GALLEGO ORTEGA, David (Instituto De Investigaciones Biomédicas, Arturo Duperier 4, Madrid, E-28029, ES)
LACAL SANJUAN, Juan Carlos (Instituto De Investigaciones Biomédicas, Arturo Duperier 4, Madrid, E-28029, ES)
RAMIREZ DE MOLINA, Ana (Instituto De Investigaciones Biomédicas, Arturo Duperier 4, Madrid, E-28029, ES)
GALLEGO ORTEGA, David (Instituto De Investigaciones Biomédicas, Arturo Duperier 4, Madrid, E-28029, ES)
LACAL SANJUAN, Juan Carlos (Instituto De Investigaciones Biomédicas, Arturo Duperier 4, Madrid, E-28029, ES)
| REIVINDICACIONES
1. Un anticuerpo monoclonal específico para Ia proteína colina quinasa alfa humana que se selecciona del grupo de AD1 , AD2, AD3, AD4, AD5, AD6, AD7, AD8, AD9, AD10, AD11 , AD12, AD13 y AD14.
2. Una línea celular de hibridoma capaz de producir un anticuerpo monoclonal específico para Ia proteína colina quinasa alfa humana que se selecciona del grupo de AD1 , AD2, AD3, AD4, AD5, AD6, AD7, AD8, AD9, AD10, AD11 , AD12, AD13 yAD14.
3. Línea celular de hibridoma según Ia reivindicación 2, obtenida mediante Ia fusión con Ia línea de mieloma de ratón NS- 1 de células de bazo de ratones Balb/c inmunizados con Ia proteína colina quinasa alfa humana.
4. Una composición que comprende al menos un anticuerpo monoclonal específico para Ia proteína colina quinasa alfa humana que se selecciona del grupo de AD1 , AD2, AD3, AD4, AD5, AD6, AD7, AD8, AD9, AD10, AD11 , AD12, AD13 y AD14, o combinaciones de los mismos.
5. Composición según Ia reivindicación 3, en Ia que el anticuerpo monoclonal está unido a otra sustancia o partícula.
6. Composición según Ia reivindicación 5, en Ia que el anticuerpo monoclonal está unido a una sustancia que facilita su detección.
7. Composición según Ia reivindicación 6, en Ia que el anticuerpo monoclonal está unido a una molécula radioactiva, un cromóforo, un fluoróforo o una enzima que cataliza un reacción en Ia que se produce un cromóforo o fluoróforo o en Ia que desaparece un cromóforo o un fluoróforo.
8. Composición según Ia reivindicación 5, en Ia que el anticuerpo monoclonal está unido a una sustancia o partícula que facilita su extracción del medio en el que se encuentra.
9. Composición según Ia reivindicación 8, en Ia que el anticuerpo monoclonal está unido a una partícula metálica o una partícula magnética.
10. Composición según Ia reivindicación 4, que comprende adicionalmente un segundo anticuerpo capaz de unirse a al menos un anticuerpo monoclonal seleccionado del grupo de AD1 , AD2, AD3, AD4, AD5, AD6, AD7, AD8, AD9, AD10, AD11 , AD12, AD13 y AD14 que esté presente en dicha composición.
11. Composición según Ia reivindicación 10, en Ia que el segundo anticuerpo es un anticuerpo que se une al fragmento Fc de las inmunoglobulinas G de ratón.
12. Composición según Ia reivindicación 10 u 11 , en Ia que el segundo anticuerpo está unido a una sustancia o partícula que facilita su detección o facilita su extracción del medio en el que se encuentre.
13. Composición según Ia reivindicación 12, en Ia que el segundo anticuerpo está unido a una molécula radioactiva, un cromóforo, un fluoróforo o una enzima que cataliza un reacción en Ia que se produce un cromóforo o fluoróforo o en Ia que desaparece un cromóforo o un fluoróforo.
14. Composición según Ia reivindicación 12, en Ia que el segundo anticuerpo está unido a una partícula metálica o una partícula magnética.
15. Uso de al menos un anticuerpo de Ia reivindicación 1 o de una composición de las reivindicaciones 4 a 14 que Io contenga para detectar y/o cuantificar Ia proteína colina quinasa alfa humana en una muestra cualquiera.
16. Uso según Ia reivindicación 15, en el que Ia detección y/o cuantificación de Ia proteína colina quinasa alfa humana en una muestra cualquiera se produce mediante un inmunoensayo en el que las proteínas presentes en Ia muestra a analizar han sido previamente objeto de transferencia Western.
17. Uso según Ia reivindicación 16, en el que el anticuerpo monoclonal utilizado en el inmunoensayo se selecciona del grupo de AD1 , AD2, AD3, AD4, AD5, AD6, AD7, AD8, AD9, AD10, AD11 , AD12, AD13 y AD14.
18. Uso según Ia reivindicación 15, en el que en el que Ia detección y/o cuantificación de Ia proteína colina quinasa alfa humana en una muestra cualquiera se produce tras Ia inmunoprecipitación de Ia misma.
19. Uso según Ia reivindicación 18, en el que en el que el anticuerpo monoclonal usado para Ia inmunoprecipitación se selecciona del grupo de AD1 , AD2, AD3, AD4, AD5, AD7, AD8, AD11 , AD13 y AD14.
20. Uso según Ia reivindicación 18, en el que Ia detección y/o cuantificación de Ia proteína colina quinasa alfa tras Ia inmunoprecipitación de Ia misma comprende una etapa en Ia que se ensaya Ia actividad colina quinasa alfa humana detectable en el inmunoprecipitado.
21. Uso según Ia reivindicación 20, en el que el anticuerpo monoclonal usado para Ia inmunoprecipitación se selecciona del grupo de AD1 , AD2, AD4, AD5, AD7, AD13 y AD14.
22. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 21 , en el que Ia muestra es una muestra biológica de un ser humano.
23. Uso según Ia reivindicación 22, en el que Ia muestra biológica es una muestra de un fluido biológico de un ser humano.
24. Uso según Ia reivindicación 22, en el que Ia muestra biológica es una muestra de tejido tomada de un ser humano.
25. Uso según Ia reivindicación 15, en el que Ia detección y/o cuantificación de Ia proteína colina quinasa alfa humana se produce mediante técnicas inmunohistoquímicas.
26. Uso según Ia reivindicación 25, en el que Ia detección y/o cuantificación de Ia proteína colina quinasa alfa humana se produce sobre una muestra de tejido tomada de un ser humano.
27. Uso según Ia reivindicación 26, en el que el anticuerpo monoclonal utilizado para Ia realización de las técnicas inmunohistoquímicas se selecciona del grupo de AD1 , AD2, AD3, AD4, AD5, AD6, AD7, AD8, AD10, AD14.
28. Uso según Ia reivindicación 26 ó 27, en el que el tejido del que se ha extraído Ia muestra es tejido de mama, pulmón, colon, próstata, vejiga o de un tumor hematológico.
29. Un método para realizar in vito el diagnóstico de cáncer, el pronóstico de su evolución, el seguimiento de dicha evolución o para comprobar Ia efectividad de un tratamiento anticancerígeno, que comprende Ia detección y/o cuantificación de Ia proteína colina quinasa alfa humana en una muestra biológica de un ser humano mediante un anticuerpo monoclonal que se selecciona del grupo de AD1 , AD2, AD3, AD4, AD5, AD6, AD7, AD8, AD9, AD10, AD11 , AD12, AD13 y AD14.
30. Método según Ia reivindicación 29, en el que Ia muestra biológica es una muestra de tejido tomada de un ser humano.
31. Método según Ia reivindicación 30, en el que Ia muestra de tejido es de tejido de mama, pulmón, colon, próstata, vejiga o de un tumor hematológico.
32. Método según Ia reivindicación 30 ó 31, en el que Ia detección y/o cuantificación de Ia proteína colina quinasa alfa humana se realiza mediante técnicas inmunohistoquímicas.
