GHIURUTAN, Christina-Laura (Taimerhofstrasse 18, München, 81927, DE)
FEUCHT, Hans-Dieter (Eschenweg 7, Renningen, 71272, DE)
GHIURUTAN, Christina-Laura (Taimerhofstrasse 18, München, 81927, DE)
Patentansprüche
1. Aminofunktionelles Haftvermittlersystem für Edelmetall - Oberflächen, umfassend: Edelmetall, eine Oberfläche aufweisend; und ein N-Aminoalkyl- (ω-thio) -Carbonsäureamid mit der Formel (D
worin das N-Aminoalkyl- (ω-thio) -Carbonsäureamid über den Thiolrest auf der Oberfläche immobilisiert ist und worin R 1 und R' ' unabhängig voneinander C 5 -C 80 sind.
2. Aminofunktionelles Haftvermittlersystem für Edelmetalloberflächen nach Anspruch 1, worin das Edelmetall ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Cu, Ru, Rh, Pd, Ag, Re, Os, Ir, Pt, Au und Hg.
3. Aminofunktionelles Haftvermittlersystem für Edelmetalloberflächen nach Anspruch 2, worin das Edelmetall Au ist.
4. Aminofunktionelles Haftvermittlersystem für Edelmetalloberflächen nach einem der vorstehenden Ansprüche, worin R' und R' ' unabhängig voneinander substituierte oder nicht- substituierte Alkylreste sind.
5. Aminofunktionelles Haftvermittlersystem für Edelmetalloberflächen nach einem der vorstehenden Ansprüche, worin R' und R' ' unabhängig voneinander lineare Alkylreste sind.
6. Aminofunktionelles Haftvermittlersystem für Edelmetall - Oberflächen nach einem der Ansprüche 4 oder 5, worin R' und R' ' unabhängig voneinander C 5 -Cso sind.
7. Aminofunktionelles Haftvermittlersystem für Edelmetall- Oberflächen nach einem der vorstehenden Ansprüche, worin an 50-95% der Oberfläche N-Aminoalkyl- (ω-thio) -Carbonsäureamid immobilisiert ist.
8. Aminofunktionelles Haftvermittlersystem für Edelmetalloberflächen nach einem der vorstehenden Ansprüche, worin an 90-95% der Oberfläche N-Aminoalkyl- (ω-thio) -Carbonsäureamid immobilisiert ist.
9. Verfahren zur Herstellung eines aminofunktionellen Haftvermittlersystems für Edelmetalloberflächen, umfassend die Schritte von:
(i) Bereitstellen eines Edelmetalls mit einer Oberfläche; (ii) Immobilisieren eines ω-Carboxylalkylthiols über den
Thiolrest auf der Oberfläche;
(iii) Wahlweise Aktivieren des ω-Carboxylalkylthiols; und
(iv) Binden eines {1, ω) -Diaminoalkyls an den Carboxylrest des ω-Carboxylalkylthiols ;
10. Verfahren nach Anspruch 8, wobei in Schritt (iii) die Aktivierung des ω-Carboxylalkylthiols durch ein Carbodiimid o- der N-Hydroxy-succinimid erfolgt.
11. Verfahren nach Anspruch 9, wobei das Carbodiimid 1-Ethyl- 3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimid ist .
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 9-11, wobei in Schritt (i) das Edelmetall mit gereinigter Oberfläche bereitgestellt wird.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 9-12, wobei in Schritt (iv) das (1, ω) -Diaminoalkyl mit einer Schutzgruppe versehen ist.
14. Verwendung des aminofunktionellen Haftvermittlersystems für Edelmetalloberflächen nach den Ansprüchen 1-8 zur Herstellung eines Biochips, in der Katalyse, oder Modifizierung von Edelmetalloberflächen unter Beibehaltung der Leitfähigkeit. |
Beschreibung
Aminofunktionelles Haftvermittlersystem für Edelmetalloberflächen
Die vorliegende Erfindung betrifft selbstorganisierende Mono- schichten (SAMs) . Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere die Herstellung eines verbesserten Haftvermittlersystems für Edelmetalloberflächen, wie sie bei SAMs zum Einsatz kommen, sowie die Herstellung und Verwendung des Haftvermittlersystems. Aufgrund des Herstellungsverfahrens weist das erfindungsgemäße Haftvermittlersystem keine oberflächendeckende Monoschichten auf, so dass an der frei zugänglichen Edelmetalloberfläche elektrochemische Reaktionen stattfinden kön- nen .
Ein erheblicher Anteil des Edelmetallverbrauchs, beispielsweise 10% des Goldverbrauchs, geht auf Anwendungen in der Elektrotechnik und Elektronik zurück. Edelmetalle, insbeson- dere Gold, dienen hierbei zur Herstellung hochwertiger Drahtverbindungen und Kontakte, sowie auch zur Herstellung von Thermoelementen und Ultrarotreflektoren. So werden im Korrosionsschutz oder als Barriereschichten gegen Gasdiffusion insbesondere dünne Goldauflagen eingesetzt. Bei den vorste- hend aufgeführten Anwendungen besteht ein wesentlicher Vorteil von Gold oder der anderen Edelmetallen in der hohen Beständigkeit gegenüber Korrosion oder Chemikalien. Diese Eigenschaft geht im Wesentlichen auf die Tatsache zurück, dass Edelmetalle nur unter extremen Bedingungen eine Oxidschicht ausbilden. Bei den meisten dieser Anwendungen wird daher die Oberfläche der Edelmetallschicht aus reinem Edelmetall gebildet.
