| WO2006065736A2 | 2006-06-22 | |||
| WO2002045527A2 | 2002-06-13 |
| EP2065034A2 | 2009-06-03 | |||
| EP2213280A1 | 2010-08-04 |
M. O. KELLEHER ET AL: "1-Cyano-2,3-epithiopropane is a novel plant-derived chemopreventive agent which induces cytoprotective genes that afford resistance against the genotoxic , -unsaturated aldehyde acrolein", CARCINOGENESIS, vol. 30, no. 10, 24 July 2009 (2009-07-24), pages 1754 - 1762, XP055047288, ISSN: 0143-3334, DOI: 10.1093/carcin/bgp182
MARTA DE TORRES ZABALA ET AL: "Characterisation of recombinant epithiospecifier protein and its over-expression in Arabidopsis thaliana", PHYTOCHEMISTRY, vol. 66, no. 8, 1 April 2005 (2005-04-01), pages 859 - 867, XP055047289, ISSN: 0031-9422, DOI: 10.1016/j.phytochem.2005.02.026
HAYES ET AL.: "The cancer chemopreventive actions of phytochemicals derived from glucosinolates", EUR. J. NUTR., vol. 47, no. 2, 2008, pages 73 - 88, XP019628481
ALTER: "Sulforaphane glucosinolate monograph", MED. CHEM., vol. 15, no. 4, 2010, pages 352 - 360
KELLEHER ET AL.: "1-Cyano-2,3-epithiopropane is a novel plant-derived chemopreventive agent which induces cytoprotective genes that afford resistance against the genotoxic a,{3-unsaturated aldehyde acrolein", CARCINOGENESIS, vol. 30, 2009, pages 1754 - 62, XP055047288, DOI: doi:10.1093/carcin/bgp182
R. C. ROWE; P. J. SHESKEY; P.J. WELLER: "Handbook of Pharmaceutical Excipients", 2003, PHARMACEUTICAL PRESS
KJAER ET AL.: "Synthesis of the 3-butenylglucosinolate ion", ACTA CHEM. SCAND., vol. 22, 1968, pages 3324 - 3344
BONES ET AL., THE MYROSINASE-GLUCOSINOLATE SYSTEM, ITS ORGANIZATION AND BIOCHEMISTRY, vol. 97, 1996, pages 194 - 208
VAN EYLEN ET AL.: "Temperature and pressure stability of mustard seed (Sinapis alba L.) myrosinase", FOOD CHEM., vol. 97, 2006, pages 263 - 271, XP025129947, DOI: doi:10.1016/j.foodchem.2005.03.046
H. L. TOOKEY: "Crambe thioglucoside gluccohydrolase (EC 3.2.3.1): Separation of a protein required for epithiobutane formation", CAN. J. BIOCHEM., vol. 23, 1973, pages 511 - 525
HOOI ET AL.: "Purification and characterization of epithioespecifier protein from Brassica napus: enzymic intramolecular sulfur adittion within alkenyl thiohydroximates derived from alkenyl glucosynolate hydrolysis", FEBS LETTERS, vol. 468, 2000, pages 243 - 246
REICHSTEIN ET AL., HELV. CHIM. ACTA, vol. 16, no. 561, 1933, pages 1019
M. E. AULTON: "Farmacia. La ciencia del diseno de las formas farmaceuticas", 2004, ELSEVIER
EUN-SUN HWANG ET AL.: "Effects of Different Processing Methods on Induction of Quinone Reductase by Dietary Broccoli in Rats", J. MED. FOOD, vol. 7, no. 1, 2004, pages 95 - 99
PROCHASKA ET AL.: "Direct measurement of NAD(P)H: quinone reductase from cells cultured in microtiter wells: a screening assay for anticarcinogenic enzyme inducers", ANAL. BIOCHEM., vol. 169, 1988, pages 328 - 336, XP024823357, DOI: doi:10.1016/0003-2697(88)90292-8
"Rapid detection of inducers of enzymes that protect against carcinogens", PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 89, 1992, pages 2394 - 2398
| REIVINDICACIONES Composición caracterizada porque comprende: a) un alquenilglucosinolato de fórmula (I) en donde Glc es glucosa, y R es un grupo alquenilo con un doble terminal, b) mirosinasa, c) proteína epitioespecífica y una sal de hierro (II) farmacéuticamente aceptable. 2.- Composición según la reivindicación 1 , caracterizada porque el alquenilglucosinolato se elige entre sinigrina, gluconapina, glucobrasicanapina, o mezclas de los anteriores. 3. Composición según la reivindicación 2, caracterizada porque el alquenilglucosinolato es la sinigrina. 4. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada porque el alquenilglucosinolato, está en forma de una fuente vegetal deshidratada, o como extracto vegetal seco, o como mezcla de los anteriores. 5. - Composición según la reivindicación 3, caracterizada porque la sinigrina está en forma de extracto vegetal seco de Lepidium latifolium, o bien como extracto vegetal seco de Brassica olerácea var. gemmifera, o bien en forma de hoja de Lepidium latifolium deshidratada, o bien es una mezcla de cualquiera de los anteriores 6. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizada porque la mirosinasa y la proteína epitioespecífica están en forma de una fuente vegetal deshidratada. 7.- Composición según la reivindicación 6, caracterizada porque la mirosinasa está en forma de una fuente vegetal deshidratada obtenida a partir de hojas de Lepidium latifolium, hojas de Brassica campestris L, hojas de Brassica napus L; semillas de Sinapis alba, o semillas de Lepidium sativum; o mezclas de los anteriores. 8. - Composición según la reivindicación 6, caracterizada porque la proteína epitioespecífica está en forma de hoja de Lepidium latifolium deshidratada, hoja de Brassica olerácea var. Gemmifera deshidratada, semillas de Lepidium sativum deshidratadas, o como mezcla de las anteriores. 9. - Composición según cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 8, caracterizada porque contiene una cantidad de alquenilglucosinolato comprendida entre 1 mg y 1000 mg. 10. Composición según cualquiera de de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizada porque, por cada 0,025 milimoles de alquenilglucosinolato, contiene entre 0,1 y 2 Ul de mirosinasa, entre 0,01 mg y 1 mg de proteína epitioespecífica, y entre 0,1 y 1 micromoles de sal de hierro (II) farmacéuticamente aceptable. 1 1 . - Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 caracterizada porque comprende también ácido ascórbico. 12. - Composición según la reivindicación 1 1 , caracterizada porque contiene entre 0,1 mg y 5 mg de ácido ascórbico por cada 0,025 milimoles de alquenilglucosinolato. 13. - Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizada porque está en forma sólida. 14. - Composición según la reivindicación 13, caracterizada porque está en forma de cápsulas, comprimidos o polvo dispersable. 15.- Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizada porque está en forma mixta, con una parte sólida y una parte líquida que deben mezclarse antes de la ingestión. 16.- Composición alimentaria caracterizada porque comprende una cantidad efectiva de la composición de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12. 17. - Procedimiento para preparar una composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, caracterizado porque comprende: a) mezclar el alquenilglucosinolato de fórmula (I) en donde R es un grupo alquenilo con un doble enlace terminal, la mirosinasa, la proteína epitioespecífica y, opcionalmente, al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable para obtener una mezcla sólida que presenta un contenido en agua inferior al 10%, y b1 ) para preparar una composición sólida: i. añadir a la mezcla obtenida en la etapa a) una sal de hierro (II) farmacéuticamente aceptable y opcionalmente ácido ascórbico, y ¡i. acondicionar la mezcla resultante en forma de comprimidos, cápsulas, o polvo dispersable en sobres; o b2) para preparar una composición mixta con una parte sólida y una parte líquida: i. depositar la mezcla obtenida en la etapa a) en un tapón que incluye un alojamiento para sólidos, ¡i. preparar una solución acuosa que comprende una sal de hierro (II) farmacéuticamente aceptable, opcionalmente ácido ascórbico, opcionalmente mirosinasa o alquenilglucosinolato, y opcionalmente al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable, iii. introducir la solución acuosa obtenida en la etapa ii) en un vial, y taparlo con el tapón resultante de la etapa i) 18. - Procedimiento según la reivindicación 17, caracterizado porque en la etapa a) el alquenilglucosinolato, la mirosinasa y la proteína epitioespecífica se incorporan en forma de una fuente vegetal deshidratada, o como mezcla de una fuente vegetal deshidratada y un extracto vegetal seco. 19.- Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 para su uso como detoxificante. |
COMPOSICION DETOXI FICANTE DE ALQUENILGLUCOSINOLATO Campo de la técnica
La presente invención se refiere a composiciones de alquenilglucosinolatos, que resultan ventajosas para aportar al organismo sustancias quimioprotectoras de efecto detoxificante. Estado de la técnica anterior
Los glucosinolatos son unas sustancias naturales, derivadas de la glucosa, que están presentes en diversas especies vegetales, principalmente de la familia de las brasicáceas (Brassicaceaé) o cruciferas (Cruciferae), por ejemplo, en la col, el brócoli, la coliflor, los rábanos, nabos o las coles de Bruselas.
Los glucosinolatos son compuestos que responden a la fórmula general
(I):
donde Glc representa glucosa, de manera que todos ellos contienen un grupo β-D- tioglucosa, una oxima sulfonada, y un grupo variable (R) que da lugar a los diferentes glucosinolatos existentes.
Se ha comprobado que el consumo habitual de cruciferas en la dieta repercute de forma positiva en la salud, especialmente por sus propiedades quimioprotectoras frente al cáncer, relacionadas con un efecto detoxificante frente a agentes cancerígenos, tales como compuestos con una estructura química poco frecuente en la naturaleza (xenobióticos).
Existen numerosos estudios que demuestran que las propiedades quimioprotectoras derivadas del consumo de glucosinolatos son debidas en realidad a sus productos de degradación, tal como se describe, por ejemplo, en el artículo Hayes et ai, The cáncer chemopreventive actions of phytochemicals derived from glucosinolates, Eur. J. Nutr., 2008, 47 (Suppl 2), 73-88. Para que pueda producirse la hidrólisis de los glucosinolatos en sus derivados activos, es necesaria la presencia de una enzima, la mirosinasa, que se encuentra también de forma endógena en los mismos vegetales donde se hallan los glucosinolatos. En dicho artículo se describe que la naturaleza de los compuestos que se pueden generar por hidrólisis de un glucosinolato debido a la acción de la enzima mirosinasa depende de la estructura del glucosinolato, del pH, de la temperatura y la presencia de iones ferroso. Entre los compuestos que se forman por hidrólisis de los glucosinolatos se encuentran: isotiocianatos (R-N=C=S), nitrilos (R-CN), tiocianatos (R-S-CN) y epitionitrilos s
( H 2 C /—\ R— CN )
La acción quimioprotectora asociada al consumo de vegetales de la familia de las cruciferas es óptima cuando éstos se consumen crudos, ya que durante su cocción, la enzima mirosinasa se desnaturaliza y, por consiguiente, la hidrólisis de los glucosinolatos queda muy disminuida. Es por ello que en el estado de la técnica se han desarrollado algunas composiciones, destinadas a proporcionar un aporte más eficiente de los derivados activos de los glucosinolatos al organismo, de forma complementaria a los que se aportan únicamente en la dieta.
