SECTOR DE LA TÉCNICA. OBJETO DE LA INVENCIÓN La presente invención, según se expresa en el enunciado de esta memoria descriptiva, se refiere a uno de los alergenos del polen de olivo (0lea europaea), la proteína Ole e 9, y a epítopos alergénicos presentes en la proteína. La invención también hace referencia a los DNAs recombinantes que codifican tanto proteínas completas como fragmentos que incluyen uno o más epítopos de la molécula, así como moléculas homólogas de Ole e 9 con capacidad alergénica en otras especies relacionadas y no relacionadas. En concreto el objeto de la invención consiste en la producción de la proteína Ole e 9, mediante tecnología recombinante en la levadura Pichia pastoris, que implica el uso de la secuencia nucleotídica caracterizada por SEQ ID NO : 1 o de otras secuencias nucleotídicas obtenidas por mutagénesis de la secuencia SEQ ID NO : 1.

La invención proporciona también un eficaz método de aislamiento tanto para el alergeno recombinante como para el natural.

ESTADO DE LA TÉCNICA La alergia tipo I es una enfermedad que afecta a más del 20% de la población de los países industrializados.

Esta afección es ocasionada por los alergenos, presentes tanto en organismos y productos biológicos-alimentos, ácaros, venenos de insectos, pólenes, hongos, epitelios de mamíferos-, como en materiales de síntesis. En la mayor parte de las fuentes biológicas alergénicas, los alergenos

son proteínas de masas moleculares comprendidas entre 5 y 70 kDa. Los síntomas que se derivan de la alergia, tales como rinitis, conjuntivitis, o asma, son provocados por la liberación de mediadores celulares, como la histamina, desde basófilos y mastocitos, células del sistema inmune.

Dicha liberación viene inducida por el entrecruzamiento de anticuerpos IgEs unidos a los receptores de alta afinidad FcsRI, los cuales se encuentran a su vez anclados a basófilos y mastocitos. El entrecruzamiento de las IgE es provocado por la unión del correspondiente alergeno, o un fragmento suyo, a través de un epítopo IgE (contenido en dicho alergeno, o en su fragmento). La terapia que actualmente se viene utilizando para tratar la alergia implica la hiposensibilización del paciente mediante la administración por vía parental u oral de dosis adecuadas del propio alergeno, o alergoides relacionados. En la práctica totalidad de los casos se administra un extracto alergénico obtenido, mediante una mínima manipulación, de la fuente biológica natural, lo que implica a una mezcla muy compleja de proteínas y otras sustancias, en la cual, el alergeno-o alergenos-puede representar una parte ínfima del producto total utilizado.

En efecto, en la actualidad, los protocolos utilizados para la diagnosis de casos de alergia y su posterior inmunoterapia implican el uso de extractos alergénicos que frecuentemente no están caracterizados, ni siquiera estandarizados respecto a los alergenos más importantes que pueden contener. A menudo, su administración no proporciona una diagnosis completa, sobre todo cuando la hipersensibilidad del paciente se refiere a alergenos presentes en baja concentración en dichos extractos. Por otro lado, la inmunoterapia realizada con estas preparaciones es frecuentemente ineficaz y origina en ocasiones efectos secundarios indeseables que pueden llegar

a ser más graves que la propia afección alérgica que se pretende resolver. Una alternativa a la utilización de estos extractos es la preparación de mezclas de los alergenos más significativos, obtenidos por aislamiento de su fuente natural. Sin embargo, esta vía presenta dos importantes barreras. Por un lado, implica un buen conocimiento de los componentes alergénicos del material que provoca la alergia, al menos de todos sus alergenos principales, y este dato, frecuentemente, no está disponible. Por otro lado, el proceso de aislamiento de los alergenos conocidos, a partir del material biológico, es a menudo difícil y no proporciona las cantidades necesarias o la calidad requerida para un posterior empleo, debido fundamentalmente a los bajos niveles en los cuales se encuentra. Todos estos problemas se acentúan cuando el material alergénico es el polen de una especie vegetal. La gran cantidad de pigmentos, carbohidratos, lípidos y componentes insolubles hacen muy difícil su manipulación.

Ni que decir tiene que su disponibilidad es, además, muy reducida y de alto coste económico, debido a la dificultad de su recolección. Por todo lo expuesto, se hace necesario el diseño de procedimientos para la producción de alergenos a utilizar en los protocolos de diagnosis e inmunoterapia de la alergia. La producción de DNA recombinante se prevé como la forma más reproducible y eficaz de obtención de polipéptidos alergénicos bien definidos, no sólo para uso clínico, sino incluso para investigación.

