Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Herstellen eines zu einem Ribonukleinsäure(RNA)-Molekül komplementären Desoxy¬ ribonukleinsäure(DNA)-Stranges (cDNA-Stranges) , sowie die Verwendung des Verfahrens zur Analyse von RNA-Molekülen.

Mangels geeigneter Verfahren wird eine direkte Analyse von RNA-Molekülen in modernen Gentechnik-Labors kaum noch durch¬ geführt. Das Arbeiten mit RNA erfordert zudem besondere, zeitaufwendige Vorkehrungen, um die RNA vor einem Abbau durch Ribonukleasen zu schützen. Heutzutage wird deshalb RNA mit Hilfe einer RNA-abhängigen DNA-Polymerase in komplementäre DNA (cDNA) übersetzt. cDNA ist die Bezeichnung für die einzel- bzw. doppelsträngige DNA-Kopie eines RNA-Moleküls. Die vorstehend erwähnte RNA-abhängige DNA-Polymerase wird auch als "Reverse Transkriptase" bezeichnet. Sie verwendet Desoxyribonukleosid-Triphosphate als Substrate und benutzt die RNA als Matrize für die Synthese des DNA-Stranges.

Für die Synthese des ersten cDNA-Stranges sind verschiedene Verfahren entwickelt worden. Diese Verfahren basieren auf der Verwendung von kurzen Oligonukleotiden, die komplementär zu einem Teilbereich eines RNA-Moleküles sind. Durch Hybridisie¬ rung des Oligonukleotids an die RNA entsteht ein kurzer, dop- pelsträngiger Nukleinsäurebereich, der von der Reversen Transkriptase als Primer (Starter) für die Synthese des er¬ sten DNA-Stranges benötigt wird. Als Primer wird beispiels¬ weise Oligo(dT) verwendet, das an den pol (A)-Schwanz von be¬ stimmten RNA-Molekülen (poly(A) ⁺ -RNA) hybridisieren kann. Soll nichtpolyadenylierte RNA, wie z.B. ribosomale RNA, in DNA umgeschrieben werden, so kann nachträglich mit poly(A)- Poly erase ein poly(A)-Schwanz an das 3'-Ende der RNA ansyn¬ thetisiert werden. Dieser kann dann wiederum mit Oligo(dT)

eine doppelsträngige Startregion ausbilden.

Weiterhin können als Primer Mischungen kurzer DNA-Hexanu- kleotide aller theoretisch denkbarer Sequenzabfolgen verwen¬ det werden. Bei diesem als "Random-Priming" bezeichneten Ver¬ fahren werden einige dieser Hexanukleotide an RNA hybridisie¬ ren und als Starter für die cDNA-Synthese fungieren können. Ein Nachteil ist jedoch, daß meist der Anteil vollständig ko¬ pierter RNA-Moleküle sinkt.

Falls ein Teil der Sequenz eines zu untersuchenden RNA-Mole¬ küls bekannt ist, kann ein spezifisches Oligonukleotid, das zu der bekannten Sequenz komplementär ist, als Primer einge¬ setzt werden.

Für die Synthese des zweiten DNA-Stranges gibt es ebenfalls mehrere Strategien. Beim sogenannten "Selbst-Priming" wird nach der Synthese des ersten cDNA-Stranges der RNA-Anteil aus dem gebildeten DNA/RNA-Hybrid durch Behandlung mit Alkali oder durch Hitzedenaturierung entfernt. Man nutzt nun die Tatsache aus, daß die gebildete, einzelsträngige cDNA am 3'-Ende, also demjenigen Ende, das dem 5'-Ende der kopierten RNA entspricht, vorübergehend sogenannte Haarnadelstrukturen ausbildet. Diese kurzen doppelsträngigen Bereiche können wie¬ derum von der DNA-Polymerase als Primer für die Synthese des zweiten DNA-Stranges verwendet werden. Der Haarnadelbereich wird durch die nachfolgende Synthese stabilisiert, so daß einseitig kovalent geschlossene, doppelsträngige cDNA-Mole- küle entstehen. Durch vorsichtige Behandlung mit Desoxyribo- nukleasen, wie z.B. Sl-Nuklease oder Mung bean-Nuclease kön¬ nen diese Moleküle geöffnet werden. Es besteht jedoch immer die Gefahr, daß man Sequenzen vom 5'-Ende der RNA verliert.