En el artículo de revisión Sulforaphane glucosinolate monograph, Alter. Med. Chem., 2010, 15(4), 352-360, se describe que el sulforafano es un derivado terapéuticamente activo que tiene notables propiedades protectoras frente al cáncer. El sulforafano es el isotiocianato derivado de la hidrólisis del glucosinolato glucorafanina.
En el estado de la técnica se han descrito formulaciones destinadas a aportar isotiocianatos. Así en la solicitud de patente europea EP-A-2065034 se describen composiciones farmacéuticas con protección entérica que contienen glucosinolatos, preferentemente glucorafanina, y enzimas β-tioglucosidasas, por ejemplo mirosinasa, con la finalidad de generar in situ en el organismo los isotiocianatos derivados, en particular el sulforafano. La protección entérica tiene la finalidad de evitar que la hidrólisis pueda tener lugar en el estómago, donde el pH bajo podría favorecer la formación nitrilos, en lugar de los isotiocianatos deseados.
Así mismo, en la solicitud de patente europea número EP-A-2213280, se describen formulaciones que contienen glucorafanina y mirosinasa. El objetivo de las mismas es también la liberación del isotiocianato sulforafano en el organismo. Estas composiciones se caracterizan porque al menos uno de los componentes, el glucosinolato o la enzima, está encapsulado o recubierto, para conseguir que dichos componentes no reaccionen en la composición, sino que lo hagan después de ser ingeridos.
Por otro lado, en la solicitud de patente internacional WO-A-02/45527, se describen composiciones obtenidas a partir vegetales de la familia de las cruciferas, especialmente brócoli y rábano, procesados y deshidratados, que contienen glucosinolatos y mirosinasa, de manera que, cuando la composición es ingerida, la mirosinasa hidroliza los glucosinolatos a isocianatos en el organismo.
Otro de los derivados activos de los glucosinolatos son los epitionitrilos que se forman a partir de la hidrólisis de un tipo particular de glucosinolatos, los alquenilglucosinolatos, que presentan un doble enlace terminal en el grupo R de la fórmula (I) anterior. Así mismo, para su formación se requiere la presencia de la denominada proteína epitioespecífica (en adelante ESP), iones ferrosos (Fe 2+ ), y unas condiciones de pH ácido.
Se ha demostrado que los epitionitrilos poseen unas notables propiedades detoxificantes, actuando como protectores frente a agentes carcinógenos, tal como se describe en el artículo Kelleher et al., 1 -Cyano-2,3-epithiopropane is a novel plant-derived chemopreventive agent which induces cytoprotective genes that afford resistance against the genotoxic α,β-unsaturated aldehyde acrolein, Carcinogenesis, 2009, 30, 1754-62, donde se estudia in vitro la capacidad de los epitionitrilos de inducir enzimas citoprotectores, así como sus propiedades quimiopreventivas frente a agentes xenobióticos genotóxicos. En este artículo se destacan las propiedades quimiopreventivas del compuesto 1 -ciano-2,3-epitiopropano, el epitionitrilo derivado de la hidrólisis del alquenilglucosinolato sinigrina, compuesto de fórmula (I) en donde el grupo R es 2-propenilo.
En el estado de la técnica no se han descrito composiciones que proporcionen un aporte óptimo de dichos epitionitrilos al organismo, a pesar de que debido a sus propiedades detoxificantes, es deseable disponer de composiciones para la administración de los epitionitrilos derivados de los alquenilglucosinolatos.
Existe, pues, la necesidad de disponer de una composición que permita proporcionar al organismo epitionitrilos derivados de alquenilglucosinolatos que sea efectiva, estable y segura.
Objeto de la invención
El objeto de la presente invención es una composición de alquenilglucosinolato.
Forma también parte del objeto de la invención un procedimiento para la preparación de dicha composición.
Forma parte del objeto de la invención una composición alimentaria que comprende dicha composición.
Forma también parte del objeto de la invención dicha composición para su uso como detoxificante. Breve descripción de los dibujos
Figura 1
En la Figura 1 se representa la inducción de la enzima quinona reductasa (QR) producida por una muestra preparada a partir de una composición de la invención que comprende hoja de Lepidium latifolium deshidratada y molida. En abscisas se representa la concentración de la muestra en mg/ml, referida al peso de hoja de Lepidium latifolium deshidratada por volumen de disolución, y en ordenadas se representa la inducción de QR que se calcula como el cociente entre la absorbancia de la muestra a una longitud de onda de 610 nm, y la absorbancia del medio control.
Figura 2
En la Figura 2 se representa la inducción de la enzima quinona reductasa (QR) producida por el isotiocianato denominado sulforafano. En abscisas se representa la concentración de sulforafano en micromoles por litro de disolución, y en ordenadas se representa la inducción de QR que se calcula como el cociente entre la absorbancia de la muestra a una longitud de onda 610 nm y la absorbancia del medio control. Figura 3
En la Figura 3 se representa la cinética enzimática de la enzima quinona reductasa (QR) para cuatro muestras: 1 ) composición según la invención que comprende hoja de Lepidium latifolium deshidratada y molida, 2) sulforafano, 3) control de células y medio, y 4) control de DMSO. La concentración del producto de la invención es de 8 mg/ml, referida al peso de hoja de Lepidium latifolium deshidratada por volumen de disolución, y la concentración de sulforafano es 5 μΜ. En abscisas se representa el tiempo en minutos y en ordenadas se representa la absorbancia de las muestras a una longitud de onda 610 nm. Figura 4
En la Figura 4 se representa la absorbancia de una muestra preparada a partir de una composición de la invención que comprende hoja de Lepidium latifolium deshidratada y molida para el ensayo de citotoxicidad según el test XTT (sal sódica de la 2,3-bis(2-metoxi-4-nitro-5-sulfofenil)-2H-tetrazolio-5-carbo xanilida). Este test se basa en la capacidad de las células metabólicamente activas de reducir dicho compuesto (XTT) formando el correspondiente tinte de formazán anaranjado, de manera que la concentración del tinte, medida en función de la absorbancia, es proporcional al número de células metabólicamente activas. En abscisas se representa la concentración de la muestra en mg/ml, referida al peso de hoja de Lepidium latifolium deshidratada por volumen de disolución, y en ordenadas se representa la absorbancia de la muestra a una longitud de onda 500 nm.
Figura 5
En la Figura 5 se representa la absorbancia de una muestra de sulforafano para el ensayo de citotoxicidad según el test XTT. En abscisas se representa la concentración de sulforafano en micromoles por litro de disolución, y en ordenadas se representa la absorbancia de la muestra a una longitud de onda 500 nm.
Descripción detallada de la invención
El objeto de la presente invención es una composición que comprende: a) un alquenilglucosinolato de fórmula (I)
en donde Glc es glucosa, y R es un grupo alquenilo con un doble enlace terminal,
b) mirosinasa,
c) proteína epitioespecífica y
d) una sal de hierro (II) farmacéuticamente aceptable.
Los autores de la presente invención han desarrollado una composición con un alquenilglucosinolato que, sorprendentemente, es estable y en condiciones que simulan las condiciones fisiológicas del estómago, genera mayoritariamente derivados del tipo epitionitrilos.
Así mismo, dicha composición es altamente estable, y permite el aporte de epitionitrilos al organismo evitando los problemas organolépticos y de estabilidad derivados de formular una composición que contuviera directamente dichos epitionitrilos.
En el ámbito de la presente invención, es adecuada cualquier formulación sólida, con un bajo contenido en agua, preferiblemente inferior al 10%, más preferiblemente inferior al 8%, y aún más preferiblemente inferior al 6%. También son adecuadas aquellas formulaciones en las que, aun no siendo sólidas, hay una separación física entre la enzima mirosinasa y el alquenilglucosinolato, para evitar la hidrólisis de éste último en la composición.
De acuerdo con estas premisas, la composición de la invención puede presentarse en una forma farmacéutica sólida; una combinación de una forma farmacéutica sólida y una forma líquida; o bien puede ser incorporada, a una composición alimentaria, como, por ejemplo, un complemento dietético.
Forma parte del objeto de la invención una composición alimentaria que comprende una cantidad efectiva de la composición de la invención.
En el contexto de la invención se entiende por cantidad efectiva aquella cantidad de composición de alquenilglucosinolato que proporciona el efecto o beneficio deseado después de ser consumida.
Entre las composiciones alimentarias a las que se puede incorporar dicha composición se encuentran, por ejemplo, complementos dietéticos, complementos nutricionales, barritas nutritivas, cereales, o galletas.
En una realización de la invención, la composición está en forma sólida. Entre las formas sólidas adecuadas para ser usadas en el marco de la presente invención están, por ejemplo, los comprimidos, cápsulas o presentaciones en polvo dispersable.
Los excipientes farmacéuticamente aceptables adecuados para ser usados en la preparación de las composiciones de la invención son bien conocidos por el experto en tecnología farmacéutica y pueden elegirse, por ejemplo, entre sustancias de relleno, agentes aglutinantes, antiadherentes, lubricantes, agentes antiapelmazantes, materiales para el recubrimiento de comprimidos, gelatina para cápsulas duras y blandas, plastificantes, estabilizantes, agentes conservantes, colorantes, edulcorantes, aromatizantes, entre otros, y sus mezclas. Dichos excipientes se describen, por ejemplo, en el manual R. C. Rowe, P. J. Sheskey y P.J. Weller, Handbook of Pharmaceutical Excipients, cuarta edición, Pharmaceutical Press, Londres, 2003.
En una realización preferida de la invención, la composición está en forma de comprimidos o de cápsulas.
En otra realización preferida de la invención, la composición está en forma de polvo dispersable. Dicho polvo es susceptible de dispersarse con agua inmediatamente antes de su ingestión. Preferiblemente, dicha composición en polvo contiene adicionalmente sustancias edulcorantes y/o aromatizantes, para mejorar el sabor de la dispersión a ingerir. Por ejemplo puede contener sacarosa o fructosa; edulcorantes como sorbitol, xilitol, sucralosa, acesulfamo, aspartamo o sacarina, entre otros; así como cualquier sustancia aromatizante tanto de origen natural como sintético. En una realización más preferida, la composición en polvo se dispone en un envase que es apropiado para añadirle un volumen adecuado de agua, para preparar in situ una dispersión mediante agitación, y proceder inmediatamente a su ingestión.