Die geringe Neigung von Edelmetallen zur Oxidation oder zum Eingehen anderer chemischen Verbindungen spiegelt sich in den hohen Redoxpotentialen und der niedrigen Polarität wieder. Derart niederenergetische (unpolare) Oberflächen von Edelmetallen weisen jedoch eine geringe Oberflächenenergie auf, was
den Nachteil mit sich bringt, dass ein zusätzliches Funktionalisieren der Goldoberfläche, wie beispielsweise durch Lacke oder Klebstoffe, erschwert ist. So gilt allgemein beim Aufbringen von Substanzen auf Oberflächen, dass die Grenzflä- chenenergie der Oberfläche mindestens so groß sein sollte, wie die Oberflächenspannung der aufzubringenden Substanz.
Eine der wenigen Möglichkeiten zur nachträglichen Funktiona- lisierung von Edelmetalloberflächen liegt daher in der Be- handlung mit organischen Thiolen oder Dithiolen. Goldoberflächen lassen sich beispielsweise durch Umsetzung mit n- Alkylthiolen (V.M. Mirsky et al . , Biosensors & Bioelectro- nics, 12 (9-10) (1997) , 977-989) oder Di-n-Alkyldisulfiden (M. Glodde et al . , Intern. J. of Adhesion & Adhesives 18 (1998) , 359-364) hydrophobieren. Es bilden sich hochorientierte selbstorganisierende Monoschichten (A. Ulman, An lntroduction to Ultrathin Organic Films: From Langmuir- Blödgett to Seif-Assembly. Academic Press, Boston, MA 1991, 254-281; L. H. Dubois und R.G. Nuzzo, Annu . Rev. Phys . Chem. 43 (1992) , 437-463) .
Eine selbstorganisierende Monoschicht bildet sich im Allgemeinen spontan beim Eintauchen in geeignete oberflächenaktive oder organische Substanzen, wie beispielsweise Alkanthiole, Trichlorsilane und Fettsäuren, die in Lösung oder suspendiert vorliegen können. Diese Substanzen bilden auf Edelmetallen aber auch anderen Elementen, wie beispielsweise Silizium, einfache Monoschichten mit einer hohen inneren Ordnung. Derart behandelte Oberflächen sind in Luft über längere Zeiträu- me stabil. Im Gegensatz zu herkömmlichen Beschichtungsverfah- ren, wie beispielsweise der chemischen Gasphasenabscheidung, weisen SAMs eine definierte Schichtdicke im Bereich von ungefähr 0,1 bis 2 nm auf.
Die so erhaltenen selbstorganisierenden Monoschichten können wiederum im Anschluss durch die Kopplung mit weiteren funktionellen Gruppen modifiziert werden. Die einfache Herstellung einer Monoschicht auf beispielsweise einer Goldoberfläche ist
daher die wesentliche Ursache dafür, dass diese Systeme im Bereich der Biosensoren für die Anbindung von Biomolekülen eine gängige Methode darstellen (X. Kang et al, Electroche- mistry Communication (2001) 489-493) .
Bei der Herstellung organischer Monoschichten durch Selbstorganisation von Organothiolen ist hierbei die Wahl geeigneter Moleküle entscheidend, die drei funktionell verschiedene Untereinheiten aufweisen müssen,- die Ankergruppe, die an die Substratoberfläche bindet, den Mittelteil, der gewissermaßen als Rückrat für die Orientierung und mechanische Stabilität der Filme verantwortlich ist, sowie die Endgruppe, die die physikalischen und chemischen Eigenschaften bzw. die Funktionalität der entstehenden Filme bestimmt. Im Fall der Orga- nothiole ist der Anker eine Thiofunktion (-SH) , die beim Kontakt mit den Münzmetallen Au, Ag, Cu stabile Thiolate ausbildet. Bei dem eigentlichen Adsorptionsvorgang, z. B. auf Goldoberflächen, reagiert die SH-Gruppe unter Abspaltung von Wasserstoff zu einem stabilen Goldthiolat . Die entstandene Bin- düng weist einen ausgeprägt kovalenten Charakter mit einer
Bindungsstärke von ca. 130 kJ mol "1 auf. Dementsprechend sind die Filme bis zu Temperaturen von über 120 0 C stabil.
Selbstorganisierende Monoschichten werden beispielsweise in der Halbleitertechnologie zur Oberflächenstabilisierung und maßgeschneiderten Funktionalisierung von Elektroden eingesetzt. Je nach Länge der verwendeten Alkylketten wird dabei die Permeabilität und die Ladungstransfergeschwindigkeit be- einflusst . Das Anwendungsgebiet von mit selbstorganisierenden Monoschichten modifizierten Elektroden ist sehr breit. Unter anderem wird die Technik der selbstorganisierenden Mono- schicht beim elektrochemischen Rastertunnelmikroskop, bei Zelluntersuchungen, bei der ξensorik und in der Nanoelektronik verwendet .
