^明

瘤中的应用。 背景技术

抗肿瘤抗生素是由微生物产生的具有抗肿瘤活 性的化学物质，产生菌 有细菌、 放线菌、 真菌、 酵母以及藻类。 迄今为止， 大多数抗肿瘤抗生素 的产生菌是土 ¾ϋ线菌， 以链球菌为主。从土壤中新分离出的菌株， 可在 适当的培养基与条件下培养， 检测其是否产生有效物质。 根据目标对象， 选用适宜的方法与模型对菌株进行筛选。一般 先用简便快速的体外实验作 为大量菌种的初筛， 对获得的有效菌种从菌、 素两方面进行早期鉴别， 综 合判断是否为新物质。

对于经过验证为新物质的化合物，还可以通过 化学修饰或者结构改良 等方式进行功能改进。

本发明中以核苷转运为靶点筛选菌发酵液中的 天然活性产物，体外培 养人口腔鱗癌 KB细胞， 将菌发酵液中的天然活性产物处理细胞， 通过与 正常对照组相比较，提供了一种新的药效更强 、抗瘤谱更广的化合物及其 专用菌林。

发明内容

发明人在筛选抗肿瘤抗生素的过程中，从我国 云南省关平县土壤样品 中分离得到一株链霉菌 Streptomyces albulus C-9095 (该产生菌已于 2011 年 5月 9日送交中国微生物菌种保藏管理委员^ 通微生物中心保藏，地 址： 北京市朝阳区北辰西路 1号院 3号， 保藏编号： CGMCC No. 4831), 从该菌株发酵液中提取到二肽核苷肽类化合物 。该化合物经过酸化后分离 得到单氨基酸核苷类化合物， 其化学名称为： 1-胞嘧啶基 -4-D-丝氨酰氨 -1,4-去二氧 -β-D-吡喃型葡萄糖羧酸， 发明人将其命名为安可霉素 ( ancomycin ) , 其分子构成包括 3个部分： 丝氨酸、 胞嘧啶和氨基己糖 (酸)， 其化学结构如式（1 )所示。 发明人发现安可霉素具有抗肿瘤活性， 例如对人肝癌细胞 Bel-7402 和 HepG2 均具杀伤作用， IC ₅ 。分别为 36.54μιηο1/1和 112.82μιηο1/1。 发明人进一步将安可霉素化学结构中己糖 环上 5，位羧基进行结构修饰， 得到安可霉素的酯类衍生物， 发现安可霉 素酯类衍生物也具有良好

为此， 本发明的第一方面提供了式（I )化合物、 其药学可接受的盐 或溶剂合物，

其中： R可为 COOR" 其中 可以是 H、取代或未取代的 C1 ~ C10 直链或直链烷烃； 优选为 H、 取代或未取代的 C1 ~ C6直链或直链烷烃； 进一步优选为 H、 取代或未取代的 CI ~ C5直链或直链烷烃。

在本发明的一个具体的实施例中， 所述的取代或未取代的 C1 ~ C10 直链或直链烷烃， 其任选被选自以下的取代基单或多取代： 卤素、 Cl ~ C6直链或直链垸基、 C2 ~ C6直链或直链烯基、 C2 ~ C6直链或直链炔基、 腈基、 三氟甲基、 三氟甲氧基、 羟基、 硝基、 氨磺酰基、 脒基、 氰基、 氨 基、 酰 J

在本发明的一个具体的实施例中，式（ I )中所述的 优选为 -H、- CH ₃ 、 -CH(CH ₃ ) ₂ 或 -(CH ₂ ) ₂ CH(CH ₃ ) ₂ 。

在本发明的一个具体的实施例中， 式（I )所示的化合物选自： 安可霉素 （ 1-胞嘧啶基 -4-D-丝氨酰氨 -1,4-去二氧 -β-D-吡喃型葡萄糖 羧酸）

安可霉素甲酯 （ 1-胞嘧啶基 -4-D-丝氨酰氨 -1,4-去二氧 -β-D-吡喃型葡 萄糖羧甲酯） ；

安可霉素异丙酯（ 1-胞嘧啶基 -4-D-丝氨酰氨 -1,4-去二氧 -β-D-吡喃型 葡萄糖羧酸异丙酯） ；

安可霉素异戊酯（ 1-胞嘧啶基 -4-D-丝氨酰氨 -1,4-去二氧 -β-D-吡喃型 葡萄糖羧酸异戊酯） 。

本发明的第二方面提供一株链霉菌 ( Streptomyces albulu C-96>95。 该菌株已于 2011年 5月 9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会 普通微生物中心（简称 CGMCC, 地址： 北京市朝阳区北辰西路 1号院 3 号，中国科学院微生物研究所，邮编 100101 )，保藏号为 CGMCC No. 4831 , 分类命名为链霉菌 Streptomyces albulus ~) , 菌株名称为 C-9095。

本发明的第三方面提供本发明的链霉菌 （ Streptomyces albulus ) C-9095 (保藏号为 CGMCC No. 4831 )用于制备式（I )化合物的用途。

本发明的第四方面提供式（I )化合物的制备方法， 该方法包括以下 步骤：

( a )安可霉素的制备： 将链霉菌（ Streptomyces albulus ) C-9095 (保 藏编号： CGMCC No. 4831 )发酵提取， 获得式（1 )所示的发酵产物安 可霉素；

( b )安可霉素酯类衍生物的制备： 根据需要， 通过合适的反应条件， 将取代或未取代的 CI ~ C10直链或直链烷烃连接在步骤（ a )中获得的安 可霉素的己糖环上 5，位羧基上， 获得安可霉素酯类衍生物。

优选地， 所述的制备方法中， 步骤 )安可霉素的制备， 包括以下 步骤：

( i )将链霉菌菌株 在合适的培养基中， 以合适的温度下培养一定 的时间， 获得发酵培养物；

( ii )将发酵液培养物固液分离， 冷冻干燥得到淡黄色粉末， 将淡黄色粉 末进一步分离纯化得到二肽核苷类化合物，所 述二肽核苷类化合物的特征 在于以在展开剂为 70%甲醇水溶液展开层析时， 其11尸0.60, 将此二肽核 苷类化合物经酸化得到安可霉素；