En otra realización de la invención, la composición está en forma mixta con una parte sólida y una parte líquida que deben mezclarse inmediatamente antes de la ingestión. Son aptas para este tipo de composiciones las presentaciones en forma de un envase, que contiene la parte líquida, provisto de un tapón que contiene la parte sólida, que es soluble o dispersable en la parte líquida, de manera que ambas se mezclan inmediatamente antes de su ingestión. Los diferentes ingredientes de la composición estarán distribuidos, o bien en la parte sólida, o bien en la parte líquida, o opcionalmente, alguno de ellos puede estar presente en ambas partes, con la condición de que la parte líquida no puede contener simultáneamente el alquenilglucosinolato y la mirosinasa, para evitar la hidrólisis del primero. Preferiblemente, la sal de hierro (II) farmacéuticamente aceptable, y eventualmente el ácido ascórbico están en la parte líquida. Preferiblemente, la proteína epitioespecífica está en la parte sólida. Preferiblemente, la mirosinasa está en la parte sólida o bien está distribuida entre la parte líquida y la parte sólida. Más preferiblemente la mirosinasa está en la parte sólida. Preferiblemente el alquenilglucosinolato está en la parte sólida, o bien está distribuido entre la parte sólida y en la parte líquida. Más preferiblemente, el alquenilglucosinolato está en la parte sólida.
La formulación de la parte líquida contiene los ingredientes activos disueltos en agua, así como, opcionalmente, otros componentes adicionales, tales como estabilizantes, agentes conservantes, colorantes, edulcorantes, aromatizantes, entre otros, y sus mezclas. Por ejemplo puede contener sacarosa o fructosa; edulcorantes como sorbitol, xilitol, sucralosa, acesulfamo, aspartamo o sacarina, entre otros; así como cualquier sustancia aromatizante tanto de origen natural como sintético.
En una realización preferida de la invención, la parte líquida de dicha composición mixta comprende un extracto vegetal líquido rico en sinigrina.
En otra realización preferida, la parte líquida de dicha composición mixta comprende la sal de hierro (II) farmacéuticamente aceptable y, opcionalmente, ácido ascórbico, mientras que la parte sólida comprende el alquenilglucosinolato, la mirosinasa y la proteína epitioespecífica con una actividad de agua suficientemente baja para que la enzima, aun estando en contacto con el alquenilglucosinolato, no sea capaz de hidrolizarlo. Preferiblemente la composición sólida presenta un contenido de agua inferior al 10%, más preferiblemente inferior al 8%, y aún más preferiblemente inferior al 6%. El alquenilqlucosinolato
El alquenilglucosinolato que forma parte de la presente invención es un compuesto que responde a la fórmula (I):
donde Glc representa glucosa y R es un grupo alquenilo con un doble enlace terminal. El contracatión es habitualmente un catión de metal alcalino, por ejemplo el ión potasio. Preferiblemente el grupo R es un grupo alquenilo C 3 -Ci 0 .
Entre los alquenilglucosinolatos que resultan apropiados para ser empleados en la composición de la invención se encuentran, por ejemplo, sinigrina (R=2-propenilo), gluconapina (R=3-butenilo), glucobrasicanapina (R= 4-pentenilo), glucowasabiamina (R=5-hexenilo), glucowasajaponicaina (R=6-heptenilo), progoitrina (R=(2R)-2-hidroxi-3-butenilo), epiprogoitrina (R=(2S)-2-hidroxi-3-butenilo), napoleiferina (R=(2S)-2-hidroxi-4-pentenilo) y epinapoleiferina (R=(2R)-2-hidroxi-4- pentenilo). Todos estos compuestos se encuentran en la naturaleza, si bien también se pueden emplear alquenilglucosinolatos de origen sintético que contengan un grupo R con un doble enlace terminal.
Preferiblemente, la composición objeto de la presente invención comprende un alquenilglucosinolato que se selecciona entre el grupo formado por sinigrina, gluconapina, glucobrasicanapina, y sus mezclas, y más preferiblemente, es sinigrina.
El alquenilglucosinolato que forma parte de la presente invención puede estar: a) en forma de una fuente vegetal deshidratada y molida, b) como extracto vegetal, o c) en forma sustancialmente pura obtenida por síntesis química.
En el contexto de la invención se entiende por fuente vegetal deshidratada la matriz vegetal que contiene el alquenilglucosinolato que ha sido sometida a un proceso de deshidratación.
Por extracto vegetal se entiende un producto obtenido a partir de una fuente vegetal, que presenta un contenido sustancialmente elevado de alquenilglucosinolato, que es superior al contenido que se encuentra en la fuente vegetal que se ha utilizado para efectuar la extracción. Este contenido es significativamente superior al de la fuente vegetal deshidratada. El extracto vegetal puede estar en forma sólida, en cuyo caso es denominado extracto vegetal seco, o extracto seco; o bien puede estar en forma líquida, y se denomina extracto vegetal líquido, o extracto líquido.
Así mismo, el alquenilglucosinolato puede obtenerse habitualmente de forma comercial tanto en forma de extracto como en forma sustancialmente pura.
En una realización preferida de la invención, el alquenilglucosinolato está en forma de una fuente vegetal deshidratada o como extracto vegetal seco, o como mezcla de los anteriores.
El alquenilglucosinolato puede obtenerse, bien como componente en la fuente vegetal deshidratada y molida, o bien como extracto vegetal, a partir de diferentes especies vegetales, mayoritariamente cruciferas. El alquenilglucosinolato, en general, se puede obtener a partir de las partes aéreas de los vegetales (semillas, flores, hojas, tallos,...) y de las partes subterráneas (raíces).
El alquenilglucosinolato en forma de una fuente vegetal deshidratada, puede preparase, por ejemplo, a partir de las hojas del vegetal. Para ello se parte preferiblemente de la planta recién recolectada, sin trocear, para evitar el contacto entre el glucosinolato y la enzima mirosinasa presente también en la planta, lo cual puede desencadenar la hidrólisis de aquél. En una primera etapa la planta es lavada con agua clorada. Tras una etapa de aclarado se procede a la deshidratacion del vegetal, por ejemplo en un horno de secado, a una temperatura no superior a los 45 5 C. Dichas condiciones se acostumbran a mantener hasta que el contenido de agua residual del producto alcanza un valor inferior o igual al 10%. En este momento ya se puede proceder al troceado y molido de la planta, sin que se produzcan reacciones de degradación. Alternativamente, puede precederse previamente a la desactivación de la enzima mirosinasa, por ejemplo, mediante un tratamiento térmico, lo que permite efectuar la deshidratacion directamente sobre la planta troceada, con lo que se acelera el proceso de secado.
En caso de prepararse el alquenilglucosinolato en forma de una fuente vegetal deshidratada a partir de semillas o raíces, el procedimiento es sustancialmente análogo al descrito para las hojas, adaptado convenientemente, según sabrá reconocer el experto en la materia. Así, por ejemplo, para el caso de semillas no será necesaria la etapa del troceado, y el proceso de deshidratacion habitualmente será más breve, puesto que las semillas contienen normalmente un porcentaje de agua menor que las hojas. El molido de la planta puede hacerse, preferiblemente, mediante un sistema de criogenización en el que previamente se ultracongela la planta con nitrógeno líquido o anhídrido carbónico líquido. De esta forma se evita el deterioro de componentes activos termolábiles. Por ejemplo, puede utilizarse un molinillo de la marca IKA ® . Preferiblemente, el producto obtenido tiene un tamaño de partícula inferior a 325 mieras, y más preferiblemente comprendido entre 100 y 200 mieras.
Para preparar el alquenilglucosinolato de la invención en forma de extracto vegetal, puede realizarse una extracción del mismo a partir de la fuente vegetal deshidratada utilizando un disolvente orgánico, preferiblemente con una mezcla de etanol y agua, con al menos el 50% de etanol.
El proceso de extracción puede llevarse a cabo según cualquier método conocido por el experto en la materia como, por ejemplo, extracción Soxhlet o maceración. En el caso de la maceración, posteriormente se retira el residuo sólido, y se procede al filtrado del líquido que contiene el extracto, preferiblemente, a través de una malla de 80 mieras. A continuación el líquido filtrado es concentrado por calentamiento a una temperatura inferior a 45 5 C. El extracto vegetal líquido obtenido puede utilizarse para la preparación de formulaciones líquidas. Alternativamente, puede obtenerse un extracto vegetal seco a partir del extracto vegetal líquido, por ejemplo, por un proceso de atomización a una temperatura no superior a los 80 5 C, por secado en horno de vacío o por liofilización, obteniéndose un polvo fino homogéneo que es parcialmente soluble en agua.
Según estos procedimientos, la sinigrina puede obtenerse como fuente vegetal deshidratada o como extracto vegetal a partir de las hojas del rompepiedras (Lepidium latifolium) y otras especies de Lepidium, semillas de Lepidium sativum, las coles de Bruselas (Brassica olerácea var. gemmifera), col de Saboya (Brassica olerácea L. convar. capitata), la hierba del ajo (Miaría officinalis), o de las semillas de mostaza negra o ajenabe (Brassica nigra), entre otras.
En una realización preferida de la invención, la sinigrina está en forma de extracto vegetal seco de Lepidium latifolium, o bien como extracto vegetal seco de Brassica olerácea var. gemmifera, o bien en forma de hoja de Lepidium latifolium deshidratada y molida, o sus mezclas. El extracto vegetal seco de Lepidium latifolium contiene sinigrina en una proporción en peso generalmente comprendida entre el 8% y el 12%; el extracto vegetal seco de Brassica olerácea var. gemmifera contiene sinigrina en una proporción en peso generalmente comprendida entre el 4% y el 6%, y la hoja de Lepidium latifolium deshidratada contiene sinigrina en una proporción en peso generalmente comprendida entre el 1 % y el 2%. Según un procedimiento análogo, la gluconapina puede obtenerse como fuente vegetal deshidratada o como extracto vegetal a partir de diversas especies vegetales, por ejemplo, las coles de Bruselas (Brassica olerácea var. gemmifera), la col china (Brassica campestris var. chinensis), el nabo (Brassica rapa var. rapa), el nabo silvestre (Brassica rapa var. nipposinicá), la colza (Brassica napus), o la col lombarda (Brassica olerácea var. capitata f. rubra), entre otras.