Eine aktuelle Anwendung ist die Ausrüstung von Mess-Punkten (Messspots) mit interdigitalen Goldelektroden auf Biochips mit Thiol-modifizierten Fänger-Oligonukleotiden. Diese Fän-
ger-Oligonukleotide dienen dazu, in einer hochspezifisehen Hybridisierungsreaktion mit zum Beispiel diagnostisch interessanten Zielmolekülen zu reagieren. Sind diese Zielmoleküle beispielsweise mit Biotin modifiziert, dann können an den hybridisierten Zielmolekülen in einem weiteren Reaktions- schritt Enzyme, wie die alkalische Phosphatase, andocken. Wird nun diesem System ein Enzymsubstrat wie para- Aminophenylphosphat angeboten, dann wird dieses Molekül enzy- matisch in Phospat und para-Aminophenol gespalten. Das para- Aminophenol kann anschließend einfach in einem Redoxcyc- lingprozess am Interdigitalelektrodensystem elektrochemisch nachgewiesen werden und somit die hochspezifische Hybridisierung der Zielmoleküle analytisch verifizieren (R. Thewes et al . , Labor Praxis 5 (2002), 42-45). Dies ist nur möglich, da die auf den Goldelektroden immobilsierten Fängermoleküle keine dichte SA-Schicht ausbilden und somit die Hybridisierung mit entsprechenden Zielmolekülen durch entsprechende Zwischenräume und die notwendigen elektrochemischen Reaktionen durch eine frei zugängliche Goldoberfläche (ohne Gold-Thio- Bindungen) ermöglichen.
Sollen diese diagnostischen Erkennungsreaktionen nun aus Gründen einer höheren Empfindlichkeit und Reproduzierbarkeit in 3-dimensionale Gelschichten stattfinden, die sich auf den jeweiligen Messspots befinden, dann müssen diese Schichten folgende Eigenschaften aufwiesen: Zunächst muss die gesamte oben aufgeführte Biochemie, d.h. Immobilisierung der Fängermoleküle, Hybridisierung, Andockung des Enzyms und enzymati- sche Reaktionen in der GelSchicht ablaufen. Die Gelschichten müssen während des gesamten Assayablaufes auf den Messspots haften bleiben und weiterhin muss genügend freie Elektrodenfläche verbleiben, um elektrochemisches Auslesen zu ermöglichen. Dies bedeutet, das eine Haftvermittlerchemie erforderlich ist, die einerseits eine ausreichende Haftung zwischen Messspot und Gelschicht ermöglicht und andererseits ausreichend Goldoberfläche für das Redoxcycling frei lässt.
Die WO 2004/020659 betrifft Immobilisierungsschichten für Biosensoren und deren Verwendung in DNA-Chips zur Erzeugung biosensorischer Erkennungsschichten. Die Immobilisierungs- schichten sind hierbei ein über Radikale vernetztes und ein fotostrukturiertes Hydrogel auf Basis von Polyacrylamid, welche den Aufbau von Sensorarrays mit biologischen Erkennungsmolekülen in einer dreidimensionalen Matrix erlauben.
Da für den Aufbau der vorstehend aufgeführten Gelschichten weiterhin bevorzugt epoxidhaltige Matrizes in Frage kommen, bieten sich als Haftvermittler auf Gold in erster Näherung längerkettige ω-Aminoalkylthiole an. Diese Verbindungen weisen allerdings den Nachteil auf, dass sie einerseits schwierig zu synthetisieren sind und andererseits hochorientierte SA-Schichten auf Gold ausbilden, so dass sie die Elektrodenoberfläche isolieren (M. Zhu et al . , Langmuir 17 (2001), 6471-6476) . Die Verwendung im Handel erhältlicher, kurzketti- ger ω-Aminoalkylthiole scheidet schon aufgrund der der leichten Desorbition dieser Verbindungen von Gold aus (V.M. Mirsky et al . , Biosensors & Bioelectronics, 12 (9-10) (1997), 977- 989) .
Nachdem eine Verwendung von ω-Aminoalkylthiolen als Haftvermittler nicht in Frage kommt, verbleibt als einzige weitere mögliche Vorgehensweise, die epoxidhaltigen Gele über die
Passivierungsschicht zwischen den Elektroden, z.B. Siliziumnitrid, zu immobilisieren. Dies erfordert erfahrungsgemäß jedoch im Verhältnis zur Elektrodenoberfläche große Passivie- rungsflachen. Die für das Redoxcycling notwendigen Abmessun- gen der Interdigitalelektroden erfordern jedoch beispielsweise eine Breite und einen Abstand der Elektroden von etwa 1 μm (R. Thewes et al . , Labor Praxis 5 (2002), 42-45). Die Schwierigkeiten der HaftVermittlung für epoxidhaltige Gelschichten auf diesen Interdigitalgoldelektroden sind daher bis heute nicht befriedigend gelöst.
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht daher in der Bereitstellung eines Haftvermittlersystem für Edelmetallober-
flächen, das die vorstehend aufgeführten Schwierigkeiten löst und weiterhin in der Lage ist, eine wirksame Haftvermittlung für epoxidhaltige Gelschichten auf Interdigitalelektroden bereitzustellen .
Die vorstehenden Aufgaben werden durch die Bereitstellung eines aminofunktionellen Haftvermittlersystems für Edelmetall - Oberflächen gelöst. Hierbei ist ein N-Aminoalkyl- (ω-thio) - Carbonsäureamid mit der Formel (I)
über den Thiolrest auf der Oberfläche eines Edelmetalls immobilisiert bzw. aufgebracht. Die vorliegende Erfindung be- trifft weiterhin ein Verfahren zur Herstellung eines auf einer Edelmetalloberfläche immobilisierten N-Aminoalkyl- (ω- thio) -Carbonsäureamids sowie dessen Verwendung bei der Katalyse, der Modifizierung von Edelmetalloberflächen unter Beibehaltung der Leitfähigkeit oder der Herstellung von Biochips oder von Microarrays.