优选地， 上述制备方法中， 步骤（i ) 中， 包括制备种子培养液和发 酵培养液两步骤；

步骤（i ) 中优选的培养基为适合链霉菌的培养基， 进一步优选的制 备种子培养液的种子培养基为葡萄糖-淀粉-牛� ��膏-鱼蛋白胨 -黄豆饼粉种 子培养基； 优选的培养温度为 25 ~ 30°C , 进一步优选为 28°C; 优选的培 养时间为 15 ~ 55小时， 进一步优选为 24 ~ 48小时；

优选地， 上述制备方法中， 步骤（i ) 中， 优选的制备发酵培养液的 培养基为葡萄糖 -淀粉 -酵母粉-黄豆饼粉发酵培养基； 优选的培养温度为 25 ~ 30°C , 进一步优选为 28°C ; 优选的培养时间为 80 ~ 120小时， 进一 步优选为 90 ~ 100小时， 更优选为 96小时；

优选地， 上述制备方法中， 步骤（ii ) 中， 所述的固液分离步骤包括 过滤、 活性炭柱吸附、 强酸型阳离子树脂柱分离的步骤； 优选的酸化剂为 浓盐酸， 优选的酸化条件为 30 ~ 40 ^e C反应 20 ~ 28小时， 进一步优选的酸 化条件为 37°C反应 24小时。

在一个优选的实施例中， 上述制备方法中， 步骤（ii ) 中， 所述的固 液分离步骤中滤液经活性炭柱吸附后，用合适 的溶液（例如丙酮和水的混 合溶液） 洗脱， 除丙酮后， 再通过强酸性阳离子树脂柱（铵型）， 再洗脱 (例如用氨水洗脱）， 除氨， 冷冻干燥得到淡黄色粉末。 优选的除丙酮的 方式为减压除丙酮。

在一个具体的实施例中， 所述的制备方法中， 步骤（a )安可霉素的 制备首先是将链霉菌菌株 斜面培养物， 接种于葡萄糖 -淀粉 -牛肉 膏-鱼蛋白胨-黄豆饼粉种子培养基， 28Ό培养 24 ~ 48 小时， 转种于葡萄 糖 -淀粉 -酵母粉-黄豆饼粉发酵培养基中， 28Ό培养 96小时后收获发酵液; 然后过滤发酵液， 滤液经活性炭柱吸附， 活性部分去除丙酮， 通过强酸性 阳离子树脂柱， 活性部份除氨， 冷冻干燥得淡黄色粉末， 将该粉末用制备 薄层硅胶层析板分离纯化，展开剂为 70%甲醇水溶液,取 Rf=0.60的条带， 得到二肽核苷类化合物，将得到的二肽核苷类 化合物溶于浓盐酸中， 37'C 搅拌反应， 反应 24h后， 分离纯化得到安可霉素。

在本发明的一个具体的实施例中， 所述的制备方法中， 步骤（b )是 将步骤（a )获得的式（1 )所示的安可霉素与式（4 )化合物在合适的条 件下反应， 制备得到 I )化合物，

其中， 的定义如权利要求 1所述， X为卤素或羟基。

在本发明的一个具体的实施例中， 当式（4 )化合物为甲醇时， 该方 法是将步骤 )获得的式（1 )所示的安可霉素溶解于甲醇 -二氯亚砜溶 液中， 室温搅拌反应完全后， 得到安可霉素甲酯。

在一个具体的实施例中， 该方法是将安可霉素溶解于甲醇-二氯亚砜 溶液中， 室温搅拌反应 48小时， 反应液减压蒸干， 用制备薄层硅胶层析 板分离纯化， 得到安可霉素甲酯。

在本发明的一个具体的实施例中， 当式（ 4 )化合物为卤代异丙烷时， 该方法是将步骤（ a )获得的式（ 1 )所示的安可霉素溶解于二甲基亚砜中， 滴加丙酮， 然后分别加入卤代异丙烷和 K ₂ C0 ₃ 粉末， 搅拌反应完全后， 得到安可霉素异丙酯； 优选的反应条件是在 50 ~ 55'C反应 17小时。

在一个具体的实施例中， 该方法是将安可霉素溶解于二甲基亚砜中， 緩慢滴加丙酮， 然后分别加入碘代异戊烷和 K ₂ C0 ₃ 粉末， 50 ~ 55。C反应 17 小时， 反应液减压蒸干， 用制备薄层硅胶层析板分离纯化， 得到安可 霉素异丙酯。

在本发明的一个具体的实施例中， 当式（ 4 )化合物为卤代异戊烷时， 该方法是将步骤 )获得的式（1 )所示的安可霉素溶解于 NaOH的水 溶液中， 滴加六甲基磷酰三胺， 然后加入 ¾代异戊烷， 搅拌反应完全后得 到安可霉素异戊酯； 优选的反应条件是在 28 ~ 30Ό反应 22小时。

在一个具体的实施例中， 该方法是将安可霉素溶解于 25% NaOH的 水溶液中， 緩慢滴加六甲基磷酰三胺， 然后加入溴代异戊烷， 28 ~ 30°C反 应 22小时， 反应液减压蒸干， 用制备薄层硅胶层析板分离纯化， 得到安 可霉素异戊酯。

本发明的第五方面提供一种药物组合物，其包 括权利要求 1所述的式 ( I )化合物、 其药学可接受的盐或溶剂合物， 及药学上可接受的辅料； 优选地， 所述的药物组合物还包括其他抗肿瘤药物；

优选地，所述的药物组合物的给药途径为口服 、静脉注射、直肠给药、 经皮给药， 进一步优选的给药途径为口服。

本发明的第六方面涉及所述的式（I )化合物、 其药学可接受的盐或 溶剂合物的用途，用于制备细胞增殖抑制剂的 用途，或用于制备抗肿瘤药 物或治疗癌症的药物的用途。其中所述的肿瘤 或癌症包括肝癌、神经胶质 瘤、 卵巢癌、 乳腺癌、 肺腺癌、 肺癌。

MTT实验检测结果表明， 本发明的安可霉素酯类衍生物对人肝癌细 胞 Bel-7402和 HepG2的 IC ₅ 。值（表 1 ) , 与安可霉素相比较， 己糖环上 5，位羧基形成酯键后抗肿瘤活性增加，此类� �生物的化学结构特点和药效 结果为核苷类似物的化学结构改造研究提供了 新思路。

