DOMAINE DE L' INVENTION

La présente invention concerne la détection de la présence d'analytes dans un échantillon liquide à l'aide de microbilles magnétiques. Elle concerne également un milieu d'analyse pour la détection des analytes dans l'échantillon permettant de mettre en œuvre ce procédé. L'invention trouve son application dans le domaine du dosage immunologique.

Plus généralement, l'invention concerne un procédé de mesures simultanées des masses respectives d'une première et d'une deuxième pluralité de nanoparticules superparamagnétiques, les nanoparticules de la première et de la deuxième pluralités présentant des caractéristiques superparamagnétiques différentes.

ARRIERE PLAN TECHNOLOGIQUE DE L' INVENTION

Dans le domaine du dosage immunologique, et comme cela est par exemple divulgué par le document de Huang, Zhen, et al. "Application and development of superparamagnetic nanoparticles in sample pretreatment and immunochromatographic assay. " TrAC Trends in Analytical Chemistry 114 (2019): 151-170 il est courant d'employer un milieu d'analyse permettant la détection d'un analyte, voire même la mesure de sa quantité ou de sa concentration, par exemple par écoulement naturel latéral d'un échantillon liquide sur une bandelette de test ou par écoulement forcé à travers une colonne comprenant un matériau poreux. Ainsi, et en référence aux figures la, lb, une bandelette de test 1 de l'état de la technique comprend un substrat formé d'une matière, par exemple poreuse, permettant par capillarité de favoriser l'écoulement de l'échantillon liquide E susceptible de contenir les analytes A. Cet échantillon E est déversé sur une zone de réception la pour imprégner le substrat et s'écoule latéralement à partir de la zone de réception la de l'échantillon 1. Des agents marqués magnétiquement 2 (comprenant par exemple des anticorps aptes à se lier aux analytes) sont disposés au niveau de la zone de réception la ou à proximité de cette zone afin de se dissoudre dans l'échantillon E, se lier aux analytes A et former des complexes analyte-agent marqués magnétiquement.

La bandelette de test 1 formant le milieu d'analyse comprend également une zone de capture le où résident des agents de capture 3 immobilisés, typiquement les mêmes anticorps que ceux compris dans les agents marqués magnétiquement 2. Les complexes et les agents marqués magnétiquement 2 et non liés migrent de la zone de réception la vers la zone de capture le et parcourent une zone intermédiaire de migration lb.

Les complexes sont sélectivement retenus par les agents de capture 3 au niveau de la zone de capture le. Les agents marqués magnétiquement 2 et non liés à des analytes A poursuivent leur migration au-delà de cette zone. La détection des agents marqués magnétiquement 2 et liés à des analytes A dans la zone de capture le fournit indirectement un moyen de détecter la présence des analytes A dans l'échantillon.

La bandelette de test 1 comprend également une zone de contrôle ld disposée en aval de la zone de capture le dans le sens de l'écoulement de l'échantillon E, et sur laquelle résident, immobilisés, des agents de contrôle 4. Ces agents 4 sont configurés pour se lier aux agents marqués magnétiquement 2 et non liés à des analytes A pour les retenir dans la zone de contrôle ld.

La détection des agents marqués magnétiquement 2 dans la zone de contrôle ld fournit des moyens permettant d'indiquer que le test s'est déroulé convenablement, c'est-à-dire que l'échantillon E s'est bien écoulé de la zone de réception la jusqu'à la zone de capture le.

Comme on l'a déjà énoncé, le milieu d'analyse peut alternativement être formé d'une colonne emplie d'un matériau poreux dans lequel sont greffés les agents de capture 3. Dans ce mode de mise en œuvre du dosage immunologique, la migration des complexes et des agents marqués magnétiquement 2 et non liés est provoquée en forçant l'écoulement de l'échantillon E à travers le matériau poreux de la colonne. Il est intéressant de constater que, dans ce cas, il n'y a pas de possibilité de réaliser de zone de contrôle.

Quel que soit le mode de mise en œuvre choisi, bandelette ou colonne de test, les agents marqués magnétiquement 2 sont usuellement formés de microbilles magnétiques de dimensions micrométriques comprenant des nanoparticules superparamagnétiques. Les microbilles sont fonctionnalisées (par exemple avec des anticorps) pour se lier à des analytes A de l'échantillon. Les nanoparticules sont de dimensions nanométriques (c'est-à-dire dont le grand diamètre est compris entre quelques nanomètres et quelques dizaines de nanomètres), par exemple des particules de Fe, de Ni ou de Co ou d'autres mélanges. Ces particules peuvent être incorporées à l'aide d'un liant dans les microbilles magnétiques.

Les matériaux superparamagnétiques qui entrent dans la constitution des microbilles ont la particularité de présenter un cycle magnétique B (H) non linéaire lorsque le champ magnétique d'excitation H varie sur une plage suffisamment étendue. B désigne l'induction magnétique dans le matériau provoqué par ce champ H. Elles présentent également l'avantage de ne pas avoir de rémanence, c'est-à-dire que B(0)=0.

Pour détecter la présence ou l'absence d'analytes A dans l'échantillon, on utilise un dispositif de mesure apte à repérer la présence des nanoparticules superparamagnétiques, voire même à estimer la quantité présente de nanoparticules. On procède pour cela à deux mesures successives, une première au niveau de la zone de capture le, une deuxième au niveau de la zone de contrôle ld lorsque celle-ci existe. A l'aide du résultat de ces mesures, on est capable de vérifier que le test immunologique s'est déroulé convenablement (détection d'un signal au niveau de la zone de contrôle ld) et de déterminer la présence ou l'absence d'analytes A dans l'échantillon analysé (présence ou absence d'un signal au niveau de la zone de capture le).

