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Patent Searching and Data


Title:
ANTHOCYANIN EXTRACTION METHOD
Document Type and Number:
WIPO Patent Application WO/2023/115183
Kind Code:
A1
Abstract:
The present invention relates to a method for extracting anthocyanins from grape waste resulting from agro-industrial processes, using ultrasound and an eutetic mixture. The present invention has applications in the food, cosmetic, pharmaceutical and/or chemical industries. The present invention is 100% ecological, from the extraction to the analysis of the extracted pigments, using a natural eutetic solvent, which is reused or discarded. Furthermore, the method is fast and efficient, with a high yield and degree of purity of the anthocyanin pigments in a stable and safe form for commercial uses.

Inventors:
MESQUITA LEONARDO MENDES DE SOUZA (BR)
ROSTAGNO MAURÍCIO ARIEL (BR)
VIGANÓ JULIANE (BR)
CONTIERI LETÍCIA SANCHES (BR)
SANCHES VITOR LACERDA (BR)
Application Number:
PCT/BR2022/050495
Publication Date:
June 29, 2023
Filing Date:
December 13, 2022
Export Citation:
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Assignee:
UNICAMP (BR)
International Classes:
C07D311/62; C09B61/00; C09B67/54
Foreign References:
CN113143908A2021-07-23
Other References:
GEORGANTZI CHRYSA ET AL: "Combination of Lactic Acid-Based Deep Eutectic Solvents (DES) with β-Cyclodextrin: Performance Screening Using Ultrasound-Assisted Extraction of Polyphenols from Selected Native Greek Medicinal Plants", AGRONOMY, vol. 7, no. 54, pages 1 - 12, XP093077537, DOI: 10.3390/agronomy7030054
LAKKA ACHILLIA ET AL: "The Effect of Ultrasonication Pretreatment on the Production of Polyphenol-Enriched Extracts from Moringa oleifera L. (Drumstick Tree) Using a Novel Bio-Based Deep Eutectic Solvent", APPLIED SCIENCES, vol. 10, no. 220, pages 1 - 19, XP093077538, DOI: 10.3390/app10010220
ALI REDHA ALI: "Review on Extraction of Phenolic Compounds from Natural Sources Using Green Deep Eutectic Solvents", JOURNAL OF AGRICULTURAL AND FOOD CHEMISTRY, AMERICAN CHEMICAL SOCIETY, US, vol. 69, no. 3, 27 January 2021 (2021-01-27), US , pages 878 - 912, XP093077540, ISSN: 0021-8561, DOI: 10.1021/acs.jafc.0c06641
Attorney, Agent or Firm:
LOPES, Renato da Rocha (BR)
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Claims:
23

REIVINDICAÇÕES Processo de extração de antocianinas caracterizado por compreender as seguintes etapas: a) Triturar biomassa de residuo agroindustrial de uva até que atinjam diâmetro de particula entre 0, 5 e 1 cm; b) Realizar a autoclave da biomassa em 121 °C, por 15 min e 5 bar para esterilização; c) Intumescer a biomassa entre 20 e 30 min, preferencialmente por 25 minutos em uma mistura eutética aquosa de nicotinamida-ácido acético na proporção molar 1:1 e 40% de água e razão sólido liquido entre 0, 013 e 0, 047, preferencialmente por 0, 03; d) Ativar o ultrassom por 4 min e potência de 240 W em temperatura ambiente; e) Centrifugar a 4000 rpm por 5 min para separação fisica do extrato e da biomassa; f ) Extrair em fase sólida e em sistema fechado, preferencialmente utilizando uma coluna de aço inoxidável contendo como adsorvente a silica, na proporção 5:2 em peso/peso de silica : extrato, em coluna de alta pressão com 100 bar e fluxo de ImL/min; g) Eluir o solvente eutético da coluna usando água por 15 min; h) Eluir a antocianinas usando etanol 50 a 100% volume/volume, preferencialmente 70% volume/volume por 10 min; i) Recuperar solvente eutético: i) submeter a solução obtida na etapa (g) a um evaporador rotativo (70 bar, 70°C) para evaporação da água e recuperação do solvente eutético; ii) obter o solvente eutético; j) remover o etanol da solução com antocianina obtida na etapa (h) por evaporação ou liof ilização; e k) Obter antocianina sólida. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo adsorvente de silica na etapa (f) poder ser selecionado do grupo silica do tipo C-18, adsorventes baseados em octadecilsilica e resinas do tipo macroporos .

