ammoniacal) dans le surnageant / quantité (azote total - azote ammoniacal) dans la solution * 100.

Lee résultats sont présentés dans la Figure 11. Le pourcentage d'insoluble, dans du jus vert de luzerne atomisé en solution dans de l'eau à 25%, est de 30%. Suite au procédé d'hydrolyse, ce pourcentage est nul. L'hydrolyse permet donc d'obtenir des protéines de luzerne solubles.

[Exemple 7.2 : Exemples d'hydrolysats de protéines obtenus du Jus de luzerne : Méthode de détermination du pouvoir émulsiflant Matériels :

• Homogénéiseur Polytron PT 3100

• Béchers ou pilullers

• (Balance de précision

• Agitateurs magnétiques

· Centrifugeuse â 530G Tubes à centrifuger

• pH mètre

• HCI ou NaOH 0,1N

• Huile de tournesol.

Protocole : Dans un pilulier, environ 10 g d'une solution aqueuse de protéines à 1% sont préparés et le volume exact A est noté.

Cette solution est mise sous agitation magnétique et le pH ajusté à la valeur choisie avec une solution HCI ou NaOH 0,1N puis laissée sous agitation lente pendant 1h. le pH est réajusté à la valeur choisie si nécessaire. Le môme volume A d'huile de tournesol est ajouté, en tenant compte de sa densité (108,4mL d'huile = 95,3g) et l'émulsion est formée dans le Polytron pendant 1min â la vitesse maximum (24000tr/min).

L'émulsion est versée dans un tube à centrifuger qui est centrifugé à 530G pendant 5min. Les volumes respectifs d'huile, d'émulsion et d'eau sont notés. Le résultat est exprimé en pourcentage de chaque phase par rapport au volume total. Il s'agit donc d'une comparaison du pouvoir émulsifiant de différentes solutions pro télques à 1%. Méthode de détermination du pouvoir moussant Matériels : · Eprouvette thermostatée de 10OOmL

• Régulateur de température

• Eprouvette de 100mL

• Eprouvette de 500mL

• Ampoule à décanter avec trait de jauge de 1000mL

· Support

• Chronomètre.

Protocole :

700mL d'une solution à 1% de protéines sont préparés avec de l'eau osmosée. Une éprouvette et la solution de protéines sont chauffées à 25°C puis 50mL de la solution sont versés dans l'éprouvette. L'ampoule est ajustée au trait de jauge avec la solution puis 500mL sont versés dans l'ampoule. Les 500 mL de solution sont mis à couler dans l'éprouvette en 3min.

La hauteur de ia mousse est mesurée pendant 20 minutes à intervalles réguliers (0-1-2-3-5- 10-15 et 20 min). La capacité moussante correspond à la hauteur de la mousse à T0 et la stabilité est déterminée par l'équation (hauteur de mousse à T20)-(hauteur de mousse à T0) x100.

(Exemple 7.2.1.

Le jus vert de luzerne est mis dans une cuve d'hydrolyse munie d'un système d'agitation, la température est montée à 55°C et le pH est ajusté à 8 avec de l'ammoniaque. La protéase est ajoutée à raison de 0,3% en poids. L'hydrolyse est conduite à un pH constant proche de 8, à une température constante de 55°C et pendant une durée de 5h.

Après 5h, l'hydrolyse est arrêtée par chauffage à 90"C pendant une durée de 10 minutes.