Von Vorteil ist hierbei, dass bei der Synthese der selbstorganisierenden Monoschichten das N-Aminoalkyl- (ω-thio) - Carbonsäureamid nicht als vollständiges Molekül auf die Edel- metalloberflache aufgebracht, sondern über eine zweistufige Reaktion auf der Edelmetalloberfläche aufgebaut wird. Zu diesem Zweck wird zuerst ein ω- Carboxylalkylthiol über die Thio-Funktionalität bzw. den Thio-Rest auf der Oberfläche immobilisiert. Aufgrund von Wasserstoffbrückenbindungen zwi- sehen den Carboxylfunktionalitäten der ω-Carboxylalkylthiole kommt es hierbei zur Entstehung von unregelmäßigen Monoschichten, bei denen die einzelnen Carboxylalkylthiole einen größeren Abstand untereinander aufweisen als beispielsweise bei einer selbstorganisierenden Monoschicht von ω- Aminoalkylthiolen. Dies hat den Vorteil, dass eine freizugängliche Edelmetalloberfläche verbleibt, die beispielswei-
se zum elektrochemischen Nachweis von zu detektierenden Molekülen verwendet werden kann. Weiterhin kann aufgrund der Wechselwirkungen zwischen den Carboxylgruppen und der damit einhergehenden größeren Beabstandung der immobilisierten ω- Carboxylalkylthiole untereinander, auf den Einsatz von beispielsweise Schablonen beim Aufbringen der Monoschichten verzichtet werden.
Grundsätzlich könnten bereits die freien ω-ständigen Carbo- xylgruppen mit beispielsweise Epoxidgruppen der Gelmatrizes zur Reaktion gebracht werden. Unter den erforderlichen Reaktionsbedingungen besteht hierbei allerdings die Möglichkeit, dass die Epoxidgruppen größtenteils bzw. vollständig mit den ω-Carboxylgruppen reagieren, wodurch ein Anbringen von Biomo- lekülen, wie beispielsweise Fänger-Oligonukleotiden, an den Epoxidgruppen unzureichend erfolgt oder gänzlich unterbleibt.
Daher werden die Carboxylreste des ω-Carboxylalkylthiols weiterhin jeweils mit einer Aminogruppe von (1, ω) -Diaminoalkylen zur Reaktion gebracht. Die freie endständige Aminogruppe kann anschließend weiterhin zum Anbringen von beispielsweise Biomolekülen unter milden Reaktionsbedingungen eingesetzt werden.
Die Abb. IA zeigt Wechselwirkungen zwischen den endständigen Carboxylgruppen von auf einer Goldoberfläche immobilisierter (ω-thio) -Hexadekansäure .
Die Abb. IB zeigt ein aminofunktionalisiertes Haftvermittler- System, in dem auf die Carboxylgruppen der (ω-thio) -
Hexadekansäure aus Fig. 1 (1 , 2) -Diaminoethan aufgebracht wurde.
Die Abb. 2A und 2B zeigen Reaktionschemata für die Synthese von 2-Aminoethyl- (16-thio) -Hexadekansäureamid auf einer Goldoberfläche. (1) ist hierbei die immobilisierter ω-thio- Hexadekansäure, deren Carboxylfunktion mit l-Ethyl-3- (3- dimethylaminopropyl) carbodiimid (EDC; Abb. 2A) bzw. N-
Hydroxysuccinimid (NHS; Abb. 2B) aktiviert wird. Die daraus erhaltenen Zwischenverbindungen (2) bzw. (5) werden jeweils mit (1, 2) -Diaminoethan (3) zur Bildung von 2-Aminoethyl- (16- thio) -Hexadekansäureamid (4) umgesetzt.
In einer Ausführungsform wird ein aminofunktionelles Haftvermittlersystem für Edelmetalloberflächen bereitgestellt, dass ein Edelmetall mit einer Oberfläche und ein N-Aminoalkyl- (ω- thio) -Carbonsäureamid mit der Formel (I)
aufweist. Das N-Aminoalkyl- (ω-thio) -Carbonsäureamid ist hierbei über den Thiorest auf der Edelmetalloberfläche immobili- siert und die Reste R' und R' ' weisen unabhängig voneinander eine Länge von C 5 -C 8O auf.
Der Ausdruck "aminofunktionelles Haftvermittlersystem" bezeichnet, dass über die freie Aminogruppe des N-Aminoalkyl - (ω-thio) -Carbonsäureamids eine Möglichkeit zur Reaktion mit anderen Molekülen, wie beispielsweise Biomolekülen, zum kova- lenten Anbringen gegeben ist. Biomoleküle umfassen beispielsweise Peptide, Proteine, Fusionsproteine, Proteinkomplexe, Enzyme, Antikörper und Nukleinsäuren. Weitere geeignete MoIe- küle können beispielsweise Polymere aus Gelmatrizen, wie in der WO 2004/020659 beschrieben, sein.
Edelmetalle sind die Metalle Kupfer (Cu) , Ruthenium (Ru) , Rhodium (Rh) , Palladium (Pd) , Silber (Ag) , Rhenium (Re) , Os- mium (Os) , Iridium (Ir) , Platin (Pt) , Gold (Au) und Quecksilber (Hg) . Die Metalle weisen eine für das anzubringende Molekül zugängliche Oberfläche auf und können beispielsweise auf geeigneten Trägern aufgebracht sein. Weiterhin kann die Oberfläche irgendeine geeignete Form aufweisen. Die Oberfläche des Metalls ist vorzugsweise von irgendwelchen Verunreinigungen, wie beispielsweise Fetten, befreit.