La polinosis a olivo es una de las más importantes causas de alergia en países del área mediterránea, donde este árbol es intensamente cultivado para la obtención de aceite y de aceituna. En la actualidad, se conocen varios alergenos del polen de olivo, habiendo sido hasta ahora Ole e 1 el que muestra una mayor incidencia entre los pacientes alérgicos a olivo ya que afecta a más del 70% de éstos

[Villalba, M, et al. Eur. J. Biochem. 216,863-869,1993; Villalba, M., et al. J. Biol. Chem. 269,15217-15222, 1994]. Además, se han aislado y caracterizado otros alergenos Ole e 2 (profilina) [Ledesma, A et al. Allergy 53,520-526,1998a], Ole e 3 [Ledesmá, A, et al. Eur. J.

Biochem. 258,454-459,1998b], Ole e 4, Ole e 5 [Boluda, L, et al. J. Immunol. Methods 223,17-23,1998], Ole e 6 [Batanero, E, et al. FEBS Lett. 410,293-296,1997], Ole e 7 [Tejera, ML, et al. J. Allergy Clin. Immunol. 104,797- 802,1999], Ole e 8 [Ledesma, A, et al. FEBS Lett. 466, 192-196,2000a]. El cDNA específico que codifica algunas de estas proteínas ha sido clonado, secuenciado, y expresado en E. coli [Batanero E., et al Clin. Exp. Allergy 26,1401- 1410,1996; Batanero E., et al. Eur. J. Biochem. 221,187- 193,1994].

EXPLICACION DE LA INVENCIÓN Producción del alergeno recombinante de Olea europaea Ole e 9 en la levadura Pichia pastoris, y sistema de aislamiento y purificación.

La presente invención se refiere al método de aislamiento utilizado para la purificación del alergeno Ole e 9-un alergeno del polen de olivo de suma importancia clínica, con una alta prevalencia del 65% de los pacientes alérgicos al polen de olivo-a partir del polen de olivo (0lea europaea). Más específicamente comprende la obtención, mediante clonación, de moléculas de DNA recombinante que codifican polipéptidos con las mismas o similares propiedades antigénicas que el alergeno procedente del polen de olivo, o bien polipéptidos que posean al menos un epítopo del alergeno Ole e 9. La invención incluye también la secuencia completa del cDNA del alergeno Ole e 9 y la secuencia completa deducida del alergeno.

El procedimiento objeto de la invención, permite llevar a cabo la purificación del alergeno Ole e 9 del polen de olivo a partir de un extracto proteico de polen de olivo mediante una cromatografía de penetrabilidad y una de afinidad, según se describe detalladamente más adelante.

De esta forma, se obtienen moléculas de DNA recombinante que codifican polipéptidos que exhiben la antigenicidad de Ole e 9, así como polipéptidos que contienen, al menos, un epítopo de Ole e 9 en su estructura. La invención dispone de secuencias polinucleotídicas de DNA que hibridan, en condiciones restrictivas, con las descritas antes-lo que implica un nivel de identidad de al menos un 60% entre sus secuencias de nucleótidos-, o bien son derivadas de ellas por degeneración del código genético o mutagénesis.

El procedimiento de clonación del alergeno recombinante de Olea europaea Ole e 9, incluye vectores de clonación y células huésped que contienen una secuencia de nucleótidos como las descritas en SEQ ID NO : 1, codificantes de Ole e 9, proteínas homólogas o fragmentos suyos.

Por lo tanto se obtienen fragmentos nucleotídicos que poseen, al menos, una secuencia que codifica un determinante antigénico del alergeno Ole e 9 de olivo o de fragmentos suyos, así como de alergenos homólogos de Ole e 9-principalmente en especies relacionadas con el olivo, como son todas las Oleaceas-que, dada la similitud estructural, al menos un 60%, presentan reactividad alergénica cruzada con Ole e 9 o con una parte de él. Entre estas las especies relacionadas con el olivo se encuentran : Syringa vulgaris (lila), Ligustrum vulgare (aligustre) y Fraxinus excelsior (fresno).

Estos polipéptidos pueden contener la secuencia antigénica unida a otros polipéptidos (por ejemplo como

proteínas de fusión), haber sido sintetizados químicamente o haber sido obtenidos mediante digestiones proteolíticas y modificados química o enzimáticamente.

La inserción de dicha secuencia en vectores de expresión en organismos hospedadores eucarióticos permite disponer de construcciones recombinantes que pueden utilizarse para la producción del alergeno recombinante.