本发明提供了以安可霉素甲酯为代表的安可霉 素酯类衍生物体内外 抗瘤药效学评价和抗瘤机制研究。 所述化合物化学名为 1-胞嘧啶基 -4-D- 丝 氨 酰 氨 -1,4- 去 二 氧 -β-D- 吡 喃 型 葡 萄 糖 羧 甲 酯 (methyl-l-cytosinyl-4-D-serylamino-l,4-dideoxy-P-D-glucopyra nosylcarbo xylate), 分子量 387.35, 分子式 C ₁₄ H ₂₁ N ₅ 0 ₈ , 质谱分析见 ( Fig.2 ) ， 化 学结构如式（3 )所示。 H?N

( 3 )

体外研究结果表明，安可霉素甲酯对体外培养 的多种肿瘤细胞有明显 的抑制作用； Western blotting 研究发现， 安可霉素甲酯通过抑制 EGFR-Raf-MEK-ERK信号通路，能抑制肿瘤细胞增殖� �安可霉素甲酯可 诱导肿瘤细胞凋亡， 并使肿瘤细胞产生周期阻滞。体内研究结果表 明， 安 可霉素甲酯可明显抑制昆明小鼠 H22肝癌和人肝癌 HepG2棵小鼠移植瘤 等模型的肿瘤生长。

本发明的优点和积极效果在于，以安可霉素甲 酯为代表的安可霉素酯 类衍生物具有较为特殊的化学结构， 由胞嘧啶、吡喃糖环和一个丝氨酸组 成， 在结构上比阿糖胞苷多一个氨基酸， 而且可以口服产生抗瘤作用； 与 含氟类抗肿瘤药物如卡培他滨相比较，安可霉 素甲酯不含氟，但是具有肯 定的抗肿瘤效果；卡培他滨主要用于对紫杉醇 和含蒽环类方案耐药的晚期 乳腺癌以及结、直肠癌的治疗， 以安可霉素甲酯为代表的安可霉素酯类衍 生物对肝癌和肺癌等有确切疗效；目前大多数 抗肿瘤药物给药方式为静脉 给药，以安可霉素甲酯为代表的安可霉素酯类 衍生物为癌症患者提供了一 种方便的口服化疗法，与卡培他滨共同成为抗 肿瘤药物中为数不多的口服 化疗药物。

这些衍生物的化学结构特点和药效结果（构效 关系）为核苷类抗肿瘤 药物的研究提供了新思路。 附图说明

Fig.l 安可霉素质傳图， 经 ESI-MS鉴定， 其分子离子峰（m/z )为 374.2[M+H] ⁺ , 以及 396.2[M+Na】+ , 确定其分子量为 373 , 分子式为 C ₁₃ H ₁₉ N ₅ 0 ₈ „

Fig.2 安可霉素甲酯质傳图， 经 ESI-MS鉴定， 其分子离子峰（m/z ) 为 388.3[M+H】+, 以及 410.3[M+Na】+, 确定其分子量为 387, 分子式为 C ₁₄ H ₂₁ N ₅ 0 ₈ 。

Fig.3 安可霉素甲酯对 EGFR和 MAPK信号通路影响的 Western blotting结果,

其中： 0、 50、 100、 200为安可霉素甲酯的剂量， 单位为 μιηοΐ/ΐ; 1为 EGFR蛋白表达水平； 2为 p-EGFR蛋白表达水平；

3为 C-Raf蛋白表达水平； 4为 p-C-Raf蛋白表达水平；

5为 MEK1/2蛋白表达水平； 6为 P- MEK1/2蛋白表达水平；

7为 ERK1/2蛋白表达水平； 8为 P- ERK1/2蛋白表达水平；

9为 PARP蛋白表达水平； 10为 Caspase-8蛋白表达水平；

11为 actin蛋白表达水平。

Fig.4 安可霉素甲酯在不同时间点对人肝癌 HepG2细胞 Caspase-3〃 活性的影响， X轴代表作用时间； Y轴代表 Caspase-3〃活性；

其中： IIIII对照组 control; 0μιηο1/1; ^100μιηο1/1; 00μιηο1/1。

** Ρ <0.01 vs. control 6h; * Ρ <0.05 vs. control 6h;

** P <0.01 vs. control 12h; P <0.01 vs. control 24h。

Fig.5 安可霉素甲酯不同浓度作用人肝癌 HepG2细胞 24h的细胞周 期分布图，其中： A、 B、 C、 D分别为 0、 50μιηο1/1、 100μιηο1/1、 200μιηο1/1。

Fig.6 安可霉素甲酯对人肝癌 HepG2细胞周期的影响， X轴代表细 胞周期； Y轴代表各细胞周期所占的百分比；

其中: IIIII对照组 control; 50μιηο1/1; ^100μιηο1/1; 200μιηο1/1。

** P<0.01 vs. control G0/G1 ; * P<0.05 vs. control G0/G1;

Ρ<0.01 vs. control G2/M; "P<0.01 vs. control S;

♦P<0.05 vs. control S。

Fig.7 安可霉素甲酯不同浓度作用人肝癌 HepG2细胞 48h细胞凋亡 率图，

其中： A、 B、 C、 D分别为 0、 50μιηο1/1、 100μιηο1/1、 200μιηο1/1 Fig.8 安可霉素甲酯对人肝癌 HepG2细胞凋亡率的影响， X轴代表 各浓度； Y轴代表细胞凋亡率； ** vs. control。 Fig.9 安可霉素甲酯对 HepG2棵小鼠移植瘤生长的抑制作用， 其中： A图为安可霉素甲酯对体重的影响；

X轴表示接种天数； Y轴表示体重；

B图为安可霉素甲酯对肿瘤生长的影响；

X轴表示接种天数； Y轴表示肿瘤体积；

其中. control; ^^250mg/kg; ~*~200mg/kg;

-«-150mg/kg; →~卡培他滨 200mg/kg。

Fig.10 安可霉素甲酯对 HepG2 荷瘤棵小鼠骨髓造血功能的影响 ( x400 ) , 其中：

A图为生理盐水对照组；

B图为安可霉素甲酯 250mg/kg。

Fig.ll 安可霉素甲酯对 HepG2棵小鼠移植瘤生长的抑制作用，

A图为安可霉素甲酯对体重的影响；

X轴表示接种天数； Y轴表示体重；

B图为安可霉素甲酯对肿瘤生长的影响；

X轴表示接种天数； Y轴表示肿瘤体积；

其中： "♦"control; ~ .Ommol/kg; ~*~1.5mmol /kg;