Análogamente, la glucobrasicanapina puede obtenerse, por ejemplo, a partir de la col china (Brassica campestris var. chinensis), el nabo (Brassica rapa var. rapa), el nabo silvestre (Brassica rapa var. nipposinicá), o la colza (Brassica napus), entre otras.
Alternativamente, el alquenilglucosinolato que forma parte de la presente invención puede obtenerse en forma pura por síntesis química. Así, la sinigrina, puede obtenerse por síntesis química, por ejemplo, según el procedimiento descrito en el artículo Kjaer et al., Synthesis of the 3-butenylglucosinolate ion, Acta Chem. Scand. 1968, 22, 3324-3344.
El alquenilglucosinolato frecuentemente puede obtenerse también en forma comercial, por ejemplo la sinigrina puede obtenerse de Sigma Aldrich, la gluconapina puede obtenerse de la empresa ChromaDex y la glucobrasicanapina puede obtenerse de Simagchem Corporation.
La composición de la presente invención contiene una cantidad de alquenilglucosinolato comprendida entre 1 mg y 1000 mg, preferiblemente comprendida entre 50 mg y 500 mg, y más preferiblemente entre 100 mg y 300 mg.
En una realización preferida de la invención, la composición contiene sinigrina en una cantidad comprendida entre 1 mg y 1000 mg, preferiblemente comprendida entre 50 mg y 500 mg, más preferiblemente comprendida entre 100 y 300 mg.
La mirosinasa
La enzima mirosinasa, también denominada tioglucosidasa, permite la hidrólisis de los glucosinolatos a diferentes derivados (isotiocianatos, tiocianatos, nitrilos y epitionitrilos, principalmente) en función del tipo de glucosinolato y de las condiciones en las que se efectúa la hidrólisis.
La mirosinasa está presente en una gran variedad de fuentes de la naturaleza, tal como se describe, por ejemplo, en el artículo Bones et al., The myrosinase-glucosinolate system, its organisation and biochemistry, 1996, 97, 194- 208. Habitualmente se encuentra en las mismas especies vegetales en las que se hallan los glucosinolatos, prácticamente en todas las especies de la familia de las cruciferas, así como en otras familias tales como Akaniaceae, Bataceae, Capparaceae, Carícaceae, Euphorbiaceae, Gyrostemonaceae, Limnanthaceae, Moringaceae, Pentadiplandraceae, Resedaceae, Salvadoraceae, Tovariaceae y Tropaeolaceae, entre otras. También se encuentra en algunos hongos (Aspergillus niger o Aspergillus sydowi), en bacterias (Enterobacter cloacae o Paracolobactrum aerogenoides), y también en algunos insectos de la familia de los Aphidoidea (como Brevicoryne brassicae y Lipaphis erísimi), o en la larva de la mariposa de la col (Pierís brassicaé).
La mirosinasa puede obtenerse a partir de cualquiera de dichas fuentes en las que se encuentra en la naturaleza.
En la composición de la presente invención la mirosinasa puede emplearse en forma pura o como fuente vegetal deshidratada.
En una realización preferida de la invención, la mirosinasa está en forma de una fuente vegetal deshidratada, preferiblemente obtenida a partir de vegetales de la familia de las cruciferas, más preferiblemente de hojas de Lepidium latifolium, hojas de Brassica campestris L, u hojas de Brassica napus L; semillas de Sinapis alba, o semillas de Lepidium sativum; o mezclas de los anteriores. En una realización más preferida, la mirosinasa está en forma de semillas de Lepidium sativum deshidratadas y molidas, o de hojas de Lepidium latifolium deshidratadas y molidas.
Dichas fuentes vegetales deshidratadas pueden prepararse, por ejemplo, por un proceso que comprende la deshidratación de la planta recién recolectada, sin trocear y posterior molido, según un procedimiento análogo al descrito para el alquenilglucosinolato. En este caso, obviamente, no es aplicable la alternativa de desactivar la mirosinasa para poder trocear la planta hidratada.
Así mismo, la mirosinasa puede obtenerse comercialmente en forma pura, obtenida a partir de extractos de origen vegetal, como por ejemplo la suministrada por la empresa Sigma-Aldrich a partir de extractos de Sinapis alba.
La composición de la presente invención contiene preferiblemente mirosinasa en una proporción comprendida entre 0,1 y 2 Ul (unidades internacionales de actividad enzimática), por cada 0,025 milimoles de alquenilglucosinolato presente en la composición (correspondientes, por ejemplo, a 10 mg para el caso de la sinigrina).
Una Unidad Internacional de mirosinasa puede definirse como la cantidad de dicha enzima que libera 1 μηιοΙ de glucosa por minuto a partir de la sinigrina a pH 6 y a 25 5 C tal como se describe por ejemplo en la página web de la compañía Sigma-Aldrich en la información correspondiente a la mirosinasa, o también como la cantidad de enzima que forma 1 μηιοΙ de glucosa por minuto a partir de la sinigrina a pH 7,6 y a 23 5 C, tal como se describe en el artículo de Van Eylen et al., Temperature and pressure stability of mustard seed (Sinapis alba L.) myrosinase, Food Chem., 2006, 97, 263-271 .
La proteína epitioespecífica
La presencia de la proteína epitioespecífica (ESP) es necesaria para que se formen epitionitrilos a partir de la hidrólisis de los alquenilglucosinolatos, puesto que en su ausencia se forman preferentemente otros productos de degradación, principalmente nitrilos, isotiocianatos y tiocianatos.
La proteína epitioespecífica está presente en muchos vegetales de la familia de las Brassicaceae, y fue aislada por primera vez a partir de semillas de Crambe abyssinica, como se describe en el artículo H. L. ookey, Crambe thioglucoside gluccohydrolase (EC 3.2.3. 1): Separation of a protein required for epithiobutane formation, Can. J. Biochem., 1973, 23, 51 1 -525.
En la composición de la presente invención, la proteína epitioespecífica puede estar contenida en una fuente vegetal deshidratada, o bien puede emplearse en forma pura.
En una realización preferida de la invención, la proteína epitioespecífica está en forma de una fuente vegetal deshidratada. Esta fuente vegetal deshidratada puede obtenerse, por ejemplo, según un proceso de deshidratación de la planta recién recolectada, sin trocear, y posterior molido, según un procedimiento análogo al descrito para el alquenilglucosinolato.
Según este procedimiento, la proteína epitioespecífica puede obtenerse, por ejemplo, a partir de Crambe abyssinica, Alyssum perenne, Alyssum saxatile, Arabidopsis thaliana, Berteroa incana, Brassica chinensis, Brassica júncea, Brassica napus, Brassica olerácea, Brassica rapa, Cakile marítima, Cardamine pratensis, Hirchfeldia incana, Lepidium latifolium, Lepidum sativum, Lubularia marítima, Sisymbrium altissimum y Turritis glabra, entre otras.
En una realización preferida de la invención, la proteína epitioespecífica está en forma de una fuente vegetal deshidratada y molida obtenida a partir de hojas de Lepidium latifolium, hojas de Brassica olerácea var. Gemmifera, semillas de Lepidium sativum, o como mezcla de las anteriores. En una realización más preferida, la proteína epitioespecífica está en forma de hojas de Lepidium latifolium deshidratadas. Dichas hojas deshidratadas contienen proteína epitioespecífica en una proporción en peso generalmente comprendida entre 0,001 % y 0,2 %.
La cuantificación de la proteína epitioespecífica puede llevarse a cabo, por ejemplo, por electroforesis según se describe en el artículo de Hooi et al., Purífication and characterization of epithioespecifier protein from Brassica napus: enzymic intramolecular sulphur adittion within alkenyl thiohydroximates derived from alkenyl glucosynolate hydrolysis, FEBS Letters, 2000, 468, 243-246.
La composición de la presente invención contiene preferiblemente proteína epitioespecífica en una proporción comprendida entre 0,01 mg y 1 mg por cada 0,025 milimoles de alquenilglucosinolato presente en la composición, preferiblemente comprendida entre 0,05 mg y 0,5 mg.
En las composiciones de la invención, el alquenilglucosinolato está preferiblemente en forma de una fuente vegetal deshidratada o como extracto vegetal seco, o como mezclas de los anteriores, y la mirosinasa y la proteína epitioespecífica están en forma de una fuente vegetal deshidratada.
En una realización de la invención, las composiciones comprenden una fuente vegetal deshidratada que contiene simultáneamente al menos dos de los ingredientes elegidos entre el glucosinolato, la proteína epitioespecífica y la mirosinasa. Preferiblemente en la composición de la invención se emplea hoja deshidratada de Lepidium latifolium que contiene simultáneamente sinigrina, mirosinasa y proteína epitioespecífica.
En otra realización, la composición de la invención comprende semilla deshidratada de Lepidium sativum que contiene simultáneamente mirosinasa y proteína epitioespecífica.
Sal de hierro (II)
La composición de la invención contiene una sal de hierro (II) farmacéuticamente aceptable. Preferiblemente, la sal de hierro (II) se elige entre el grupo formado por ascorbato, lactato, gluconato, glutamato, sulfato, cualquiera de sus formas hidratadas, y mezclas de las mismas. Todas estas sales son productos comerciales fácilmente asequibles.
En una realización preferida de la invención, la sal de hierro (II) se elige entre sulfato ferroso pentahidratado y fumarato ferroso. La composición de la presente invención contiene preferiblemente la sal de hierro (II) en una proporción comprendida entre 0,1 y 1 micromoles por cada 0,025 milimoles de alquenilglucosinolato, más preferiblemente entre 0,25 y 0,75 micromoles. Ácido ascórbico
Opcionalmente, las composiciones de la invención contienen ácido ascórbico, o vitamina C, que es un compuesto que se encuentra ampliamente distribuido en la mayoría de frutas y verduras frescas, por ejemplo, en los cítricos, manzana, piña, pimientos, o espinacas, entre otros muchos. El ácido ascórbico puede emplearse como tal, o bien como una sal dietéticamente aceptable, por ejemplo como ascorbato de sodio, potasio o calcio.
El ácido ascórbico puede así mismo obtenerse por síntesis química, por ejemplo según el procedimiento descrito en el artículo Reichstein et al., Helv. Chim. Acta, 1933, 16, 561 , 1019. El ácido ascórbico puede obtenerse comercialmente a través de diversos suministradores, por ejemplo, a través de la empresa Sigma- Aldrich.
En una realización de la presente invención, la composición contiene preferiblemente ácido ascórbico en una proporción comprendida entre 0,1 mg y 5 mg por cada 0,025 milimoles de alquenilglucosinolato.
