La présente invention concerne une combinaison de séquences d'ADN permettant de développer des animaux modèles comprenant d'une part une modification de son génome afin d'introduire un nouveau gène pour être exprimé dans les animaux modèles, en particulier un gène d'origine humaine et d'autre part une expression contrôlée d'un RNA interférant avec ledit nouveau gène.

La combinaison de séquences ADN selon l'invention permet de réaliser sur le même modèle animal plusieurs opérations nécessitant autrefois le développement et l'usage de plusieurs modèles distincts. Il permet par exemple, d'étudier avec le même modèle le phénotype obtenu par l'expression d'un transgène donné, puis d'observer le phénotype obtenu en exprimant le RNA interférant de manière contrôlée spatialement et/ou temporellement, c'est-à-dire en inhibant localement la traduction du RNAm du transgène exprimé.

Différentes stratégies à base de recombinases et de vecteurs permettant d'insérer puis de supprimer des éléments de gènes dans les génomes de différents organismes sont décrits dans l'état de la technique, notamment dans EP 1 462 525, US 2003/165497, US 2004/241851, WO 02/40685, WO 2004/056964, WO 2004/044151, WO 2005/007877, Kasin & al (Nucleic Acid Research. 2004, vol 32, n° 7, pp E66.1-E66.8), Coumoul & al (Nucleic Acid Research 2004, vol 32, n° 10, pp E85.1-E85.7), Conrad & al. (Biotechnologies, vol 34, n° 6, juin 2003, 1136-1140), Kϋhn & al. (Methods in Molecular Biology 2003, vol 209, 159-185), Soukharev & al. (Nucleic Acid Research 1999, vol 27, n° 18, ppE21.1-E21.8), McMinn & al. (Mammalian Génome 2004, vol 15, n° 9, 677-685), Casanova & al (Genesis 2002, vol 32, n° 2, 15/8-160) et Ren & al (Genesis 2002, vol 32, n° 2, 105-108). Cependant, aucun de ces documents ne vient apporter de solution au problème technique associé à la présente invention, ni décrire la solution de la présente invention.

La combinaison de séquences d'ADN selon l'invention comprend une première séquence (Sl) et une deuxième séquence (S2) destinées à être insérés dans l'ADN génomique d'une cellule eucaryote d'un organisme hôte.

Par séquence d'ADN on entend selon l'invention une molécule d'ADN constituée par une séquence d'acides désoxyribonucléiques liés de manière covalente.

Pour la combinaison selon l'invention, les première et deuxième séquences Sl et S2 sont supportées soit sur deux vecteurs, soit sur un même vecteur, soit encore dans le génome d'au moins une cellule eucaryote d'un organisme hôte.

Par cellule eucaryote, on entend plus particulièrement selon l'invention toutes cellules d'origine animale, à l'exception de l'homme, en particulier les cellules de mammifères, préférentiellement de mammifères rongeurs, plus préférentiellement de rat ou de souris.

La première séquence Sl de la combinaison selon l'invention comprend, dans le sens 5 '-3', les éléments suivants : - un premier site SRI de reconnaissance d'une première recombinase Rl

- un acide nucléique hétérologue, et

- un deuxième site SRI de reconnaissance d'une première recombinase Rl.

La deuxième séquence S2 de la combinaison selon l'invention comprend, dans le sens 5 '-3', les éléments suivants : - une séquence d'acide nucléique comprenant une séquence de régulation promotrice fonctionnelle dans la cellule eucaryote dans le génome de laquelle elle sera intégrée,

- un premier site SR2 de reconnaissance d'une recombinase R2,

- une séquence d'acide nucléique comprenant une séquence d'arrêt de la transcription,

- un second site SR2 de reconnaissance de la recombinase R2, et - une séquence d'acide nucléique codant pour un RNA interférant avec le RNAm produit de l'expression de l'acide nucléique hétérologue de la séquence Sl, lié de manière fonctionnelle avec une séquence d'arrêt de la transcription.

De manière préférentielle, la séquence d'acide nucléique comprenant une séquence de régulation promotrice fonctionnelle dans la cellule eucaryote dans le génome de laquelle elle sera intégrée est choisie parmi les promoteurs forts, plus préférentiellement des promoteurs PoI III.

De manière préférentielle, le RNA interférant selon l'invention est un RNA antisens, un miRNAi, un shRNAi ou un siRNAi.

De manière préférentielle, l'acide nucléique hétérologue de la première séquence Sl comprend un acide nucléique codant pour un polypeptide d'intérêt, en particulier un

ADNc, plus préférentiellement un ADNc codant pour un polypeptide d'origine humaine.

L'acide nucléique hétérologue codant pour un polypeptide d'intérêt peut être intégré par des méthodes usuelles permettant de remplacer le gène correspondant de l'organisme hôte.

Le gène d'intérêt peut également comprendre une mutation par rapport à un gène cible de l'organisme hôte, sont intégration ciblée permettant d'introduire la mutation dans ledit gène cible.

Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, l'acide nucléique hétérologue de la première séquence Sl comprend un acide nucléique codant pour un polypeptide d'intérêt fusionné à un acide nucléique codant pour un polypeptide marqueur de sélection ou une polypeptide rapporteur, les deux acides nucléiques étant avantageusement séparés par une séquence de reprise de la traduction (1RES). Cette variante permet d'exprimer de manière concomitante avec substantiellement un même niveau d'expression le polypeptide d'intérêt et le polypeptide marqueur. Ainsi, la quantification du niveau d'expression du polypeptide d'intérêt peut être effectuée dans le temps et dans l'espace, permettant d'évaluer rapidement les effets de l'expression contrôlée du RNA interférant sur ladite expression.

Parmi les séquences codant pour un polypeptide d'intérêt, on peut citer une séquence d'acide nucléique codant pour un polypeptide est un ADNc, plus préférentiellement un ADNc codant pour un polypeptide d'origine humaine. On citera notamment ceux décrits dans Li, et al. ((1997). J CeIl Biol 139, 129-44), Schneider- Maunoury et al. ((1993). CeIl 75, 1199-214) et Tajbakhsh et al. ((1996) Nature 384, 266- 70). Les gènes codant pour un marqueur de sélection fonctionnel dans les cellules animales sont également bien connus de l'homme du métier. On citera notamment Yagi et al, (1990, PNAS, 87, 9918-22). Les gènes de sélection positive sont bien connus de l'homme du métier et sont préférentiellement des gènes de résistance à un antibiotique, tel les gènes de résistance à la kanamycine, qui permet également la résistance à la néomycine dans les cellules mammifères, résistance à l'hygromycine, à la zéocine, à la blasticidine...

De manière préférentielle, la séquence d'acide nucléique codant pour une séquence d'intérêt dans la séquence Sl comprend, liés de manière fonctionnelle, des éléments fonctionnels nécessaires à l'initiation de la transcription et/ou des éléments fonctionnels nécessaires à l'arrêt de la transcription. Parmi les éléments nécessaires à l'initiation de la transcription, on peut citer ceux décrits notamment dans Baker et al ((1972) J Mol Biol.; 69:89-102.) et dans Georgiev GP.((1972) Curr Top Dev Biol. 7, 1-60).

Les séquences d'arrêt de la transcription dans les cellules eucaryotes sont bien connues de l'homme du métier. On citera notamment les séquences décrites notamment dans Proudfoot et al (CeIl. (1991) 64,:671-4) et dans Beaudoing et al. (Génome Res. (2001) 11, 520-526).

Dans un mode particulier de réalisation de l'invention, les séquences Sl et S2 sont supportées par un même vecteur, la séquence Sl étant préférentiellement en amont de la séquence S2.

De manière avantageuse, les sites de reconnaissance de recombinases SRI et SR2 sont choisis, indépendamment l'un de l'autre, parmi les sites Lox P, Lox P modifiés et FRT.

Les sites SRI et SR2 sont choisis indépendamment l'un de l'autre parmi les sites LoxP, LoxP modifiés et FRT. De préférence, les sites de reconnaissances SRI et SR2.

Les combinaisons préférées sont représentées sur le tableau ci-dessous.

En fonction des sites de reconnaissance choisis, les recombinases Rl ou R2 sont choisies, indépendamment l'une de l'autre, parmi les recombinases suivantes : Cre ou FLP.

Les sites de reconnaissance Lox P, Lox P modifié, FRT et les recombinases Cre et

FLP correspondantes sont bien connus de l'homme du métier, notamment décrits dans

Kilby, et al. ((1993). Trends Genêt 9, 413-21), Sauer, et Henderson ((1988). Proc Natl Acad Sci U S A 85, 5166-70), Gu et al. ((1994). Science 265, 103-6), Cohen-Tannoudjiet Babinet ((1998). Mol Hum Reprod 4, 929-38), Shibata, et al. ((1997). Science 278, 120-3), Schlake et Bode ((1994). Biochemistry 33, 12746-51).

Les recombinases peuvent être délivrées de façon ubiquitaires ou tissue-spécifique. Parmi les moyens permettant une telle délivrance tissus-spécifique, on citera en particulier la délivrance de vecteurs viraux, virus ou rétro-virus, permettant l'expression de la recombinase R2 de manière tissus-spécifique, l'injection des recombinases de manière tissus-spécifique ou encore le croisement des animaux selon l'invention avec des animaux modèles comprenant des éléments permettant l'expression de la recombinase R2 de manière tissus-spécifique.

L'expression de la recombinase R2 de manière tissus-spécifique au moyen de vecteurs viraux peut être réalisée comme suit : Un virus d'expression de la recombinase d'intérêt est préparé et purifié selon les méthodes classiques de préparation virales, bien connues de l'homme du métier. Le virus est alors injecté par stéréotaxie dans la région d'intérêt, par exemple la région cérébrale d'intérêt. La dose de virus ainsi que le nombre d'injection sont des paramètres permettant d'obtenir un nombre de cellules hôtes excisées croissant ainsi qu'une diffusion « géographique » accrue.