Pour procéder à ces mesures, on peut employer un dispositif de mesure exploitant la non-linéarité du cycle magnétique des nanoparticules incorporées dans les microbilles, par exemple conforme à celui décrit dans le document EP3314248. Ce dispositif permet notamment d'estimer les quantités de matériaux superparamagnétiques respectivement présentes dans les zones de contrôle ld et de capture le, au cours de deux étapes séparées de mesure.

Ce dispositif comprend quatre bobines arrangées dans un circuit de mesure, dont une bobine de mesure dans laquelle on place la zone de la bandelette de test 1 que l'on souhaite évaluer.

Les quatre bobines sont disposées électriquement en série et sont identiques les unes aux autres. Les bobines sont traversées par des courants à haute fréquence (HF), à basse fréquence (BF) et continu (DC) selon une configuration bien précise visant à développer un champ magnétique différent dans chacune des bobines. On expose le matériau superparamagnétique à un champ magnétique haute et basse fréquences et, du fait du comportement non linéaire du matériau, la réponse à cette excitation contient des composantes à des fréquences qui sont des combinaisons linéaires des fréquences d'excitation. Le document prévoit de procéder à la mesure d'une composante de tension de mesure à une fréquence correspondant par exemple à la fréquence HF - BF et/ou HF + BF. Cette composante devient proportionnelle à la quantité de matériau superparamagnétique disposée dans la bobine de mesure lorsque l'on applique en plus une composante continue. Cette quantité s'inverse lorsque l'on inverse la composante continue, ce qui permet d'améliorer le rapport signal sur bruit de la mesure lorsque l'on réalise une séquence d'excitation avec plusieurs valeurs de composante continue (en général à valeur moyenne nulle).

Après avoir convenablement placé le milieu d'analyse dans (ou à proximité) de la bobine de mesure, on reproduit une pluralité de mesures d'une force électromotrice prélevée dans le circuit de mesure. Cette pluralité de mesures est indexée par les valeurs de courant continu distinctes injecté dans le circuit de mesure. Ces mesures sont alors combinées pour former un vecteur de mesure. Ce vecteur est lui-même combiné à un vecteur de signature d'une masse magnétique étalon pour estimer la masse de matière superparamagnétique présente dans un périmètre de mesure du dispositif. Cette combinaison peut notamment mettre en œuvre un produit scalaire des deux vecteurs.

Cet état de la technique présente plusieurs limitations. Lorsque le milieu d'analyse est formé d'une colonne emplie d'un matériau poreux, il n'est généralement pas possible de vérifier le bon déroulement du test par une mesure au niveau d'une zone de contrôle. Cette absence de validation du test est désavantageuse .

Lorsqu'une telle zone de contrôle existe, comme cela peut être le cas d'un milieu d'analyse se présentant sous la forme d'une bandelette permettant la migration latérale de l'échantillon, son exploitation nécessite de procéder à deux mesures successives, l'une au niveau de la zone de capture le et l'autre niveau de la zone de contrôle ld. Cette duplication de la mesure nécessite de déplacer manuellement la bandelette de test relativement au dispositif de mesure ou d'équiper celui-ci d'un réceptacle mobile de la bandelette. Dans tous les cas, cette exigence ralentit l'obtention du résultat du test immunologique. De plus, la mesure est très sensible à la distance séparant la zone de mesure de la bobine de mesure, ce qui impose de contrôler très précisément et répétablement la position de la bandelette.

Lorsque le dispositif de mesure est exploité pour fournir une estimation de la masse magnétique présente dans la zone de capture le et ainsi estimer la quantité d'analytes A dans l'échantillon E, le résultat fourni est parfois imprécis. Cela tient du fait que la quantité d'agents marqués magnétiquement 2 initialement présente dans l'échantillon E est généralement mal connue. Certains de ces agents 2 peuvent par ailleurs s'accrocher dans la zone de migration et ne pas atteindre la zone de capture le et/ou la zone de contrôle ld. De plus, les propriétés magnétiques des microbilles ainsi que les phénomènes de migration varient assez fortement en fonction de la température.

En conséquence, la mesure de la masse magnétique absolue présente dans la zone de capture le est une information gu'il est peu fiable d'exploiter, dans les solutions de l'état de la technique, pour estimer la quantité ou la concentration d'analytes A dans l'échantillon E.

OBJET DE L' INVENTION

Un but de l'invention est de remédier à une partie au moins des inconvénients précités.

BREVE DESCRIPTION DE L' INVENTION

En vue de la réalisation de ce but, et selon un premier aspect, l'objet de l'invention propose un milieu d'analyse pour dosage immunologique comprenant un substrat pour favoriser l'écoulement naturel ou forcé d'un échantillon liquide susceptible de comporter des analytes, le substrat présentant une zone de capture.

Selon l'invention, la zone de capture comprend, immobilisées sur ou dans le substrat, une pluralité de premiers agents de capture apte à sélectivement retenir des complexes liés aux analytes et une pluralité de deuxièmes agents de capture apte à sélectivement retenir des agents de référence.

Selon d'autres caractéristiques avantageuses et non limitatives de l'invention, prises seules ou selon toute combinaison techniquement réalisable :

- le substrat comprend également, en amont de la zone de capture dans le sens de l'écoulement, une pluralité d'agents de test marqués d'un premier type de microbilles magnétiques, les agents de test étant aptes à se lier aux analytes, et une pluralité d'agents de référence marqués d'un deuxième type de microbilles magnétiques, le premier type de microbilles magnétiques et le deuxième type de microbilles magnétiques ayant des propriétés superparamagnétiques différentes ;

- les premiers agents de capture sont respectivement associés à des complexes comprenant des analytes et des agents de test marqués d'un premier type de microbilles magnétiques, et les deuxièmes agents de capture sont associés à des agents de référence marqués d'un deuxième type de microbilles magnétiques, le premier type de microbilles magnétiques et le deuxième type de microbilles magnétiques ayant des propriétés superparamagnétiques différentes ;

- le substrat est formé d'un matériau poreux ; le substrat se présente sous la forme d'une bandelette ; le substrat se présente sous la forme d'une quantité de matériau disposé dans une colonne.