Una vez producida la molécula polipeptídica con actividad antigénica de Ole e 9 o epítopos B y T suyos, ésta es aislada del medio extracelular del cultivo en forma soluble mediante cromatografía de intercambio aniónico y de afinidad.

Los productos recombinantes obtenidos mediante el procedimiento objeto de la invención presentan la capacidad de unión de anticuerpos IgE del suero de pacientes alérgicos a olivo, sensibles a Ole e 9.

Finalmente, con el procedimiento objeto de la invención, se dispone de Ole e 9 inmunológicamente activo, además de fragmentos antigénicos y alergénicos de este alergeno, y de proteínas homólogas de él, que sirven para ser incorporados en las pruebas"in vivo"e"in vitro"a realizar para la fiel diagnosis de la hipersensibilidad a este polen, y a otros pólenes relacionados filogenéticamente con él. También podrán ser empleados en las preparaciones de alergenos que se utilicen para llevar a cabo la inmunoterapia correspondiente para el tratamiento de la alergia al polen de olivo.

Para el diagnóstico y la terapia de la alergia al polen de olivo se utilizan actualmente extractos proteicos obtenidos a partir del polen. Esto implica una escasa reproducibilidad y un alto contenido en'moléculas contaminantes, de origen proteico y no proteico, que pueden originar efectos secundarios adversos en los pacientes

tratados. El disponer de moléculas homogéneas obtenidas por las técnicas del DNA recombinante, en cantidades ilimitadas, perfectamente cuantificables y estandarizadas, rebajaría considerablemente todos los inconvenientes citados. Esta tecnología permite disponer de esas moléculas y, además, de péptidos o formas modificadas de las mismas que contienen al menos uno de los epítopos alergénicos.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figura 1. Oligonucleótidos diseñados para las amplificaciones por PCR que han dado como resultado la obtención de la secuencia completa de Ole e 9.

Figura 2. Esquema de las amplificaciones parciales por PCR.

Se indican los oligonucleótidos que se han utilizado en cada caso.

MODO DE REALIZACIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a un DNA recombinante que codifica epítopos del alergeno de Olea europaea Ole e 9, a la producción recombinante, en la levadura Pichia pastoris, de los polipéptidos codificados por dicho DNA y al aislamiento del alergeno natural procedente del polen de olivo. También se refiere a la aplicación de ambas moléculas al diagnóstico y terapia de este desorden inmunológico.

En el procedimiento de clonación del alergeno recombinante de Olea europaea Ole e 9, se llevó a cabo la digestión con tripsina de la proteína que originó varios péptidos cuya secuencia fue determinada por Degradación de Edman. Dichas secuencias internas sirvieron para diseñar varios oligonucleótidos degenerados (Figura 1) que fueron utilizados para amplificar por PCR las secuencias parciales

codificantes y no codificantes (Figura 2) correspondientes al cDNA de Ole e 9, que condujeron a su clonación y secuenciación.

El procedimiento objeto de esta invención se realiza mediante las siguientes fases : Aislamiento de RNA total Se aisló el RNA total a partir del polen de olivo siguiendo el protocolo publicado por Ullrich y col.

[Science 196,1313-1318,1977]. En este aislamiento se partió de 0.5 g de polen que se homogeneizó en un tampón 0.1 M de Tris-HCl, pH 7.5 que contenía tiocianato de guanidinio 4M, laurilsarcosinato sódico al 0.5 % y 2- mercaptoetanol 0.14 M, mediante un homogeneizador Polytron.

Se centrifúgó esta suspensión a 5000 xg a 20 °C en una centrífuga Sorvall. Posteriormente se sometió al sobrenadante a una centrifugación en gradiente de CsCl 5.7 M en 0.01 M EDTA a 40.000 rpm en un rotor SW 60 (Beckman) durante 12 horas. E1 mismo procedimiento se llevó a cabo para aislar otros RNAs de diferentes pólenes usados (aligustre, fresno, lila) y con los diferentes tejidos del olivo empleados (tallo, hojas y frutos). Con estos últimos se introdujo una etapa inicial adicional en la que fueron macerados en presencia de nitrógeno líquido hasta obtener un polvo fino y homogéneo. A partir de 5 pg de RNA total se llevó a cabo la síntesis del cDNA utilizando el"kit"SMART II de síntesis de cDNA (Clontech).

* Clonación de Ole e 9 basado en técnicas de PCR Como ya se ha mencionado anteriormente, los cebadores utilizados fueron diseñados teniendo en cuenta la secuencia de la proteína obtenida por degradación de Edman. El método utilizado se basó en una reacción de PCR en varias etapas.