Eine weitere Technik geht von einzelsträngiger cDNA aus, an deren 3'-Ende mit terminaler Desoxynukleotidyl-Transferase ein ho opolymerer Oligo(dC) -Schwanz angelagert wird. Der für

die Synthese des zweiten cDNA-Stranges benötigte, doppel¬ strängige Primerbereich entsteht durch Reaktion des am ersten cDNA-Strang vorhandenen Oligo(dC)-Schwanzes mit einem komple¬ mentären Oligo(dG)-Primer.

Beim Gubler-Hoffman-Verfahren handelt es sich um "RNA-Pri- ming". Hierbei verzichtet man auf die Entfernung des RNA- Stranges aus dem nach der Synthese des ersten cDNA-Stranges gebildeten RNA/DNA-Hybridmolekül. Unter kontrollierten Bedin¬ gungen wird der RNA-Strang im intakten Hybridmolekül mit ei¬ ner spezifischen Ribonuklease (RNAse H) behandelt, so daß kurze RNA-Primer mit freiem Hydroxyl-Ende an der einzelsträn- gigen cDNA verbleiben. Diese dienen dann in einer gleichzei¬ tig laufenden Reaktion als Primer für die Synthese des zwei¬ ten DNA-Stranges durch DNA-Polymerase.

Obwohl es möglich ist, die nach der Synthese des ersten cDNA- Stranges entstandenen RNA/DNA-Hybridmoleküle direkt zu klo- nieren, wird meist mit doppelsträngiger cDNA gearbeitet. Die¬ se kann in weiteren Experimenten in einen geeigneten Klonie- rungsvektor eingebaut werden. Da die cDNA-Moleküle, bedingt durch die Syntheseschritte, meist Undefinierte Enden aufwei¬ sen, müssen sie nach der Synthese mit Enden versehen werden, die den gezielten Einbau in einen Klonierungsvektor erlauben. Für diesen Zweck verwendet man homopolymere Nukleotidschwanze oder doppelsträngige als "Linker" bezeichnete Oligonukleoti- de, die die Erkennungssequenz für eine Restriktionsendonukle- ase tragen. Zum Anhängen der Linker werden die Enden der cDNA enzymatisch so bearbeitet, daß glatte DNA-Enden entstehen.

Verschiedene Techniken der cDNA-Synthese kombinieren die ein¬ zelnen Syntheseschritte und die nachfolgenden Klonierungsre- aktionen. Beispielsweise werden beim Heidecker-Messing-Ver¬ fahren an ein Vektormolekül angebrachte Oligo(dT)-Schwänze zur Anlagerung von poly(A) ⁺ -RNA und zum Primen der cDNA-Syn- these verwendet. Eine relativ aufwendige Abfolge von Reak-

tionen führt nach der Synthese des ersten cDNA-Stranges zur Klonierung einer doppelsträngigen cDNA.

Es ist weiterhin bekannt, cDNA-Stränge mittels geeigneter Primer durch die Polymerase-Kettenreaktion (polymerase chain reaction; PCR) zu amplifizieren. Als Primer kommen Oligonu- kleotide in Frage, die entweder an den cDNA-Strang direkt hy¬ bridisieren oder an einen an den cDNA-Strang angelagerten ho- mopolymeren Nukleotid-Schwanz oder Linker. Die amplifizierten cDNA-Fragmente können danach in einen Vektor kloniert oder auch direkt sequenziert werden.

Für die DNA-Sequenzierung, d.h. die Bestimmung der Abfolge von Basen in einem DNA-Molekül, werden heute meist zwei me¬ thodisch unterschiedliche Verfahren angewendet: die Maxam- Gilbert-Technik, auch als chemische DNA-Sequenzierung be¬ zeichnet, und das Kettenabbruch-Verfahren nach Sanger, auch enzymatische DNA-Sequenzierung oder die Didesoxy-Sequenzie- rung genannt.