Das N-Aminoalkyl- (ω-thio) -Carbonsäureamid weist die beiden Alkylketten R 1 und R' ' auf. Die Alkylketten können hierbei unabhängig voneinander verschiedene Längen, beispielsweise C 5 -C 80 , aufweisen und nicht oder mit anderen Resten substituiert sein.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform ist das das Edelmetall ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Cu, Ru, Rh, Pd, Ag, Re, Os, Ir, Pt, Au und Hg, vorzugsweise ist das Edelmetall eines der Münzmetalle Cu, Au, Ag und noch bevorzugter Au.
Gemäß einer Ausführungsform sind R' und R' ' unabhängig von- einander substituierte oder nicht-substituierte Alkylreste. Substituierte Alkylreste umfassen hierbei die Modifikation der Alkylketten mit einer oder mehreren Funktionalitäten, wie beispielsweise F, Cl, Br, I, OH, NH 2 etc, aber auch anderen Alkylresten. Substituierte Alkylreste können weiterhin eine oder mehrere Doppelbindungen und/oder Dreifachbindungen umfassen. Vorzugsweise sind die Alkylreste linear und weisen keinerlei Verzweigungen und/oder Substituenten auf.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform weisen die Alkylreste R' und R 1 ' unabhängig voneinander eine Länge von C 5 -C 50/ vorzugsweise von C 5 -C 40 , C 5 -C 30 , C 5 -C 2 O oder Ci 0 -C 20 und am meisten bevorzugt von C 13 -C 17 auf.
In einer weitern Ausführungsform ist das N-Aminoalkyl- (ω- thio) -Carbonsäureamid an 50-95%, vorzugsweise an 60-95%,
70-95%, 80-95%, 90-95%, 91-95% und am meisten bevorzugt an 92-95% der Oberfläche des Edelmetalls immobilisiert. D.h., dass zumindest 5% der Edelmetallfläche für beispielsweise den Nachweis von zu detektierenden Molekülen zur Verfügung steht.
Es wurde darüber hinaus gefunden, dass zwischen der Länge des Alkylrestes R' des eingesetzten ω-Carboxylalkylthiols und dem erzielten durchschnittlichen intramolekularen Abstand der im-
mobilisierten ω-Carboxylalkylthiole ein Zusammenhang steht. So können durch den Einsatz längerer Alkylreste R 1 größere durchschnittliche intramolekulare Abstände erzielt und somit eine insgesamt größere freie Oberfläche des Edelmetalls er- reicht werden.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird ein Verfahren zur Herstellung eines aminofunktionellen Haftvermittlersystems für Edelmetalloberflächen bereitgestellt. Das Verfahren um- fasst die Schritte von, (i) Bereitstellen eines Edelmetalls mit einer Oberfläche; (ii) Immobilisieren eines ω- Carboxylalkylthiols über den Thiolrest auf der Oberfläche; (iii) Wahlweise Aktivieren des ω-Carboxylalkylthiols; und (iv) Binden eines (1, ω) -Diaminoalkyls an den Carboxylrest des ω-Carboxylalkylthiols, um ein aminofunktionelles Haftvermittlersystem auf einer Edelmetalloberfläche zu erhalten, in dem N-Aminoalkyl- (ω-thio) -Carbonsäureamid mit der Formel (I) über die Thio-Funktion auf der Edelmetalloberfläche immobilisiert und die Aminogruppe für Folgereaktionen zugänglich ist. Die Durchführung der einzelnen Reaktionsschritte ist dem Fachmann bekannt und kann der einschlägigen Literatur entnommen werden.
Gemäß einer Ausführungsform erfolgt das Aktivieren des ω- Carboxylalkylthiols durch ein Carbodiimid, vorzugsweise 1- Ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimid (EDC) oder N-Hy- droxy-succinimid (NHS) . Das Aktivieren des Carboxylrests von Carbonsäuren mittels Carbodiimiden oder NHS und anschließender Reaktion mit einem Amin ist dem Fachmann bekannt und kann für verschiedene Verbindungen mit geringen Modifikationen der
Reaktionsbedingungen durchgeführt werden (V.M. Mirsky et al . , Biosensors & Bioelectronics, 12 (9-10) (1997) , 977-989) .
Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird das Edelmetall in Schritt (i) mit gereinigter Oberfläche bereitgestellt. Dies kann beispielsweise durch Reinigen mit verdünnter Salzsäure (0,1-0,2 M) erfolgen.
Gemäß einer Ausführungsform wird in Schritt (iv) eine Amino- guppe des (1, ω) -Diaminoalkyls mit einer Schutzgruppe versehen, um die Reaktion der anderen Aminogruppe zu verhindern. Geeignete Schutzgruppen umfassen beispielsweise die Benzylo- xycarbonyl- und die tert-Butoxycarbonyl-Gruppe. Weitere geeignete Schutzgruppen, sowie ein Anbringen und Abspalten derselben sind dem Fachmann bekannt.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfin- düng ist eine Verwendung des aminofunktionellen Haftvermittlersystems für Edelmetalloberflächen zur Herstellung eines Biochips oder eines Microarrays, in der Katalyse, insbesondere der heterogenen Katalyse, oder zur Modifizierung von Edelmetalloberflächen unter Beibehaltung der Leitfähigkeit vorge- sehen.
