антиаллерген

область техники

изобретение относится к области медицины, а более конкретно к отысканию новых средств противоаллергенного действия.

уровень техники

аллергия является чрезвычайно важной медицинской и социальной проблемой. по различным данным она поражает от 20 до 40 % населения, при этом последние 30 лёт заболеваемость аллергией удваивалась каждые десять лет.

существует достаточно большое число широко известных гистаминных препаратов (антиаллергенов), используемых в современной медицине, однако проблема отыскания новых, эффективных антиаллергенов продолжает оставаться актуальной, в частности, ввиду расширения спектра аллергенов из-за последовательного ухудшения экологии.

особенно актуальной является задача отыскания новых антиаллергенов природного, в частности растительного происхождения, минимизирующих побочные эффекты при применении.

в народной медицине целый ряд растений считается антиаллергенами. в их числе фигурирует и береза бородавчатая, листья и сок которой могут использоваться для приготовления антиаллергенов.

сущность изобретения авторами настоящего изобретения была обнаружена возможность использования в качестве антиаллергена экстракта белой части коры березы (бересты), при этом эффективность его оказалась очень высокой, на уровне таких общеизвестных и широко применяемых синтетических антигистаминных препаратов, как супрастин (международное непатентованное название - хлоропирамин) и кларитин (международное непатентованное название - лоратодин).

применение экстракта бересты в качестве антиаллергена и составляет предмет настоящего изобретения.

раскрытие изобретения

противоаллергенное действие экстракта бересты было установлено авторами изобретения в результате исследований бересты экстракта сухого (бэс), производимого обществом с ограниченной ответственностью «бepeзoвый миp» (россия, москва), применяемого в качестве сырья при производстве биологически активных добавок.

экстракт бересты может быть получен различными известными способами. так, в соответствии с документами SU 382657 и SU 2172178 экстракцию осуществляют с использованием спирта. в соответствии с патентом RU 2192879, принадлежащим заявителю, экстракцию бересты осуществляют толуолом, с получением в качестве конечного продукта сухого кристаллического вещества, основным компонентом которого (до 97 %) является бетулин - тритерпеновый двуатомный спирт.

оценку специфического противоаллергенного действия проводили согласно методическим рекомендациям, утвержденным

фармакологическим комитетом рф "методические указания по оценке аллергизирующих свойств фармакологических веществ" и «Meтoдичecкиe указания по изучению иммунотропной активности фармакологических веществ" (2000 г.). в работе использовали самцов морских свинок альбиносов из питомника российской академии медицинских наук (рамн) «цeнтpaльный» массой 250-300 г и мышей самцов линии CBA массой 18- 20 г из питомника рамн «Cтoлбoвaя», после двухнедельного карантина в виварии научно-исследовательского института фармакологии рамн. животных содержали в стандартных условиях со свободным доступом к корму и воде. в качестве основного корма были использованы брикетированные гранулированные корма. препаратами сравнения были выбраны два современных препарата, обладающие различными механизмами противоаллергенного фармакологического действия: кларитин и супрастин. методы исследования

реакция общей анафилаксии на морских свинках-альбиносах учитывая современные представления о том, что аллергическая сенсибилизация, стимуляция продукции IgE антител вызывается

селективным развитием Th2-xeлпepoв, а также экспериментальное доказательство аллергизирующих свойств овальбумина (1), была выбрана модель сенсибилизации интактных морских свинок 0,6% раствором белка куриного яйца (бкя), основным аллергенным компонентом которого является овальбумин.

для получения реакции анафилаксии животных контрольной и опытных групп иммунизировали перорально 0,6 % раствором белка куриного яйца (бкя) в дозе 1 мл на 250 г массы тела в течение трех дней (растворенный в физиологическом растворе бкя морским свинкам вводили перорально через мягкий пластмассовый зонд) (2).