~"~2.0mmol /kg; →~卡培他滨 l.Ommol /kg。

Fig.12 安可霉素甲酯对 HepG2 荷瘤棵小鼠骨髓造血功能的影响 ( x400 ) , 其中：

A图为生理盐水对照组；

B图为安可霉素甲酯 2.0mmol/kg。

Fig.13 安可霉素甲酯对 A549棵小鼠移植瘤生长的抑制作用，

A图为安可霉素甲酯对体重的影响；

X轴表示接种天数； Y轴表示体重；

B图为安可霉素甲酯对肿瘤生长的影响；

X轴表示接种天数； Y轴表示肿瘤体积；

其中： "♦"control; ^^1. Ommol/kg; ~*~1.5mmol /kg;

-«-2.0mmol /kg; →~卡培他滨 1.5mmol /kg。

Fig.14 安可霉素甲酯对 A549 荷瘤棵小鼠骨髓造血功能的影响 ( X400 ) , 其中：

Α图为生理盐水对照组；

B图为安可霉素甲酯 2.0mmol/kg。 具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详 细描述，但是本领域 技术人员将会理解， 下列实施例仅用于说明本发明， 而不应视为限定本 发明的范围。 实施例中未注明具体条件者， 按照常规条件或制造商建议 的条件进行。 所用试剂或仪器未注明生产厂商者， 均为可以通过市购获 得的常规产品。

<实施例 1 >链霉菌菌株 C-9095的筛逸

体外培养人口腔鳞癌 KB细胞至对数生长期， 胰酶消化后细胞计数， 以 1 X 10 ⁵ 个 /孔的密度接种于 24孔细胞培养板中， 24 h细胞贴壁后，对照 组加入无菌株的葡萄糖-淀粉-酵母粉-黄豆饼粉 发酵培养基 500μ1, 加药组 分别加入不同的待筛菌株发酵液 500μ1， 作用时间均为 24h。 然后取对照 组和加药组的细胞，去除培养基， PBS溶液冲洗 3次，加入无血清的 Hank's 液， 再加入 7.4 x l0 ⁴ Bq标记的 [ ³ H-甲基】胸腺嘧啶脱氧核苷和 [ ³ H】尿嘧啶 核苷， 继续培养 lh。 将细胞收集到玻璃纤维滤纸上， 用水冷（4°C )的生 理盐水冲洗 3次， 滤纸上滴加 0.2mol/l的 NaOH溶液 0.1ml, 然后将滤纸 置液体闪烁瓶中，加入闪烁液，在液体闪烁仪 上计数细胞^的同位素活 性（每分钟放射性计数， cpm )。 结果表明从云南省土样中分离得到的一 株链霉菌， 镊^^号 Streptomyces albulus C-9095, 从该菌株的发酵液中 能提取分离得到具有抗肿瘤活性的物质，其可 显著抑制肿瘤细胞的氚标胸 苷和尿苷转运。

将该菌株于 2011年 5月 9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会 普通微生物中心（简称 CGMCC, 地址： 北京市朝阳区北辰西路 1号院 3 号，中国科学院微生物研究所，邮编 100101 )，保藏号为 CGMCC No. 4831 , 分类命名为链霉菌 Streptomyces albulus ~) , 菌株名称为 C-9095。

〈实施例 2 >安可霉素 （ 1-胞嘧啶基 -4-D-丝氨酰氨 -1,4-去二氧 -β-D- 吡喃型葡萄糖羧酸） 的制备 将甘油管保藏的链霉菌菌株 (保藏编号： CGMCC No. 4831) 接种到斜面（葡萄糖 1%,天门冬素 0.1%,磷酸氢二鉀 0.05%,琼脂 1.5%, PH 7.2-7.4,灭菌， 28°C培养 7-10天）培养基上， 28°C恒温培养箱培养 7-10 天。 将斜面培养物挖块接种于 100ml—级种子培养基中（葡萄糖 10 _g , 可 溶性淀粉 15g， 牛肉膏 5g， 鱼蛋白胨 5g, 黄豆饼粉 10g， 氯化钠 3g， 调 PH至 7.0, 双蒸水配成 1000ml, 高压灭菌） ， 28°C在转速为 180转 /min 的旋转摇床培养 48小时， 取培养好的一级种子， 按 10%的接种量转种于 100ml二级种子培养基中（同一级种子培养基)， 28。C旋转摇床培养 24 小 时。 取培养好的二级种子， 按 10%的接种量转种于 1000ml发酵培养基中 (葡萄糖 10g, 可溶性淀粉 15g, 酵母粉 10g, 黄豆饼粉 10g, 氯化钠 3g, 调 PH至 7.0, 双蒸水配成 1000ml, 高压灭菌） ， 28°C在 90往复 /min的 往返摇床培养 96小时后收获发酵液。

发酵液经助滤粉过滤， 滤液经活性炭柱 (20%， g/ml ) 吸附，无盐水冲 洗， 用丙酮： 水 =1: 1 (体积比） 的混合溶液洗脱， 收集对大肠杆菌显示 活性的部分， 减压去除丙酮， 将水溶液调 pH至 3.0, 通过强酸性阳离子 树脂柱（铵型)， 用 lmol/L氨水洗脱， 活性部份除氨， 冷冻干燥，得淡黄 色粉末。 将该粉末用制备薄层硅胶层析板分离純化， 展开剂为 70%甲醇 水溶液， 取 Rf=0.60的条带， 得到二肽核苷类化合物。 该二肽核苷类化合 物再经过酸化（浓 HC1， 37。C水解 24h )得到安可霉素。质谱分析见（ Fig.l ), ESI-MS m/z 374.2[M+H] ⁺ , 396.2[M+Na] ⁺ (分子式为 C ₁₃ H ₁₉ N ₅ 0 ₈ , 分子 量为 373 ) 。