Als "Biochip" oder "Microarray" wird ein Trägermaterial bezeichnet, auf dem sich eine große Anzahl biologischer oder biochemischer Nachweise oder Tests auf kleinem Raum befinden und stellt ein Sammelbegriff für eine Vielzahl unterschiedlichster Testverfahren und technischer Verfahren dar. Ein Microarray, im Gegensatz zu einem Biochip, basiert nicht auf Halbleitern oder elektrischen Leitern, weshalb Microarrays im Allgemeinen keine integrierten Schaltkreise aufweisen. Micro- arrays ermöglichen somit ausschließlich Testverfahren, die auf Interaktion zwischen den auf dem Träger immobilisierten Molekülen und anderen Molekülen ohne Einbezug der Oberfläche des Trägers beruhen. Bei Biochips hingegen werden zusätzlich die Eigenschaften des Trägers zum Bestimmen von beispielswei- se Redoxcyclingprozessen, bei denen ein Molekül verschiedene
Oxidationsstufen durchläuft, verwendet.
Ein Mikroarray oder auch ein Biochip kann beispielsweise für die Bestimmung von Polymorphismen, klinisch relevanten Muta- tionen, Expressionsmonitoring, Fingerprinting und Sequenzierung verwendet werden. Der Mikroarray besteht vorzugsweise aus Fängermolekülen, die auf einer bestimmten Stelle auf der Oberfläche oder in dem Träger oder auf dem den Träger bede-
ckenden Substrat abgeschieden sind. Vorzugsweise handelt es sich bei Mikroarrays um feste Träger, die auf ihrer Oberfläche eine Reihe einzelner Bereiche enthalten, die Fänger- Nukleotidsequenzen tragen, die (über Hybridisierung) an eine oder mehrere entsprechende Ziel-Nukleotidsequenzen binden können, die möglicherweise in einer zu analysierenden Probe vorhanden sind und ein charakteristisches Muster auf dem Mik- roarray ergeben. Falls die Zielsequenz geeignet markiert ist, kann ein Signal unmittelbar an der Bindestelle erfasst, iden- tifiziert und gemessen werden. Die Intensität des jeweiligen Signals ermöglicht eine Abschätzung der Menge an in der Probe vorliegenden Zielsequenzen. Die zu identifizierende Nukleo- tidsequenz wird zweckmäßigerweise vor ihrer Hybridisierung mit den einzelsträngigen Fänger-Nukleotidsequenzen markiert. Das Markieren, ein dem Fachmann bekanntes Verfahren, wird vorzugsweise während des Amplifikationsschrittes durch Einbau markierter Nukleotide oder nach Vervollständigung davon durch Anbringen eines Markers an die Hybride durchgeführt. Im Fall eines Einbaus markierter Nukleotide während der Amplifikati- onsreaktion, wird der Assay sensitiver je länger die amplifi- zierte Sequenz ist und je mehr Marker in dem hybridisierten Ziel vorliegt.
Fänger-Nukleinsäuren können auf dem festen Träger an bestimm- ten Stellen unter Verwendung von Masken bei jedem Verfahrens- schritt unmittelbar synthetisiert oder als ganzes befestigt/angebracht werden. Die Synthese umfasst das Hinzufügen eines neuen Nukleotids an eine verlängernde Nukleinsäure, um eine erwünschte Sequenz an einer bestimmten Stelle zu er- halten. Dieses Verfahren ist aus dem photolitographischen
Verfahren abgeleitet und verwendet Photo-Schutzgruppen, die vor einem Hinzufügen eines neuen Nukleotids entfernt werden müssen (beispielsweise die EP 0476014, US 5,445,934, US 5,143,854 und US 5,510,270). Allerdings liegen nur kleine Oligonukleotide auf der Oberfläche vor und das Verfahren wird hauptsächlich zur Sequenzierung oder Identifizierung einer Sequenz über ein Muster positiver Stellen verwendet, die verschiedenen auf dem Array gebundenen Oligonukleotiden entspre-
chen, wobei jede der Sequenzen aus kleinen Oligonukleotidse- quenzen besteht und an verschiedene Teile der Zielsequenz binden kann. Die Charakterisierung eine Zielsequenz wird durch Vergleich eines bestimmten Musters mit einer Referenz- sequenz erhalten.
Feste Träger können in irgendeiner Form (beispielsweise als Kügelchen) vorliegen, weisen jedoch vorzugsweise eine ebene Form auf und können aus verschiedenen Materialien bzw. Werk- Stoffen bestehen, die insbesondere verschiedene Metalle, Glas und Kunststoffe umfassen.
Der Begriff Nukleotid umfasst DNA und RNA, wobei sie Adenin, Cytosin, Guanin, Thymin und Uracil als Basen und Desoxyribose und Ribose als die strukturgebenden Elemente enthalten. Ein Nukleotid kann allerdings weiterhin irgendeine modifizierte (künstliche) der momentanen Technologie bekannte Base umfassen, die unter Verwendung von mindestens einer der vorstehend genanten Basen (beispielsweise Inosin) zur Basenpaarung befähigt ist. Weiterhin sind in dem Begriff Nukleotid die Derivate der vorstehend genannten Verbindungen, insbesondere Derivate mit Farbstoffen von fluoreszierenden Markeren, enthalten.