33. Método según Ia reivindicación 32, en el que Ia detección del anticuerpo monoclonal unido a Ia proteína quinasa alfa humana se realiza mediante un segundo anticuerpo capaz de unirse al anticuerpo monoclonal.
34. Método según Ia reivindicación 33, en el que el segundo anticuerpo monoclonal capaz de unirse al anticuerpo monoclonal está unido a una molécula radioactiva, un cromóforo, un fluoróforo o una enzima que cataliza una reacción en Ia que se produce un cromóforo o fluoróforo o en Ia que desaparece un cromóforo o un fluoróforo.
35. Método según Ia reivindicación 33 ó 34, en el que el segundo anticuerpo capaz de unirse al anticuerpo monoclonal específico para Ia colina quinasa alfa humana en un anticuerpo que se une al fragmento Fc de las inmunoglobulinas G de ratón.
36. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 32 a 35, en el que el anticuerpo monoclonal específico para Ia colina quinasa alfa humana utilizado para Ia realización de las técnicas inmunohistoquímicas se selecciona del grupo de AD1 , AD2, AD3, AD4, AD5, AD6, AD7, AD8, AD10 y AD14.
37. Un kit para realizar ¡n vitro el diagnóstico de cáncer, el pronóstico de su evolución, el seguimiento de Ia misma o para comprobar Ia efectividad de un tratamiento anticancerígeno en una muestra biológica de un ser humano que comprende al menos un anticuerpo monoclonal de Ia reivindicación 1.
38. Kit según la reivindicación 37, que comprende adicionalmente un segundo anticuerpo capaz de unirse a al menos un anticuerpo monoclonal de Ia reivindicación 1 que esté presente en el kit.
39. Kit según Ia reivindicación 38, en el que el segundo anticuerpo capaz de unirse a al menos un anticuerpo monoclonal de Ia reivindicación 1 está unido a una molécula radioactiva, un cromóforo, un fluoróforo o una enzima que cataliza una reacción en Ia que se produce un cromóforo o fluoróforo o en Ia que desaparece un cromóforo o un fluoróforo.
40. Kit según Ia reivindicación 38 ó 39, en el que el segundo anticuerpo capaz de unirse a al menos un anticuerpo monoclonal de Ia reivindicación 1 presente en el kit es un anticuerpo que se une al fragmento Fc de las inmunoglobulinas G de ratón.
41. Uso de al menos un anticuerpo monoclonal seleccionado del grupo de AD3, AD8 y AD11 para Ia fabricación de una medicamento para Ia terapia contra el cáncer.
42. Uso según Ia reivindicación 41, en el que el cáncer es cáncer de mama, pulmón, colon, próstata, vejiga o un tumor hematológico. |
ANTICUERPOS MONOCLONALES ANTI-COLINA QUINASA ALFA Y
SU USO EN TéCNICAS ANALíTICAS, DE DIAGNóSTICO DEL CáNCER Y
EN LA PREPARACIóN DE MEDICAMENTOS
CAMPO DE LA INVENCIóN
La invención se refiere a anticuerpos monoclonales capaces de unirse a Ia colina quinasa alfa humana. Concretamente, Ia invención se refiere a los anticuerpos monoclonales AD1 , AD2, AD3, AD4, AD5, AD6, AD7, AD8, AD9, AD10, AD11 , AD12, AD13 y AD14, a los hibridomas que los producen, las composiciones que los contienen, el uso de los mismos para detectar y/o cuantificar Ia presencia de Ia proteína colina quinasa alfa humana y los métodos para realizar diagnósticos in vito de Ia presencia de tumores en un individuo o pronosticar su posible evolución que hagan uso de dichos anticuerpos.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIóN
La colina quinasa α (ChoKα) es Ia primera enzima de Ia ruta de Kennedy para Ia biosíntesis de fosfatidilcolina (PC), el principal fosfolípido de las membranas biológicas. Hay evidencias consistentes que demuestran Ia implicación de Ia colina quinasa y de su producto, Ia fosforilcolina (PCho), en el proceso de carcinogénesis (1-4).
ChoK está sobreexpresada en un elevado porcentaje de líneas celulares derivadas de tumores humanos, así como en diferentes tejidos tumorales humanos tales como mama, pulmón, colon y próstata (5,6). Tomados en conjunto, estos tumores representan más del 70% del número total de casos de cáncer en los países desarrollados. La incidencia de Ia sobreexpresión o incremento de Ia actividad de ChoK en estos cuatro tipos de cáncer oscila entre el 40% y el 60% (5-7). Recientemente, los autores de Ia presente invención demostraron no sólo que Ia proteína colina quinasa alfa está incrementada en los tejidos tumorales humanos mencionados (mama, pulmón, colon y próstata), sino que también está aumentada en otros tipos de tumores como vejiga y tumores hematológicos. Además, Ia sobreexpresión de dicha enzima induce
tumores in vivo y parece estar relacionada con Ia severidad del cáncer, el estadio de evolución del mismo y Ia disminución del tiempo de supervivencia de los pacientes que presentan tumores en los que se detecta dicha sobreexpresión. Es más, se ha demostrado que Ia inhibición de Ia ChoKα en particular, tanto mediante inhibidores químicos como mediante ARN de interferencia, representa una estrategia antitumoral efectiva Todo ello indica que ChoKα representa un nuevo e importante marcador de tumores, útil para el diagnóstico, el pronóstico o Ia respuesta al tratamiento. Por ello, en Ia solicitud de patente internacional PCT/ES2006/070047 se proporciona un método para detectar Ia presencia de cáncer en un individuo, para determinar el estadio o Ia severidad de dicho cáncer, o para monitorizar el efecto de Ia terapia administrada a un individuo que presente cáncer, mediante Ia detección y cuantificación de Ia proteína colina quinasa alfa, así como mediante Ia detección y cuantificación del RNA mensajero de dicha enzima o del correspondiente cDNA.
Los procedimientos diseñados para el diagnóstico temprano y fiable del cáncer proporcionan información valiosa que puede mejorar el tratamiento de esta enfermedad, ayudando a lograr un incremento en Ia esperanza de vida. Los métodos que comprendan Ia determinación de Ia sobreexpresión de ChoKα en tumores humanos podrían representar un avance significativo tanto en el diagnóstico del cáncer como en Ia identificación de candidatos potenciales para terapia utilizando inhibidores de ChoK. El desarrollo de estos métodos lleva implícito el desarrollo de reactivos y metodologías apropiadas que permitan Ia determinación de Ia sobreexpresión de ChoKα. Una herramienta adecuada para determinar con precisión un incremento de los niveles de ChoKα en muestras de tejidos podrían ser los anticuerpos monoclonales, que son poblaciones de moléculas de anticuerpo, todas ellas idénticas, producidas por un único clon de células, que poseen Ia misma especificidad, en contraposición a los anticuerpos policlonales o polisueros, que son poblaciones complejas de anticuerpos, formadas por distintas clases de moléculas de inmunoglobulinas en las que está presente una variedad de especificidades. Se trata de moléculas que han tenido gran éxito como
reactivos analíticos, debido a que son sustancias químicamente bien definidas, cuya naturaleza y estructura se conoce con detalle y ello permite Ia formulación de preparaciones estables y facilita los procedimientos para su conjugación a través de trazadores tales como sustancias fluorescentes, enzimas, radioisótopos, oro coloidal, moléculas electrón-densas (ferritina), etc; además, son reactivos que pueden ser preparados de forma pura, en condiciones muy controladas y en grandes cantidades. En particular, los anticuerpos monoclonales son ampliamente utilizados en Ia investigación biomédica y el diagnóstico de muchas enfermedades, incluido el cáncer, y proporcionan alta sensibilidad y especificidad, necesarias ambas para dichos estudios. Sin embargo, no existen referencias publicadas en el Estado de Ia Técnica de anticuerpos monoclonales dirigidos contra ChoKα. Existen anticuerpos comerciales disponibles frente a esta proteína, todos ellos policlonales, cuya especificidad es reducida y, cuando se utilizan en inmunoensayos sobre transferencias Western, dan lugar a muchas bandas inespecíficas. Esta baja especificidad es particularmente problemática cuando se desean realizar ensayos inmunohistoquímicos, en los que es importante que no se produzcan tinciones ¡nespecíficas, por Io que tampoco existen referencias publicadas en el Estado de Ia Técnica en las que se describan ensayos inmunohistoquímicos en los que se detecte Ia proteína ChoKα. Por todo ello, dada Ia demostrada implicación de ChoKα en carcinogénesis humana, existía Ia necesidad de desarrollar anticuerpos monoclonales dirigidos contra Ia colina quinasa alfa, preferentemente de alta especificidad y sensibilidad, con buena capacidad para precipitar Ia proteína colina quinasa alfa de soluciones en las que se encuentre o de interaccionar con dicha proteína en muestras de tejido o soluciones en las que esté presente, (Io que permite Ia aplicación de métodos inmunoquímicos en general y, en particular, de métodos inmunohistoquímicos, para los que hasta ahora no se disponía de herramientas adecuadas y que ayudarían, por ejemplo, al análisis de tumores extirpados. Con ello se facilitaría Ia evaluación de los niveles de ChoKα y el establecimiento de relaciones entre los resultados obtenidos y Ia posible existencia de cáncer en los individuos origen de las muestras analizadas, Ia determinación de su estadio o severidad, el pronóstico
de su posible evolución, el seguimiento de dicha evolución o Ia monitorización del efecto de Ia terapia administrada a un individuo que presente cáncer. Dichos anticuerpos serían de utilidad, además, en cualquier procedimiento en el que se desee detectar y/o cuantificar Ia proteína colina quinasa alfa presente en una muestra cualquiera.