Description:
PROCESSO DE EXTRAÇÃO DE ANTOCIANINAS

Campo da invenção

[ 1 ] A presente invenção é um processo de extração de antocianinas a partir de residue agroindustrial de uva utilizando ultrassom e uma mistura eutética .

[ 2 ] A presente invenção tem aplicação na indústria de alimentos , cosmética , farmacêutica e/ou quimica . Fundamentos da invenção

[ 3 ] Residues e subprodutos agroindustriais representam um enorme prej uizo para a sociedade e o meio ambiente . Neste sentido, a criação de tecnologias alternativas no setor industrial , bem como a valorização destes residues se torna uma excelente estratégia para mitigação de impactos ambientais . Além disso , destaca-se o impacto econômico na cadeia produtiva de alimentos , visto que os custos de descarte e manej o adequado dos residues representam uma elevada parcela do montante total relacionado à produção . Outro problema ambiental deste setor industrial está relacionado com os pigmentos sintéticos usados como corantes em alimentos , tecidos e papéis . Estes pigmentos , apesar da elevada capacidade de fingimento e elevada estabilidade ( alto tempo de meia vida ) ; são também nocivos ao meio ambiente , visto que para sua sintese são necessários elevados gastos energéticos , bem como uso de solventes orgânicos e estabilizantes quimicos , o que em tudo contribui para uma pegada de carbono elevada . Mais ainda é de salientar a sua toxicidade para a saúde do consumidor e a grande problemática associada à contaminação de águas .

[ 4 ] Usualmente , a extração de pigmentos naturais é realizada por solventes orgânicos convencionais ( SOCs ) , o que tem demonstrado ser uma estratégia pouco econômica e com elevado impacto ambiental . Como exemplos , convencionalmente clorofilas e carotenóides (pigmentos lipofilicos ) são extraídos por acetona e éter; j á pigmentos hidrof ilicos , como antocianinas e taninos , são extraídos com metanol . Além disso , elevados volumes desses solventes são necessários para uma recuperação efetiva destes compostos , o que não é recomendável considerando as tendências atuais de mercado , bem como as metas de desenvolvimento sustentável estipuladas pela Organização das Nações Unidas (ONU) e representadas atualmente pelos 17 desafios de desenvolvimento sustentável . Além disso , normalmente o uso de SOCs não promove um elevado rendimento de extração , ou uma elevada seletividade no processo, o que torna necessário a aplicação de etapas subsequentes de purificação , as quais contribuem igualmente para o gasto de mais solventes , elevando os custo e impactos para o meio ambiente . Uá a extração mediada por água, apesar de preencher os quesitos de sustentabilidade e de não apresentar risco ao manipulador e consumidor do extrato , não promove uma extração de alto rendimento, e por isso elevados volumes de matéria prima, bem como do próprio solvente seriam necessários para atingir um rendimento equiparado ao obtido pelos SOCs .

[ 5 ] Mas a questão dos pigmentos naturais não se prende apenas com o impacto ambiental que estes acarretam, também se relaciona com o seu impacto positivo na substituição de pigmentos sintéticos na indústria alimentar . Assim e do ponto de vista nutricional , há um aumento na demanda por alimentos naturais , livres de alergênicos e aditivos sintéticos , o que j ustifica a substituição de corantes e estabilizantes sintéticos por aqueles de origem natural . No entanto, mesmo com essa estratégia, os corantes sintéticos são muito competitivos no mercado em comparação aos pigmentos naturais , provavelmente devido à convencionalidade e praticidade de uma produção j á consolidada ; e ainda devido à elevada estabilidade da cor do produto sintético quando comparado com o similar natural .