Irgendein Verfahren gemäß des Standes der Technik kann zum
Anbringen von einzelnen Nukleotiden oder der Nukleinsäuren als ganzes auf den Träger verwendet werden, das eine zeitweilige oder permanente Immobilisierung, Fixierung oder Adhäsion des Sondennukleotids auf eine Stelle oder einen Bereich des Trägers , durch beispielsweise die Bildung von kovalen- ten, metallorganischen oder ionischen Bindungen, Bindungen basierend auf van der Waal ' s Kräften oder irgendwelchen Arten von Enzym Substrat Wechselwirkungen oder dem so genannten Affinitätsbinden bewirkt.
Irgendeine Zahl von Spacern bzw. Abstandshalter-Molekülen kann zwischen dem Träger und den auf den Träger aufgebrachten Nukleotiden angeordnet sein, wobei im Falle einer Verwendung
von SAMs als Trägermaterial, die Monoschichten als Abstandshalter dienen können. Der Spacer kann beispielsweise ein auf Polyraer-basierender Spacer sein, kann jedoch ebenso aus einer Alkankette oder irgendwelchen Derivaten davon mit einer ge- eigneten Länge bestehen, die an jedem Ende jeweils funktionelle Gruppen zum Anbringen an den festen Träger und die Nukleinsäure umfasst. Vorzugsweise wurden 15-Thymidine Spacer mit einem Ende auf den festen Träger und mit dem anderen Ende auf das 3 '-terminale Ende des/der jeweiligen zu im- mobilisierenden Nukleotids/Nukleinsäure immobilisiert.
Bei der Nukleinsäure kann es sich sowohl um Oligo- als auch Polynukleotide im Fall von DNA Arrays genauso wie um Ribonukleinsäuren im Fall von RNA Arrays handeln. Die Nukleinsäuren des Arrays sind entweder über eine chemische, kovalente Bindung oder durch Adhäsion immobilisiert. Die Länge der immobilisierten Nukleinsäuren umfasst zumindest den Bereich von 10 bis 100 Nukleinsäuren (lOmers bis lOOmers) , vorzugsweise beträgt die Länge zumindest 20 bis 80 Nukleinsäuren, mehr be- vorzugt mindestens 20 bis 50 Nukleinsäuren genauso wie mindestens 20 bis 40 Nukleinsäuren und am meisten bevorzugt mindestens 20 bis 30 Nukleinsäuren. Die Nukleinsäuren können entweder unmittelbar aus Versuchsproben von Säugetieren oder auf eine dem Fachmann gut bekannte Art synthetisiert werden.
Zur Implementierung eines gewöhnlichen Mikroarrays werden drei Komponenten benötigt. Zuerst den Mikroarray, beziehungsweise den Träger, zweitens eine Leseeinheit und drittens Mittel zur Bewertung der Ergebnisse, beispielsweise eine geeignete Computersoftware. Die Leseeinheit umfasst im Allgemeinen einen beweglichen Boden (tray) , Fokusierlinse (n) , Spiegel und einen geeigneten Detektor, beispielsweise eine CCD Kamera. Der bewegliche Boden trägen den Mikroarray und kann bewegt werden, um den Mikroarray in dem Lichtweg einer oder mehrerer geeigneter Lichtquellen, beispielsweise ein Laser mit einer geeigneten Wellenlänge zur Anregung einer fluoreszierenden Verbindung, zu platzieren. Das Auswertungsprogramm oder Software kann beispielsweise zum Erkennen spe-
zifischer Muster auf dem Array dienen oder zur Analyse von verschiednen Expressionsprofilen von Genen. In diesem Fall sucht die Software farbige Punkte auf dem Array und vergleicht die Intensität verschiedener Farbspektren des glei- chen Punktes. Das Ergebnis kann von einer Analyseeinheit interpretiert und danach in einem geeigneten Dateiformat zur Weiterverarbeitung gespeichert werden.
Sonden sind im Allgemeinen an zwei oder mehr fluoreszierende Farbstoffe kovalent gebunden und die Intensität der Fluoreszenz bei verschiedenen Wellenlängen eines jeden Punkts wird mit dem Hintergrund verglichen. Der Detektor, beispielsweise ein Photomultiplier oder CCD Array, wandelt geringe Lichtintensitäten in ein elektrisches Signal um, das verstärkt wer- den kann. Andere Verfahren verwenden verschiedene Enzyme, die an das Nukleotid mit einem Linkermolekül kovalent gebunden sind. Die enzymatische Colorimetrie verwendet beispielsweise alkalische Phosphatase und Meerrettich Peroxidase als Marker. Durch Kontaktieren mit einem geeigneten Molekül kann ein nachweisbarer Farbstoff erhalten werden. Andere chemolumines- zierende oder fluoreszierende Marker umfassen Proteine, die ein Chemolumineszenz- oder Fluoreszenz-Signal ausstrahlen können, wenn sie mit Licht einer bestimmten, spezifischen Wellenlänge, beispielsweise 488 nm für das Grüne Fluoreszenz- protein, bestrahlt werden. Radioaktive Marker werden im Fall verwendet, dass niedrige Nachweisgrenzen erforderlich sind, sind allerdings aufgrund ihrer gesundheitsschädlichen Eigenschaften nicht weit verbreitet. Eine Fluoreszenzmarkierung wird mit Nukleotiden vorgenommen, die an ein fluoreszierendes Chromophor gebunden sind. Kombinationen von Nukleotiden und fluoreszierendem Chromophor umfassen im Allgemeinen Cy3 (Cya- nin 3)/ Cy5 (Cyanin 5) markiertes dUTP as Farbstoff, da sie leicht aufgenommen werden können, der Elektronenübergang für die Fluoreszenz durch gewöhnliche Laser angeregt werden kann und sie ebenso bestimmte Emmisionsspektren aufweisen.