SUMARIO DE LA INVENCIóN
La presente invención proporciona un juego de anticuerpos monoclonales dirigidos contra ChoKα, útiles como herramientas en varias técnicas de biología molecular, incluido el análisis de muestras biológicas, así como en estudios inmunohistoquímicos, especialmente en los que se lleven a cabo sobre muestras de tejido humano como parte de métodos de diagnóstico o pronóstico de Ia existencia de cáncer en dicho tejido, posible uso del que se proporcionan evidencias. Estos anticuerpos constituyen una herramienta específica que permite Ia detección de ChoKα sin interaccionar, por ejemplo, con otra ¡soenzima con Ia que guarda un 70% de homología, Ia colina quinasa beta. La disponibilidad de un reactivo específico que diferencia entre una y otra isoenzima permitió Ia realización de los ensayos descritos en Ia solicitud de patente internacional PCT/ES2006/070047, pendiente de publicar, en los que se demuestra que Ia sobreexpresión de ChoKα , y no Ia de ChoKβ, es capaz de inducir carcinogénesis en seres humanos, estando además los niveles de ChoKα relacionados con Ia severidad del cáncer y con una disminución del tiempo de supervivencia de los individuos que presentan tumores con niveles elevados de ChoKα. Por todo ello, en dicha patente internacional se proporcionan tanto métodos para diagnosticar el tiempo de supervivencia de un paciente aquejado de cáncer como métodos de monitorización del efecto de terapias contra el cáncer, basados ambos en Ia evaluación del nivel de expresión de Ia proteína colina quinasa alfa mediante, por ejemplo, Ia determinación de Ia concentración de dicha proteína en muestras de tejido extraídas del paciente. La realización de dichos métodos no sería posible con los anticuerpos conocidos en el estado de Ia técnica, policlonales e
¡nespecíficos, y requiere de Ia especificidad de los anticuerpos monoclonales cuya obtención y características se describen en Ia presente invención, cuya existencia, al igual que sus propiedades, no han sido hechas accesibles de modo alguno para el público en general en el momento de presentación de Ia presente memoria.
Por tanto, un aspecto de Ia invención Io constituyen los anticuerpos monoclonales AD1 , AD2, AD3, AD4, AD5, AD6, AD7, AD8, AD9, AD10, AD11 , AD12, AD13 y AD14, que se unen específicamente a Ia proteína colina quinasa alfa humana. Un segundo aspecto de Ia invención Io constituyen las líneas celulares de hibridoma capaces de producir los anticuerpos monoclonales AD1 , AD2, AD3, AD4, AD5, AD6, AD7, AD8, AD9, AD10, AD11 , AD12, AD13 y AD14.
Un aspecto más de Ia invención son las composiciones que comprenden uno o más de los anticuerpos monoclonales AD1 , AD2, AD3, AD4, AD5, AD6, AD7, AD8, AD9, AD10, AD11 , AD12, AD13 y AD14.
Un aspecto adicional de Ia invención es el uso de los anticuerpos monoclonales AD1 , AD2, AD3, AD4, AD5, AD6, AD7, AD8, AD9, AD10, AD11 , AD12, AD13 y AD14 para detectar y/o cuantificar Ia presencia de colina quinasa alfa humana en una muestra cualquiera. Otro aspecto más de Ia invención son los métodos de diagnóstico in vitro de cáncer, particularmente cáncer de mama, pulmón, colon, próstata, vejiga o tumores hematológicos, que comprendan Ia detección de proteína colina quinasa alfa humana presente en una muestra biológica tomada de un ser humano y/o Ia cuantificación de Ia proteína colina quinasa alfa humana mediante el uso de uno o más de los anticuerpos monoclonales AD1, AD2, AD3, AD4, AD5, AD6, AD7, AD8, AD9, AD10, AD11 , AD12, AD13 y AD14.
Otro aspecto adicional de Ia invención son los kits de ensayo para el diagnóstico del cáncer, el pronóstico de su evolución, el seguimiento de dicha evolución o Ia evaluación de una terapia contra el cáncer que comprendan al menos uno de los anticuerpos monoclonales de Ia invención: AD1 , AD2, AD3, AD4, AD5, AD6, AD7, AD8, AD9, AD10, AD11 , AD12, AD13 y AD14.
Por último, es también un aspecto de Ia invención el uso de al menos un anticuerpo monoclonal seleccionado de entre AD3, AD8 y AD11 para Ia fabricación de un medicamento destinado a Ia terapia contra el cáncer.
BREVE DESCRIPCIóN DE LAS FIGURAS
La Figura 1 muestra las pruebas realizadas durante Ia generación y selección de los anticuerpos monoclonales e hibridomas de Ia invención. La parte A muestra el análisis por transferencia Western de los sueros de los ratones inmunizados (R1 , R2, R3, R4, R5 y R6), comparados con los resultados obtenidos con un suero preinmune (Preinm.) y un suero policlonal (Polic); en todos los casos, Ia calle 1 corresponde a extractos de células humanas HEK293T transfectadas con un vector vacío, que no expresa ChoKα, como control y Ia calle 2 a células HEK293T que sobreexpresan ChoKα por haber sido transfectadas con un vector de expresión de dicha proteína. La parte B muestra un ejemplo de los ensayos de ELISA realizados durante Ia selección de hibridomas, el correspondiente al hibridoma del anticuerpo AD1: los pocilios de Ia columna de Ia izquierda se recubrieron con ChoKα recombinante y los de Ia derecha con GST y fueron incubados con: (Ctrl.- ):anticuerpo monoclonal anti-GST; AD1 : sobrenadante del medio de cultivo del hibridoma correspondiente al anticuerpo AD1 ; ChoK PoAC (Ctrl.-*-): anticuerpo policlonal anti-ChoKα. La parte C muestra un ejemplo de Ia confirmación de Ia selección de hibridomas por inmunocitoquímica (cytospin) de células HEK293 transfectadas con un vector que no expresa ChoKα (foto marcada como HEK- Ctrl) o con un vector de expresión de ChoKα (foto marcada como HEK+ChoKα) que se sometieron a un proceso de inmunotinción con el sobrenadante de cultivo de un mismo hibridoma.