через 12 дней после начала иммунизации бкя в первой серии экспериментов животным опытных групп в течение трех дней внутрибрюшинно вводили бетулин в дозах 100 мг/кг и 1000 мг/кг, контрольным животным - соответствующий объем растворителя. на следующие сутки животным опытных групп в/б вводили бэс в дозах 100 мг/кг и 1000 мг/кг, контрольным животным - 1% раствор крахмала. через 2 часа животным всех групп внутрисердечно вводили бкя в дозе 1 мг на 300 г массы тела, после чего регистрировали развитие анафилактической реакции. во второй серии экспериментов через 12 дней после начала иммунизации бкя животным опытных групп в течение трех дней внутрибрюшинно вводили 1-ой опытной группе морских свинок бэс в дозе 50 мг/кг, 2-ой опытной группе животных вводили препарат сравнения, супрастин, в дозе 50 мг/кг, контрольным животным вводили 1 % крахмальный гель. на следующие сутки 1-ой опытной группе морских свинок вводили бэс в дозе 50 мг/кг, 2-ой опытной группе - супрастин, в дозе 50 мг/кг, контрольным животным вводили аналогичный объем растворителя. через 2 часа животным всех групп внутрисердечно вводили бкя в дозе 1 мг на 300 г массы тела, после чего регистрировали развитие анафилактической реакции.

в третьей серии экспериментов через 12 дней после начала иммунизации бкя животным опытных групп в течение трех дней внутрибрюшинно вводили 1-ой опытной группе морских свинок бэс в дозе

50 мг/кг, 2-ой опытной группе животных вводили бетулин в дозе 50 мг/кг, контрольным животным вводили 1 % крахмальный гель. на следующие сутки 1-ой опытной группе морских свинок вводили внутрибрюшинно бэс в дозе 50 мг/кг, 2-ой опытной группе - бетулин в дозе 50 мг/кг, контрольным животным вводили аналогичный объем растворителя. через 2 часа животным всех групп внутрисердечно вводили бкя в дозе 1 мг на 300 г массы тела, после чего регистрировали развитие анафилактической реакции.

дополнительно было изучено действие введения препарата сравнения, кларитина, в дозе 30 мг/кг, на анафилактическую реакцию морских свинок, иммунизированных 6 % раствором бкя.

вычисление анафилактического индекса по Wеiglе проводили по следующей формуле:

(Nx4) + (Nчхз) + (N ₂ x2) + (N _? x1) +(N ₄ XO) , N + N ₁ + N ₂ + N ₃ + N ₄ , где N - число морских свинок, у которых наступила смерть;

Ni - число морских свинок, у которых развился тяжелый шок; N ₂ - число морских свинок, у которых развился умеренный, шок; Nз— число морских свинок, у которых развился слабый шок; N ₄ - морские свинки, у которых не наступило шока.

при гибели всех животных в группе индекс Wеiglе составляет 4(++++). при тяжелом шоке - 3(+++), при умеренном шоке - 2(++), при слабом шоке - 1 (+), при отсутствии анафилактоидных реакций у морских свинок - индекс равен 0 (3). реакция воспаления на конканавалин а (кон а)

реакция воспаления на кон а (псевдоаллергическая реакция) основана на способности кон а неспецифически, т.е. без участия реагинов с аллергенами на мембранах клеток-мишеней, в результате прямого действия на рецепторы мембран тучных клеток и базофильных лейкоцитов высвобождать медиаторы воспаления (гистамин, серотонин, лейкотриены и др.).

опыты были проведены на мышах самцах линии CBA массой 18-20 г. использовались два пути введения испытуемых веществ - внутрибрюшинный и пероральный, введение осуществляли в 1 % крахмальном геле. при внутрибрюшинном введении бэс вводили в дозах 5 мг/кг, 50 мг/кг и 100 мг/кг, бетулин вводили в дозах 10 мг/кг и 100 мг/кг, препараты сравнения, супрастин и кларитин, вводили в дозах 5 мг/кг и 50 мг/кг. при пероральном пути введения бэс вводили в дозах 5 мг/кг, 50 мг/кг и 100 мг/кг, бетулин вводили в дозах 50 мг/кг и 100 мг/кг, супрастин и кларитин - в дозах 5 мг/кг и 50 мг/кг. животным контрольной группы аналогичным способом вводили соответствующий объем крахмального геля. учитывая данные по фармакокинетике изучаемых фармакологически эффективных соединений, кон а (20 мкл раствора в концентрации 5 мг/мл) вводили мышам подопытных и контрольной групп через 2 часа субплантарно (в подушечку задней стопы), в контрлатеральную конечность - тот же объем физиологического раствора. через час мышей забивали, определяли массу лап и подсчитывали индекс реакции воспаления (и _p ) по формуле:

P _к

где P _0n - масса стопы, в подушечку которой вводили кон а; P _к - масса стопы, в подушечку которой вводили физиологический раствор. результаты исследований противоаллергенного действия бэс показал наличие у него противоаллергенной биологической активности, что подтверждается следующими примерами. пример 1.

пероральное введение бэс в дозах 100 мг/кг и 1000 мг/кг подавляло интенсивность системной реакции анафилаксии у животных опытных групп по сравнению с контролем (таблица 1). индекс реакции у контрольной группы животных составил 2,0 (погибла 1 свинка из 10, у 2-х животных определили тяжелый анафилактический шок, у 3-х - умеренный шок, у 4-х - слабый шок). при введении бэс в дозе 100 мг/кг погибла 1 свинка из 10, у

заменяющий лист (правило 26)

б

1-го животного определили тяжелый анафилактический шок, у 4-х свинок развился слабый шок, у 4-х - анафилактической реакции не выявили (индекс реакции по Wеiglе составил 1 ,1). при введении бэс в дозе 1000 мг/кг погибла 1 свинка из 10, у 1-го животного развился тяжелый анафилактический шок, у 3-х свинок определили умеренный шок, у 5 морских свинок реакция отсутствовала (индекс по Wеiglе - 1 ,3).

пример 2.

данные, представленные в таблице 2 показывают, что внутрибрюшинное введение бэс в дозе 50 мг/кг подавляло интенсивность системной реакции анафилаксии у животных опытных групп по сравнению с контролем. индекс реакции у контрольной группы животных составил 2,1 (у 4-х морских свинок определили тяжелый анафилактический шок, у 3-х - умеренный шок, у 3-х - слабый шок). при введении бэс в дозе 50 мг/кг у 3-х свинок развился умеренный шок, у 4-х слабый шок, у 3-х — анафилактической реакции не выявили (индекс реакции по Wеiglе составил 1 ,0). при введении препарата сравнения, в данном случае супрастина, в дозе 50 мг/кг у 2-х животных определили умеренный анафилактический шок, у 2-х свинок развился слабый шок, у 6-ти - анафилактической реакции не выявили (индекс реакции по Wеiglе составил 0,6).

пример 3.

установлено, что внутрибрюшинное введение бэс в дозе 50 мг/кг (таблица 3) подавляло интенсивность системной реакции анафилаксии у морских свинок. индекс реакции при введении бэс в дозе 50 мг/кг составил 0,8 (у 1-х морских свинок определили тяжелый анафилактический шок, у 2-х - умеренный шок, у 1-й - слабый шок, у 6-ти анафилактическая реакция отсутствовала). при внутрибрюшинном введении бетулина в дозе 50 мг/кг у 2-х свинок развился тяжелый шок, у 2-х - слабый шок, у 5-ти - анафилактической реакции не выявили (индекс реакции по Wеiglе составил 0,9). в контрольной группе животных 1-a морская свинка погибла, у 2-х - тяжелый шок, у 2-х животных определили умеренный анафилактический шок, у 5-ти свинок развился слабый шок (индекс реакции по Wеiglе составил 1 ,9).

при изучении влияния введения кларитина дозе 30 мг/кг на интенсивность анафилактического шока у морских свинок, иммунизированных 6% бкя, установили, что в опытной группе из 7-ми животных 2 морские свинки погибли, у 2-х развился тяжелый шок, у 3-х свинок определили умеренный шок, индекс реакции составил 2,9. в контрольной группе 7 из 11 животных погибли, у 2-х животных развился сильный шок, у 2-х - умеренный шок, индекс реакции - 3,5 (таблица 4).