Selon un autre aspect, l'invention propose un procédé de détection de la présence d'analytes dans un échantillon liquide, le procédé comprenant les étapes suivantes :

- mettre l'échantillon en présence d'agents de test marqués d'un premier type de microbilles magnétiques, les agents de test étant aptes à se lier aux analytes, et d'agents de référence marqués d'un deuxième type de microbilles magnétiques, les premier et deuxième types de microbilles magnétiques présentant des caractéristiques superparamagnétiques différentes ;

- appliquer l'échantillon à un milieu d'analyse avant ou après l'étape de mise en présence ;

- sélectivement retenir sur ou dans une zone de capture du milieu d'analyse une partie au moins des agents de test liés aux analytes et des agents de référence par l'intermédiaire, respectivement, d'une pluralité de premiers agents de capture et d'une pluralité de deuxièmes agents de capture ;

- successivement exposer la zone de capture à une pluralité de champs magnétiques d'excitation d'intensités moyennes distinctes, mesurer la réponse magnétique combinée des microbilles du premier type et des microbilles du deuxième type présent dans la zone de capture pour chaque champ magnétique d'excitation et ainsi former un vecteur de mesure ;

- traiter le vecteur de mesure pour déterminer la quantité absolue ou relative de microbilles du premier type et des microbilles du deuxième type.

Selon d'autres caractéristiques avantageuses et non limitatives de l'invention, prises seules ou selon toute combinaison techniquement réalisable :

- la réponse magnétique combinée correspond à la dérivée seconde de la fonction reliant le champ d'excitation à l'induction magnétique des microbilles du premier type et des microbilles du deuxième type ;

- l'étape de traitement du vecteur de mesure comprend une recherche, dans une base de vecteurs étalons, d'un vecteur étalon le plus proche du vecteur de mesure, chaque vecteur étalon de la base étant associé à une quantité connue de microbilles du premier type et de microbilles du deuxième type ;

- l'étape de traitement du vecteur de mesure comprend la recherche numérique des masses magnétiques respectives des nanoparticules composant les microbilles de chaque type ; l'étape de traitement comprend le repérage d'un premier pic et d'un deuxième pic de la réponse magnétique respectivement associés aux microbilles du premier type et aux microbilles du deuxième type pour déterminer les pentes reliant le premier pic et le deuxième pic à l'origine ; l'étape de traitement comprend le recalage de la réponse magnétique combinée pour faire correspondre un deuxième pic de cette réponse associé aux microbilles du deuxième type à un pic de référence de la signature des microbilles de deuxième type ou des vecteurs étalons.

BREVE DESCRIPTION DES FIGURES

D'autres caractéristiques et avantages de l'invention ressortiront de la description détaillée de l'invention qui va suivre en référence aux figures annexées sur lesquels :

- Les figures la et lb représentent un milieu d'analyse de l'état de la technique respectivement avant et après son emploi ;

- La figure 2 représente la dérivée seconde de la relation liant un champ magnétique d'excitation à l'induction magnétique provoqué par ce champ dans deux matériaux superparamagnétiques ayant des propriétés différentes ;

- Les figures 3a et 3b représentent un milieu d'analyse conforme à un mode de mise en œuvre de l'invention respectivement avant et après son emploi ;

- La figure 4 représente la caractéristique superparamagnétique d'une zone de capture le d'un milieu d'analyse 1 pour des échantillons E comprenant des quantités croissantes d'analytes A ; - La figure 5 représente l'effet de la variabilité de la distance sur la caractéristique superparamagnétique relevé par un dispositif de mesure.

DESCRIPTION DETAILLEE DE L' INVENTION

Par souci de simplification de la description à venir, les mêmes références sont utilisées pour des éléments identiques ou assurant la même fonction dans l'état de la technique ou dans les différents modes de mise en œuvre de l'invention.

Microbilles du premier et du deuxième type.

D'une manière générale, les principes qui sous-tendent l'invention consistent à employer sur ou dans le milieu d'analyse 1 deux types différents de microbilles, c'est-à-dire des microbilles présentant des caractéristiques superparamagnétiques différentes. Ces microbilles seront respectivement désignées microbilles du premier type Ml et microbilles du deuxième type M2.

Comme cela a déjà été évoqué en introduction de cette demande, ces microbilles du premier type Ml et du deuxième type M2 sont formées d'un liant incorporant des nanoparticules superparamagnétiques. Chaque type de microbilles Ml, M2 contient une quantité fixe, d'une microbille à l'autre, de nanoparticules superparamagnétiques. Les microbilles Ml du premier type sont fonctionnalisées (par exemple par des anticorps choisis pour être aptes à se lier aux analytes A de l'échantillon E qui sera soumis au test) et ainsi former des agents de test T. Les microbilles de deuxième type M2 sont quant à elles fonctionnalisées pour prévenir cette liaison (ou de manière plus générale, prévenir toute liaison avec toute forme d'analyte si plusieurs types d'analytes sont susceptibles d'être présents dans l'échantillon E) et ainsi former des agents de référence R. Pour le dire autrement, les agents de référence R sont donc inaptes à former des complexes avec des analytes.