La Figura 2 muestra un ejemplo de inmunoensayos sobre transferencias Western realizados con anticuerpos de Ia invención. La parte A muestra los resultados obtenidos al incubar usados de células HEK293 transfectadas con un vector vacío (calle marcada como "Vector") o de células HEK293 transfectadas con un vector de expresión de ChoKα (calles marcadas como
"ChoKα) bien con un anticuerpo policlonal anti-ChoKα (fotografía marcada como "ChoK PoAb") o bien con el anticuerpo monoclonal de Ia invención (fotografía marcada como "ChoK MoAb") que se indica sobre cada calle. La parte B muestra los resultados obtenidos al incubar usados de células que expresan Ia colina quinasa α de ratón, NIH3T3-Tmar-9 (calles marcadas con el número 9) o NIH3T-Tmar-11 (calles marcadas con el número 11) con los anticuerpos AD6 y AD9.
La Figura 3 muestra ejemplos de tinción negativa (fotografía superior izquierda), débil (fotografía superior derecha) y fuerte (fotografías inferiores) de muestras tomadas de tumores colorrectales sobre las cuales se había realizado un análisis inmunohistoquímico (IHQ) con los anticuerpo AD9, AD6, AD1 y AD2 tal como se indica bajo cada fotografía.
La Figura 4 muestra el análisis inmunohistoquímico de tumores de pulmón (1) y mama (2) con anticuerpos monoclonales anti-ChoKα representantivos. En cada uno de los casos, las fotografías marcadas con Ia letras A (1A y 2A) y B (1 B y 2B), corresponden a tejidos tumorales fuertemente teñidos, con una leve tinción basal de los tejidos normales adyacentes. Las fotografías marcadas con Ia letra C (1C y 2C) corresponden a muestras de ambos tipos de tumores en las que Ia tinción con estos anticuerpos útiles en inmunohistoquímica resultó negativa. La tinción de contraste se realizó con hematoxilina.
DESCRIPCIóN DETALLADA DE LA INVENCIóN La invención se refiere a los anticuerpos monoclonales AD1 , AD2, AD3,
AD4, AD5, AD6, AD7, AD8, AD9, AD10, AD11 , AD12, AD13 y AD14, que son capaces de unirse de forma específica a Ia proteína colina quinasa alfa (ChoKα), enzima implicada en Ia síntesis de fosfolípidos que ha sido implicada en Ia proliferación celular, Ia transformación y Ia progresión de tumores. En particular, su sobreexpresión parece estar implicada en Ia carcinogénesis de tumores de mama, pulmón, colon y próstata en seres humanos, Io que apunta hacia ella como un marcador potencial de tumores (5,6). La detección y
cuantificación de sus niveles, sin embargo, requiere el desarrollo de herramientas adecuadas para ello, como pueden ser los anticuerpos monoclonales, en especial aquellos que presenten alta especificidad y sensibilidad frente a este antígeno, ChoKα. Por ello, Ia invención proporciona los anticuerpos monoclonales AD1 ,
AD2, AD3, AD4, AD5, AD6, AD7, AD8, AD9, AD10, AD11 , AD12, AD13 y AD 14, cuya especificidad y sensibilidad se demuestra en los Ejemplos que se describen posteriormente. Así, por ejemplo, se observa que, aunque hay un 77% de similitud estructural entre las colina quinasas humana y de ratón (19), sólo los anticuerpos monoclonales AD4 y AD10 se unen de forma eficaz a Ia colina quinasa de ratón (mChoK) en un inmunoensayo realizado sobre proteínas transferidas a membranas de nitrocelulosa, Io que demuestra Ia alta especificidad de los anticuerpos monoclonales de Ia invención, en especial de AD1 , AD2, AD3, AD5, AD6, AD7, AD8, AD9, AD10, AD11 , AD12, AD13 y AD14. También se proporcionan los correspondientes hibridomas capaces de producir cada uno de dichos anticuerpos, Io que permite obtenerlos en grandes cantidades y facilita su purificación.
Los anticuerpos monoclonales de Ia invención constituyen una herramienta útil y fiable para ser utilizados en técnicas básicas de ensayo tales como el inmunoensayo realizado sobre proteínas transferidas a membranas (técnica conocida como transferencia Western y abreviada WB, de su denominación en inglés Western blot) y Ia inmunoprecipitación (IP), por Io que podrían ser excelentes herramientas para incrementar el conocimiento que se tiene de Ia biología de Ia ChoKα o para cualquier tipo de ensayo en el que se desee comprobar Ia presencia de dicha proteína y/o realizar una cuantificación de Ia misma. Por ello, está comprendido dentro del alcance de Ia invención el uso de uno o más anticuerpos monoclonales seleccionados del grupo de AD1, AD2, AD3, AD4, AD5, AD6, AD7, AD8, AD9, AD10, AD11 , AD12, AD13 y AD14 para Ia detección y/o cuantificación de Ia proteína quinasa alfa en una muestra cualquiera. Se tiene especial preferencia por las muestras que sean muestras biológicas, entendiendo como tal cualquier muestra tomada de un ser humano, bien de un tejido suyo o de alguno de los llamados fluidos biológicos, de los
que los más típicos son Ia orina, Ia sangre y el plasma obtenido de Ia misma, aunque también están comprendidas dentro de esta denominación cualquier otro fluido corporal, como puede ser como el líquido cefalorraquídeo o el líquido sinovial. La técnica utilizada para Ia detección y/o cuantificación de Ia proteína colina quinasa alfa humana mediante uno o más anticuerpos monoclonales de Ia invención puede ser cualquiera de las técnicas conocidas por los expertos en Ia técnica, entre las que se incluyen las que hacen uso de transferencias Western, inmunoprecipitación o, en el caso de tejidos, las técnicas inmunohistoquímicas, de las que también se dan describen ensayos concretos con los anticuerpos monoclonales de Ia invención en los Ejemplos que aparecen más adelante.
Los ensayos de inmunoprecipitación realizados para caracterizar los anticuerpos de Ia invención han revelado que los epítopos reconocidos por cada uno de estos anticuerpos no son los mismos, pues algunos de ellos parecen interferir con Ia actividad enzimática, no siendo posible detectar actividad enzimática colina quinasa a partir de proteínas colina quinasa alfa inmunoprecipitadas con algunos de los anticuerpos monoclonales de Ia invención, mientras que otros (AD1 , AD2, AD4, AD5, AD7, AD13 y AD14) no impiden que las proteínas inmunoprecipitadas muestren esta actividad enzimática cuando se les proporciona el sustrato y las condiciones adecuadas. Por ello, estos últimos anticuerpos (AD1 , AD2, AD4, AD5, AD7, AD13 y AD14) son los anticuerpos preferidos para ser utilizados en cualquier ensayo que implique Ia inmunoprecipitación de colina quinasa alfa de manera que dicha proteína conserve su actividad colina quinasa, especialmente AD1 , AD4, AD5, AD7 y AD13, que dan lugar a una mayor grado de actividad enzimática en los inmunoprecipitados generados con ellos.