El ácido ascórbico también puede estar en una proporción superior a la mencionada ya que puede ser empleado como agente antioxidante en la composición.
Procedimiento de preparación de la composición
Forma también parte de la presente invención un procedimiento para la preparación de la composición de alquenilglucosinolato.
El procedimiento de la invención comprende:
a) mezclar el alquenilglucosinolato de fórmula (I) en donde R es un grupo alquenilo con un doble enlace terminal, la mirosinasa, la proteína epitioespecífica y, opcionalmente, al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable para obtener una mezcla sólida que presenta un contenido en agua inferior al 10%, y
b1 ) para preparar una composición sólida:
i. añadir a la mezcla obtenida en la etapa a) una sal de hierro (II) farmacéuticamente aceptable y opcionalmente ácido ascórbico, y ¡i. acondicionar la mezcla resultante en forma de comprimidos, cápsulas, o polvo dispersable en sobres; o b2) para preparar una composición mixta con una parte sólida y una parte líquida:
i. depositar la mezcla obtenida en la etapa a) en un tapón que incluye un alojamiento para sólidos,
¡i. preparar una solución acuosa que comprende una sal de hierro (II) farmacéuticamente aceptable, opcionalmente ácido ascórbico, opcionalmente mirosinasa o alquenilglucosinolato, y opcionalmente al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable,
i¡¡. introducir la solución acuosa obtenida en la etapa ii) en un vial, y taparlo con el tapón resultante de la etapa i)
En una realización preferida, el alquenilglucosinolato, la mirosinasa y la proteína epitioespecífica se incorporan en forma de una fuente vegetal deshidratada, o como mezcla de una fuente vegetal deshidratada y un extracto vegetal seco.
Preferiblemente el alquenilglucosinolato es sinigrina.
La sinigrina se incorpora a la composición preferiblemente en forma de extracto vegetal seco de Lepidium latifolium, o bien como extracto vegetal seco de Brassica olerácea var. gemmifera, o bien en forma de hoja de Lepidium latifolium deshidratada y molida, o sus mezclas.
La mirosinasa se incorpora a la composición preferiblemente en forma de una fuente vegetal seca procedente de semillas de Lepidium sativum o de hojas de Lepidium latifolium deshidratadas y posteriormente molidas. Alternativamente la mirosinasa se puede incorporar en forma pura.
La proteína epitioespecífica se incorpora a la composición preferiblemente en forma de una fuente vegetal seca procedente de hojas de Lepidium latifolium, hojas de Brassica olerácea var. Gemmifera, semillas de Lepidium sativum deshidratadas y posteriormente molidas.
Para la preparación de las composiciones de la invención, según cualquier forma farmacéutica adecuada, pueden seguirse los procedimientos que son bien conocidos para el experto en tecnología farmacéutica, como se describe, por ejemplo, en el libro M. E. Aulton, Farmacia. La ciencia del diseño de las formas farmacéuticas, segunda edición, Elsevier, Madrid, 2004.
Ensayo de formación de epitionitrilos
La finalidad de las composiciones de la presente invención es que, tras su ingestión, se produzca la hidrólisis del alquenilglucosinolato, formándose en el organismo su correspondiente epitionitrilo, de efecto detoxificante, según se representa en el Esquema 1 :
ESQUEMA 1
alquenilglucosinolato epitionitrilo
Según este esquema, la hidrólisis de la sinigrina (n= 1 , R'=H) da lugar al 1 -ciano-2,3-epitiopropano o CETP, la hidrólisis de la gluconapina (n=2, R'=H) da lugar al 1 -ciano-3,4-epitiobutano o CETB, y la hidrólisis de la glucobrasicanapina (n=3, R'=H) da lugar al 1 -ciano-4,5-epitiopentano o CETPent.
Para verificar la formación de los epitionitrilos tras la ingestión de dichas composiciones se puede emplear, por ejemplo, un ensayo en el que se simulan las condiciones fisiológicas del estómago humano en presencia de alimentos con un valor de pH aproximadamente 2. En dichas condiciones se pueden ensayar las composiciones de la invención y determinar analíticamente las cantidades formadas de epitionitrilos.
A efectos comparativos, también se pueden ensayar las composiciones de la invención en condiciones de pH 7.
Los productos de hidrólisis del alquenilglucosinolato sinigrina que se pueden formar se muestran en el Esquema 2:
E EMA 2
Cianuro de alilo A partir del análisis de los resultados obtenidos en este ensayo, que se muestran detalladamente en el Ejemplo 20, los autores observaron que, sorprendentemente, las composiciones de la presente invención experimentan una conversión superior al 60% del alquenilglucosinolato mayoritariamente en su epitionitrilo correspondiente cuando se someten a unas condiciones que simulan las condiciones fisiológicas en el estómago. Dicha conversión se ve drásticamente disminuida si se altera el pH, o si las composiciones carecen de mirosinasa o de proteína epitioespecífica.
También de forma sorprendente, los autores constataron que las composiciones de la invención presentan una alta estabilidad incluso en condiciones de estabilidad acelerada, tal como se demuestra en los estudios de estabilidad del Ejemplo 23.
Ensayo de la actividad detoxificante
La actividad detoxificante de las composiciones de la invención se puede valorar, por ejemplo, según un modelo in vitro basado en medir su capacidad para inducir la enzima NADPH quinona oxidoreductasa, o quinona reductasa (QR). La quinona reductasa es una conocida enzima de detoxificación de fase II, que cataliza reducciones obligatorias de dos electrones dependientes de NAD(P)H y protege a las células contra los efectos tóxicos y neoplásicos de los radicales libres y especies reactivas de oxígeno que se originan en las reducciones de un electrón. La determinación del grado de inducción de la QR se ha usado para aislar agentes anticancerígenos y para diseñar quimioprotectores, tal como se describe en el artículo Eun-Sun Hwang et ai, Effects of Different Processing Methods on Induction of Quinone Reducíase by Dietary Broccoli in Ftats, J. Med. Food., 2004, 7 (1 ), 95-99.
Para determinar la capacidad de inducción de la QR de las composiciones de la invención, se puede utilizar una línea celular de hepatoma de ratón Hepa 1 c1 c7, que expresa QR. En este ensayo se determina la reducción experimentada por el tinte de tetrazolio asociado a menadiona, según el método descrito, por ejemplo, en las publicaciones de Prochaska et al., Direct measurement of NAD(P)H: quinone reducíase from cells cultured in microíiíer wells: a screening assay for aníicarcinogenic enzyme inducers, Anal. Biochem, 1988, 169, 328-336 y Rapid deíecíion of inducers of enzymes íhaí proíecí againsí carcinogens, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 1992, 89, 2394-2398. A efectos comparativos, también se puede realizar el ensayo con un inductor de la quinona reductasa bien conocido como es el sulforafano, el isotiocianato activo derivado de la hidrólisis del glucosinolato glucorafanina. Los resultados de este ensayo se presentan en el Ejemplo 21 , y ponen de manifiesto que las composiciones de la invención poseen una actividad detoxificante significativa, comparable con la del sulforafano, que es un reconocido agente detoxificante.
Ensayo de toxicidad
La toxicidad de las composiciones de la invención se puede determinar, por ejemplo, mediante el empleo de un Kit de Proliferación Celular XTT (suministrado por la empresa Roche). Este ensayo está basado en la reducción de la sal sódica de 2,3-bis(2-metoxi-4-nitro-5-sulfofenil)-2H-tetrazolio-5-carbo xanilida (XTT), para formar el tinte formazán anaranjado, conversión que sólo puede ser llevada a cabo por las células metabólicamente activas.
Los resultados del ensayo de toxicidad se muestran en el Ejemplo 22, y ponen de manifiesto que los compuestos de la invención muestran ausencia de citotoxicidad en este ensayo, con unos resultados comparables a los del sulforafano, que se tomó como referencia.
Uso de la composición
Los autores comprobaron que la composición de la invención presenta una actividad detoxificante significativa, según se observa en el Ejemplo 21 .
Se ha observado que las composiciones de la invención son capaces de inducir la enzima quinona reductasa (QR) en un grado comparable al sulforafano. Dicha enzima protege las células contra los efectos tóxicos y neoplásicos de los radicales libres y especies reactivas de oxígeno. La QR activa también importantes quinonas quimioterapéuticas tales como mitomicinas y aziridilbenzoquinonas.
Así mismo, dicha composición se comporta de forma óptima en el ensayo de toxicidad, según los resultados obtenidos en el Ejemplo 22.
Es por ello que también forma parte del objeto de la presente invención una composición que comprende un alquenilglucosinolato de fórmula (I), en donde R es un grupo alquenilo C 3 -C 10 con un doble enlace terminal, mirosinasa, proteína epitioespecífica y una sal de hierro (II) farmacéuticamente aceptable para su uso como detoxificante frente a agentes cancerígenos, tales como compuestos con una estructura química poco frecuente en la naturaleza (xenobioticos). En el contexto de la invención se entiende por detoxificante un compuesto quimioprotector frente a agentes cancerígenos, es decir, un compuesto efectivo para reducir la susceptibilidad de los mamíferos a los efectos tóxicos y neoplásicos de los agentes carcinogénicos. Los ejemplos que siguen a continuación sirven para ilustrar la invención si bien no deben considerarse limitantes de la misma
Ejemplos
Ejemplo 1 : Preparación de comprimidos
Se prepararon comprimidos utilizando los ingredientes que se indican en la Tabla 1 :
TABLA 1
*Contiene sinigrina
** Contiene sinigrina, mirosinasa y ESP
Para preparar los comprimidos, se pesaron los ingredientes, se pasaron por un tamiz de 325 mieras y se introdujeron todos ellos, excepto el estearato, en un bombo volteador para su mezclado. Tras homogeneizacion se añadió el estearato y se continuó el proceso de mezclado durante un tiempo no superior a 5 minutos. A continuación, se prepararon los comprimidos utilizando una máquina de comprimir, aplicando una presión entre 1 ,5 y 3 Tm/cm 2 .
Se comprobó que los comprimidos se disolvían en menos de 10 minutos, según el test de disolución que figura en la Farmacopea Europea.