〈实施例 3 >安可霉素甲酯 （ 1-胞嘧啶基 -4-D-丝氨酰氨 -1,4-去二氧 -β-D-吡喃型葡萄糖羧甲酯） 的制备

取甲醇 12ml于反应瓶中，水盐浴中緩慢滴加二氯亚砜� � SOCl ₂ )3ml, 控制温度在 0。C以下， 滴加完毕后维持 0。C左右继续反应 lh。 称取 500m _g 安可霉素 （实施例 1制得） , 使溶于甲醇-二氯亚砜溶液中， 室温搅摔反 应， TLC检测跟踪反应， 溶剂甲醇： 乙酸乙酯： 氨水（5: 3: 2 ) , 共计反 应 48h, 减压蒸干得黄色油状液。 将黄色油状液 2ml用甲醇溶解， 再加入 20ml 乙醚， 有白色固体析出， 减压抽滤得固体物。 将固体物用制备薄层 硅胶层析板分离，展开剂为甲醇：氨水 =5: 1,取11尸0.50的条带， 以乙醇： 水 = 3: 2的洗脱液洗脱， 洗脱液减压蒸干， 得安可霉素甲酯 397m _g ， 质谱 分析见 （Fig.2 ) , ESI-MS m/z 388.3 [M+H] ⁺ , 410.3[M+Na] ⁺ (分子式 C ₁₄ H ₂₁ N ₅ 0 ₈ , 分子量为 387 ) 。

〈实施例 4 >安可霉素异丙酯（ 1-胞嘧啶基 -4-D-丝氨酰氨 -1，4-去二氧 -β-D-吡喃型葡萄糖羧酸异丙酯） 的制备

向反应瓶中投入安可霉素 （实施例 1 制得） 200mg 和二甲基亚砜 ( DMSO ) 2ml, 温热状态下搅拌至溶解， 緩' I"曼滴加 3ml丙酮（ aceton ) , 无明显浑浊。 然后分别加入 lml碘代异丙烷和 100mg K ₂ CO ₃ 粉末， 反应 液呈现少浑浊， 保持内温（50 ~ 55 ) °C , 搅摔反应过夜， 共计反应 17h。 反应液减压蒸干得固体物，将固体物用制备薄 层硅胶层析板分离，展开剂 为甲醇： 乙酸乙酯： 氨水 = 2: 0.4: 0.1 , 取 Rf=0.35的条带， 以甲醇洗脱， 洗脱液减压蒸干，得到安可霉素异丙酯 28mg。经 ESI-MS m/z 416 [M+H] ⁺ (分子式 C ₁₆ H ₂₅ N ₅ 0 ₈ ， 分子量为 415 ) 。

〈实施例 5 >安可霉素异戊酯（ 1-胞嘧啶基 -4-D-丝氨酰氨 -1，4-去二氧 -β-D-吡喃型葡萄糖羧酸异戊酯）的制备

向反应瓶中投入安可霉素 （实施例 1制得） 400mg和 25% NaOH的 水溶液 5ml, 室温搅拌至安可霉素完全溶解，緩慢滴加 4ml六甲基磷酰三 胺（ HMPA ) , 半小时后加入 0.5ml溴代异戊烷， 保持内温（ 28 ~ 30 ) °C , 搅拌反应过夜， 共计反应 22h。 反应液减压蒸干得固体物， 将固体物用制 备薄层硅胶层析板分离， 展开剂为甲醇： 乙酸乙酯： 氨水 = 2: 0.2: 0.2, 取 的条带， 以甲醇洗脱， 洗脱液减压蒸干， 得到安可霉素异戊酯 65mg„经 ESI-MS m/z 444 [M+H] ⁺ (分子式 C ₁₈ H ₂₉ N ₅ 0 ₈ ，分子量为 443 )。

〈实施例 6 >安可霉素甲酯的体外细胞毒性试验

采用 MTT法进行体外细胞毒性实验， 取对数生长期人肝癌 Bel-7402 细胞、 人肝癌 HepG2细胞、 人神经胶质瘤 U87细胞、 人卵巢癌 OVCR3 细胞、 人乳腺 MCF-7细胞、 人肺腺癌 A549细胞（所有上述细胞由中国 医学科学院医药生物技术研究所肿瘤室保存） ， 按每孔（3-5 ) xlO ⁴ 接种 于 96孔板中， 培养箱中孵育 24h后加入药物实施例 2制备的安可霉素甲 酯， 设空白对照组用于调零， 安可霉素甲酯浓度组分别为 10μιηο1/1, 25μιηο1/1， 50μιηο1/1, 100μιηο1/1, 200μιηο1/1, 400μιηο1/1, 每组重复 3孔， 培养箱中孵育 48h。 各孔加入 MTT ( 5mg/ml ) 20μ1, 继续孵育 4h， 弃上 清， 加入 150μ1 ϋΜ8Ο, 震荡 15min待 Formazan结晶（在琥珀酸脱氢酶 和细胞色素 C的作用下， MTT的四唑环开裂， 生成蓝色结晶）充分溶解 后， 使用酶标仪在 570nm处测定吸光值（ A ) 。 每个检测点取 3个平行 孔的平均值， 实验重复 3次， 计算 IC ₅ 。值。 细胞存活率％= (加药组细胞 A值 -本底 A值） / (对照组细胞 A值-本底 A值） x%。

结果表明：安可霉素甲酯对 Bel-7402、HepG2、U87、OVCR3、MCF-7、 A549细胞的 IC ₅ o值 μιηοΐ/ΐ)分别为 22.26、 89.67、 146.23、 239.98、 7.95 和> 400(表1)。

〈实施例 7 >安可霉素的体外细胞毒性试验

采用 ΜΤΤ法进行体外细胞毒性实验，取对数生长期 Bel-7402、HepG2 细胞，按每孔（3-5 ) xlO ⁴ /孔接种于 96孔板中，培养箱中孵育 24h后加药， 设空白对照组用于调零， 药物 （实施例 1 制备的安可霉素） 浓度组 10μιηο1/1, 20μιηο1/1, 40μιηο1/1, 80μιηο1/1, 160μιηο1/1, 320μιηο1/1, 余操 作方法同实施例 5。

结果表明： 安可霉素对人肝癌 Bel-7402 和 HepG2 细胞的 IC ₅ 。值 (μιηοΐ/ΐ)分别为 36.54和 112.82(表 1)。

〈实施例 8 >安可霉素异丙酯的体外细胞毒性试验

采用 ΜΤΤ法进行体外细胞毒性实验，取对数生长期 Bel-7402、HepG2 细胞，按每孔（3-5 ) xlO ⁴ /孔接种于 96孔板中，培养箱中孵育 24h后加药， 设空白对照组用于调零， 药物（实施例 3制备的安可霉素异丙酯）浓度组 5μιηο1/1, 10μιηο1/1, 20μιηο1/1, 40μιηο1/1, 80μιηο1/1, 160μιηο1/1, 余操作 方法同实施例 5。