Le jus est ensuite centrifugé dans un décanteur centrifuge pour éliminer les particules solides. L'hydrolysat est concentré sous vide puis séché par atomisation. L'analyse chimique de l'hydrolysat obtenu est le suivant :

• le profil peptidique (suivant la méthode analytique ARD) :

- entre 1 et 3% de molécules de poids moléculaire compris entre 10000 et 5000Da

- entre 15 et 26% de molécules de poids moléculaire compris entre 5000 et 1 000Da

- entre 10 et 15% de molécules de poids moléculaire compris entre 1 000 et 500Da

- entre 7 et 11 % de molécules de poids moléculaire compris entre 500 et 300Da

- entre 46 et 73% de molécules de poids moléculaire Inférieur à 300Da

• la teneur en matière azotée protéique ((Nt - Nammo) x 6,25) est comprise entre 27% et 47% de l'extrait sec

• la teneur en minéraux est comprise entre 14% et 20% de l'extrait sec

• la teneur en chlorophylles est comprise entre 82ppm et 400ppm de l'extrait sec

• ta teneur en caroténoïdes (β-carotène) est comprise entre 1ppm et 10ppm de l'extrait sec

• la teneur en xanthophylles (lutéine, néoxanthine et violaxanthine) est comprise entre 1 ppm et 46ppm de l'extrait sec

L'analyse des propriétés fonctionnelles de l'hydrolysat est le suivant :

• solubilité : soluble au pH compris entre 2 et 11 ,

• propriété moussante : capacité moussante de 20

• propriété émulsifiante : phase émulsion de 60%.

Exemple 7.2.2.

Le jus vert de luzerne est mis dans une cuve d'hydrolyse munie d'un système d'agitation, la température est montée à 25°C et le pH est ajusté à 8 avec de l'ammoniaque.

La protéase est ajoutée à raison de 0,3% en poids. L'hydrolyse est conduite à un pH constant proche de 8, à une température constante de 25°C et pendant une durée de 5h.

Après 5h, l'hydrolyse est arrêtée par chauffage à 90°C pendant une durée de 10 minutes.

Le jus est ensuite centrifugé dans un décanteur centrifuge pour éliminer les particules solides. L'hydrolysat est concentré sous vide puis séché par atomisation. L'analyse chimique de l'hydrolysat obtenu est le suivant :

• le profil peptidique (suivant la méthode analytique ARD): o entre 1 et 3% de molécules de poids moléculaire compris entre 10000 et 5000Da

o entre 13 et 26% de molécules de poids moléculaire compris entre 5000 et 1 000Da

o entre 9 et 15% de molécules de poids moléculaire compris entre 1 000 et 500Da

o entre 7 et 11% de molécules de poids moléculaire compris entre 500 et 300Da

o entre 46 et 73% de molécules de poids moléculaire Inférieur à 300Da

• la teneur en matière azotée protéique ((Nt - Nammo) x 6,25) est comprise entre 27% et 47% de l'extrait sec

• la teneur en minéraux est comprise entre 14% et 20% de l'extrait sec

• la teneur en chlorophylles est comprise entre 82ppm et 400ppm de l'extrait sec

• la teneur en caroténoTdes (β-carotène) est comprise entre 1ppm et 10ppm de l'extrait sec

• la teneur en xanthophylles (lutéine, néoxanthine et violaxanthine) est comprise entre 1ppm et 48ppm de l'extrait sec

L'analyse des propriétés fonctionnelles de l'hydrolysat est le suivant :

• solubilité : solubie au pH compris entre 2 et 11 ,

• propriété moussante : capacité moussante de 290 et stabilité de 79%

• propriété émulsifiante : phase émulsion de 60%.

Exemple 7.2.3.

Le jus vert de luzerne est mis dans une cuve d'hydrolyse munie d'un système d'agitation, la température est montée à 55°C et le pH est ajusté à 8 avec de l'ammoniaque.

La protéase est ajoutée à raison de 0,3% en poids. L'hydrolyse est conduite à un pH constant proche de Θ, à une température constante de 55°C et pendant une durée de 1h. Après 1h, l'hydrolyse est arrêtée par chauffage à 90°C pendant une durée de 10 minutes. Le jus est ensuite centrifugé dans un décanteur centrifuge pour éliminer les particules solides. L'hydrolysat est concentré sous vide puis séché par atomisatlon.