Les microbilles du premier type et du deuxième type Ml, M2 présentent des caractéristiques superparamagnétiques bien déterminées. Par « caractéristique superparamagnétique », on désigne la relation ou le graphe liant un champ magnétique d'excitation H de ces nanoparticules à l'induction magnétique B dans le matériau provoqué par ce champ H, B=f(H), ou à la dérivée première, seconde ou troisième de cette relation. Un tel graphe de la fonction f, cette fonction elle-même (ou l'une de ses dérivées) forme en quelque sorte une signature unique de la caractéristique superparamagnétique d'un type de microbille.

Selon un aspect important de la présente description, les caractéristiques superparamagnétiques du premier type Ml et du deuxième type M2 de microbilles sont distinctes l'une de l'autre. En d'autres termes, soumis à un même champ magnétique d'excitation, l'induction magnétique des nanoparticules des microbilles du premier type Ml et du deuxième type M2 sont distinctes. Les graphes ou les fonctions reliant respectivement pour ces deux types de microbilles le champ H d'excitation à l'induction magnétique B sont différents l'un de l'autre.

Une telle distinction de comportement superparamagnétique peut être obtenue en choisissant pour l'un et l'autre type de microbilles des nanoparticules de natures différentes. Ces nanoparticules peuvent notamment être de compositions chimiques différentes (par exemple des particules de Fe304 dans un cas et de Fe200180 dans l'autre cas). Elles peuvent alternativement présenter des tailles différentes (par exemple présentant un grand diamètre de 7 nm dans un cas et de 10 nm dans l'autre cas). On peut bien entendu également mixer ces propriétés de taille et de nature chimique.

On a ainsi respectivement représenté sur la figure 2, les caractéristiques superparamagnétiques respectives de deux types de microbilles, un premier type de microbilles comprenant des nanoparticules de Fe304 de 7nm de diamètre (en traits pointillés) et le deuxième type de microbilles comprenant les mêmes natures de nanoparticules, mais cette fois de 10 nm de diamètre (en trait plein). Les courbes représentées sont des courbes de sensibilité, c'est-à-dire de la dérivée seconde de la fonction f liant un champ d'excitation H à l'induction magnétique B des nanoparticules .

On note que sur la figure 2, les caractéristiques superparamagnétiques des microbilles présentent un aspect général d'arche sinusoïdale similaire. Elles passent l'une et l'autre par le centre du repère et présentent des extrema d'aimantation B+, B- pour des valeurs de champ H+, H-. Toutefois les caractéristiques superparamagnétiques des deux types de microbilles diffèrent grandement l'une de l'autre, notamment par la hauteur des extrema B _R +, B _R - (pour les microbilles de deuxième type), B _T +, B _T - (pour les microbilles de premier type) et par les valeurs du champ d'excitation H _R +, H _R -(pour les microbilles de deuxième type) et Ht+, H _T - (pour les microbilles de premier type) à laquelle les nanoparticules doivent être soumises pour atteindre ces extrema.

Pour des raisons qui deviendront apparentes dans la suite de cette description, on choisira avantageusement les microbilles magnétiques Ml du premier type (qui marqueront magnétiquement des agents de test T) pour que ses caractéristiques superparamagnétiques évoluent sur un intervalle [H _T -, H _T +] relativement étroit, et on choisira les microbilles magnétiques du deuxième type M2 (formant l'agent de référence R) pour que ses caractéristiques superparamagnétiques évoluent dans un intervalle [H _R -, H _R +] relativement large.

De manière générale, lorsque les nanoparticules des microbilles du premier et du deuxième type Ml, M2 diffèrent par leurs tailles, on fera en sorte que celles présentant le plus grand diamètre soient de dimension au moins 20 % plus importante que celles présentant le plus petit diamètre, et avantageusement au moins 30%, voire même plus de 40%. On s'assure ainsi de bien marquer les différences de caractéristiques superparamagnétiques entre ces les deux types de microbilles Ml, M2.

Lorsque la caractéristique superparamagnétique, représentée dans la figure 2 sous forme de fonctions continues, est échantillonnée en une pluralité de valeurs selon l'axe des abscisses et représentée sous la forme d'un vecteur, on désignera ce vecteur par le terme « signature ».

1 ^er mode de réalisation du milieu d'analyse - bandelette de test.

En référence aux figures 3a, 3b on présente un milieu d'analyse 1 pour une application dans le domaine du dosage immunologique, permettant de mettre en œuvre les principes qui viennent d'être exposés.

Le milieu d'analyse 1 est formé dans ce mode de réalisation d'un substrat plan, ici sous la forme d'une bandelette, pour recevoir l'échantillon liquide E au niveau d'une zone de réception la, ici disposée à une extrémité de ce substrat. Le substrat 1 est composé de matière poreuse favorisant l'écoulement latéral de la solution, par capillarité, de la zone de réception la à l'extrémité distale de la bandelette 1. Dans l'exemple représenté, la zone de réception la jouxte une zone sur laquelle sont disposées une pluralité d'agents de test T marqués d'un premier type Ml de microbilles magnétiques et une pluralité d'agent de référence R marqués d'un deuxième type M2 de microbilles magnétiques.

Les agents de test T sont aptes à se lier aux analytes A de l'échantillon E, dans le cas bien sûr où ces analytes A sont bien présents. Ce n'est pas le cas des agents de référence R. Lorsqu'un agent de test T se lie à un analyte A, ils forment un ensemble désigné « complexe » dans la suite de cette demande, marqué magnétiquement par une microbille Ml du premier type.