结果表明： 安可霉素异丙酯对人肝癌 Bel-7402和 HepG2细胞的 IC ₅₀ 值 (μιηοΐ/ΐ)分别为 16.73和 62.51(表 1)。

〈实施例 9 >安可霉素异戊酯的体外细胞毒性试验

采用 ΜΤΤ法进行体外细胞毒性实验，取对数生长期 Bel-7402、HepG2 细胞， 按每孔（3-5 ) xlO ⁴ 接种于 96孔板中， 培养箱中孵育 24h后加药， 设空白对照组用于调零， 药物（实施例 4制备的安可霉素异戊酯）浓度组 5μιηο1/1, 10μιηο1/1, 20μιηο1/1, 40μιηο1/1, 80μιηο1/1, 160μιηο1/1, 余操作 方法同实施例 5。

结果表明： 安可霉素异戊酯对人肝癌 Bel-7402和 HepG2细胞的 IC 值 (μιηοΐ/ΐ)分别为 18.48和 59.43(表 1)

表 1 安可霉素衍生物对人肝癌细胞的 IC ₅₀ 值

IC ₅₀ mol/l)

化合物

Bel-7402 HepG2 U87 OVCR3 MCF-7 A549 安可霉素 36.54 112.82

安可霉素曱酯 22.26 89.67 146.23 239.98 7.95 > 400 安可霉素异丙酯 16.73 62.51

安可霉素异戊酯 18.48 59.43

由表 1 可见： 安可霉素酯类衍生物对相关肿瘤细胞的增殖有 抑制作 用， 与安可霉素相比较， 酯类衍生物的 IC ₅ 。下降， 细胞毒性增强。

<实施例 10 >安可霉素甲酯对 MAPK分子信号通路及凋亡信号通路 相关分子表达的影响

将人肝癌 HepG2 细胞用含 10% 胎牛血清的 DMEM培养液， 在 37。C、 5% C0 ₂ 培养箱中培养。 取对数生长期的 HepG2细胞， 按 10 ⁴ 细 胞 /cm ² 密度接种于培养瓶中， 24h细胞贴壁后加入实施例 2制备的安可霉 素甲酯 50μιηο1/1、 100μιηο1/1 、 200μιηο1/1处理 24h， 收集正常的未加药的 对照组细胞以及各浓度安可霉素甲酯处理组细 胞， 将各组细胞用预冷的 PBS緩冲液洗 3遍， 加入（ 150-200 ) μΐ新鲜配制的细胞裂解液（ 50 mM Tris-HCl, H 7.5； 1% NP-40; 150 mM NaCl; 1 mM Na ₃ V0 ₄ ; 1 mM NaF,临用时加入 3种蛋白酶抑制剂（ lmg/ml aprotinin; lmg/ml leupeptin; lmg/ml PMSF )， 使细胞与裂解液充分混合， 4°C 充分裂解 30min后， 于 4。C 16000rpm 离心 15 min, 收集上清液于新的微量 EP 管中。 用 BCATM Protein Assay Kit 试剂盒（美国 Pierce公司）测上清液的蛋白 浓度并定量，上样前将蛋白质煮沸 5min，每孔 30μ _§ 上样，进行 SDS-PAGE 电泳， 以半干转法转移至 PVDF膜上。 常规方法孵育一抗和二抗， 以预 染分子量标准确定目的蛋白的条带位置， ECL plus超敏免疫印迹法检测 蛋白表达，化学发光成像系统 Chemilmager 5500捕获图像， 以 β-actin为 内参。

结果表明，安可霉素甲酯能抑制表皮生长因子 家族 EGFR和 p-EGFR 蛋白的表达， 进一步研究发现， 其通过抑制 C-Raf-MEKl/2-ERKl/2信号 通路， 抑制肿瘤细胞的增殖。 同时安可霉素甲酯还能抑制凋亡相关分子 PARP和 Caspase-8的表达， 从而 i秀导细胞凋亡（ Fig.3 ) 。

<实施例 11 >安可霉素甲酯对凋亡相关信号分子 Caspase 3/7活性的 影响

按 Caspase-Glo® 3〃活性测试试剂盒（美国 Promega公司）步骤操 作： 开始检测之前， 制备好 Caspase-Glo®3/7 试剂， 让试剂平衡到室温， 混合均匀。 HepG2 细胞经不同浓度的实施例 2 制备的安可霉素甲酯 50μιηο1/1、 100μιηο1/1、 200μιηο1/1处理 2h 、 6h、 12h、 24h后， 将培养 HepG2细胞的 96孔板从孵育箱中取出， 平衡至室温。 在含有 ΙΟΟμΙ 空 白对照、阴性对照细胞和安可霉素甲酯处理过 的细胞的全白 96 孔板各孔 中各加入 lOO l Caspase-Glo®试剂， 混匀， 室温孵育 2h, 然后上荧光酶 标仪检测。

结果表明， HepG2 细胞在加入安可霉素甲酯后， 在 6h、 12h、 24h 等不同时间点的 Caspase 3〃活性发生明显改变， 启动凋亡通路， 导致细 胞凋亡（Fig.4 ) 。

<实施例 12 >安可霉素甲酯对细胞周期的影响

HepG2 细胞经实施例 2制备的安可霉素甲酯 50μιηο1/1、 100μιηο1/1、 200μιηο1/1处理 24h后， 收集正常的未加药的对照组细胞和各加药浓度 组 细胞， 加入水冷的 PBS緩冲液， 将细胞轻轻吹打成单个细胞， 离心， PBS 洗 2遍， 用约 500 μΐ 的 PBS 重悬细胞， 一边振荡一边加入 5 ml预冷的 70% 乙醇溶液， 4°C 固定过夜。 染色前细胞用 PBS 洗 2遍， 沉淀重悬于 PI ( 丙啶）染液（ 50 g/ml PI +200 g/ml RNase A ) 中， 37°C避光 染色 30 min。 细胞经 200目尼龙网过滤后，用流式细胞仪测定 DNA含量 并分析细胞周期变化。

结果显示， 与对照组比较， 安可霉素甲酯作用 HepG2细胞 24h后， G2/M期和 S期的细胞均有明显增加（见表 2 ) ， 并且随着浓度的增加， 阻 滞作用更加显著， 表明安可霉素甲酯可使 HepG2 细胞产生 G2/M期和 S期 P且滞 ( Fig.5, Fig.6 ) 。