L'utilisation de systèmes d'inhalation pour les poumons, d'injection IV pour le foie et les épithéliums et d'injection anaux pour le colon sont d'autres exemples de mode d'administration.

Lorsque l'on dispose d'un modèle animal exprimant la recombinase R2 de manière tissus-spécifique, il est possible d'obtenir un animal exprimant séquence d'intérêt de manière tissus-spécifique par son croisement avec l'animal modèle selon l'invention.

De tels modèles animaux exprimant une recombinase de manière tissus-spécifique sont bien connus de l'homme du métier, décrits notamment dans Xu et al. ((1999). Nat

Genêt 22, 37-43), Shibata, et al. ((1997). Science 278, 120-3), Kulkarni, et al. ((1999). CeIl

96, 329-39), Tsien et al. ((1996). CeIl 87, 1327-38) et Harada, et al. ((1999). Embo J 18,

5931-42).

La présente invention concerne également un procédé de transformation de cellules eucaryotes pour intégrer dans son génome la combinaison de vecteurs selon l'invention.

Les méthodes d'intégration de séquences dans le génome de cellules eucaryotes sont bien connues de l'homme du métier, notamment décrites dans Smithies et al. ((1985). Nature 317, 230-4) et Wong et al. ((1986). Somat CeIl Mol Genêt 12, 63-72).

De manière préférentielle, les cellules sont des cellules animales transformées par les méthodes telles que décrites dans Vasquez et al ((2001) PNAS 98, 8403-8410) et Yanez et al ((1999), somatic cell and molecular genetics 25, 27-31).

La présente invention concerne aussi les cellules eucaryotes dans le génome desquelles est intégré la combinaison de séquences selon l'invention, plus préférentiellement les cellules animales telles que définies précédemment, en particulier souris ou rat.

Ces cellules selon l'invention peuvent être des cellules obtenues par intégration de la combinaison de séquences par le procédé selon l'invention. Elles peuvent également

comprendre des cellules obtenues par prélèvement sur des animaux obtenus à partir desdites cellules obtenues par le procédé selon l'invention.

L'invention concerne également des embryons d'animaux obtenus à partir des cellules selon l'invention, ainsi que les animaux obtenus à partir de ces embryons et la descendance desdits animaux ayant conservé le vecteur selon l'invention. Les animaux selon l'invention sont définis précédemment à l'exception de l'homme, préférentiellement des mammifères, plus préférentiellement des mammifères rongeurs, encore plus préférentiellement des rats ou des souris.

Les méthodes de préparation d'animaux modèles sont bien connues de l'homme du métier, et notamment décrites pour le mouton (Wilmut et al. Nature 385, 810-813, 1997 ;

WO 97 07669), la souris (Wakayama et al. Nature 394, 369-374, 1998 ; WO 99 37143), les bovins (Wells et al. Biol. Reprod. 60, 996-1005, 1999), la chèvre (Baguisi et al. Nature

Biotechnol. 17, 456-461, 1999 ; WO 00 25578), le porc (Polejaeva et al. Nature 407, 86-90,

2000), le lapin (Chesne et al. Nature Biotechnol. 20, 366-369, 2002) et le rat (Zhou & al., Science, 25 septembre 2003 ; PCT/FR04/001275). Les méthodes de transfert nucléaire sont notamment décrites par Campbell & al. (Nuclear transfer in practice, School of

Biosciences, University of Nottingham, Leicestershire, United Kingdom).

Les animaux modèles ainsi obtenus peuvent être employés de la manière décrite ci- dessous. La stratégie décrite permet de développer un animal porteur d'un gène intérêt par exemple un gène Humain introduit en remplacement de son homologue de souris.

Ce modèle Humanisé peut faire l'objet d'étude : criblage de composés pharmaceutiques, études physiologiques ...

L'animal est également porteur d'un shRNA produisant un siRNA dirigé contre la forme Humaine. L'expression d'une recobinase cre ubiquitaire permet d'exprimer ce siRNA dans tous les tissus et donc d'étudier l'effet de l'inactivation de cette protéine Humaine dans le modèle murin et / ou de mesurer l'efficacité in vivo du siRNA.

Une expression tissu-spécifique en employant une souri exprimant la recombinase

Cre (recombinase R2) dans les neurones permet ainsi d'exprimer le siRNA uniquement dans les neurones exprimant la recombinase et donc d'étudier l'inactivation de la forme

Humaine dans ces seules cellules. Cette approche permet de disséquer des mécanismes impliquant plusieurs organes ou types cellulaires.

Dans un second temps cet animal peut être croisé avec une souris FIp ubiquitaire (recombinase Rl) de façon à supprimer la cible Humaine. Ce modèle est très intéressant car il permet d'étudier in vivo les effets non spécifiques du siRNA.

A partir d'un seul modèle animal il est donc possible d'étudier la spécificité d'un siRNA, et son efficacité puis d'utiliser ce modèle pour analyser des phénomènes biologiques.