Von der Sequenz der cDNA kann man direkt auf die ursprüngli¬ che RNA-Sequenz schließen.

Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein verbessertes Verfahren zum Herstellen eines zu einem RNA-Mo¬ lekül komplementären DNA-Stranges zur Verfügung zu stellen, welches im Vergleich zu bekannten Verfahren erhöhte Ausbeuten an cDNA-Molekülen liefert.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch ein Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 17 gelöst.

Das erfindungsgemäße Verfahren bietet den großen Vorteil, daß es ausgehend von subnano olaren Konzentrationen von sowohl polyadenylierten als auch nicht-polyadenylierten RNA-Molekü¬ len durchführbar ist, und auf diese Weise indirekt RNA-Mole-

küle sehr effizient analysiert werden können.

Weiterhin betrifft die Erfindung die Verwendung des Verfah¬ rens nach einem der Ansprüche 1 bis 17 zur Analyse von RNA-Molekülen.

Die Erfindung wird nachstehend mit Bezug auf die Zeichnungen im einzelnen erläutert.

Die Figur 1 zeigt eine schematische Darstellung des erfin¬ dungsgemäßen Verfahrens:

1) Verknüpfung des 5'-Phosphat-Endes (P5') eines doppel- strängigen DNA-Moleküls mit 5'- überhängendem Ende mit dem 3'-Hydroxyl-Ende (3OH) eines RNA-Moleküls ((+)RNA X),

2) cDNA-Synthese ausgehend vom 3'-Hydroxyl-Ende des DNA-Moleküls,

3) PCR-Amplifikation der cDNA mittels eines ersten Pri¬ mers, der an den 3'-5'-Strang des DNA-Moleküls hybridisiert (Vektor-Primer) , und eines zweiten, biotinylierten Primers, der an den ersten cDNA-Strang hybridisiert (-Primer) , und

4) Festphasen-Didesoxy-Sequenzierung des zweiten cDNA- Stranges mittels Streptavidin-beschichteter magnetischer Kügelchen.

Die Figur 2 stellt schematisch die Schritte der Figur 1 dar, mit dem Unterschied, daß nach der Synthese des ersten cDNA- Stranges an diesen ein homopolymerer Nukleotid-Schwanz ange¬ fügt wird (2.1) und der zweite biotinylierte Primer an die¬ sen homopolymeren Nukleotid-Schwanz hybridisiert.

In die Stufe (a) des erfindungsgemäßen Verfahrens nach An¬ spruch 1 können sowohl einzel- als auch doppelsträngige

DNA-Moleküle mit einem 5'-Phosphat-Ende eingesetzt werden.

Vorzugsweise wird jedoch in Stufe (a) des erfindungsgemäßen Verfahrens nach Anspruch 1 ein zumindest teilweise doppel- strängiges DNA-Molekül eingesetzt. Besonders bevorzugt ist ein doppelsträngiges DNA-Molekül mit einem 5'-überhängenden Ende. Das 5'-überhängende Ende kann durch Spalten des DNA- Moleküls mit Hilfe einer Restriktionsendonuklease, wie z.B. EcoRI, erzeugt werden.

Vorzugsweise verwendet man einen gängigen,- kommerziell er¬ hältlichen DNA-Vektor, der mit einer geeigneten Restriktions¬ endonuklease linearisiert wird.

Die Verknüpfung des 5'-Phosphat-Endes des DNA-Stranges mit dem 3'-Hydroxyl-Ende des einzelsträngigen RNA-Moleküls ("tagging") wird vorzugsweise enzymatisch mittels einer Liga- se durchgeführt.

Als Ligase eignet sich eine RNA-Ligase, wie z.B. T4-RNA-Li- ggaassee,, ddiiee iinn GGeeggeennwwaarrtt vvoonn Mn DNA- und RNA-Moleküle kova- lent miteinander verbindet.