L'analyse chimique de l'hydrolysat obtenu est le suivant :

• le profil peptkJique (suivant la méthode analytique ARD) : o entre 1 et 3% de molécules de poids moléculaire compris entre 10000 et 5000Da

o entre 11 et 26% de molécules de poids moléculaire compris entre 5000 et 1 000Da

o entre 8 et 15% de molécules de poids moléculaire compris entre 1 000 et 500Da

o entre 7 et 11% de molécules de poids moléculaire compris entre 500 et 300Da

o entre 46 et 73% de molécules de poids moléculaire inférieur à 300Da

• la teneur en matière azotée protéique ((Nt - Nammo) x 6,25) est comprise entre 27% et 47% de l'extrait sec

• la teneur en minéraux est comprise entre 14% et 20% de l'extrait sec

• la teneur en chlorophylles est comprise entre 82ppm et 400ppm de l'extrait sec

• la teneur en caroténoTdes (B-carotène) est comprise entre 1ppm et 10ppm de l'extrait sec

• la teneur en xanthophylles (lutéine, néoxanthine et violaxanthine) est comprise entre 1 ppm et 46ppm de l'extrait sec

L'analyse des propriétés fonctionnelles de l'hydrolysat est le suivant :

• solubilité : soluble au pH compris entre 2 et 11 ,

• propriété moussante : capacité moussante de 20

• propriété émulsifiante : phase émulsion de 60%.

[Exemple 7.2.4.

Le jus vert de luzerne est mis dans une cuve d'hydrolyse munie d'un système d'agitation, la température est montée à 55"C et le pH est ajusté à 6 avec de l'ammoniaque.

La protéase est ajoutée à raison de 0,3% en poids. L'hydrolyse est conduite à un pH constant proche de 6, à une température constante de 55°C et pendant une durée de 5h. Après 5h, l'hydrolyse est arrêtée par chauffage à 90°C pendant une durée de 10 minutes.

Le jus est ensuite centrifugé dans un décanteur centrifuge pour éliminer les particules solides.

L'hydrolysat est concentré sous vide puis séché par atomisation. L'analyse chimique de l'hydrolysat obtenu est le suivant :

• le profil peptidique (suivant la méthode analytique ARD): o entre 1 et 3% de molécules de poids moléculaire compris entre 10000 et 5000Da

o entre 10 et 26% de molécules de poids moléculaire compris entre 5000 et 1 000Da

o entre 8 et 15% de molécules de poids moléculaire compris entre 1 000 et 500Da

o entre 7 et 11% de molécules de poids moléculaire compris entre 500 et 300Da

o entre 48 et 73% de molécules de poids moléculaire inférieur à 300Da

• la teneur en matière azotée protéique ((Nt ~ Nammo) x 6,25) est comprise entre 27% et 47% de l'extrait sec

• la teneur en minéraux est comprise entre 14% et 20% de l'extrait sec

• la teneur en chlorophylles est comprise entre 82ppm et 400ppm de rextrait sec

• la teneur en caroténoTdes (β-carotène) est comprise entre 1ppm et 10ppm de l'extrait sec

• la teneur en xanthophylles (lutéine, néoxanthine et violaxanthine) est comprise entre 1 ppm et 46ppm de l'extrait sec

L'analyse des propriétés fonctionnelles de l'hydrolysat est le suivant :

• solubilité : soluble au pH compris entre 2 et 11 ,

• propriété moussante : capacité moussante de 150

• propriété émulsrfiante : phase émulsion de 68%.

Exemple 7.2,5. Le jus vert de luzerne est mis dans une cuve d'hydrolyse munie d'un système d'agitation, la température est montée à 55°C et le pH est ajusté à 8 avec de l'ammoniaque. La protéase est ajoutée à raison de 0,3% en poids. L'hydrolyse est conduite à un pH constant proche de 8, à une température constante de 55°C et pendant une durée de 5h.

Après 5h, l'hydrolyse est arrêtée par chauffage à 90°C pendant une durée de 10 minutes.

Le jus est ensuite centrifugé dans un décanteur centrifuge pour éliminer les particules solides.