[ 6 ] Uma alternativa viável , é o uso de solventes alternativos não voláteis para criação de plataformas sustentáveis de extração e purificação de pigmentos naturais , representada aqui pelos solventes eutéticos ( ou misturas eutéticas ) , que é formado pela mistura de um doador de hidrogênio com um receptor de ligação de hidrogênio em uma proporção molar especifica , e quantidade de água limitada . Entretanto , apesar de promissora a aplicação de solventes alternativos , poucos grupos de investigação se têm dedicado ao estudo de processos onde a sua aplicação sej a sustentável . Analisando o processo como um todo, acreditamos que um processo de extração e purificação para ser sustentável deve considerar a sua avaliação em três pilares fundamentais : a matéria-prima , os solventes e tecnologias e o ( s ) produto ( s ) . o uso de matérias primas pouco exploradas ou mesmo residues de uma determinada indústria , a obtenção de produtos com elevado valor acrescentado recorrendo ao uso de tecnologias mais simples , menos dispendiosas e de menor impacto ambiental são os principais parâmetros a serem tidos em conta . No que diz respeito aos solventes usados , estes devem ser de baixo custo com o menos impacto ambiental possivel e possiveis de serem reciclados e reutilizados em novos ciclos de extração e/ou purificação .

[ 7 ] Dito isto, a aplicação dos conceitos de economia circular e biorref inaria emergem como fundamentais para a implementação de uma indústria e sociedade mais sustentáveis , podendo (e devendo ) ser aplicados no aproveitamento de subprodutos diversos , nomeadamente aos residues da indústria alimentícia . Hoj e , a indústria segue uma cadeia linear de produção , onde a matéria-prima é utilizada em detrimento da fabricação de produtos altamente competitivos no mercado , mas que se tornam obsoletos em poucos anos . I sto se torna insustentável , visto que inúmeras consequências adversas a este conceito são expostas diariamente sob a forma de impactos ambientais . Portanto, o uso de rej eitos biológicos para criação de novos corantes naturais pode auxiliar na solução de problemas relacionados não só a aquisição de recursos , mas também ao descarte . Hoj e em dia, existe uma grande necessidade no desenvolvimento de processos alternativos ao uso de combustíveis fósseis , bem como a recuperação e reciclagem de matérias primas utilizadas nos processos industriais . Por isso , os 12 princípios da quimica verde têm ganhado destaque no cenário global . Lideres de Estados debatem anualmente medidas mitigatórias para a preservação do meio ambiente e de condições climáticas adequadas à vida ; sendo o equilíbrio do binômio entre economia e meio ambiente o principal desafio de ação dessas autoridades . [ 8 ] 0 documento de patente CN110643196 descreve um método de extração e separação de antocianinas a partir de resíduos de frutas , entre elas , a uva . Pertence ao campo técnico de extração e separação de pigmentos naturais . De acordo com o método, o modo de secagem é melhorado, a antocianina no bagaço é extraída com um solvente eutétlco combinando a extração por microondas e assistência ultrassónica . Contudo, o documento não faz menção de qual biomassa foi considerada como fonte de antocianinas , e isso limita o seu uso, visto que o processo desenvolvido não necessariamente será reprodutível em qualquer biomassa só porque ela é rica em antocianinas . 0 processo utiliza uma solução eutética composta de ácido oxálico, o qual é considerado extremamente tóxico e , portanto, o processo descrito não é seguro ou eco- friendly , sendo nocivo se ingerido ou descartado . Ainda não faz menção quanto a pureza dos pigmentos ou a reutilização do solvente eutétlco utilizado foi retirado do extrato . Diferentemente , a presente invenção é um processo mais complexo, visto que para atingir um rendimento elevado é necessário combinar técnicas de microondas e ultrassom . 0 presente processo é 100 % verde , desde a extração até a análise dos pigmentos extraídos e utiliza solvente eutétlco natural , formado por nicotinamida (vitamina B3 ) e ácido acético (utilizado na indústria de alimentos e cosmética ) e é retirado do extrato , podendo ser reutilizado ou então descartado . Ainda , a resina utilizada para a extração em fase sólida (etapa de purificação ) pode ser reutilizada por 8 ciclos diferentes sem perda de eficiência . Por fim, a presente invenção refere-se a um rápido e eficiente processo, que não utiliza de nenhum solvente orgânico de alta volatilidade como acetona. Além disso, o grau de pureza dos pigmentos antociânicos obtidos é superior a 90%.