таким образом, бэс подавляет анафилактический шок в реакции анафилаксии у морских свинок, иммунизированных бкя. подавление анафилактического шока при введении бэс более выражено, чем при введении препарата сравнения, кларитина. пример 4.

из данных, представленных в таблице 5, следует, что однократное внутрибрюшинное введение бэс в дозах 5 мг/кг, 50 мг/кг и 100 мг/кг мышам линии CBA вызывало значимое подавление реакции воспаления на кон а на 45,3 %, 56,0 % и 71 ,7 %, соответственно. при однократном внутрибрюшинном введении бетулина в дозах 5 мг/кг и 50 мг/кг наблюдалось подавление реакции воспаления на кон а на 50,3 % (p<0,01 ) и 39,0 % (p<0,01), соответственно. введение аналогичным образом препаратов сравнения, кларитина и супрастина, статистически достоверно подавляло реакцию воспаления на кон а. при введении кларитина в дозах 5 мг/кг и 50 мг/кг разница с контрольными значениями достигала 79,9 % и 90,6 %, при введении супрастина в тех же дозах - 78,6 % и 66,0 %. пример 5. однократное пероральное введение бэс в дозе 50 мг/кг мышам линии

CBA приводило к статистически достоверному подавлению реакции воспаления на кон а на 72,7 % (таблица 6). введение бэс в дозах 5 мг/кг и 100 мг/кг значимого подавления реакции воспаления на кон а не вызывало. при однократном введении рег оs бетулин в дозах 5 мг/кг и 100 мг/кг и супрастин в дозах 5 мг/кг и 50 мг/кг не вызывали подавления реакции воспаления на кон а. препарат сравнения, кларитин, вводимый перорально в дозах 5 мг/кг и 50 мг/кг, вызывал статистически достоверное

дозозависимое подавление реакции воспаления на кон а на 45,5 % и 83,2 %, соответственно.

промышленная применимость

представленные выше данные позволяют сделать вывод об эффективности экстракта бересты в качестве средства противоаллергенного действия, сопоставимой с действием таких препаратов, как супрастин и кларитин и тем самым о возможности применения экстракта бересты в качестве антиаллергена и для изготовления средств противоаллергенного действия.

таблица 1

влияние бэс в дозах 100 мr/кг и 1000 мг/кг на интенсивность анафилактического шока у морских свинок, иммунизированных 0,6 %

бкя

таблица 2

влияние бэс на интенсивность анафилактического шока у морских свинок, иммунизированных 0,6 % бкя, в сравнении с супрастином

таблица Ns 3

влияние бэс на интенсивность анафилактического шока у морских свинок, иммунизированных 0,6 % бкя, в сравнении с бетулином

таблица Ns 4

влияние кларитина на интенсивность анафилактического шока у морских свинок, иммунизированных 6% бкя

таблица Na 5

влияние бэс в сравнении с бетулином, кларитином и супрастином на реакцию воспаления на кон а (внутрибрюшинное введение изучаемых фармакологически эффективных соединений)

таблица Ns 6

влияние бэс в сравнении с бетулином, кларитином и супрастином на реакцию воспаления на кон а (лероральное введение фармакологически эффективных соединений)

ссылки:

1. кimbеr I., кеrkvliеt N.I.,Taylor S. L. еt аl. - тохiсоiоgу оf рrоtеiп аllθrgепiсitу: рrеdiсtiоп апd сhаrасtеrizаtiоп- тохiсоl. Sci.-1999, VoI. 48, P. 157-162. 2. адо в. а., горячкина л. а. - подавление аллергических реакций низкомолекулярными соединениями - минск, 1971 , с. 40. 3. хлопушина T. г., кринская A.B., коваленко л. п. и др. - влияние зиксорина на фармакокинетику . антипирина у интактных и сенсибилизированных морских свинок - бюл. экспер. биол., 1991 , Ns 7, с. 67-69.