En la primera de ellas, el cDNA específico de Ole e 9 que se ha usado como molde y los cebadores degenerados, OL9A, OL9B y OL9C, correspondientes a secuencias internas de la proteína, así como los oligonucleótidos SMART II y 3'CDS son utilizados para originar fragmentos que contienen secuencias parciales de este alergeno. El molde y los cebadores fueron disueltos en una mezcla de PCR estándar (250M de dNTPs, tampón estándar y 50 pmoles de los cebadores). Después de una primera etapa de desnaturalización a 95 °C durante 15 min, se llevaron a cabo 25-35 ciclos a temperaturas de hibridación de 42-55 °C en presencia de TaqGold DNA polimerasa (Applied Biosystem PE Corp.). La reacción se sometió a electroforesis en geles de agarosa al 1.5% y los fragmentos de DNA fueron purificados usando el Magic PCR Prep kit (Promega) e insertados en el plásmido pCR2.1 linearizado y con una T terminal en los extremos 5'. Con esta construcción se transformaron células competentes DH5aF', a continuación se seleccionaron los recombinantes y se llevó a cabo la secuenciación de algunos de los clones seleccionados, obteniéndose secuencias parciales de este alergeno. En la segunda etapa de PCR, y utilizándose los oligonucleótidos no degenerados OL9D, OL9E y OL9F, se obtuvieron las secuencias correspondientes a la secuencia 5'del DNA. Por último, en una última reacción de PCR con los oligonucleótidos NT-OL9, NTC-OL9 y C-OL9, se obtuvieron los fragmentos de DNA que contenían la secuencia completa del alergeno. Cuando se utilizaron los cebadores NTC-OL9 y C- OL9 se amplificó la región del DNA que incluye la secuencia correspondiente al péptido señal junto con la secuencia correspondiente a la proteína madura. Con los oligonucleótidos NT-OL9 y C-OL9 se amplificó la secuencia del DNA que contiene únicamente la región codificante desde

el hipotético primer aminoácido amino-terminal, determinado teóricamente aplicando el método de von Heijne [Nielsen, H, et al. Protein Engineering 12,3-9,1997].

Para la producción de la forma natural de estas proteínas, la secuencia codificante de DNA fue ligada al plásmido de expresión pPICZaA (Invitrogen Corp.). Las células utilizadas fueron de la cepa X-33 de Pichia pastoris. La inducción se llevó a cabo por metanol al 0.5% durante cuatro días, creciendo las células a 30°C. Las células se sedimentaron centrifugando a 5000 xg, se recogieron los sobrenadantes y una muestra de los mismos se aplicó en un gel de poliacrilamida al 15% en presencia de SDS. Una banda de 45 kDa, única, fue detectada mediante tinción de los geles con Azul de Coomassie. La proteína es reconocida por sueros de pacientes alérgicos específicos de Ole e 9 natural (dilución 1 : 10). La purificación de las proteínas se llevó a cabo mediante dos etapas, una cromatografía de intercambio iónico en DEAE-celulosa y una de afinidad en fenil-Sefarosa, obteniéndose tras esta última el alergeno con un grado de pureza del 99%. Se llevaron a cabo con ellas estudios de caracterización estructural (espectros de dicroismo en el UV lejano, espectrometría, de masas) e inmunológica (con sueros individuales de pacientes alérgicos) y en todos los casos las proteínas recombinantes se comportaron de manera equivalente a la del alergeno natural.

* Aislamiento del alergeno Ole e 9 a partir del polen de olivo (0lea europaea).

El alergeno Ole e 9 ha sido purificado a partir de extracto proteico de polen de olivo, obtenido por homogeneización de 3g de polen en bicarbonato amónico 50 mM pH 8.0. Dicho extracto fue aplicado a una columna de Sephadex G-150. Las fracciones que contenían la proteína

fueron aplicadas a una columna de afinidad en fenil- Sepharosa con un gradiente de NaCl 0.5-0 M en TrisHCl 50mM pH7.5 y finalmente la proteína fue eluida con agua destilada.

La invención cubre el uso de Ole e 9 recombinante en diagnóstico,"in vivo"mediante pruebas cutáneas o"in vitro"mediante técnicas de inmunodetección (ELISA, RAST), permitiendo precisar qué alergenos son los responsables de la sintomatología clínica de un individuo y reducir así el número de moléculas necesarias para su inmunoterapia. Se origina, por tanto, una inmunoterapia personalizada.