[9] O documento de patente CN113143908 apresenta um método para produzir uma composição em pó contendo antocianina realizado a partir da extração em casca de uva ou amora, usando um solvente eutético como agente de extração e auxiliando com ultrassom, em seguida, separando e purificando a solução de extração de antocianina, liofilização e peneiração para obter antocianina em pó; a relação alimento-liquido entre a casca da uva ou amora e o solvente eutético é de 1 : 5- 1: 20 g/mL; a potência ultrassónica é 100-500W, o tempo ultrassónico é 30-150 min e a temperatura ultrassónica é 40-100 °C. O documento não faz referência a reciclo de matérias primas, não reporta como as antocianinas extraídas foram analisadas e quantificadas, não há menção quanto a pureza dos pigmentos extraídos e o solvente eutético é formulado em uma proporção molar de 1:2 a 2:3 usando diversos compostos. De outra forma, a presente invenção refere-se a um processo 100% verde, desde a extração até a análise dos pigmentos extraídos que utiliza solvente eutético natural, formado por nicotinamida (vitamina B3) e ácido acético (utilizado na indústria de alimentos e cosmética) , podendo ser reutilizado ou então descartado.

[10] O artigo cientifico de Lakka et al (2019) intitulado "The Effect of Ultrasonication Pretreatment on the Production of Polyphenol-Enriched Extracts from Moringa oleifera L. (Drumstick Tree) Using a Novel Bio- Based Deep Eutectic Solvent" descreve um processo verde que utiliza solvente eutético composto de glicerol e nicotinamida e ultrassonicação da amostra antes da extração, mas não com uva . As folhas de Moringa oleifera L . são um tecido vegetal particularmente rico em fitoquimicos polif enólicos com bioatividades significativas , e recentemente tem havido significativo interesse para a produção de extratos enriquecidos com essas substâncias . A presente investigação visa estabelecer um processo de extração verde , usando um novo solvente eutético profundo natural ecologicamente correto , composto de glicerol e nicotinamida . Além disso , a ultrassonicação da amostra antes da extração em tanque agitado em lote foi estudada para examinar sua utilidade como uma etapa de pré-tratamento . A otimização do processo de extração por meio da metodologia de superfície de resposta mostrou que o rendimento máximo total de polifenóis ( 82 , 87 ± 4 , 28 mg equivalentes de ácido gálico g - 1 massa seca ) poderia ser alcançado após um pré-tratamento de ultra-som de 30 min , mas a diferença com o rendimento obtido do não

A amostra pré-tratada foi estatisticamente não significativa (p <0 , 05 ) . A cinética de extração revelou que a energia de ativação para as amostras pré-tratadas com ultrassom exigia mais energia, um fato atribuído à lavagem fenomenal dos polifenóis prontamente extraídos durante o pré-tratamento . A espectrometria de massa de matriz de diodo de cromatograf ia liquida mostrou que o pré-tratamento com ultrassom pode ter um efeito positivo limitado sobre a capacidade de extração do polifenol , mas o perfil polifenólico geral era idêntico para as amostras pré-tratadas e não pré-tratadas com ultrassom . Apesar dos obj etivos serem distintos do da presente invenção , o documento não faz referência à reciclagem de matérias primas utilizadas , nem análise verde e não há menção da pureza dos compostos extraídos . Na presente invenção a biomassa utilizada foi residues de uva .