L'hydrolysat est concentré sous vide puis séché par lyophilisation. L'analyse chimique de l'hydrolysat obtenu est le suivant :

• le profil peptJdique (suivant la méthode analytique ARD) : o entre 1 et 3% de molécules de poids moléculaire compris entre 10000 et 5000Da

o entre 15 et 26% de molécules de poids moléculaire compris entre 5000 et 1 000Da

o entre 10 et 15% de molécules de poids moléculaire compris entre 1 000 et 500Da

o entre 7 et 11% de molécules de poids moléculaire compris entre 500 et 300Da

o entre 46 et 73% de molécules de poids moléculaire inférieur à 300Da.

• la teneur en matière azotée protéique ((Nt - Nammo) x 6,25) est comprise entre 27% et 47% de l'extrait sec

• la teneur en minéraux est comprise entre 14% et 20% de l'extrait sec

• la teneur en chlorophylles est comprise entre 82ppm et 400ppm de l'extrait sec

• la teneur en caroténoïdes (β-carotène) est comprise entre 1ppm et 10ppm de l'extrait sec

• la teneur en xanthophylles (iutéine, néoxanthine et violaxanthine) est comprise entre 1ppm et 46ppm de l'extrait sec

L'analyse des propriétés fonctionnelles de l'hydrolysat est le suivant :

• solubilité : soluble au pH compris entre 2 et 11 ,

• propriété moussante : capacité moussante de 20

• propriété émulsifiante : phase émulsion de 60%.

Exemple 9 : coagulum Le jus vert de luzerne, de pH compris entre 5,8 et 6,2 est neutralisé ou légèrement alcalinisé par ajout d'une solution de potasse jusqu'à pH 7,0-8,0.

Ce jus est monté à une température de 85 ^e C, en moins de 5 minutes, par une Injection de vapeur directe type lyre, avec un temps de contact minimum de 20s. Un précipité se forme, précipité nommé coagulum.

Le coagulum protéique produit est séparé des eaux mères (ou sérum) par décantation centrifuge à un débit de 30 à 55t/h.

Le coagulum, dilué à 15%MS dans l'eau, est mis dans une cuve d'hydrolyse munie d'un système d'agitation, la température est montée à 55°C et le pH est ajusté à 8,5 avec de l'ammoniaque.

La protéase est ajoutée à raison de 0,42% en poids. L'hydrolyse est conduite à un pH constant proche de 8,5, à une température constante de 55°C et pendant une durée de 5h.

Après 5h, l'hydrolyse est arrêtée par chauffage à 90°C pendant une durée de 10 minutes. Le jus est ensuite centrifugé dans un décanteur centrifuge pour éliminer les particules solides.

La phase liquide est ensuite retraitée sur centrifugeuse autodebourbeuee. L'hydrolysat est concentre sous vide puis séché par atomisation, L'analyse chimique de l'hydrolysat obtenu est le suivant : · le profil peptidique (suivant la méthode analytique INZO) :

- entre 1 et 4% de molécules de poids moléculaire compris entre 10000 et 5000Da

- entre 9et 32% de molécules de poids moléculaire compris entre 5000 et 1 000Da

- entre 8 et 28% de molécules de poids moléculaire compris entre 1 000 et 500Da

- entre 14 et 46% de molécules de poids moléculaire compris entre 500 et 300 Da - entre 14 et 48% de molécules de poids moléculaire inférieur à 300Da.