Otra técnica de importancia clínica en Ia que son útiles los anticuerpos monoclonales son los estudios inmunohistoquímicos, técnica que tiene por objeto Ia detección e identificación in situ de componentes biomoleculares que son parte integral de células y tejidos. Esta técnica puede ser de gran utilidad para el diagnóstico in vitro del cáncer en muestras de tejido tomadas de pacientes, mediante el ensayo de un marcador concreto, del que se conozca su
asociación con el cáncer. Como se ha mencionado, los estudios indican que ChoKα representa un nuevo e importante marcador de tumores, cuya expresión aparece incrementanda en un porcentaje importante de tumores, concretamente en un 40-60% de los tumores de mama, colon, pulmón, próstata, vejiga o tumores hematológicos, habiéndose demostrado también tanto Ia capacidad de inducción de tumores in vivo de Ia sobreexpresión de esta enzima como Ia efectividad de su inhibición como estrategia antitumoral. Incluso, se ha observado una relación entre su nivel de expresión y Ia gravedad de los tumores. Por todo ello, están comprendidos dentro del alcance de Ia invención no sólo el uso de los anticuerpos monoclonales de Ia invención para Ia detección y/o cuantificación de Ia proteína ChoKα mediante técnicas inmunohistoquímicas, aplicadas preferentemente a muestras de tejidos tomadas de seres humanos, especialmente cuando se trate de muestras de tejido de mama, colon, pulmón o vejiga, sino que también está incluido, además, cualquier método para el diagnóstico de cáncer, el pronóstico de su evolución, el seguimiento de dicha evolución o Ia evaluación de Ia respuesta a un tratamiento en el que se detecte y/o cuantifique Ia proteína ChoKα, mediante los anticuerpos monoclonales de Ia invención. El potencial de estos métodos y Ia capacidad de los anticuerpos monoclonales de Ia invención para ser de utilidad en Ia realización de los mismos se demuestra en los ejemplos descritos más adelante, en los que se realizaron ensayos inmunohistoquímicos sobre muestras tomadas de biopsias de pacientes a los que previamente se les había diagnosticado cáncer de mama o pulmón. En Ia mayor parte de los casos, esta técnica permitió distinguir claramente entre el tejido tumoral en el que se sobreexpresa ChoKα (que aparecía fuertemente marcada) del tejido normal circundante, en el que Ia tinción con los anticuerpos anti-ChoKα era sólo tenue. Como se ha comentado, los datos bioquímicos previos de Ia sobreexpresión y el incremento de actividad de ChoKα en tumores humanos demostraron que hay un intervalo del 40% al 60% de incidencia de ChoKα en distintos tipos de cáncer humano (5-7). Por ello, es de esperar que aparezca una tinción basal en los tumores en los que los niveles de ChoKα son similares a los de las células normales circundantes. Por Io tanto, los datos obtenidos en
las pruebas inmunohistoquímicas realizadas con los anticuerpos monoclonales anti-ChoKα de Ia invención son consistentes con los datos bioquímicos previos disponibles y avalan Ia utilidad de dichos anticuerpos monoclonales para Ia identificación de células tumorales mediante métodos inmunohistoquímicos y, por ello, su utilidad como herramienta en métodos de diagnóstico de cáncer, pronóstico de su evolución o evaluación de Ia respuesta a un tratamiento. Es por ello que están comprendidos dentro del alcance de Ia invención los métodos in vito para el diagnóstico de Ia existencia de cáncer en un paciente, el pronóstico de su evolución, el seguimiento de dicha evolución o para Ia evaluación de Ia respuesta a un tratamiento en los que se haga uso de al menos uno de los anticuerpos monoclonales de Ia invención para Ia detección y/o Ia cuantificación de Ia proteína colina quinasa alfa humana, pudiendo ser los estudios en los que se recurra a estos métodos tanto retrospectivos como prospectivos. Se prefiere el uso de los anticuerpos AD1 , AD2, AD4, AD5, AD7, AD13 y AD14 y, dentro de estos, se prefieren especialmente los anticuerpos AD1 , AD4, AD5, AD7 y AD13, por ser los que mayor sensibilidad mostraron en los ensayos realizados. Para Ia realización de estos métodos, se prefiere que las muestras a analizar sean muestras de tejido tomadas de un ser humano, en especial las extraídas de mama, colon, pulmón o vejiga. Por otro lado, en el campo terapéutico, dada Ia utilidad de los inhibidores específicos de ChoKα en estrategias antitumorales, los anticuerpos monoclonales que interfieren con Ia actividad colina quinasa, podrían ser útiles como inhibidores específicos de dicha actividad y, en consecuencia, como compuestos activos antitumorales. En el Ejemplo 2 se demuestra Ia capacidad de los anticuerpos monoclonales de Ia invención AD3, AD8 y AD11 para inhibir Ia actividad enzimática de Ia colina quinasa alfa humana. Por ello, es otro aspecto de Ia invención el uso de al menos un anticuerpo monoclonal seleccionado de entre AD3, AD8 y AD11 para Ia fabricación de un medicamento destinado a Ia terapia contra el cáncer. Como se ha comentado, son también objeto de Ia invención las composiciones que comprendan al menos uno de los anticuerpos AD1 , AD2, AD3, AD4, AD5, AD6, AD7, AD8, AD9, AD10, AD11 , AD12, AD13 y AD14 o
combinaciones de los mismos. Los anticuerpos presentes en estas composiciones pueden estar unidos a distintas sustancias o partículas, que pueden ser bien sustancias o partículas que faciliten su detección o bien sustancias o partículas que faciliten Ia extracción del anticuerpo del medio en el que se encuentre, generalmente con Ia finalidad de aislar los complejos formados tras su reacción con el anticuerpo. Son ejemplos de sustancias que facilitan Ia detección del anticuerpo una molécula radiactiva, un cromóforo, un fluoróforo, o una enzima que catalice alguna reacción que dé lugar a un producto de fácil detección (como puede ser una molécula radiactiva, un cromóforo o un fluoróforo) o que parta de un compuesto en el que Ia disminución de su concentración es también fácil de detectar (que puede ser igualmente una molécula radiactiva, un cromóforo o un fluoróforo). Los ejemplos típicos de las sustancias o partículas que facilitan Ia extracción del anticuerpo del medio en el que se encuentren son las partículas metálicas o las partículas magnéticas, que posibilitan el aislamiento de las moléculas acopladas a ellas mediante Ia utilización de campos magnéticos; también es un ejemplo de tales sustancias o partículas como cualquier molécula que posea una alta afinidad por otra y que posibilite que el anticuerpo se una a algún tipo de matriz o medio sólido al cual esté ligada Ia segunda molécula por Ia cual Ia molécula unida al anticuerpo presenta alta afinidad.
Son también realizaciones preferidas de las composiciones de Ia invención aquellas que comprendan adicionalmente un segundo anticuerpo capaz de unirse a al menos un anticuerpo de Ia invención presente en Ia composición de Ia invención. Se prefieren los segundos anticuerpos que interaccionen con el fragmento Fc de los anticuerpos de Ia invención, para que no interfieran con su unión al antígeno colina quinasa alfa humana. El segundo anticuerpo puede ser de cualquier origen, bien un anticuerpo anti-lgG de ratón generado en cabra tal como el utilizado en los ejemplos descritos posteriormente, o generado en cualquier otra especie. Preferiblemente, el segundo anticuerpo estará unido a otra sustancia o partícula, que pueden ser bien una sustancia que faciliten su detección o bien una sustancia o partícula que facilite Ia extracción del anticuerpo del medio en el que se encuentre,
generalmente con Ia finalidad de aislar los complejos formados tras su reacción con el anticuerpo. Los ejemplos de estas sustancias o partículas son los mismos que los mencionados en el caso de las posibles sustancias o partículas unidas a los anticuerpos de Ia invención. Finalmente, es también un objeto de Ia invención un kit para el diagnóstico del cáncer, el pronóstico de su evolución, el seguimiento de dicha evoluación o Ia evalución de una terapia contra el cáncer que comprenda al menos uno de los anticuerpos monoclonales de Ia invención. Se prefieren aquellos kits que comprendan un segundo anticuerpo capaz de unirse a al menos un anticuerpo de Ia invención presente en el kit de Ia invención. Como en el caso de las composiciones de Ia invención, se prefieren los segundos anticuerpos que interaccionen con el fragmento Fc de los anticuerpos de Ia invención. El segundo anticuerpo puede ser de cualquier origen, bien un anticuerpo anti-lgG de ratón generado en cabra tal como el utilizado en los ejemplos descritos posteriormente, o generado en cualquier otra especie que no sea ratón. Preferiblemente, el segundo anticuerpo estará unido a otra sustancia o partícula, que pueden ser bien una sustancia que faciliten su detección o bien sustancia o partícula que faciliten Ia extracción del anticuerpo del medio en el que se encuentre.
La invención se explicará ahora con más detalle gracias a los Ejemplos y las Figuras que aparecen a continuación.