Eine Hybridisierung von Mikroarrays folgt im Wesentlichen den herkömmlichen Bedingungen von Southern oder Northern Hybridi-
sierungen, die dem Fachmann gut bekannt sind. Die Schritte umfassen eine Vor-Hybridisierung, die eigentliche Hybridisierung und einen Waschschritt nach dem Eintreten der Hybridisierung. Die Bedingungen müssen derart gewählt werden, dass Hintergrundsignale klein gehalten werden, dass eine minimale Kreuzhybridisierung (im Allgemeinen eine verringerte Anzahl von Abweichungen) auftritt und dass die Signalstärke ausreichend ist, die für manche Anwendungen zur Konzentration des Zielmoleküls proportional sein muss.
Das Hybrdisierungsereignis kann im Allgemeinen durch zwei verschiedene Arten von Array-Scannern nachgewiesen werden. Ein Verfahren bedient sich des Prinzips der konfokalen Lasermikroskopie, das zumindest einen Laser zur Durchmusterung des Arrays auf eine Punkt-zu-Punkt Art verwendet. Eine Fluoreszenz wird anschließend durch Photomultiplier nachgewiesen, die das ausgestrahlte Licht verstärken. Die kostengünstigeren GGD basierenden Leseeinheiten verwenden für gewöhnlich gefiltertes weißes Licht zur Anregung. Die Oberfläche des Arrays wird mit diesem Verfahren in Abschnitten durchmustert, was den schnelleren Erhalt von Ergebnissen einer niedrigen Aussagekraft ermöglicht.
Von Wichtigkeit ist ebenso das so genannte Gridding zur Ana- lyse der Ergebnissen bei dem ein idealisiertes Modell des Mikroarraylayouts mit den durchmusterten Daten verglichen wird, um die Punkt (spot) Bestimmung zu erleichtern. Bildpunkte werden als Punkt (Vordergrund) oder Hintergrund eingestuft (segmentiert) , um die Punkt-Maske zu erzeugen. Seg- mentierungsverfahren können in feste Segmentierungskreise, anpassende Kreissegmentierung, anpassende Formsegmentierung und Histogrammsegmentierung unterteilt werden. Die Verwendung dieser Verfahren hängt von der Form der Punkte (regelmäßig, unregelmäßig) und der Qualität der Nahanordnung der Punkte ab.
Ein anderer wichtiger Punkt für die Auswertung der Ergebnisse liegt in der Intensität der verschiedenen Punkte, da die Kon-
zentration der hybridisierten Nukleotide in einem Punkt zu der Gesamtfluoreszenz dieses Punktes proportional ist. Die gesamte Bildpunktintensität und das Verhältnis der verwendeten verschieden fluoreszierenden Chromophore (im Fall con Cy3 und Cy5, grün und rot) sind insbesondere für die Berechnung der Punktintensität von Wichtigkeit. Neben der Punktintensität muss ebenso die Hintergrundintensität berücksichtigt werden, da verschiedene Effekte die Fluoreszenz der Punkte stören können, beispielsweise die Fluoreszenz des Trägers und der für die Hybridisierung verwendeten Chemikalien. Dies kann durch die so genannte Normalisierung durchgeführt werden, die die vorstehend genannten Effekte und andere beinhaltet, wie Fluktuationen der Lichtquelle, die geringere Verfügbarkeit/Aufnahme der verschiednen Markermoleküle (Cy5 schlechter als Cy3) und deren Unterschiede bei Emmisionsintensitäten.
Von Wichtigkeit für die Normalisierung ist weiterhin die Referenz gegen die normalisiert werden soll. Im Allgemeinen kann es ein bestimmter Satz von Genen oder eine Gruppe von Kotrollmolekülen sein, die auf dem Mikroarray vorliegen. Die Ergebnisse können weiterhin durch verfügbare Software-
Werkzeuge und gemäß dem Wissenstand der Bioinformatik weiterverarbeitet werden
Eine Verwendung der erfindungsgemäßen aminofunktionellen Haftvermittlersysteme für Edelmetalloberflächen ist sowohl bei "zweidimensionalen" Biochips, wie R. Thewes et al . , Labor Praxis 5 (2002) , 42-45) beschrieben, als auch "dreidimensionalen" Biochips vorgesehen. Dreidimensionale Biochips können durch Kombinationation der erfindungsgemäßen Haftvermittler- Systeme mit geeigneten Gelschichten, wie beispielsweise in der WO 2004/020659 beschrieben, erzeugt werden.
Weiterhin können die erfindungsgemäßen Haftvermittlersysteme als Träger verwendet werden auf denen geeignete Moleküle, beispielsweise Biomoleküle, zur Katalyse, insbesondere zur heterogenen Katalyse, angebracht sind. In dem vorstehend beschrieben Fall dienen die Biomoleküle nicht mehr zum Nachweis anderer Moleküle, sondern ausschließlich zum Umsetzen ent-
sprechender Substrate, um gewünschte Reaktionsprodukte zu erhalten. Von Vorteil ist hierbei, dass oberflächenimmonbili- sierte Enzyme häufig eine gesteigerte Enzymaktivität im Vergleich zu einem Vorliegen in Lösung aufweisen. Katalytische Verfahren mit SAMs sind beispielsweise in B. H. Rehm; Biochem J. (2003) Nov 15; 376(Pt 1)15-33 und X.W. Kan et al . , Ann Chim. (2005) Jul-Aug;95 (7-8) :593-600 beschrieben.