Falls ein einzelsträngiges DNA-Molekül in Stufe (a) einge¬ setzt wird, wird vorzugsweise nach dem Verknüpfen des DNA-Stranges mit dem einzelsträngigen RNA-Molekül ein Oligo- nukleotid als Primer für die cDNA-Synthese verwendet, das an den DNA-Strang hybridisiert. Für die Auswahl eines geeig¬ neten Oligonukleotids ist es wünschenswert, die Sequenz des eingesetzten einzelsträngigen DNA-Moleküls zumindest teil¬ weise zu kennen.

Bei Verwendung eines doppelsträngigen DNA-Moleküls fungiert das 3'-Hydroxyl-Ende des nicht mit dem RNA-Molekül verknüpf¬ ten DNA-Stranges direkt als Primer für die cDNA-Synthese.

Die cDNA-Synthese wird enzymatisch mittels Reverser Trans¬ kriptase, welche kommerziell erhältlich ist, durchgeführt.

Der so erhaltene erste cDNA-Strang kann nachfolgend durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR) amplifiziert werden. Dabei werden zwei Fälle unterschieden:

(i) eine Teilsequenz aus dem zu analysierenden RNA-Mole¬ kül ist bereits bekannt, und

(ii) das RNA-Molekül, welches analysiert werden soll, ist völlig unbekannt, d.h. es steht keine SequenzInforma¬ tion zur Verfügung.

Im ersten Fall kann man für die PCR einen ersten Primer ver¬ wenden, dessen Sequenz komplementär zu einer Teilsequenz des mit dem RNA-Molekül verknüpften DNA-Stranges ist (plus-Strang-Primer) und einen zweiten Primer, der komple¬ mentär zu dem ersten cDNA-Strang ist (minus-Strang-Primer) , d.h. dessen Sequenz einer Teilsequenz des RNA-Moleküls ent¬ spricht.

Im zweiten Fall, d.h. wenn keine SequenzInformation bezüglich des zu analysierenden RNA-Moleküls zur Verfügung steht, wird nach der Synthese des ersten cDNA-Stranges an dessen 3'-Ende ein Oligonukleσtid angefügt ("tailing") . Vorzugsweise werden mittels terminaler Desoxynukleotidyl-Transferase (TdT) homo¬ polymere, einzelsträngige Nukleotid-Schwänze ansynthetisiert. Das Enzym katalysiert die Anlagerung von Desoxynukleosid-Triphosphaten an die 3'-Enden eines DNA-Fragments, ohne hierfür eine Matrize zu benötigen. An dem vorliegenden DNA-RNA/cDNA- Hybridmolekül verläuft die Reaktion effizienter an glatten Enden als an Enden, an denen aufgrund einer nur partiellen reversen Transkription das 5'-Hydroxyl-Ende des RNA-Moleküls noch übersteht. Diese Tat¬ sache begünstigt die Selektion auf cDNA, die der vollen Länge

des zu analysierenden RNA-Moleküls entspricht. Alternativ können unter Verwendung von T4-DNA-Ligase Oligonukleotide, wie z.B. Linker, an den synthetisierten ersten cDNA-Strang angefügt werden. Dieses Enzym akzeptiert ebenfalls DNA/RNA-Hybridmoleküle als Substrat. Als Linker bezeichnet man chemisch synthetisierte, kurzkettige Oligonukleotide von 6 bis 12 Basen Länge, die die Erkennungssequenz für eine oder mehrere Restriktionsendonukleasen enthalten. Als minus-Strang-Primer können somit Oligonukleotide verwendet werden, die komplementär zu dem an den cDNA-Strang angefügten homopolymeren Nukleotid-Schwanz bzw. zu dem angefügten Linker sind.

Die PCR wird in an sich bekannter Weise durchgeführt, z.B. mittels Taq-DNA-Polymerase.

Die durch PCR amplifizierten cDNA-Moleküle können anschlie¬ ßend sequenziert oder kloniert werden.