Qu'ils soient liés ou non aux analytes A, les agents de test T ainsi que les agents de référence R migrent latéralement, entraînés par le phénomène d'écoulement latéral déjà évoqué, et progressent à travers une zone de migration lb pour atteindre une zone de capture le disposée en aval du milieu d'analyse 1, dans le sens de l'écoulement.

En alternative à l'exemple représenté sur ces figures dans lequel les agents de tests T et les agents de référence R sont disposés sur le substrat 1 à côté de la zone de réception la, on pourra prévoir de placer ces agents directement sur la zone de réception la ou plus en aval de cette zone, à proximité de la zone de capture le.

On précise également qu'il n'est pas nécessaire que le milieu d'analyse 1 soit originellement muni des agents de référence R et des agents de test T. Ceux-ci peuvent être mélangés préalablement à l'échantillon E avant que celui-ci ne soit déversé sur la zone de réception la de la bandelette de test 1. Dans tous les cas néanmoins, on veillera à mettre l'échantillon en présence des agents de test T et des agents de référence R, que cette mise en présence soit réalisée avant ou après l'imprégnation du milieu d'analyse 1 par l'échantillon E.

La zone de capture le du milieu analyse comporte quant à elle une pluralité de premiers agents de capture Cl et une pluralité de deuxièmes agents de capture C2, ces agents étant l'un et l'autre immobilisés sur le substrat.

Les premiers agents de capture Cl sont aptes à sélectivement retenir les complexes formés d'analytes A et d'agents de test T, c'est-à-dire marqués magnétiquement par des microbilles Ml de premier type. Les deuxièmes agents de capture C2 sont quant à eux aptes à sélectivement retenir des agents de référence R, marqués donc par des microbilles M2 du deuxième type. Par « sélectivement », on signifie que ces agents de capture retiennent et immobilisent uniquement les agents pour lesquels ils sont aptes à se lier.

Selon l'invention, le milieu d'analyse peut ainsi comporter une unique zone de capture le comportant, immobilisés de manière mélangée à la fois la pluralité de premiers agents de capture Cl et la pluralité de deuxièmes agents de capture C2.

Pour être complet, on précise que la figure 3a représente un milieu d'analyse 1 conforme à l'invention lors du déversement de l'échantillon E sur le substrat. La figure 3b représente quant à elle ce même milieu 1 après que l'écoulement latéral de l'échantillon E ait provoqué la migration des agents de référence R et de test T vers la zone de capture le. On note que les complexes sont bien retenus au niveau de cette zone de capture le par les premiers agents de capture Cl. Les agents de test T ne s'étant pas liés à des analytes A ont poursuivi leurs migrations vers une zone dite « poubelle » ld du milieu 1. Les agents de référence R sont quant à eux retenus dans la zone de capture le par les deuxièmes agents de capture C2, de manière à saturer ces deuxièmes agents C2 dans cette zone.

Dans tous les cas, une telle configuration du milieu d'analyse permet à ce milieu d'être dépourvu de zone de capture. Les témoins de migration sont donc constitués par les agents de référence R marqués par les microbilles M2 du deuxième type et détectés au niveau de la zone de capture le, et non par les agents de test T non liés à des analytes et détectés au niveau d'une zone de contrôle ld comme dans l'état de la technique cité en introduction de la présente description. De la sorte, l'exploitation du milieu d'analyse ne nécessite plus de procéder à deux mesures successives, l'une au niveau de la zone de capture le et l'autre niveau de la zone de contrôle, mais à une unique mesure au niveau de la zone de capture le.

2ème mode de réalisation du milieu d'analyse - colonne de test.

Selon un mode de réalisation alternatif et non représenté, le milieu d'analyse 1 peut prendre la forme d'une colonne, ouverte à chaque extrémité, et dans laquelle on a disposé un matériau poreux formant substrat. Ce substrat comprend, immobilisés dans au moins une partie de son épaisseur dans la colonne, les premiers et deuxièmes agents de captures Cl, C2. Ces agents de captures Cl, C2 présentent les mêmes propriétés que ceux décrits en relation avec le premier mode de réalisation. La partie d'épaisseur du substrat dans lesquelles sont immobilisés ces agents forme la zone de capture le du milieu d'analyse 1 selon ce mode de réalisation. Cette zone de capture le du milieu d'analyse 1 est donc ici « volumique » par opposition à la zone de capture « surfacique » du premier mode de réalisation. De manière similaire à ce qui a été présenté dans le cadre du premier mode de réalisation, les agents de test T et de référence R peuvent être disposés dans la colonne, en amont de la zone de capture le, avant l'application de l'échantillon E, ou mélangés à cet échantillon E avant de forcer son écoulement à travers le substrat emplissant au moins en partie la colonne.

Quel que soit la manière avec lequel l'échantillon E est mis en présence avec les agents de test T et de référence R, on cherche à favoriser les liaisons entre les agents de test T et les analytes A. On force ensuite l'écoulement de l'échantillon à travers la colonne et le substrat, pour faire migrer les agents de test T, les complexes, les agents de référence R vers la zone de capture le. On retient sélectivement dans cette zone, à l'aide des agents de capture Cl, C2, les agents de test T liés aux analytes et les agents de référence R.

La portion du substrat poreux traversé par l'échantillon E et dépourvu d'agent de capture Cl, C2 constitue une zone de migration lb du milieu d'analyse 1, similaire à celui du premier mode de réalisation. Les agents de test T non liés à des analytes, et donc non retenus dans la zone de capture le, sont évacués de la colonne avec le reste de l'échantillon liquide E.