表 2 安可霉素甲酯对 HepG2细胞周期的影响 （ ± 24h ) 安可霉素甲酯 G0/G1 G2/M S

(μπιοΐ/l) (%) (%) (%) 对照组 65.20士 1.76 8.65士 1.58 24.56士 0.51

50 44.39士 2.73* 17.27 ± 3.35** 37.24士 5.42·

100 31.75 ± 3.82** 21.97 ± 3.14** 45.44 ± 3.10*令

200 28.26士 4.50** 22.09士 2.27** 50.13 ± 4.66*令 注： ** ΡκΟ. ΟΙ vs. control G0/G1; * P<0.05 vs. control G0/G1;

P<0.01 vs. control G2/M; ，,P<0.01 vs. control S; P<0.05 vs. control S 。

〈实施例 13 > Annexin V-FITC/PI双染结合流式细胞仪检测细胞的 凋亡率：

HepG2细胞经实施例 2制备的安可霉素甲酯 50μιηο1/1、 100μιηο1/1、 200μιηο1/1处理 48h后，胰酶消化收集正常的未加药的对照组和 各加药浓度 组的细胞， 将待测细胞的浓度调整为 5xl0 ⁵ ~ lxl0 ⁶ cells/ml; 取 lml细胞悬 液， lOOOrpm, 4°C离心 lOmin, 弃上清； 加入 lml冷 PBS, 轻轻振荡使细 胞悬浮； lOOOrpm, 4°C 离心 lOmin, 弃上清， 重复此步驟两次； 将细胞 重悬于 500μ1 binding buffer, 加入 ΙΟμΙ Annexin V-FITC/PI, 轻轻摇匀， 室温反应 lh; 加入 5μ1 PI 轻轻摇匀， 室温反应 15min; 细胞经 200目尼龙 网过滤后， 在流式细胞检测仪上进行检测， 采集荧光强度并用自带软件 FACScan 进行数据处理。 流式细胞仪检测结果的散点图 （参见 Fi _g .7 ) 中 左上象限为坏死细胞（FITC-/PI+ ) ， 单红色荧光； 左下象限为活细胞 ( FITC-/PI- ) ， 无荧光； 右上象限为晚期凋亡细胞（FITC+/PI+ ) ， 为 绿色和红色双荧光； 右下象限为早期凋亡细胞（FITC+/PI- ) , 为单绿色 荧光。

结果表明， 不同浓度安可霉素甲酯作用 HepG2 细胞 48h后， 细胞凋 亡率随浓度增加而升高。 50μιηο1/1、 100μιηο1/1、 200μιηο1/1安可霉素甲酯 作用于 HepG2 细胞凋亡率分别为 17.25% ±1·05%、 20·67%±2·96%、 32·84%±4·71%, 显著高于对照组 1·36%±0·96% (参见 Fig.7， Fig.8 ) 。

〈实施例 14 >安可霉素甲酯抑制小鼠肝癌 H22肿瘤生长：

实验采用雌性昆明小鼠， 体重（18 ~ 22 ) _g (购自军事医学科学院）。 取小鼠腹腔悬液传代的肝癌 H22细胞， 每只小鼠腋窝皮下接种 200万个 细胞（0.2ml ) 。 实验按照体重随机分为四组： 濯胃生理盐水对照组， 安 可霉素甲酯组 200 mg/kg、 150 mg/kg, 100 mg/kg,每组 10只。给药方案： 从腋窝接种 24h后开始濯胃给药，共给药 8天，对照组每天濯胃等体积的 生理盐水， 停药一天， 然后处死小鼠称体重， 剥离肿瘤称瘤重。 肿瘤抑制 率= (对照组平均瘤重一实验组平均瘤重） /对照组平均瘤重 xl00%。

实验结果表明： 安可霉素甲酯可以抑制小鼠肝癌 H22肿瘤的生长， 口服安可霉素甲酯 200 mg/kg, 150 mg/kg, 100 mg/kg对肿瘤生长的抑制 率分别为 71.5%、 48.9%, 30.6% (见表 3 ) 。

表 3 安可霉素甲酯对昆明小鼠肝癌 H22肿瘤生长的抑制作用 （ ±

剂量 动物只数 体重改变 平均瘤重 抑制率 组别

(mg/kg) 开始 结束 (g) (g) (%) 对照 0 10 10 10.10±1.75 1.86±0.38

200 10 10 4.80±0.87 0.53±0.18 71.5** 安可霉素曱酯 150 10 10 9.49±1.82 0.95±0.30 48.9**

100 10 10 10.70±2.13 1.29±0.28 30.6*

>£: ** P <0.01 vs. control; * P <0.05 vs. control

<实施例 15 >安可霉素甲酯对人肝癌 HepG2棵小鼠移植瘤生长抑制 作用

15.1实验动物采用 BALB/c棵鼠， 雌性， （4 ~ 6 )周龄， 体重（18 ~ 22 ) g (购自北京维通利华有限公司） 。 将 HepG2细胞置于含 10%胎牛 血清的 DMEM培养液中培养。 当细胞生长至对数生长期收集细胞， 细胞 浓度 2.5xl0 ⁷ /ml， 每只棵鼠左侧皮下接种 0.2ml， 共接种三只。 当棵小鼠 肿瘤生长至 lxlxlcm ³ 后， 处死小鼠， 取出瘤组织， 用眼科剪， 剪成 2x2x2mm ³ 的组织块， 应用套管针将肿瘤块接种于棵小鼠左侧腋窝皮 下。

HepG2瘤块接种一周后用游标卡尺测量肿瘤长� ��（ L )和肿瘤短颈（ W )， 按照肿瘤体积计算公式 TV= ( LxW ² ) II, 计算肿瘤体积， 根据肿瘤体积 大小将棵小鼠随机分成五组：对照组，安可霉 素甲酯（分子量 387 )组 250 mg/kg, 200 mg/kg, 150 mg/kg, 卡培他滨（分子量 359 )组 200 mg/kg， 每组 6只。 同时开始口服给药， 连续给药 5天， 停药 2天， 共三个疗程， 最后一次给药后， 停药 7天， 处死小鼠， 称体重， 剥离肿瘤称瘤重， 每 4 天测量小鼠体重和肿瘤体积， 期间观察小鼠的营养状况和活动情况。