EJEMPLOS
Los ejemplos que se describen a continuación describen los procedimientos seguidos para Ia generación de los anticuerpos monoclonales, su caracterización y el ensayo de su capacidad para ser utilizados en pruebas inmunohistoquímicas. Los detalles de los mismos fueron los siguientes:
Ejemplo 1.- Generación de anticuerpos monoclonales
La generación de los anticuerpos monoclonales se llevó a cabo en las siguientes fases:
1.1.- Preparación del antígeno La expresión y purificación del antígeno para el cual se desean generar los anticuerpos, Ia ChoKα humana, se llevó a cabo tal como se ha descrito previamente en forma de proteína de fusión GST-ChoKα (5,4,15). Brevemente, se subclonó el cDNA que codifica para Ia ChoKα humana en un vector de expresión procariota, pGEX-4T2, vector que posee Ia secuencia codificante de Ia glutation-S-transferasa, de manera que Ia expresión de dicho vector da lugar a una proteína de fusión GST-ChoKα. La presencia de Ia proteína GST, que tiene capacidad de unirse a una fase semisólida de sefarosa que lleve unido glutation, facilita Ia semipurificación de Ia proteína de fusión del resto de proteínas bacterias. Por ello, se siguió un procedimiento estándar para Ia purificación mediante el método de Ia glutatión-sefarosa siguiendo las instrucciones del fabricante (Amersham Biosciences Europe, Alemania). Una vez liberada Ia ChoKα de Ia GST mediante proteolisis con trombina, Ia ChoKα parcialmente purificada se resolvió mediante electroforesis de proteínas en geles de poliacrilamida con SDS (SDS-PAGE). Se extrajo del gel Ia zona que contenía Ia banda correspondiente a ChoKα y el fragmento de gel extraído se homogeneizó en PBS con el adyuvante de Freund, bien completo o bien incompleto (suministrado en ambos casos por Sigma-Aldrich, MO, EE.UU.) (1:1 , volumen:volumen) según Ia fase de inmunización en Ia que se deseara utilizar Ia emulsión obtenida.
1.2.- Inmunización de los ratones
Se inmunizaron por vía intraperitoneal (i.p.) seis ratones de 8 semanas de edad, de Ia cepa Balb/c, siguiendo el siguiente calendario:
- Día 1: inyección i.p. de 0,5 mi de homogeneizado de antígeno, que contenía 100 μg de ChoKα recombinante purificada con adyuvante completo de Freund.
- Día 15 (dosis de refuerzo 1): inyección i.p. de 0,5 mi de homogeneizado de antígeno, que contenía 100 μg de ChoKα recombinante purificada pero, en este caso, mezclada con el adyuvante de Freund incompleto. - Día 30 (dosis de refuerzo 2): inyección i.p. de 0,5 mi de homogeneizado de antígeno, que contenía 100 μg de ChoKα recombinante purificada mezclada con el adyuvante de Freund incompleto.
- Día 40 (testado de Ia generación de anticuerpos frente a ChoKα en el suero de los ratones). Los ratones con una respuesta inmune positiva frente a ChoKα se identificaron mediante transferencia tipo Western frente a Ia proteína parcialmente purificada, tal como se muestra en Ia parte A de Ia Figura 1. De todos los ratones, se seleccionaron para Ia fusión los ratones 2 y 4 (el 2 para inyección intravenosa y el 4 para inyección intraperitoneal), por ser los que presentaban menos bandas inespecíficas. - Día 42 (dosis de refuerzo 3): inyección i.v. (ratón 2 ) o i.p. (ratón 4) de
0,5 mi de homogeneizado de antígeno, que contenía 100 μg de ChoKα recombinante purificada mezclada con el adyuvante de Freund incompleto.
- Día 45: Fusión.
1.3.- Fusión
Los ratones seleccionados se prepararon mediante fusión de esplenocitos 3 días después de Ia última dosis de refuerzo. Los bazos se extrajeron de forma aséptica de cada uno de los ratones y se depositaron en una placa que contenía 10 mi de Medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) sin suero, se procedió al disrupción del tejido hasta que Ia mayor parte de las células se hubieron liberado, y luego se recogieron los esplenocitos descartando los trozos de tejido de mayor tamaño (16). Para cada fusión se utilizó un total de 10 8 esplenocitos y 10 7 células de mieloma NS-1 , que se cultivaron en medio suplementado con 10% de suero en condiciones estándar de temperatura y humedad, y con un 5% de CO 2 .. Después de 24 horas de incubación, las células se pasaron a medio fresco suplementado con FBS al 10% a una concentración final de 5 x 10 6 células/ml. Para Ia fusión de
células se utilizó 1 mi de DMEM sin suero que contenía 0,5 g de PEG 1500 (Roche) a 5O 0 C.
1.4.- Selección, cribado y clonación de colonias híbridas Los híbridos de interés se seleccionaron manteniendo las células 15 días en medio HAT suplementado siguiendo las recomendaciones del fabricante (GIBCO, Invitrogen, California, EE.UU.), medio en el cual se produce Ia muerte celular de todas aquellas células que no corresponden a moléculas híbridas de las dos poblaciones entre las que se ha realizado Ia fusión. Los hibridomas se clonaron mediante Ia técnica de dilución límite, de Ia que se realizaron dos rondas consecutivas de crecimiento.
La tercera semana después de Ia fusión, se realizó el cribado de 149 colonias híbridas examinado si producían anticuerpos. Debido a su simplicidad y al elevado número de muestras que se pueden comprobar al mismo tiempo, Ia selección de colonias híbridas positivas respecto a Ia producción de inmunoglobulinas se llevó a cabo mediante ELISA. Los detalles del ELISA se describen a continuación:
Se recubrieron placas multipocillo de microtitulación (NUNC, Alemania) utilizando 50 μl/pocillo de ChoKα recombinante a 5 μg/ml o GST en agua destilada. Después de una hora de incubación a 37 0 C, las placas se lavaron con PBS/Tween 20 al 0,05%, y se bloquearon con leche al 10% en PBS, durante toda Ia noche a 4 0 C. Se lavaron las placas y se incubaron con 50 μl/pocillo de sobrenadante durante 1 hora a 37 0 C. Se lavaron los pocilios, y se añadió un anticuerpo secundario de cabra anti-ratón con HRP (peroxidasa de rábano) (Dako Cytomation, California), a una dilución 1 :1000. Las placas se incubaron durante 1 hora a 37 0 C, se lavaron y se revelaron utilizando una solución con el sustrato colorimétrico ABTS (BIO-RAD, California). La reacción se paró mediante Ia adición de 100 μl de SDS al 0,5%.
La mayor parte de los sobrenadantes de cultivo de las colonias híbridas presentaba reacción positiva frente al antígeno ChoKα, pero sólo las colonias que mostraron una reacción de color más fuerte que el anticuerpo policlonal fueron seleccionadas para continuar con su análisis. Así, se seleccionaron 19
colonias de hibridomas y se clonaron utilizando Ia técnica de Ia dilución límite. Para asegurar que el cultivo fuera monoclonal, se llevaron a cabo dos rondas consecutivas de subclonación en una placa de 96 pocilios. Se obtuvieron un total de 49 clones positivos, con los se continuó con los ensayos referentes a Ia producción de anticuerpos.
1.5. Selección de clones
La selección de los clones positivos respecto a Ia producción de inmunoglobulinas se llevó a cabo mediante dos métodos consecutivos: ELISA y inmunotinción en cytospin. El ELISA se llevó a cabo de forma análoga a Ia descrita en Ia sección 1.4, con el fin de confirmar los resultados obtenidos durante el proceso de clonación. De los 49 clones iniciales en los que se había comprobado Ia producción de anticuerpos anti-ChoKα, se seleccionaron 14 clones que reconocían con fuerza el antígeno mediante ELISA, a los que se denominó AD1-AD14. Un ejemplo del ELISA de selección, el correspondiente al hibridoma del anticuerpo AD1 , se muestra en Ia parte B de Ia Figura 1.