Indépendamment du mode de réalisation choisi pour le milieu d'analyse 1, et avantageusement, la zone de capture le est dimensionnée pour s'inscrire entièrement dans le périmètre de mesure d'un dispositif de mesure. Comme cela sera détaillé par dans la suite, on peut de la sorte procéder en une seule étape (c'est-à-dire sans déplacer le milieu d'analyse 1 vis-à-vis du dispositif de mesure) à une mesure d'un signal visant à déterminer simultanément la présence et/ou la quantité de microbilles du premier et du deuxième type Ml, M2, c'est-à-dire la présence et/ou la quantité de complexes et d'agents de référence R.

Procédé de détection de la présence d'analytes A dans un échantillon E.

On présente maintenant un procédé de détection de la présence d'analytes A dans un échantillon E qui tire profit d'un milieu d'analyse 1 conforme à ceux qui viennent d'être présentés. D'une manière générale, et comme cela est bien connu dans le domaine du dosage immunologique, on cherche à déterminer la quantité de microbilles du premier type Ml associées à des agents de test T pour en déduire la présence d'analytes A. Plus spécifiquement, l'invention cherche à déterminer la quantité absolue ou relative des microbilles du premier et du deuxième type Ml, M2. Chaque type de microbilles Ml, M2 contient une quantité constante d'une microbille à l'autre de nanoparticules superparamagnétiques, si bien que déterminer la quantité de microbilles d'un type et/ou de l'autre type est équivalent à déterminer la masse de nanoparticules présente dans toutes les microbilles d'un type et/ou de l'autre type.

Comme on l'a vu, ce procédé comprend la mise de l'échantillon E en présence d'agents de test T marqués magnétiquement par les microbilles du premier type Ml et en présence d'agents de référence R marqués magnétiquement par les microbilles du deuxième type M2. Ces microbilles du premier et du deuxième type Ml, M2 comprennent des nanoparticules présentant des caractéristiques superparamagnétiques différentes. Cette étape de mise en présence permet notamment de lier les agents de test T aux analytes, s'ils sont présents dans l'échantillon E, pour former des complexes. Le procédé comprend, avant ou après l'étape de mise en présence, l'application de l'échantillon liquide E sur ou dans le milieu d'analyse 1. La nature poreuse du substrat formant ce milieu favorise l'écoulement naturel ou bien forcé, selon la nature du milieu, de la solution et la migration des complexes, des agents de référence R, des agents de tests T non liés vers la zone de capture le.

Au niveau de cette zone de capture le, les premiers agents de capture Cl se lient aux complexes qu'ils retiennent sélectivement dans cette zone. Les agents de tests T non liés ne sont pas retenus par les premiers agents de capture Cl, ni même par les deuxièmes agents de capture C2 immobilisés dans cette zone le. Ils poursuivent donc leurs migrations vers la zone poubelle ld de la bandelette 1 ou évacués de la colonne.

Simultanément, les deuxièmes agents de capture C2 retiennent sélectivement les agents de référence R dans la zone de capture le, c'est-à-dire que seuls les agents de référence R sont retenus par les deuxièmes agents de capture C2.

Avantageusement, on cherche à disposer dans la zone de capture le une quantité relativement constante d'un test immunologique à l'autre. Cela peut être obtenu en intégrant une quantité contrôlée d'agents de référence R et de deuxièmes agents de capture C2 dans le milieu d'analyse.

À l'issue de cette étape de migration et de retenue sélective, on met en œuvre une étape de mesure visant à obtenir la caractéristique superparamagnétique combinée des microbilles du premier type Ml (associées aux complexes) et des microbilles de deuxième type M2 (associées aux agents de référence R) disposées dans la zone de capture le. Pour cela, on peut utiliser un dispositif de mesure du type décrit dans le document européen cité en introduction de cette demande. Ce dispositif permet d'estimer sous la forme d'un vecteur de mesure, la dérivée seconde de la relation f liant le champ magnétique H d'excitation et l'induction magnétique B dans le matériau superparamagnétique. On pourrait employer d'autres techniques de mesure pour estimer la fonction f elle-même (plutôt que sa dérivée seconde), ou pour estimer sa dérivée première ou troisième. Toutefois, l'établissement de la fonction de sensibilité (la dérivée seconde de la fonction f reliant le champ d'excitation H à l'induction magnétique B) par le dispositif de mesure forme le mode de mise en œuvre préféré.

Pour mettre en œuvre l'étape de mesure, et quel que soit le dispositif de mesure employé, on dispose le milieu d'analyse 1 dans ce dispositif de mesure de telle sorte que la zone de capture le soit placée dans une bobine de mesure de ce dispositif, ou à proximité d'une telle bobine, et dans le périmètre de mesure du dispositif afin de pouvoir être entièrement exposée aux champs magnétiques produits.

On expose la zone de capture le à un champ magnétique d'excitation comprenant une première fréquence (par exemple une relativement basse fréquence), une deuxième fréquence différente de la première (par exemple une relativement haute fréquence) et comprenant également une composante sensiblement constante permettant de fixer l'intensité moyenne du champ. On répète successivement cette exposition pour des composantes constantes distinctes du champ d'excitation de manière à exposer la zone de capture à une pluralité de champs d'excitation d'intensités moyennes variées et distinctes. Pratiquement, ces champs d'excitation sont contrôlés par l'intensité et la fréquence de courants à la première, à la deuxième fréquence et par un courant constant injectés dans un circuit de mesure (comprenant la bobine de mesure) du dispositif de mesure.