• la teneur en matière azotée protêique ((Nt - Nammo) x 6,25) est comprise entre 32% et 95% de l'extrait sec

• la teneur en minéraux est comprise entre 3% et 9% de l'extrait sec

• la teneur en chlorophylles est comprise entre 60ppm et 940ppm de l'extrait sec

· la teneur en caroténoTdes (β-carotène) est comprise entre 11ppm et 211ppm de l'extrait sec

• la teneur en xanthophylles (lutéine, nôoxanthtne et violaxanthine) est comprise entre 20ppm et 225ppm de l'extrait sec

- l'amlnogramme :une teneur en alanine notamment de 2,8% à 8,9% sur protéines - une teneur en cystine notamment de 0,2% à 0,7% sur protéines

- une teneur en acide aspartique notamment de 4% à 13,9% sur protéines - une teneur en acide glutamique notamment de 5,5% à 17,3% sur protéines

- une teneur en phênylalanine notamment de 2,6% à 8,2% sur protéines

- une teneur en glycine notamment de 2,5% à 7,7% sur protéines

- une teneur en histidine notamment de 1 ,0% à 3,2% sur protéines

- une teneur en isoleucine notamment de 42,3% à 7,5% sur protéines

- une teneur en lysine notamment de 2,8% à 9,2% sur protéines

- une teneur en leucine notamment de 4% à 12,5% sur protéines

- une teneur en méthionine notamment de 0,9% à 2,9% sur protéines

- une teneur en proline notamment de 2,4% à 7,9% sur protéines

- une teneur en arginine notamment de 2,7% à 9,0% sur protéines

- une teneur en sérine notamment de 1 ,7% à 5,8% sur protéines

- une teneur en thréonlne notamment de 2,2% à 7,2% sur protéines

- une teneur en valine notamment de 2,9% à 9,3% sur protéines

- une teneur en tryptophane notamment de 0,8% à 2,7% sur protéines

- une teneur en tyrosine notamment de 2,0% à 6,4% sur protéines.

L'analyse des propriétés fonctionnelles de l'hydroiysat est la suivante :

• solubilité : soluble au pH compris entre 5 et 8,

• propriété moussante : capacité moussante comprise entre 20 et 40

• propriété émulstfiante : pas de propriété

Exemple 8 : utilisation des hydrolysats selon la présente Invention :

La méthode utilisée pour la mesure de la force de collage aux exemples 8.1, 8.2 et 8.3 est la suivante :

La poudre d'hydrolysat est diluée dans de l'eau osntosée aux proportions 1/3 (hydrolyeat /eau, masse/masse) à 20°C, ce mélange est laissé maturé de 1h à 24h à température ambiante. Cette dilution est ensuite disposée sur la phase lisse à encoller d'une feuille de papier vinyl de 190 grammes sur une surface de 10 cm ² (préalablement dessinée sur la feuille d'une largeur de 2 cm et d'une longueur de 5 cm) à l'aide d'une spatule. Une autre feuflle de papier vinyl est disposée au-dessus de celle-ci. Ces deux feuilles ainsi collées sont mises à sécher dans une étuve de type Memmert à 45"C pendant une durée aHant de 1h à 24h. Les feuilles ainsi collées sont ensuite accrochées à une planche. Un dispositif (panier) permettant d'introduire des poids est ainsi attaché à la feulle de papier vinyl. Des poids sont Introduits dans le panier jusqu'à arrachement par pelage de la feuille collée par la luzerne. Le panier est ensuite pesé. Le poids ainsi déterminé est rapporté à la quantité de luzerne introduite et comparé avec d'autres échantillons travaillés dans des conditions similaires.

Exemple 8.1 : Colle végétale (non formulée)

La poudre d'hydrolysat, obtenue tele que décrit en exemple 6, est diluée dans de l'eau osmosée aux proportions 1/3 (hydrolysat /eau, masse masse) à 20°C, ce mélange est laissé maturé de 1h à 24h à température ambiante. La colle ainsi obtenue démontre une force de collage de 0,088 kg/cm ² pour 1g de produit sec (contre 0,380 kg/cm ² pour 1g de produit sec de colle en tube type UHU; 0,072 kg cm ² pour 1g de produit sec de type colle à base d'amidon gélatinisée et 0,130 kg/cm ² pour 1g de produit sec de colle à base de farine gélatinisée). Exemple 8.2 : Colle végétale formulée avec du bicarbonate de soude

La poudre cPhydrolysat, obtenue telle que décrit en exemple 6, est diluée dans de l'eau osmosée aux proportions 1/3 (hydrolysat /eau, masse/masse) à température ambiante (20°C). A ce mélange est ajouté 6 à 7 % de bicarbonate de soucie (poudre). Ce mélange est laissé maturé de 1 h à 24h à température ambiante. La colle ainsi obtenue démontre une force de colage de 0,097 kg cm ² pour 1g de produit sec.