Ejemplos 2-7: Preparación de comprimidos Siguiendo un procedimiento análogo al descrito en el Ejemplo 1 , se prepararon otras formulaciones también en forma de comprimidos, utilizando las composiciones que se detallan en la Tabla 2:
TABLA 2
Ejemplo n 5
Componente 2 3 4 5 6 7
Cantidad por comprimido (mg)
Extracto seco de
Brassica olerácea var: 300 326 - - - - gemmifera*
Extracto seco de
- - 326 - - 176 Lepidium latifolium*
Hoja de Lepidium
latifolium 300 - - 626 599 38 deshidratada **
Semilla de Lepidium
sativum - 300 300 - - - deshidratada ***
Mirosinasa pura - - - - 1 -
Sulfato ferroso
70 - - - 70 70 pentahidratado
Fumarato ferroso - 43,75 43,75 43,75 - -
Ácido ascórbico molido 80 80 80 80 80 80
Avicel pH 105 230 230 - - 230 230
Almidón de arroz - - 230 230 - -
Croscarmelosa sódica 10 10 10 10 10 10
Estearato de magnesio 10 10 - - 10 10 Estearato de calcio - - 10 10 - -
Total: 1000 999,75 999,75 999,75 1000 614
* Contiene sinigrina
** Contiene sinigrina, mirosinasa, y ESP
* ** Contiene sinigrina, mirosinasa, y ESP
Ejemplo 8: Preparación de cápsulas
Para preparar las cápsulas, se mezclaron los ingredientes que se indican en la Tabla 3, y con dicha mezcla se llenaron cápsulas de celulosa, utilizado una máquina encapsuladora:
TABLA 3
* Contiene sinigrina
** Contiene sinigrina, mirosinasa y ESP
Ejemplos 9-12: Preparación de cápsulas
Siguiendo un procedimiento análogo al descrito para el Ejemplo 8, se prepararon otras formulaciones en forma de cápsulas, utilizando cápsulas de gelatina en lugar de celulosa, y llenándolas con las composiciones que se detallan en la Tabla 4:
TABLA 4
Componente Ejemplo n 5
9 10 1 1 12 Cantidad por cápsula (mg)
Extracto seco de Brassica olerácea van
200 - - - gemmifera*
Extracto seco de Lepidium latifolium* - - - 176
Hoja de Lepidium latifolium 38
200 400 399
deshidratada **
Mirosinasa pura - - 1 -
Sulfato ferroso pentahidratado 47 47 47 70
Ácido ascórbico molido 53 53 53 80
Total: 500 500 500 364
* Contiene sinigrina
** Contiene sinigrina, mirosinasa y ESP
Ejemplo 13: Preparación de una formulación en polvo dispersable
Se procedió a la molienda, por separado, de cada uno de los componentes de la composición, empleando las cantidades especificadas en la Tabla 5, y tras su cribado por una malla de 325 mieras, se mezclaron en un dispositivo de mezclado de sólidos. El producto en polvo se introdujo en una envasadora de sólidos para dosificar en un envase susceptible de añadirle un volumen determinado de agua, aproximadamente comprendido entre 25 mi y 100 mi y, tras su agitación, proceder inmediatamente a la ingestión de la dispersión preparada
TABLA 5
Componente Cantidad por sobre (mg)
Extracto seco de Lepidium latifolium * 200
Hoja de Lepidium latifolium deshidratada ** 200
Sulfato ferroso pentahidratado 47
Sacarosa 5000
Aroma de limón en polvo 200 Ácido ascórbico molido 53
Total: 5700
* Contiene sinigrina
** Contiene sinigrina, mirosinasa y ESP
Ejemplos 14 y 15: Preparación de formulaciones en polvo dispersable
Siguiendo un procedimiento análogo al descrito para el Ejemplo 13, se prepararon así mismo las composiciones de los Ejemplos 14 y 15, también en forma de formulación en polvo dispersable, utilizando los componentes y cantidades que se muestran en la Tabla 6:
TABLA 6
* Contiene sinigrina
** Contiene sinigrina, mirosinasa y ESP Ejemplo 16: Preparación de una formulación mixta formada por una parte líquida y una parte sólida
La composición se elaboró a partir de los componentes y cantidades que se muestran en la Tabla 7: TABLA 7
* Contiene sinigrina, mirosinasa y ESP
Se procedió al mezclado de los componentes activos de la parte líquida y a su disolución con agua; esta mezcla se pasteurizo a través de un intercambiador de placas a una temperatura de 85 5 C durante 3 segundos, después se sometió a un enfriado rápido a 10 5 C, y seguidamente se procedió al llenado en zona aséptica de los viales previamente esterilizados, los cuales fueron inmediatamente cerrados con un tapón diseñado para contener la parte sólida del producto. Tras el llenado del producto en polvo, que previamente había sido mezclado y homogeneizado, se tapó todo el conjunto con una tapa provista de un percutor afilado que permite romper el tapón de la parte sólida en polvo para que ésta caiga sobre la parte líquida y proceder a su mezcla por agitación, previamente a su ingestión. Ejemplos 17-19: Preparación de formulaciones mixtas formadas por una parte líquida v una parte sólida
Se prepararon según un procedimiento similar al descrito en el Ejemplo 16, según las composiciones que se muestran en la Tabla 8: TABLA 8
* Contiene sinigrina
** Contiene sinigrina, mirosinasa y ESP
Ejemplos de Referencia 1 a 3
El Ejemplo de Referencia 1 (comprimido) se preparó siguiendo un procedimiento análogo al del Ejemplo 7, pero eliminando de la composición la hoja deshidratada de Lepidium latifolium, de manera que el comprimido de referencia no contenía mirosinasa, ni proteína epitioespecífica.
El Ejemplo de Referencia 2 (cápsula) se preparó siguiendo un procedimiento análogo al del Ejemplo 12 pero eliminando de la composición la hoja deshidratada de Lepidium latifolium, de manera que la cápsula de referencia no contenía mirosinasa, ni proteína epitioespecífica.
El Ejemplo de Referencia 3 (formulación mixta sólido-líquido), se preparó siguiendo un procedimiento análogo al del Ejemplo 19 pero eliminando de la composición la hoja deshidratada de Lepidium latifolium, de manera que la formulación mixta sólido-líquido de referencia no contenía mirosinasa, ni proteína epitioespecífica.
Ejemplos de Referencia 4 a 6
El Ejemplo de Referencia 4 (comprimido) se preparó siguiendo un procedimiento análogo al del Ejemplo 7, pero eliminando de la composición la hoja deshidratada de Lepidium latifolium, y sustituyéndola por 2 Ul de enzima mirosinasa pura proveniente de Sinapis alba (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA), de manera que dichas composiciones no contenían proteína epitioespecífica.
El Ejemplo de Referencia 5 (cápsula) se preparó siguiendo un procedimiento análogo al del Ejemplo 12, pero eliminando de la composición la hoja deshidratada de Lepidium latifolium, y sustituyéndola por 2 Ul de enzima mirosinasa pura proveniente de Sinapis alba (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA), de manera que dichas composiciones no contenían proteína epitioespecífica.
El Ejemplo de Referencia 6 (formulación mixta sólido-líquido), se preparó siguiendo un procedimiento análogo al del Ejemplo 19, pero eliminando de la composición la hoja deshidratada de Lepidium latifolium, y sustituyéndola por 2 Ul de enzima mirosinasa pura proveniente de Sinapis alba (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA), de manera que dichas composiciones no contenían proteína epitioespecífica.
Ejemplo 20: Ensayo de formación de epitionitrilos
La formación de epitionitrilos se verificó mediante un ensayo en el que se simularon las condiciones fisiológicas del estómago humano en presencia de alimentos y bajo las que se ensayaron las composiciones de la invención, cuantificando analíticamente la formación de los epitionitrilos.
Para cada ensayo, se introdujeron en sendas bolsas de plástico con cierre tipo zip los siguientes componentes: 50 mi de solución de pepsina, 50 mi de solución de HCI y 50 g de clara de huevo cocida. La solución de pepsina se preparó inmediatamente antes de cada uso, disolviendo 1 g de pepsina en 200 mi de agua destilada. La solución de ácido clorhídrico se preparó disolviendo 4 mi de ácido clorhídrico concentrado en 250 mi de agua destilada. De este modo, el pH de la mezcla era aproximadamente 2, reproduciéndose así las condiciones fisiológicas del estómago.
A efectos comparativos, se ensayaron también las composiciones de la invención en condiciones de pH 7, para lo cual se siguió el mismo procedimiento descrito anteriormente, pero sin añadir solución de HCI en las bolsas de plástico, es decir, éstas contenían únicamente 50 mi de solución de pepsina y 50 mi de clara de huevo cocida.
Cada composición a ensayar se introdujo en una bolsa con esta mezcla. A continuación, se introdujo la bolsa durante 2 minutos en un dispositivo homogeneizador "Masticator basic" (IUL Instruments, Barcelona, España) que dispone de un dispositivo de palas y rodillos que emula el proceso de trituración propia del masticado. Seguidamente, la bolsa se depositó en un baño a 37 5 C, para simular la temperatura corporal humana. Tras 120 minutos de incubación se procedió a recuperar el contenido de la bolsa y a su extracción mediante tres lavados con 100 mi de diclorometano. Tras centrifugación y secado con sulfato sódico anhidro, se inyectó una muestra en un cromatógrafo de gases para cuantificar los productos de la hidrólisis del alquenilglucosinolato. Cada composición se ensayó por triplicado, y se calculó el valor promedio de los resultados.
Se ensayaron las composiciones de los Ejemplos 7, 12 y 19, correspondientes a un comprimido, una cápsula y una formulación mixta sólido-líquido, respectivamente.
Las tres composiciones se habían formulado de manera que todas ellas contenían 10 mg de sinigrina, que se cuantificó por cromatografía HPLC, y todas contenían iguales cantidades de mirosinasa y también de proteína epitioespecífica. Dichas composiciones se ensayaron a pH 2 y a pH 7.
También se ensayaron los Ejemplos de Referencia 1 , 2 y 3, que carecían de la enzima mirosinasa y la proteína epitioespecífica, y los Ejemplos de Referencia 4, 5 y 6 que carecían de la proteína epitioespecífica.
Las tablas que se incluyen a continuación muestran los resultados del análisis de los productos resultantes de la hidrólisis, donde las cantidades se refieren a mg de producto. Para valorar la tasa de conversión a epitionitrilo en cada caso, se calculó (última fila de cada tabla), la relación entre la cantidad de 1 -ciano-2,3- epitiopropano formado, respecto a la suma de todos los productos de la hidrólisis de sinigrina, incluida, de haberla, la sinigrina que queda sin hidrolizar.