Falls die cDNA sequenziert werden soll, ist es bevorzugt, in die PCR einen am 5'-Ende biotinylierten minus-Strang-Primer einzusetzen. Dies erlaubt eine schnelle Isolierung der an diesen Primer ansynthetisierten cDNA-Moleküle aus der Reakti¬ onsmischung mit Hilfe von Streptavidin-beschichteten mag¬ netischen Kügelchen (magnetic beads) . Die isolierten, einzel¬ strängigen cDNA-Moleküle können anschließend unter Verwendung eines geeigneten Sequenzierungs-Primers (plus-Strang-Primer) z.B. durch die Didesoxy-Kettenabbruch-Methode mittels T7-DNA- Polymerase sequenziert werden. Obwohl diese direkte Festpha¬ sensequenzierung bevorzugt ist, können alle bekannten Sequen¬ zierungsverfahren verwendet werden. Aus der Sequenz des cDNA- Moleküls kann man direkt auf die Sequenz des zu analysieren¬ den RNA-Moleküls schließen.

Wenn die durch die PCR a plifizierte cDNA kloniert werden soll, ist es bevorzugt, sowohl als plus-Strang-Primer als

auch als minus-Strang-Primer biotinylierte Oligonukleotide zu verwenden, die die Erkennungssequenz einer Restriktionsendo¬ nuklease enthalten. Die amplifizierten cDNA-Moleküle können dann mit Hilfe von mit Streptavidin-beschichteten magne¬ tischen Kügelchen aus der Reaktionsmischung gereinigt werden. Die an die magnetischen Kügelchen über den

Streptavidin/Biotin-Ko plex gebundenen cDNA-Moleküle können anschließend mit Hilfe einer Restriktionsendonuklease, die für die in den Primern enthaltene Erkennungssequenz spezi¬ fisch ist, freigesetzt werden. Dieses Verfahren erlaubt eine Selektion auf cDNA-Moleküle, die an beiden- Enden von der verwendeten Restriktionsendonuklease geschnitten sind, wo¬ durch die Klonierungsausbeute erhöht wird.

Für die in der PCR amplifizierten cDNA-Moleküle können weite¬ re bekannte Klonierungssysteme verwendet werden.

Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt es, RNA-Moleküle zu analysieren. Das erfindungsgemäße Verfahren kann vorzugsweise für die in vitro-Diagnostik von genetischen Defekten ver¬ wendet werden. Dazu werden dem Patienten beispielsweise Blut¬ zellen entnommen, aus denen anschließend die zelluläre RNA isoliert wird. Nach Durchführung des erfindungsgemäßen Ver¬ fahrens können beispielsweise Erkenntnisse erhalten werden, ob und in welchem Ausmaß ein bestimmtes Gen translatiert wird. Weiterhin können Spleiß-Defekte in RNA-Molekülen sowie post-transkriptionale RNA-Modifikationen (z.B. die Insertion oder Deletion von Nukleotiden (RNA-Editing) nach Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens erkannt werden. Das er¬ findungsgemäße Verfahren erleichtert somit die genetische Diagnostik.

Außerdem ist das erfindungsgemäße Verfahren bestens dazu ge¬ eignet, cDNA-Banken zu erstellen. Dazu können kommerziell er¬ hältliche Klonierungsvektoren verwendet werden, die passende

Schnittstellen für Restriktionsendonukleasen besitzen. Nach

Linearisieren des Vektors durch Schneiden mittels einer Restriktionsendonuklease kann an den überhängenden 5'-Phosphat-Enden die erfindungsgemäße cDNA-Synthese durchge¬ führt werden. Nach wahlweiser Modifikation des 3 OH-Endes der erzeugten cDNA und Ausnutzen weiterer

Restriktionsendonukleaseschnittstellen im Vektor können Vektor plus cDNA religiert werden. Dieses Verfahren führt zu hohen Ausbeuten an cDNA-Klonen und kann sowohl ausgehend von poly(A) - als auch von poly(A)~-RNA durchgeführt werden.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung:

Beispiel 1

(1) Tagging: Gel-gereinigte einzelsträngige RNA (0,1 bis 10 pMol) wurde über Nacht bei 4°C mit 0,1 pMol eines mit EcoRI gespaltenen Plasmids (BS/bll; Augustin, S. , Müller, M.W. , Schweyen, R.J. (1990) Nature 343, 383-385)) im Vorhandensein von 5 Einheiten T4-RNA-Ligase (Pharmacia) in 20 μl Endvolumen unter den folgenden Reaktionsbedingungen inkubiert: 50 mM HEPES (pH 8,0), 3 mM DTT, 20 mM MgCl ₂ , 20 mM MnCl ₂ , 0,1 mg/ml Rinderserumalbumin (BSA) und 0,1 M ATP.