A chaque exposition successive, on prélève une tension (une force électromotrice) à des bornes de mesure de ce circuit de mesure, que l'on traite pour en extraire une composante à une fréquence de mélange, cette fréquence de mélange étant une combinaison linéaire des premières et deuxièmes fréquences du champ d'excitation. La valeur de cette composante est liée (proportionnelle) à la quantité de matière de superparamagnétique présent dans le champ H produit par la bobine de mesure, c'est-à-dire aux masses respectives des nanoparticules superparamagnétiques présents dans les microbilles de premier et de deuxième types. Pour l'exprimer différemment, à chaque exposition successive, on mesure la réponse magnétique combinée des microbilles du premier type Ml et des microbilles du deuxième type M2 présentes dans la zone de capture le pour chaque champ magnétique d'excitation H.

En répétant ce traitement pour chacune des étapes d'exposition, on peut former un vecteur de mesure échantillonnant, pour différentes valeurs de courant continu (représentatives d'un champ d'excitation), la caractéristique superparamagnétique combinée des microbilles du premier et du deuxième type Ml, M2 présentes dans la zone de capture le.

A titre d'exemple de caractéristiques superparamagnétiques qui peuvent être relevées par cette approche, on a représenté sur la figure 4 la caractéristique superparamagnétique d'une zone de capture le d'un milieu d'analyse 1 pour des échantillons E comprenant des quantités croissantes d'analytes E (et donc de microbilles magnétiques du premier type Ml). L'axe des abscisses de ce graphique correspond au courant continu Idc injecté dans le circuit de mesure du dispositif de mesure, il est représentatif de l'intensité moyenne du champ d'excitation H auquel la zone de capture le a été exposée au cours de la mesure. L'axe des ordonnées correspond à la composante de tension U prélevée par le circuit de mesure à la fréquence de mélange. Cette mesure, à chaque valeur de courant continu Idc donnée, est proportionnelle à la quantité de masse magnétique présente dans la zone de capture le. Dans cet exemple, les microbilles du premier type Ml comprennent des nanoparticules de Fe304 de 7nm de diamètre et le deuxième type de microbilles M2 comprenant les mêmes natures de nanoparticules de 10 nm de diamètre. Les fonctions de sensibilité (la fonction f'') de ces microbilles sont celles représentées sur la figure 2 déjà commentée.

On observe sur cette représentation que, que pour une quantité d'analytes et de microbilles de premier type Ml donnée, la caractéristique superparamagnétique de la zone de capture combine la caractéristique superparamagnétique des microbilles du premier type Ml et la caractéristique superparamagnétique des microbilles du deuxième type M2 dans leurs proportions respectives. Plus le nombre microbilles du deuxième type M2 est important, plus la caractéristique superparamagnétique associée à ces microbilles est marquée dans la caractéristique combinée. On comprend donc l'intérêt de choisir la nature distincte des microbilles de premier et de deuxième type Ml, M2, et de faire en sorte que les extrema de la composante prélevée apparaissent pour des courants Idc dans des gammes de valeur différentes. On peut de la sorte facilement séparer la contribution de chaque type de microbilles de la caractéristique superparamagnétique combinée. En tout état de cause, on dispose à l'issue de l'étape de mesure d'un procédé conforme à l'invention d'un vecteur de mesure Vm représentatif de la caractéristique superparamagnétique combinée des microbilles du premier et du deuxième type Ml, M2 disposées dans le périmètre de mesure du dispositif de mesure (et donc dans la zone de capture le).

Dans une étape suivante, ce vecteur de mesure Vm est exploité pour déterminer la quantité absolue ou relative de microbilles de premier type Ml et de microbilles de deuxième type M2.

Selon une première approche, le vecteur de mesure Vm est exploité en le comparant à une base de vecteurs étalons Vij, un vecteur étalon d'indice i, j ayant été obtenu à l'aide du dispositif de mesure pour une quantité connue de Ni microbilles du premier type Ml et de Nj microbilles de deuxième type M2, disposées dans le périmètre de mesure. La comparaison cherche donc à identifier le vecteur étalon le plus proche du vecteur de mesure Vm, c'est- à-dire à identifier les indices i*, j* qui minimisent la norme (Vm-Vij) pour tout couple (i,j) indexant la base de vecteurs étalons. Les quantités de microbilles du premier type Ml et de microbilles de deuxième type M2 sont alors respectivement fournies par les quantités Ni* et Nj* associées au vecteur Vi*j* dans la base de vecteurs.

Selon une autre approche, on peut rechercher numériquement les quantités respectives de microbilles, en posant que le vecteur de mesure Vm est formé de la somme, respectivement pondérée par les masses magnétiques ml, m2 des nanoparticules composant les microbilles de chaque type, des signatures SI, S2 de chaque type de microbilles Ml, M2 :

Vm = ml*Sl + m2*S2. On peut par application d'une décorrélation/séparation de sources déterminer simultanément la masse ml et la masse m2, et obtenir facilement les quantités respectives de microbilles de chaque type. Il peut ainsi s'agir de mettre en œuvre une technique d'optimisation numérique visant à déterminer les masses magnétiques ml, m2 tel que la norme (Vm-ml*Sl-m2*S2) soit minimale.

L'une et l'autre de ces approches présentent l'avantage de fournir une quantité absolue de microbilles du premier type Ml et de microbilles du deuxième type M2. La quantité de microbilles de deuxième type M2 (associée, pour mémoire, à un agent de référence R) peut être utilisée, si elle dépasse un seuil prédéterminé, comme indicateur de la bonne migration de cet agent R, et ainsi valider le bon déroulement du test immunologique. La quantité de microbilles de premier type Ml (associés pour mémoire aux agents de tests T) peut permettre de quantifier la présence de l'analyte A dans l'échantillon E.