(Exemple 8.3 : Colle végétale avec formulation urée

La poudre d'hydrolysat, obtenue telle que décrit en exemple 6, est diluée dans de l'eau osmosée aux proportions 1/3 (hydrolysat /eau, masse/masse) à température ambiante (20 ^e C). A ce mélange est ajouté 6 à 7 % d'urée (poudre). Ce mélange est laissé maturé de 1 h à 24h à température ambiante.

La colle ainsi obtenue démontre une force de collage de 0.105 kg/cm ² pour 1g de produit sec.

Exemple 8.4 : Utilisation en tant que tenseur :

La poudre d'hydrolysat, obtenue telle que décrit en exemple 6, est diluée dans de l'eau osmosée aux proportions comprises entre 1 et 10% (hydrolysat /eau, masse masse) à température ambiante (20°C).

Des brins de laine sont trempés dans ces solutions pendant 15 minutes à température ambiante. Les brins sont ensuite déposés et séchés à température ambiante sur une potence (24h minimum). Une longueur de fil est mesurée à tO (avant trempage) et à t final (après trempage et séchage), les résultats sont donnés en pourcentage d'étirement du fil :

Exemple 8.5 : Préparation d'un gâteau au chocolat

Dans une casserole, 200g de chocolat Type pâtissier dessert et 100g de beurre coupé en morceaux (de type doux 60% M. G.) sont fondus à feu très doux. Dans un saladier, 100g de sucre blanc (type sucre de betterave en poudre), 3 œufs de poule, et 50g de farine de blé sont mélangés jusqu'à homogénéisation totale. Le mélange chocolat/beurre est ajouté au mélange précédent et mélangé jusqu'à homogénéisation totale. A ce mélange sont ajoutés, 9g de poudre d'hydrolysat, obtenu tel que décrit en exemple 6, et 6g de levure chimique (de type poudre à lever de tête). L'ensemble est mélangé jusqu'à homogénéisation totale.

Ce mélange est versé dans un moule pâtissier préalablement beurré et fariné. Le moule est alors placé au four, préalablement préchauffé à Thermostat 6 (180°C), pendant 45minutes à 180°C.

Exemple 8.6 : Préparation d'une guimauve 25g de sirop de glucose base blé et 250g de sucre cristallisé blanc de betterave sont placés dans une casserole et sont cuits jusqu'à 130°C, une fois cette température atteinte, le jus obtenu est incorporé à 75g de blanc d'œufs de poule. Le tout est mélangé au batteur ménagé (type phillips HR 1459/00). A pari 4 feui les de gélatine alimentaire d'origine porcine sont recouvertes d'eau froide pendant 10minutes puis les feuilles sont essorées à la main et ajoutées à 10 gouttes de sirop de fraise. Ce mélange est incorporé au mélange précédent 1 cuillère à café de poudre d'hydrolysat, obtenu tel que décrit en exemple 6, est ajoutée à ce dernier mélange. L'ensemble est mélangé jusqu'à homogénéisation totale, avec un batteur ménagé (type phillips HR 1459/00).