Para obtener una confirmación adicional de estos resultados y asegurarse de que los anticuerpos seleccionados podían reconocer Ia ChoKα en condiciones nativas, se llevó a cabo una inmunotinción en cytospin, técnica basada en Ia centrifugación de células sobre un portaobjetos utilizando un cásete y un rotor especial (vasculante), de manera que las células quedan pegadas en el portaobjetos como células enteras que no sufren alteraciones y mantienen su estructura original. Para ello, se utilizó como control positivo células embrionarias de riñon humano HEK293 transfectadas de forma transitoria con el vector de expresión de Ia secuencia codificante del gen de ChoKα y como control negativo células transfectadas con el vector vacío pCDNA3b; ambas líneas celulares habían sido cultivadas en medio DMEM suplementado con 10% de suero en condiciones estándar de temperatura y humedad, y con un 5% de CO 2 .. Para ello, se colocaron en un portaobjetos un total de 2,5 x 10 4 células HEK293 transfectadas, se cargaron en un tubo de cytospin, y se centrifugaron a 800 rpm durante 3 minutos. En este caso, las células transfectadas se adhieren al portaobjetos por Ia centrifugación de las
mismas (cytospin), Io que permite llevar a cabo con ellas un ensayo de inmunodetección (inmunotinción) utilizando el medio de cultivo de hibridomas como anticuerpo primario. Después de bloquear los sitios de unión inespecíficos con una solución bloqueante de peroxidasa, los portaobjetos que contenían las células adheridas se incubaron con los sobrenadantes de las colonias híbridas durante 30 minutos a temperatura ambiente. Tras dos lavados con PBS, se aplicó un anticuerpo secundario anti-ratón durante 1 hora a temperatura ambiente y se reveló mediante procedimientos estándar utilizando DAB. Un ejemplo de los resultados obtenidos se muestra en Ia parte C de Ia Figura 1.
Los resultados de las inmunodetecciones realizadas sobre cytospins confirmaron que Ia totalidad de los 14 hibridomas seleccionados producía anticuerpo que reconocen de forma eficiente ChoKα en condiciones nativas. Así, se seleccionaron un total de 14 clones diferentes, todos ellos provenientes de Ia fusión realizada con células procedentes del ratón 4, y que resultaron ser positivos respecto a Ia producción de inmunoglobulinas anti-ChoKα utilizando los dos métodos de cribado. Con estos clones se llevaron a cabo pruebas para su caracterización.
Ejemplo 2.- Caracterización de los anticuerpos monoclonales generados
La caracterización de los hibridomas generados y de los anticuerpos monoclonales que producen se realizó mediante las siguientes técnicas:
- isotipado
- transferencia Western - inmunoprecipitación
Los resultados obtenidos se muestran en Ia Tabla 1.
Tabla 1.- Caracterización de los anticuerpos monoclonales AD1-AD14
1 WB: detección de proteínas transferidas a membranas 2 IP: inmunoprecipitación
*: Análisis en el que se aplicó un sistema arbitrario de cuantificación, en el que Ia reactividad obtenida se clasificó en las siguientes categorías:
+++: excelente
++: buena
+: baja
-: sin reacción detectable
10 Los detalles de ejecución de cada una de las pruebas fueron los siguientes:
2.1.- Isotipado
La determinación de Ia clase y Ia subclase de los anticuerpos es útil para i 5 predecir las propiedades del anticuerpo y es necesaria para utilizarlos apropiadamente. El conocimiento de estas propiedades facilita Ia correcta elección del anticuerpo secundario que reconoce el anticuerpo monoclonal producido, o del tipo de resina que se une de forma eficaz al anticuerpo. Además, también es una primera indicación de monoclonalidad (17).
20 Según el esquema de inmunización seguido, sería esperable una respuesta inmune en los ratones tratados en Ia que los anticuerpos producidos fueran predominantemente de Ia clase de las inmunoglobulinas G (18). Los
anticuerpos tipo IgG muestran a menudo afinidades mayores por los antígenos que otras clases generadas en una respuesta primaria. Tal como se muestra en Ia Tabla 1 , las cadenas pesadas de los anticuerpos monoclonales generados son cadenas γ de Ia subclase 1 excepto en el caso de anticuerpo monoclonal AD14, que es de Ia subclase 2a, cadenas pesadas que forman todas ellas anticuerpos de Ia clase de las inmunoglobulinas G. Las cadenas ligeras eran todas de Ia clase K. Por ello, en los experimentos siguientes se utilizó un anticuerpo anti-lgG de ratón como anticuerpo secundario.
2.2,- Análisis por transferencia Western (WB)
Las inmunoensayos llevados a cabo sobre proteínas transferidas a membranas son esenciales para establecer Ia auténtica especificidad de los anticuerpos con respecto a Ia proteína de interés (17,18). Por ello, se investigó el uso potencial de los anticuerpos monoclonales producidos en transferencias Western (WB). Con ese objetivo, se transfectaron células HEK293 con el plásmido que contenía Ia secuencia codificante del gen de Ia ChoKα humana o con un vector vacío como control negativo. Muestras de cultivos de estas células se homogeneizaron y usaron en un tampón que contenía MgCb 1 ,5 mM, EDA 0,2 mM, NaCI 0,3 M, HEPES 25 mM pH 7,5, β-glicerofosfato 20 mM y Tritón X-100 al 0,1% con un cóctel de inhibidores de proteasas, solución a Ia que se denominará en adelante tampón de lisis. Se separaron cantidades iguales de usados de células (30 μg) mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS al 10% (SDS-PAGE) tal como se ha descrito previamente (5) y se transfirieron las proteínas a una membrana de nitrocelulosa. La unión específica se detectó utilizando un kit de detección por quimioluminiscencia ECL (Amersham) siguiendo las instrucciones del fabricante. Cada medio de cultivo correspondiente a uno de los 14 hibridomas seleccionados se incubó separadamente, y como control positivo se utilizó un antisuero policlonal generado contra ChoKα humana previamente descrito (1). 13 de los 14 medios seleccionados resultaron positivos. La parte A de Ia Figura 2 muestra un experimento representativo de este ensayo. No se observaron
reacciones cruzadas o bandas inespecíficas, Io que es una indicación de Ia especificidad de los anticuerpos.
Adicionalmente, se ensayó si los anticuerpos monoclonales generados eran capaces de reconocer Ia ChoKα de ratón (mChoK). Para ello, se utilizaron fibroblastos NIH3T3 que sobreexpresaban de forma estable Ia mChoK (células NIH3T3-Tmar-9 y NIH3T3-Tmar-11), que se mantuvieron en medio DMEM suplementado con 10% de suero en condiciones estándar de temperatura y humedad, y con un 5% de CO 2 . Se obtuvieron usados de estas células de forma análoga a Ia descrita en el ensayo de Ia transferencia Western de las células HEK293T (transfectadas) recién descrito, que se resolvieron igualmente por Ia técnica de SDS-PAGE, transfiriendo las proteínas a membranas de nitrocelulosa, que fueron incubadas con los 14 medios de cultivo. El experimento, demostró que, aunque hay un 77% de similitud estructural entre las colina quinasas humana y de ratón (19), sólo los anticuerpos monoclonales AD6, AD9 y AD11 fueron capaces de unirse de forma eficaz a Ia mChoK en el inmunoensayo realizado sobre proteínas transferidas a membranas de nitrocelulosa. Los resultados obtenidos con dos de estos anticuerpos, AD6 y AD9, se muestran en Ia parte B de Ia Figura 2.
2.3.- Inmunoprecipitación
La inmunoprecipitación (IP) es una de las técnicas inmunoquímicas más ampliamente utilizadas. Con el fin de caracterizar Ia capacidad de los anticuerpos generados para inmunoprecipitar ChoKα, se recubrieron microperlas de proteína G-Sefarosa con cada uno de los anticuerpos monoclonales generados y se probó su capacidad de provocar Ia inmunoprecipitación de ChoKα presente en usados de células HEK293 transfectadas. Para ello, el medio de cultivo de cada uno de los hibridomas se diluyó 1 :100 en tampón de lisis y se incubó con microperlas recubiertas de Proteína G bloqueada con BSA (Sigma-Aldrich, MO) durante 1 hora a 4 0 C. Después de tres lavados en tampón de lisis, los usados de células se inmunoprecipitaron con los anticuerpos monoclonales ligados a las microperlas.