En la Tabla 9 se muestran los resultados del ensayo realizado con las composiciones de los Ejemplos 7, 12 y 19 a pH 2:
TABLA 9
Compuesto Ejemplo 7 Ejemplo 12 Ejemplo 19
1 -ciano-2,3-epitiopropano 3,689 3,512 3,978 cianuro de alilo 2,267 2,198 2,023 alilisotiocianato 0,021 nd * 0,009 sinigrina nd nd nd
% Conversión epitionitrilo 61 ,7% 61 ,5% 66,2%
( * nd = no detectado)
Se puede observar que las composiciones objeto de la presente invención, en unas condiciones que simulan las fisiológicas en el estómago, experimentan una alta tasa de conversión de la sinigrina en su epitionitrilo (1 -ciano- 2,3-epitiopropano), con valores de conversión comprendidos entre el 61 ,5% y el 66,2%.
En la Tabla 10 se muestran los resultados del ensayo realizado con las mismas composiciones, pero a pH 7:
TABLA 10
En este caso puede observarse que, al cambiar el pH a un valor más alcalino en comparación con el pH del estómago, la tasa de conversión a epitionitrilo se ve sensiblemente disminuida, hasta unos valores comprendidos entre el 3,2% y el 9,3%. Se demuestra así que el pH ácido del estómago es un factor determinante para que la hidrólisis de los alquenilglucosinolatos sea dirigida mayoritariamente hacia la formación de epitionitrilos.
En la Tabla 1 1 se muestran los resultados del ensayo realizado a pH 7 con las composiciones que no contenían la enzima mirosinasa y la proteína epitioespecífica, que corresponden a los Ejemplos de Referencia 1 , 2 y 3. TABLA 1 1
Se puede observar que sin la presencia de la enzima mirosinasa, no tiene lugar la hidrólisis del alquenilglucosinolato.
Finalmente, en la Tabla 12 se muestran los resultados del ensayo a pH
2 con las composiciones que no contenían proteína epitioespecífica, que corresponden a los Ejemplos de Referencia 4, 5, y 6
TABLA 12
También en este caso se confirma que la proteína epitioespecífica es imprescindible en las composiciones, puesto que sin ella la tasa de conversión a epitionitrilo se ve muy disminuida, hasta valores de tan solo entre el 0,2% y el 1 ,3%. Ejemplo 21 : Ensayo de la actividad detoxificante La actividad detoxificante de las composiciones de la invención se valoró según un ensayo in vitro basado en medir su capacidad para inducir la enzima quinona reductasa (QR).
En dicho ensayo se utilizó una línea celular de hepatoma de ratón Hepa 1 c1 c7, que expresa QR, determinándose la reducción experimentada por el tinte de tetrazolio asociado a menadiona, según el método descrito, por ejemplo, en las publicaciones de Prochaska et ai, Direct measurement of NAD(P)H: quinone reducíase from cells cultured in microtiter wells: a screening assay for anticarcinogenic enzyme inducers. Anal. Biochem, 1988, 169, 328-336 y Rapid detection of inducers of enzymes that protect against carcinogens. Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 1992, 89, 2394- 2398. Mediante la lectura de la absorbancia, se determina la formación del tinte reducido de tetrazolio azul. Dicha formación resulta lineal durante al menos los 5 primeros minutos, de modo que se toma la lectura a los 5 minutos de iniciada la reacción como la más representativa para cada producto ensayado.
También se determinó la cinética enzimática de la QR durante 15 minutos. A efectos comparativos, se incluyó el ensayo con sulforafano, el isotiocianato activo derivado de la hidrólisis del glucosinolato glucorafanina, que es un conocido inductor de la quinona reductasa.
En dicho ensayo se evaluó un extracto preparado a partir de una composición según la presente invención, que contenía un alquenilglucosinolato, la enzima mirosinasa y la proteína epitioespecífica en forma de hoja de Lepidium latifolium deshidratada y molida, y que se sometió a unas condiciones análogas a las del estómago para permitir la hidrólisis en sus correspondientes epitionitrilos activos.
Para ello se preparó una composición que contenía 200 mg de hoja de Lepidium latifolium deshidratada y molida, 70 mg de sulfato de hierro (II) y 80 mg de ácido ascórbico.
Dicha composición se sometió a hidrólisis a pH ácido, para lo cual se suspendió en 10 mi de agua destilada, se ajustó el pH a 4 con una disolución 0,5 M de HCI y se mantuvo en agitación en un recipiente hermético en un baño a 37 5 C, tras lo cual se centrifugó a 4000 rpm durante 20 minutos. El sobrenadante se filtró por un filtro de 0,22 μηι, se hicieron alícuotas y se congelaron a -20 5 C hasta su uso.
Se efectuó el ensayo del extracto a diferentes concentraciones: 0,03; 0,06; 0,12; 0,25; 0,50; 1 ,00; 2,00; 4,00 y 8,00 mg de Lepidium latifolium deshidratado por mi de disolución.
A efectos comparativos, también se realizó el ensayo con sulforafano, en forma de una disolución en dimetilsulfóxido (DMSO). En este caso el ensayo se efectuó a las siguientes concentraciones micromolares: 0,1 ; 0,3; 0,5; 0,8; 1 ,0; 2,0; 3,0; 4,0 y 5,0.
Para el ensayo, se utilizaron células de hepatoma de ratón Hepa 1 c1 c7 (Colección Europea de Cultivos Celulares, ECACC). Las células se sembraron en placas de 96 pocilios con una densidad de 10.000 células/pocilio en 100 μΙ de MEM (a- Minimum essential médium sin nucleósidos) suplementado con 10% de Suero Fetal Bovino, glutamina 2mM, penicilina 100 U/ml y estreptomicina 100 g ml, y crecidas en un incubador humidificado en 5% C0 2 a 37 5 C (medio de cultivo y suplementos de Gibco Invitrogen, Carlsbad, California USA).
Para realizar el ensayo, el medio de cultivo se eliminó y las células se lisaron mediante incubación a 37 5 C con 50 μΙ de digitonina al 0,08% y EDTA 2 mM, a pH 7,8, con agitación suave durante 30 min. Durante esta incubación, se preparó una solución stock mezclando 16,7 mg de BSA (albúmina sérica bovina), 7,5 mg de 3-(4,5- dimetil-2-tiazolil)-2,5-difenil-2H-bromuro de tetrazolio (MTT), 0,6 mg de NADP, 1 ,25 mi de solución tampón Tris-HCI 0,5 M (pH=7.4), 166,7 μΙ de Tween 20 (polisorbato 20) al 1 ,5%, 166,7 μΙ de solución de glucosa-6-fosfato 150 mM, 16,7 μΙ de solución de FAD (flavin adenin dinucleótido disodio) 7,5 mM, 50 unidades de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa de levadura y agua destilada, hasta un volumen final de 25 mi por placa (reactivos obtenidos de Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri USA). Inmediatamente antes su uso, se añadieron a la solución stock 25 μΙ de solución 50 mM de menadiona en acetonitrilo (también de Sigma-Aldrich). Posteriormente, se dispensaron 200 μΙ de la solución stock completa a cada uno de los pocilios de la placa, con la ayuda de una pipeta multicanal. La placa se colocó en un lector Synergy HT (BioTek, Winooski, Vermont, USA) y se hicieron lecturas a 610 nm, cada 50 segundos durante 15 minutos, tras el inicio del tratamiento.
Se tomaron medidas de la absorbancia para cinco ensayos realizados para cada concentración de los extractos de la invención, tres ensayos con el control de DMSO y de células con medio de cultivo, y un ensayo para cada concentración de sulforafano, calculándose el valor promedio para los casos en que se realizó más de una medida.
La potencia de inducción de la enzima QR se expresó como la proporción de la actividad QR de las células tratadas respecto a la actividad QR de los pocilios control: células con medio de cultivo en el caso de los extractos de la invención, y DMSO en el caso del sulforafano.
En la Tabla 13 se muestran los resultados a los 5 minutos de comenzar la reacción, para el extracto de la invención, a diferentes concentraciones. La concentración está en peso de hoja de Lepidium latifolium deshidratada por mi de disolución. El valor promedio de la absorbancia de las células del medio fue 0,934, de manera que la potencia de inducción se calculó según la relación absorbancia:0,934. Los resultados están representados de forma gráfica en la Figura 1 .
TABLA 13
Se observa un claro efecto dosis-respuesta a lo largo del rango de concentraciones de Lepidium latifolium ensayadas, ya que la potencia de inducción aumenta con la concentración.
En la Tabla 14 se muestran los resultados a los 5 minutos de comenzar la reacción, para la solución de sulforafano en DMSO, a diferentes concentraciones. El valor promedio de la absorbancia del DMSO fue 1 ,253, de manera que la potencia de inducción se calculó en cada caso según la relación absorbancia:1 ,253. Los resultados están representados de forma gráfica en la Figura 2.
TABLA 14 Concentración de sulforafano Absorbancia Potencia de inducción de (μΜ) (Abs) QR (Abs:1 ,253)
0,1 0,839 0,670
0,3 1 ,152 0,919
0,5 1 ,519 1 ,212
0,8 1 ,437 1 ,147
1 ,0 1 ,745 1 ,393
2,0 1 ,807 1 ,442
3,0 1 ,944 1 ,551
4,0 1 ,973 1 ,575
5,0 1 ,861 1 ,485
También en este caso se observa un claro efecto dosis-respuesta a lo largo del rango de concentraciones de sulforafano ensayadas.
Comparando la potencia de inducción de QR de las hojas deshidratadas de Lepidium latifolium con la potencia del sulforafano, se observa que las composiciones de la invención presentan un comportamiento análogo al del sulforafano.
También se realizaron medidas de cinética enzimática de la QR a lo largo de quince minutos. En la Tabla 15 se muestran los valores de la absorbancia obtenidos para las medidas efectuadas cada 50 segundos, durante 15 minutos, para el producto de la invención a la concentración más alta (8 mg/ml de Lepidium latifolium), para el sulforafano también a la concentración más alta (5 μΜ), y también para los controles de células más medio, y DMSO. Los resultados se han representado gráficamente en la Figura 3.
TABLA 15
Absorbancia
Tiempo
(segundos) Composición Control Control
Sulforafano
invención Células+medio DMSO 0 0,458 0,386 0,272 0,168
50 0,761 0,664 0,439 0,286
100 1,023 0,912 0,599 0,389
150 1,292 1,158 0,755 0,488
200 1,550 1,401 0,908 0,582
250 1,799 1,632 1,063 0,679
300 2,040 1,861 1,214 0,772
350 2,277 2,081 1,363 0,870
400 2,500 2,289 1,511 0,964
450 2,721 2,500 1,662 1,058
500 2,924 2,692 1,810 1,149
550 3,130 2,892 1,961 1,244
600 3,282 3,068 2,108 1,339
650 3,470 3,254 2,256 1,434
700 3,533 3,410 2,406 1,527
750 3,724 3,600 2,551 1,621
800 3,764 3,696 2,694 1,716
850 3,962 3,830 2,832 1,813
900 4,020 3,837 2,960 1,910
En los cuatro casos se observa un aumento en la absorbancia a medida que transcurre la reacción, signo de la inducción enzimática. Se observa también que esa inducción enzimática es significativamente menor en los ensayos de control.