Le tout est mis dans un moule, préalablement recouvert d'un mélange d'amidon de pommes de terre en poudre et de sucre glace (1 cuillère d'amidon et 4 cuillères de sucre glace). Le tout est laissé 3h à 20°C puis 1 nuit à 4°C. Exemple 8.7 : préparation d'une soupe

Quatre pommes de terre rouges de montagne de type chair ferme de variété Rosabelle, 4 carottes, ½ aubergines, 1 oignon jaune, 150 g de tomate sont nettoyés, pelés et découpés en dés. L'ensemble est placé dans une casserole avec un peu d'huile et fait revenir pendant 15minutes, puis 1 ,5L d'eau minérale et un cube de légumes (type bouquet garni). Le tout est chauffé durant 1 h à feu doux avant d'être mixé mixeur de type moulinex DD1001 41 turbomix plus, une pincée de sel (type sel marin) et 37g de poudre d'hydrolysat, obtenu tel que décrit en exemple 6, sont ajoutés à la préparation finale. Exemple 8.8 : préparation d'une barre de céréales protéinée 2 œufs de poule, 2 cuillères à café d'huile de tournesol alimentaire (de type Lesieur), 4 cuillères à soupe de miel liquide (de type toutes fleurs), 250g de muesli (de type croustillant fruits), 2 cuillères à café de chocolat en poudre de type pur cacao et 4 cuillères à café de poudre d'hydrolysat, obtenu tel que décrit en exemple 6, sont mélangés jusqu'à homogénéisation.

Le mélange est déposé sur une plaque, afin d'obtenir une couche uniforme et compacte de 2 cm. La plaque est mise au four 15min à thermostat 6.

Exemple 8.9 : préparation d'une crème dessert 30g de maïzena, 30g de sucre roux et 50cl de lait demi-écrémé de vache à 4"C sont mélangés jusqu'à homogénéisation et fouettés. 100g de chocolat pâtissier coupés en petits morceaux sont incorporés à la préparation précédente et l'ensemble est chauffé afin de faire fondre le chocolat, après ajout de 4g de poudre d'hydrolysat, obtenu tel que décrit en exemple 6, l'ensemble est mélangé jusqu'à épaississement. Le tout est réservé à 4°C. Exemple 8.10 : préparation d'un yaourt au café protélné 1L de lait entier de vache, 1 yaourt nature non sucré de type Danone, 2 cuillères à café d'arôme de café liquide de type Vahiné, 4 cuillères à soupe de sucre cristallisé blanc de betterave sont mélangés jusqu'à homogénéisation à 2 cuillères à café de poudre d'hydrolysat, obtenu tel que décrit en exemple 6. L'ensemble est placé dans des ramequins placés dans une yaourtière durant 12h de type (type Heru) à 30°C.

Exemple 8.11 : préparation de ketchup 131g d'oignons jaunes, 7g de gousse d'ail sont épluchés, l'ensemble est ajouté à 1 123g de tomates rouges bien mûres et l'ensemble est coupé grossièrement. L'ensemble est placé 30minutes dans une casserole sous feu vif, tout en remuant régulièrement afin d'éviter que le mélange n'accroche. Le mélange cuit est passé au moulin à légumes afin d'obtenir un coulis. 7CI de vinaigre d'alcool coloré, 1 clou de girofle et une pincée de piment de Cayenne sont mélangés à ce coulis avant d'être cuit 45minutes dans une casserole, ou jusqu'à réduction de la moitié du volume, et ce afin d'obtenir une consistance sirupeuse. L'ensemble est mixé afin d'obtenir un mélange homogène. 60g de cassonade sont mélangés à la préparation avant d'être remis sur le feu durant 15minutes, toujours en remuant régulièrement afin que le mélange n'accroche pas. 3g de poudre d'hydrolysat, obtenu tel que décrit en exemple 6, sont mélangés à 179g du mélange précédent L'ensemble est réservé 3-4 jours à 4°C avant consommation. Dans cette recette l'hydrolysat remplace le sel et le poivre. Exemple 8.12 : préparation d'une mayonnaise 21.5g de jaune d'oeuf de poule et 9.2g de moutarde de dljon « fine et forte » sont mélangés avant incorporation progressive d'huile de tournesol afin de faire monter la mayonnaise. A 50g de ce mélange, 1g de poudre d'hydrolysat, obtenu tel que décrit en exemple 6, sont mélangés. Le tout est réservé à 4°C avant dégustation.