Para cuantificar Ia capacidad relativa de los anticuerpos monoclonales producidos para precipitar ChoKα, se llevó a cabo un ensayo radioactivo in vito de actividad enzimática colina quinasa en los inmunoprecipitados, basado en Ia fosforilación de colina para dar lugar a o-fosfocolina (P-Cho) tal como se ha descrito previamente (12,14), en presencia de cloruro de metil-[ 14 C]-colina (50- 60 μCi/mmol, Amersham Biosciences Europe, Alemania) a 37 0 C durante 30 minutos. Las muestras se resolvieron mediante cromatografía en capa fina (TLC) y se cuantificó Ia 14 C-PChO. Puesto que Ia única fuente de actividad ChoK es Ia fracción inmunoprecipitada, si el anticuerpo ha sido eficaz en Ia inmunoprecipitación, habrá actividad ChoK detectable y se generará PCho.
Según se muestra en Ia Tabla 1 , un total de 7 de los 14 anticuerpos monoclonales analizados (AD1 , AD2, AD4, AD5, AD7, AD13, AD14) generaron ChoKα inmunoprecipitada de forma que fuera funcional y Ia enzima inmunoprecipitada fuera completamente activa. Sin embargo, Ia interacción de algunos de los anticuerpos con Ia ChoKα podría interferir con su actividad enzimática y, aun siendo capaz de inmunoprecipitar Ia proteína ChoKα, dar lugar a una valoración negativa en el ensayo de actividad enzimática.
Para evaluar esta última posibilidad, Ia capacidad para inmunoprecipitar ChoKα se determinó también mediante transferencia Western utilizando el anticuerpo policlonal para reaccionar con Ia posible ChoKα inmunoprecipitada por los anticuerpos monoclonales que dieron resultados negativos en el ensayo enzimático. Como se muestra en Ia Tabla 1, los anticuerpos monoclonales AD3 y AD8 y, en menor medida, AD11 , fueron capaces de inmunoprecipitar ChoKα. Estos resultados sugieren que algunos de los anticuerpos monoclonales pueden interferir con Ia actividad enzimática de ChoKα, dando lugar a Ia ausencia de actividad ChoK en los inmunoprecipitados.
Ejemplo 3.- Pruebas inmunohistoquímicas
Finalmente, se analizó el uso potencial de los anticuerpos generados para inmunohistoquímica (IHC). Los anticuerpos monoclonales se ensayaron primero en cytospines de células embebidas en parafina que sobreexpresaban
ChoKα en condiciones experimentales óptimas. Para asegurar concentraciones
elevadas del antígeno, se transfectaron células HEK293 con el plásmido que codifica ChoKα o con el vector vacío pCDNA3b como control negativo y se cultivaron las células en medio DMEM suplementado con 10% de suero en condiciones estándar de temperatura y humedad, y con un 5% de CO 2 . Alrededor de 10 millones de células HEK293T (transfectadas) que sobreexpresaban ChoKα humana se centrifugaron mediante Ia técnica de cytospin y las células sedimentadas se embebieron en parafina líquida, siguiendo con ellas un procedimiento análogo al que se realiza habitualmente con secciones de tejido, tanto en laboratorios de investigación como en los servicios de anatomía patológica de los distintos hospitales. Después de 24 horas de fijación en formalina/acético/alcohol (FAA), los sedimentos celulares de deshidrataron comenzando con etanol al 50% durante 30 minutos e incrementando gradualmente Ia concentración de alcohol al 100%. Los sedimentos se introdujeron en xileno después de su inclusión en parafina líquida, para proceder a su aclaramiento.
A continuación, se llevaron a cabo citoinmunotinciones con anticuerpos monoclonales de Ia invención, obteniéndose un fuerte mareaje citoplasmático específico en células transfectadas HEK293T/ChoKα. Estos resultados indican que los anticuerpos monoclonales generados son capaces de reconocer ChoKα también en células embebidas en parafina, y mostrando una elevada afinidad por ChoKα.
Puesto que ChoKα ha sido descrita recientemente como un nuevo oncogén (4) con alta incidencia en el cáncer humano (5-7), se ensayó también el uso potencial de los anticuerpos monoclonales en el diagnóstico del cáncer mediante análisis inmunohistoquímico (IHC) de muestras humanas, llevando a cabo pruebas inmunohistoquímicas de tinción de ChoKα en unas cuantas biopsias, de pacientes del Hospital La Paz (Madrid, España) a los que previamente se les había diagnosticado cáncer de mama y que se habían almacenado embebidas en parafina según el procedimiento estándar. Los bloques de parafina de las distintas muestras se cortaron en secciones de 5 μm. Posteriormente, se desparafinaron las secciones y se bloqueó Ia actividad peroxidasa endógena por incubación en H 2 O 2 al 3% en metanol durante 10
minutos a temperatura ambiente. Los antígenos se recuperaron mediante Ia incubación en EDTA 940 μM, pH 7,2, durante 45 minutos a 155 0 C. El anticuerpo monoclonal primario anti-ChoK se diluyó 1 :2 en TBS con BSA al 1%. Las secciones de tejido se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. Las secciones se sumergieron en TBS y se incubaron con el kit de EnVision™ (Dako Cytomation, CA), basado en peroxosidasa, durante 30 minutos a temperatura ambiente. Las muestras se incubaron luego con el sustrato cromógeno diaminobencidina (Dako Cytomation, CA) durante 5 minutos a temperatura ambiente. Las secciones se contratiñeron con hematoxilina. En Ia Figura 3 pueden observarse los resultados obtenidos con muestras tomadas de tumores colorrectales de distintos pacientes, en los que se puede observar un ejemplo de anticuerpo no válido para inmunohistoquímica, AD9 (tinción negativa), un anticuerpo no recomendable para su uso en esta técnica al mostrar un patrón de tinción débil, AD6, y dos ejemplos de anticuerpos, AD6 y AD1 , considerados como buenos para su uso en inmunohistoquímica, por dar lugar a una fuerte tinción del tejido tumoral y tinción basal baja del tejido normal adyacente.
En Ia Figura 4 pueden observarse los resultados obtenidos con el anticuerpo AD1 (considerado válido para el análisis de Ia expresión de ChoKα por inmunohistoquímica) en biopsias procedentes de tejido de mama cancerosa (segunda fila, marcada con el número 2), así como en biopsias correspondientes a pacientes a los que se les había diagnosticado cáncer de pulmón, entre las que había muestras de cáncer NSCLC y SCLC (primera fila, marcada con el número 1). El análisis de las biopsias teñidas muestra un fuerte mareaje de algunos de los tejidos tumorales, mientras que en el tejido normal adyacente se observó una tenue tinción. Sin embargo, en algunas biopsias tanto las células tumorales como las de tejido normal mostraron tinción basal de ChoKα. Estos resultados están en consonancia con estudios previos de los autores de Ia invención, en los que un 40-60% de los tumores de mama, pulmón, colon y próstata mostraron un incremento de los niveles de ChoKα o de Ia actividad colina quinasa.
De los 14 anticuerpos monoclonales, con 10 de ellos se obtuvo inmunotinción, dando lugar a resultados similares en muestras correspondientes a los mismos tejidos, mientras que los 4 restantes resultaron dieron resultados negativos en el análisis IHQ. El comportamiento de cada uno de los anticuerpos se resume en Ia Tabla 2.
Tabla 2.- Comportamiento de los anticuerpos monoclonales en ensayos inmunohistoquímicos
*: La valoración dada a Ia reactividad obtenida fue: +++ excelente ++ buena + baja -: sin reacción detectable
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