(2) Direkte Initiierung der cDNA-Synthese: 2 μl der Reakti¬ onsmischung wurden direkt in die cDNA-Synthesereaktion ein¬ gesetzt, die für 15 min bei 40°C unter Verwendung von 10 Einheiten SuperScript Reverse Transcriptase (RT; Gibco BRL) in 20 μl durchgeführt wurde: 50 mM Tris-HCl, pH 8, 3 , 40 mM KC1, 6 mM MgCl ₂ , 5 mM DTT, 0,1 mg/ml BSA, 0,3 mM dNTPs.

(3) PCR-Amplifizierung der cDNA: 2 , 5 μl der cDNA-Synthesere- aktionsmischung wurden direkt in eine Standard-PCR eingesetzt (1' 94°C, 30" 58°C, 1' 72°C; 35 Zyklen) , die in 50 μl Reak¬ tionsvolumen unter Verwendung von 1 Einheit Taq-DNA-Poly- merase (Stratagene) und unter den vom Hersteller (Stratagene) beschriebenen Pufferbedingungen durchgeführt wurde. A plifi-

zierte PCR-Produkte: 424 bp bis 428 bp. Verwendete PCR-Primer: BS/bll-spezifischer plus-Strang-Primer (5' GATTAATGTGAAAGCATGCTAACTTC; 25 pMol) ; 5'-terminal biotiny- lierter Primer (5' AAATCTGGTACCGGGAACAAAGGAAGAC: 25 pMol) , partiell komplementär (unterstrichen) zum 3'-Teil der cDNA-Sequenz.

(4) Direkte Festphasen-Sequenzierung der PCR-Produkte: Die Reinigung der PCR-Produkte und die Didesoxy-Sequenzierung un¬ ter Verwendung von magnetischen Kügelchen als Festphase wur¬ den durchgeführt wie beschrieben in Holtman, S., Staahl, E. , Hornes, M. , Uhlen, L. , (1989) Nucl. Acids Res. 17, 4937- 4939. Verwendeter Sequenzierungs-Primer: GAATATCTTATATTAATT-

AAGAGTATAG; plus-strang BS/bll.

Beispiel 2

(1) : Tagging und (2) direkte Initiierung der cDNA-Synthese: wie in Beispiel l.

(2.1) Tailing: 2,5 μl der cDNA-Synthesereaktionsmischung wur¬ den für das Tailing mit einem homopolymeren dCTP-Schwanz in 20 μl Endvolumen im Vorhandensein von 10 Einheiten terminaler Transferase (Boehringer, Mannheim) unter den vom Hersteller (Boehringer; Mannheim) beschriebenen Bedingungen eingesetzt.

(3) PCR-Amplifizierung der verlängerten cDNA-Produkte: 2,5 μl der Tagging-Reaktionsmischung wurden direkt in eine Standard- PCR (l' 94°C, 30" 58°C, l' 72°C; 35 Zyklen) eingesetzt, die in einem 50 μl Reaktionsvolumen unter Verwendung von 1 Ein¬ heit Taq-DNA-Polymerase (Stratagene) und unter den vom Her¬ steller (Stratagene) beschriebenen Pufferbedingungen durchge¬ führt wurde. Verwendete PCR-Primer: BS/bll spezifischer plus- Strang-Primer (5' GATTAATGTGAAAGCATGCTAACTTC; 25 pMol) ; 5'- ter inal biotinylierter Primer (5' GGGGGGGGGGGGGGG; 25 pMol) ,

komplementär oder teilweise komplementär zum 3'-terminalen dC, ■ -Schwanz der cDNA-Sequenz.

(4) Direkte Festphasen-Sequenzierung der PCR-Produkte: ie in Beispiel 1.