De manière avantageuse, on peut également calculer le ratio entre les deux quantités de microbilles et ainsi obtenir un résultat indépendant des quantités de départ de ces microbilles, ou bien de l'influence d'autres paramètres (tel que la température) sur la migration des agents R, T et sur leurs propriétés superparamagnétiques. On note en particulier qu'une minorité d'agents de référence R, d'agents de test T ou de complexes peuvent rester accrochés au cours de la migration dans la zone de migration lb. Il n'est donc pas exclu que cette zone comprenne des quantités de ces agents R, T et de complexes, que l'on peut raisonnablement estimer être identiques. En conséquence, les quantités absolues de microbilles du premier et du deuxième type Ml, M2 retenues dans la zone de capture le peut varier d'un test à l'autre. En fournissant une valeur relative, sous la forme du ratio proposé ci-dessus, on peut masquer ce phénomène d'accroche et fournir un résultat du test immunologique plus fiable.

Selon une variante avantageuse de l'invention, on cherche à compenser une éventuelle variabilité de la distance séparant la zone de capture le, sur laquelle ou dans laquelle sont disposées les microbilles Ml, M2, et la bobine de mesure, générant notamment le champ d'excitation à l'origine de la mesure. La figure 5 illustre l'effet de cette variabilité sur la caractéristique superparamagnétique relevé par le dispositif de mesure.

Bien que la relation liant le courant injecté dans le circuit de mesure du dispositif de mesure au champ d'excitation généré soit bien établie, la position relative de la zone de capture le vis-à-vis de ce champ peut parfois être moins bien maitrisée, et l'intensité de ce champ au niveau de la zone de capture le peut varier d'une mesure à l'autre. On observe sur la figure 5 la variation de la sensibilité relevée lors d'une variation de cette distance D, car la pente générale de la fonction f'' diminue avec l'augmentation de cette distance D. On observe aussi la variation de la position des extrema (le courant nécessaire pour saturer les nanoparticules devant être augmenté lorsque ces particules sont plus éloignées).

Des études complémentaires ont toutefois montré que le rapport des pentes pO/pref restait quant à lui relativement invariant avec la distance D.

La pente p0 correspond au ratio Ul/Il, où II est le courant injecté dans le circuit de mesure permettant d'obtenir le pic de tension U1 associé à la caractéristique superparamagnétique des microbilles de premier type Ml. Il s'agit donc de la pente reliant l'origine à un premier pic de la réponse magnétique combinée, ce premier pic étant associé aux microbilles de premier type Ml.

La pente pref correspond au ratio Uref/Iref, où Iref est le courant injecté dans le circuit de mesure permettant d'obtenir le pic de tension Uref associé à la caractéristique superparamagnétique des microbilles de deuxième type M2. Il s'agit donc de la pente reliant l'origine à un deuxième pic de la réponse magnétique combinée aux microbilles de deuxième type M2 à l'origine.

Selon donc une autre approche avantageuse, le vecteur de mesure Vm est traité pour repérer les maxima U1 et Uref, ainsi que les courants II et Iref pour lesquels ces maxima sont atteints afin de déterminer les pentes p0 et pref. Si le maxima U1 ne peut être identifié (cas où la quantité de microbilles de premier type Ml est nulle), on prendra par défaut pO = pref. A l'issue de ce traitement, on peut alors fournir la quantité relative de microbilles de premier type Ml vs de microbilles de deuxième type M2 en retournant par exemple le ratio r = p0/pref - 1, même lorsque la distance séparant ces microbilles du dispositif de mesure est mal maîtrisée. Avantageusement, pour procéder à cette analyse, on peut reconstituer la fonction f'' de sensibilité par interpolation des points de mesure formant le vecteur de mesure

Vm.

On peut utiliser les mêmes principes sous-jacents à l'approche précédente pour recaler les vecteurs de mesure, les vecteurs étalons et les signatures fournis par le dispositif de mesure, afin de rendre ces vecteurs plus indépendants de la distance.

En prenant l'hypothèse que la quantité de microbilles de deuxième type M2 (associées aux agents de référence R retenus dans la zone de capture le) est sensiblement constante, on peut déterminer les facteurs fx, fy de recalage à appliquer respectivement selon l'axe des abscisses (courant Idc) et selon l'axe des ordonnées (tension mesurée U) au graphe représentant le vecteur de mesure pour faire coïncider les maxima (Iref, Uref) de ce vecteur de mesure avec les maxima du vecteur de signature S2 des microbilles de deuxième type M2. Ce traitement permet d'élaborer un vecteur de mesure recalé que l'on peut exploiter selon l'une des deux premières approches présentées ci-dessus, afin de déterminer la quantité absolue de microbilles de premier type Ml (associées aux agents de tests T). A nouveau, ce traitement peut nécessiter de reconstituer la fonction de sensibilité f'' par interpolation des points de mesure formant le vecteur de mesure Vm. On peut de la sorte reconstituer un vecteur de mesure recalé, présentant une cardinalité standard.

Bien entendu l'invention n'est pas limitée aux modes de mise en œuvre décrits et on peut y apporter des variantes de réalisation sans sortir du cadre de l'invention tel que défini par les revendications .

Bien que l'on ait présenté ici une application de la méthode de mesure dans le domaine du dosage immunologique, le procédé de mesure peut s'appliquer plus généralement pour mesurer simultanément les masses magnétiques d'une pluralité de premières et d'une pluralité de deuxièmes nanoparticules superparamagnétiques présentant des caractéristiques différentes. Ce procédé met en œuvre une étape visant à successivement exposer les premières et deuxièmes nanoparticules à une pluralité de champs magnétiques d'intensités moyennes distinctes, mesurer leurs réponses magnétiques combinées et former un vecteur de mesure. Il met ensuite en œuvre une étape visant à traiter ce vecteur de mesure pour déterminer les masses magnétiques des pluralités des premières et des deuxièmes nanoparticules superparamagnétiques.