Así mismo, cabe destacar que, en las condiciones ensayadas, la inducción enzimática debida al producto de la invención es algo mayor que en el caso del sulforafano. Ejemplo 22: Ensayo de toxicidad
La toxicidad se determinó en placas paralelas tratadas de manera idéntica a las usadas en el ensayo de la enzima quinona reductasa. Después de 48h y 72h de exposición al tratamiento correspondiente, las células fueron tratadas con el Kit de Proliferación Celular XTT (Roche, Basilea, Suiza), de manera que se añadieron 50 μΙ de la mezcla de mareaje XTT a cada pocilio, hasta una concentración final 0,3 mg/ml. La placa fue incubada durante 4h en una atmósfera humidificada, a 37 5 C y con un 5% de C02, y a continuación se midió espectrofotométricamente la absorbancia del formazán producido, a 500 nm en un lector ELISA. La longitud de onda de referencia fue de 700 nm.
Se determinó la citotoxicidad en función de la absorbancia obtenida. Se repitió el ensayo 5 veces para cada concentración de Lepidium latifolium en las composiciones de la invención, 3 veces para los controles DMSO y células más medio de cultivo y 1 para el sulforafano. Para los ensayos con más de una repetición, se tomó el valor medio de la absorbancia.
En la Tabla 16 se muestran los resultados de citotoxicidad de la composición de la invención y se representan en la Figura 4. En este ensayo, el promedio de la absorbancia del control de células+medio fue de 1 ,976. TABLA 16
Concentración de hoja de
L. latifolium deshidratada Absorbancia
(mg/ml)
0,03 2,393
0,06 2,239
0,12 2,189
0,25 2,305
0,50 2,603
1 ,00 2,343
2,00 2,268
4,00 2,569
Se puede observar que los valores de absorbancia se mantienen aproximadamente constantes a lo largo del rango de las nueve concentraciones ensayadas, lo que revela ausencia de citotoxicidad en los tratamientos.
En la Tabla 17 se muestran los resultados del ensayo de citotoxicidad para el sulforafano, que se representan en la Figura 5. El valor promedio de absorbancia del control de DMSO de 2,290.
TABLA 17
También en este caso, se puede observar que los valores de absorbancia se mantienen aproximadamente constantes a lo largo del rango de las nueve concentraciones ensayadas, lo que revela ausencia de citotoxicidad en los tratamientos.
La comparación de los resultados obtenidos con la composición de la invención y con el sulforafano permite concluir que se comportan de forma análoga en cuanto a citotoxicidad. Ejemplo 23: Ensayos de estabilidad
Se diseñaron sendos ensayos para comprobar la estabilidad de la sinigrina, la mirosinasa y la proteína epitioespecífica.
Todos los estudios de estabilidad se realizaron según dos protocolos distintos:
- Estabilidad a tiempo real, donde las muestras se almacenaron a 25 5 C ± 2- C, a una humedad relativa del 60% ± 5%, durante un período de 12 meses, en un vial de PET (polietilen tereftalato) de color topacio. Se tomaron medidas de los parámetros cada 3 meses durante 1 año.
- Estabilidad en condiciones aceleradas, donde las muestras se almacenaron a 40 5 C ± 2- C, a una humedad relativa de 75% ± 5%, durante un período de 6 meses, en un vial de PET de color topacio. Se tomaron medidas cada mes durante 6 meses.
En todos los estudios, cada ensayo se efectuó por triplicado y se calculó el valor promedio.
El estudio de estabilidad de la sinigrina se llevó a cabo mediante la cuantificación de la sinigrina por cromatografía de HPLC, a lo largo del proceso de envejecimiento, a partir de dos fuentes distintas de sinigrina:
- un extracto vegetal líquido concentrado de Lepidium latifolium con un 3,26% de sinigrina, y al que se añadió glicerol como conservante en una cantidad equivalente al 40% del volumen del extracto;
- mezcla al 50% en peso de hoja deshidratada de Lepidium latifolium en polvo y extracto vegetal seco de Lepidium latifolium con un contenido total en sinigrina del 6,87%
- En la Tabla 18 se muestran los resultados de los estudios de estabilidad de sinigrina a tiempo real, mientras que la Tabla 19 muestra los estudios de estabilidad de sinigrina en condiciones aceleradas.
TABLA 18
Mezcla 1 :1 extracto seco/planta
Extracto líquido concentrado de
deshidratada de Lepidium Lepidium latifolium
latifolium
Tiempo Sinigrina Sinigrina
(meses) (mg) (mg)
0 10,02 10,124 3 9,814 9,997
6 9,756 9,912
9 9,512 9,823
12 9,367 9,689
TABLA 19
Mezcla 1 :1 extracto seco/planta
Extracto líquido concentrado de
deshidratada de Lepidium
Lepidium latifolium
latifolium
Tiempo Sinigrina Sinigrina
(meses) (mg) (mg)
0 10,023 10,124
1 9,712 10,001
2 9,436 9,912
3 9,125 9,645
4 8,956 9,415
5 8,798 9,123
6 8,125 8,891
A partir de los resultados obtenidos se observa que la sinigrina presenta una alta estabilidad, especialmente en los productos con baja proporción de agua, con unas tasas de degradación relativamente bajas en un plazo mayor de 6 meses en condiciones aceleradas, equivalentes a al menos 24 meses en condiciones normales. Esto demuestra que la estabilidad de la composición no queda mermada durante el tiempo de vida del producto.
El estudio de la estabilidad de la mirosinasa se basó en la cuantificación de su capacidad de hidrólisis de la sinigrina a lo largo del proceso de envejecimiento, utilizando la técnica de cromatografía de gases. La estabilidad de la mirosinasa se estudió en dos sustratos distintos: - una mezcla al 50% en peso de hoja deshidratada de Lepidium latifolium en polvo y extracto seco de Lepidium latifolium,
- una mezcla al 50% en peso de semilla de Sinapis alba y extracto seco de Lepidium latifolium.
Para cada ensayo, a los tiempos indicados a lo largo del proceso de envejecimiento, se tomó la cantidad necesaria del producto que contenía 10 mg de sinigrina, añadiéndose, de ser necesario, sinigrina pura (Sigma-Aldrich) hasta completar los 10 mg por muestra. Se llevó a cabo la hidrólisis en el sistema de "estómago artificial" previamente descrito, a pH 7, adicionando 80 mg de ácido ascórbico y 70 mg de sulfato ferroso, y se analizaron los productos de hidrólisis de la sinigrina.
En las Tablas 20 y 21 se muestran los resultados de estabilidad de mirosinasa realizados con el primer sustrato, es decir, con la mezcla 1 :1 de extracto seco y planta deshidratada de Lepidium latifolium, en condiciones de tiempo real y en condiciones aceleradas, respectivamente.
TABLA 20
TABLA 21
Mezcla 1 :1 extracto seco/planta deshidratada de Lepidium latifolium
Tiempo 1 -ciano-2,3- cianuro de alilo alilisotiocianato Sinigrina Total (meses) epitiopropano
0 0,659 0,071 6,356 nd 7,086 1 0,638 0,078 6,368 nd 7,084
2 0,641 0,056 6,349 nd 7,046
3 0,612 0,068 6,301 nd 6,981
4 0,598 0,055 6,284 nd 6,937
5 0,581 0,049 6,201 nd 6,831
6 0,546 0,058 6,212 nd 6,816
Se observa que la actividad de la mirosinasa se mantiene durante un plazo de al menos 6 meses en condiciones aceleradas, equivalentes al menos a 24 meses en condiciones normales, de manera que permite hidrolizar toda la sinigrina presente, lo que demuestra que su funcionalidad no queda mermada durante el tiempo de vida del producto.
En las Tablas 22 y 23 se muestran los resultados de estabilidad de mirosinasa realizados con el segundo sustrato, es decir, con una mezcla 1 :1 de extracto seco de Lepidium latifolium y semilla de Sinapis alba, en condiciones de tiempo real y en condiciones aceleradas, respectivamente. Todas las cantidades están en mg.
TABLA 22
Mezcla 1 :1 extracto seco Lepidium latifolium/sem\\\a de Sinapis alba
Tiempo 1 -ciano-2,3- cianuro de alilo alilisotiocianato Sinigrina Total (meses) epitiopropano
0 nd 0,039 6,979 nd 7,018
3 nd 0,069 7,099 nd 7,168
6 nd 0,044 7,056 nd 7,100
9 nd 0,069 7,075 nd 7,144
12 nd 0,041 6,998 nd 7,039 TABLA 23
Se observa también en este caso que la actividad de la mirosinasa se mantiene durante un plazo de al menos 6 meses en condiciones aceleradas, equivalentes al menos a 24 meses en condiciones normales, de manera que permite hidrolizar toda la sinigrina presente, lo que demuestra que su funcionalidad no queda mermada durante el tiempo de vida del producto.
Finalmente, el estudio de la estabilidad de la proteína epitioespecífica se basó en el análisis de la tasa de conversión de sinigrina en 1 -ciano-2,3-epitiopropano a lo largo del proceso de envejecimiento, utilizando la técnica de cromatografía de gases.
La estabilidad de la proteína epitioespecífica se estudió en una mezcla al 50% en peso de hoja deshidratada de Lepidium latifolium en polvo y extracto seco de Lepidium latifolium. Para cada ensayo, a los tiempos indicados a lo largo del proceso de envejecimiento, se tomó la cantidad necesaria del producto que contenía 10 mg de sinigrina, y se llevó a cabo la hidrólisis en el sistema de "estómago artificial" previamente descrito, a pH 2, adicionando 80 mg de ácido ascórbico y 70 mg de sulfato ferroso, y se analizaron los productos de hidrólisis de la sinigrina. Todas las cantidades están en mg. La Tabla 24 muestra el resultado de los estudios de estabilidad de la proteína epitioespecífica a tiempo real, mientras que la Tabla 25 muestra los estudios realizados en condiciones aceleradas. TABLA 24
TABLA 25
Se comprueba que durante un plazo de al menos 6 meses en condiciones aceleradas, la actividad de la proteína epitioespecífica se mantiene, puesto que conservan unas altas tasas de conversión de la sinigrina en el epitionitrilo, 1 ,ciano-2,3-epitiopropano, lo que demuestra que su funcionalidad perdura a lo largo del tiempo de vida del producto.
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