[ 11 ] O artigo cientifico de Jeong ( 2015 ) intitulado "Highly effi cien t extraction of anthocyanins from grape skin using deep eutecti c solvents as green and tunable media" descreve um método de extração de antocianinas da casca da uva, que geralmente é descartada como residue utilizando ultrassom . Solventes eutéticos profundos ( DESs ) foram investigados como sintonizável , ambientalmente benigno, mas superior meio de extração para aumentar a extração de antocianinas da casca da uva , que geralmente é descartada como residue . Como resultado , o ácido citrico, D- ( +) maltose e frutose foram selecionadas como eficazes Componentes DES , e o DES recentemente proj etado, CM-6 que é composto de ácido citrico e D - ( + ) - maltose a 4 : 1 molar proporção , exibiu niveis significativamente mais elevados de antocianina rendimentos de extração do que solventes de extração convencionais tal como metanol aquoso a 80 % . A extração final do método foi estabelecido com base no ultrassom assistido à extração sob condições otimizadas . Seus rendimentos de extração foram o dobro ou ainda maior do que os métodos convencionais que são demorados e usam solventes orgânicos voláteis . O método é realmente um método verde para a extração de antocianina com grande eficiência de extração usando uma quantidade minima de tempo e solvente . Além disso, este estudo sugeriu que a casca de uva , os subprodutos do processamento de suco de uva , pode servir como uma fonte valiosa de corantes naturais e seguros ou antioxidantes . Contudo , o documento não utiliza o mesmo solvente eutético, sendo ácido citrico e maltose em proporções diferentes da presente invenção , não faz análise a estabilidade colorante e nem menciona a pureza dos compostos extraídos . 0 documento não faz avaliação da estabilidade térmica da antocianina extraida e nem de sua pureza e não realiza o reciclo de matéria prima . A presente invenção é 100 % verde , desde a extração até a análise dos pigmentos extraídos que utiliza o solvente eutético natural , formado por nicotinamida (vitamina B3 ) e ácido acético (utilizado na indústria de alimentos e cosmética) , podendo ser reutilizado ou então descartado . Ainda o processo é rápido e eficiente , com grau de pureza dos pigmentos antociânicos obtidos superior a 90 % .

[ 12 ] O artigo cientifico de Grillo et al ( 2020 ) intitulado "Deep Eutectic Solvents and Nonconventional Technologies for Bl ueberry-Peel Extraction : Kineti cs , Anthocyanin Stabili ty , and Antiproliferative Activi ty" descreve um estudo comparativo entre processos de extração de antocianina utilizando solventes eutéticos profundos naturais (NADES ) e processos convencionais e seus efeitos em ensaios de proliferação celular . Cinco solventes eutéticos profundos naturais (NADES ) foram testados para a extração de antocianina . Soluções hidroalcoólicas acidificadas foram utilizadas como benchmarks e a vida útil dos sistemas eutéticos foi monitorada . O NADES mais promissor foi testado em microondas (MAE ) - e extrações assistidas por ultrassom (UAEs ) , e o modelo cinético de Peleg foi usado . Ambas as tecnologias habilitadoras forneceram desempenho superior ao da extração convencional . MAE e UAE renderam até 25 , 83 e 21 , 18 mg/gmatrix de teor de antocianina total , respectivamente , após 15 e 30 min . Além disso, foi realizado um teste preliminar de concentração de extrato e reciclagem de NADES por adsorção de resina . Finalmente , a atividade antiproliferativa dos extratos foi determinada por um ensaio de proliferação celular CellTiter 96® AQueous One Solution , o chamado ensaio MTS , em células HeLa de tumor humano e células HaCaT de pele humana . Os extratos não convencionais exibiram forte atividade antiproliferativa , muito maior do que a de seus análogos extraídos convencionalmente . A citometria de fluxo foi usada para avaliar o tipo de morte celular e a apoptose foi considerada a principal causa de morte celular tumoral . O estudo apresentado demonstra que a implementação de tecnologias de extração f acilitadoras e solventes verdes podem produzir um agente antiproliferative a partir de um subproduto da indústria alimentícia . Contudo a biomassa utilizada como fonte de antocianinas são mirtilos e os solventes eutéticos utilizados são formados por cloreto de colina como aceptor de hidrogênio . A purificação das antocianinas é realizada utilizando uma resina do tipo microporo , capaz de recuperar apenas 72 . 55 % das antocianinas e não é reciclada . Diferentemente , a presente invenção é 100 % verde , utiliza biomassa de uva e utiliza solvente eutético natural formado por nicotinamida (vitamina B3 ) e ácido acético (utilizado na indústria de alimentos e cosmética ) , podendo ser reutilizado ou então descartado . Ainda o processo é rápido e eficiente, com grau de pureza dos pigmentos antociânicos obtidos superior a 90%.