15.2 取出对照组和安可霉素甲酯各剂量组、 卡培他滨组实验动物的 股骨以及心、 肺、 肝、 脾、 肾、 胃、 小肠标本， 放置于 10%甲醛固定液中 固定， 取出固定股骨组织， 依次 ;¾U 75%、 80%、 85%、 90% 酒精中各 2 h, 95% 酒精过夜， 无水乙醇脱水 2 h, 二甲苯透明， 浸蜡， 石蜡包埋， 在 Leica RM2315切片机上制备 (4 ~ 5) μιη石蜡切片。 取水化切片， 苏木素 染色 5min, 蒸馏水冲洗， 盐酸酒精分色， 自来水返蓝； 伊红染色 2min , 蒸馏水冲洗， 常规脱水透明； 中性树胶封片。 光镜下观察股骨骨髓组织以 及各脏器的病理学改变。

实验结果表明： 各组棵小鼠体重和肿瘤体积生长情况如 Fi _g .9中 A、 B所示， 安可霉素甲酯灌胃给药可以抑制 HepG2棵小鼠移植瘤生长。 安 可霉素甲酯 250 mg/kg、 200 mg/kg, 150 mg/kg以及卡培他滨 200 mg/kg, 对肿瘤生长的抑制率分别为 62.5% ( P <0.01 )、 46.3% ( P <0.01 )、 33.2% ( P <6».05 )和 58.3% ( Ρ <0.01 ) 。 对照组和安可霉素甲酯 250 mg/kg组 动物股骨病理切片的结果如 Fig.10中 A、 B, 股骨髓的细胞密度以及粒细 胞系、红细胞系和巨核细胞系均无明显改变， 说明此治疗剂量下不影响骨 髓的造血功能， 其余各脏器组织均未见病理改变。 同样， 卡培他滨组股骨 骨髓组织以及各脏器也均未见病理学改变。

<实施例 16 >安可霉素甲酯对人肝癌 HepG2棵小鼠移植瘤生长抑制 作用

16.1实验动物采用 BALB/c棵鼠， 雌性， （4 ~ 6 )周龄， 体重（18 ~ 22 ) g (购自北京维通利华有限公司） 。 余操作方法同实施例 13中 1.1。 根据肿瘤体积大小将棵小鼠随机分成五组： 对照组， 安可霉素甲酯（分子 量 387 ) 2.0mmol/kg、 1.5 mmol/kg, 1.0mmol/kg, 卡培他滨（分子量 359 ) 1.0mmol/kg, 每组 6只。 同时开始口服给药， 连续给药 5天， 停药 2天， 共三个疗程， 最后一次给药后， 停药 7天， 处死小鼠， 称体重， 剥离肿瘤 称瘤重，每 4天测量小鼠体重和肿瘤体积，期间观察小鼠� �营养状况和活 动情况。

16.2 取出对照组和安可霉素甲酯各剂量组、 卡培他滨组实验动物的 股骨以及心、 肺、 肝、 脾、 肾、 胃、 小肠标本， 其余操作方法同实施例 15中 15.2。

实验结果表明： 各组棵小鼠体重和肿瘤体积生长情况如 Fig.ll中 A、 B所示， 安可霉素甲酯灌胃给药可以抑制 HepG2棵小鼠移植瘤生长。 安 可霉素甲酯 2.0mmol/kg、 1.5mmol/kg、 1.0mmol/kg 以及卡培他滨 1.0mmol/kg, 对肿瘤生长的抑制率分别为 82.9% (P <0.01) 、 77.8% (P <0.01 ) 、 70.1% (P <0.01 )和 76.3% (P <0.01) 。 对照组和安可霉素 甲酯 2.0 mmol/kg组动物股骨病理切片的结果如 Fi _g .12中 A、 B， 股骨髓 的细胞密度以及粒细胞系、红细胞系和巨核细 胞系均无明显改变，说明此 治疗剂量下不影响骨髓的造血功能，其余各脏 器组织均未见病理改变。 同 样， 卡培他滨组股骨骨髓组织以及各脏器均未见病 理学改变。

<实施例 17 >安可霉素甲酯对人肺癌 A549棵小鼠移植瘤生长抑制作 用

17.1实验动物采用 BALB/c棵鼠， 雌性， （4~6)周龄， 体重（18~ 22 ) g (购自北京维通利华有限公司） 。 将 A549细胞置于含 10%胎牛血 清的 1640培养液中培养，余操作方法同实施例 13中 1.1。 A549瘤块接种 一周后用游标卡尺测量肿瘤长颈 （L)和肿瘤短颈 （W) , 按照肿瘤体积 计算公式 TV= (LxW ² ) II, 计算肿瘤体积， 根据肿瘤体积大小将棵小鼠 随机分成五组： 对照组， 安可霉素甲酯 2.0mmol/kg、 1.5mmol/kg、 1.0mmol/kg, 卡培他滨 1.5mmol/kg, 每组 6只。 同时开始口月良给药， 连 续给药 5天， 停药 2天， 共三个疗程， 最后一次给药后， 停药 7天， 处死 小鼠， 称体重， 剥离肿瘤称瘤重， 每 4天测量小鼠体重和肿瘤体积， 期间 观察小鼠的营养状况和活动情况。

17.2 取出对照组和安可霉素甲酯各剂量组、 卡培他滨组实验动物的 股骨以及心、 肺、 肝、 脾、 肾、 胃、 小肠标本， 其余操作方法同实施例 15中 15.2。

实验结果表明： 各组棵小鼠体重和肿瘤体积生长情况如 Fi _g .13中 A、 B所示， 安可霉素甲酯濯胃给药可以抑制 A549棵小鼠移植瘤生长。 安可 霉素甲酯 2.0 mmol/kg、 1.5mmol/kg、 1.0mmol/kg 以及卡培他滨 1.5mmol/kg, 对肿瘤生长的抑制率分别为 79.1% (P <0.01) 、 73.0% (P <0.01 ) 、 61.9% (P <0.05)和 85.1% (P <0.01) 。 对照组和安可霉素 甲酯 2.0 mmol/kg组动物股骨病理切片的结果如 Fi _g .14中 A、 B， 股骨髓 的细胞密度以及粒细胞系、红细胞系和巨核细 胞系均无明显改变，说明此 治疗剂量下不影响骨髓的造血功能，其余各脏 器组织均未见病理改变。 同 样， 卡培他滨组股骨骨髓组织以及各脏器也均未见 病理学改变。