Breve descrição da invenção

[13] A presente invenção é um processo de extração de antocianinas a partir de residue agroindustrial de uva utilizando ultrassom e uma mistura eutética. 0 processo de extração de antocianinas compreende as seguintes etapas: a) Triturar biomassa de residue agroindustrial de uva até que atinjam diâmetro de partícula entre 0,5 e 1 cm; b) Realizar a autoclave da biomassa em 121 °C, por 15 min e 5 bar para esterilização; c) Intumescer a biomassa entre 20 e 30 min, preferencialmente por 25 minutos em uma mistura eutética aquosa de nicotinamida-ácido acético na proporção molar 1:1 e 40% de água e razão sólido liquido entre 0,013 e 0,047, preferencialmente por 0,03; d) Ativar o ultrassom por 4 min e potência de 240 W em temperatura ambiente; e) Centrifugar a 4000 rpm por 5 min para separação fisica do extrato e da biomassa; f) Extrair em fase sólida e em sistema fechado, preferencialmente utilizando uma coluna de aço inoxidável contendo como adsorvente a silica, na proporção 5:2 em peso/peso de silica : extrato, em coluna de alta pressão com 100 bar e fluxo de ImL/min; g) Eluir o solvente eutético da coluna usando água por 15 min; h) Eluir a antocianinas usando etanol 50 a 100% volume/volume, preferencialmente 70% volume/volume por 10 min;

1) Recuperar solvente eutético:

1) submeter a solução obtida na etapa (g) a um evaporation rotativo (70 bar, 70°C) para evaporação da água e recuperação do solvente eutético;

11) obter o solvente eutético; j ) remover o etanol da solução com antocianina obtida na etapa (h) por evaporação ou liofilização; e k) Obter antocianina sólida.

[14] Sendo que o adsorvente de silica na etapa (f) poder ser selecionado do grupo silica do tipo C-18, adsorventes baseados em octadecilsilica substituídos ou não e resinas do tipo macroporo.

Breve descrição das figuras

[15] Na Figura 1 apresenta-se cromatograma representativo do extrato de antocianinas obtido dos residues de uva. Solvente de extração: solução aquosa de nicotinamida-ácido acético (1:2 molar, 40% água) . Identificação dos picos realizada por espectrometria de massas conforme tabela 1.

[16] Na Figura 2 apresenta-se a comparação do rendimento de extração de processo otimizado com outras técnicas convencionais.

[17] Na Figura 3 é representado a eficiência de recuperação (%) de antocianinas por ciclo de purificação utilizando o mesmo adsorvente, o que demonstra que o adsorvente octadecisilica é reciclado por ao menos oito ciclos distintos sem perda de eficiência . [ 18 ] Na Figura 4 é representado o screening de solventes eutéticos naturais formulados que foram testados inicialmente para extração de antocianinas do residue de uva, onde a solução aquosa de nicotinamida- ácido acético foi selecionada como a mais promissora para ser investigada no processo de otimização a fim de se atingir rendimento, pureza e estabilidade elevados .

Descrição detalhada da invenção

[ 19 ] A presente invenção é um processo de extração de antocianinas a partir de residue agroindustrial de uva utilizando uma mistura eutética que atua como solvente para obtenção de antocianinas por meio da técnica de ultrassom, que compreende as seguintes etapas : a ) Triturar biomassa de residue agroindustrial de uva com auxilio de moinho ou processador até que atinj am diâmetro de partícula entre 0 , 5 e 1 cm, podendo variar em ± 30 % ; b ) Realizar a autoclave da biomassa em 121 °C , por 15 min e 5 bar para esterilização; c ) Intumescer a biomassa entre 20 e 30 min ( tempo estático) , preferencialmente por 25 minutos em uma mistura eutética aquosa de nicotinamida-ácido acético na proporção molar 1 : 1 e 40% de água e razão sólido liquido entre 0 , 013 e 0 , 047 , preferencialmente por 0 , 03 ; d) Ativar o ultrassom por 4 min e potência de 240 W em temperatura ambiente ; e ) Centrifugar a 4000 rpm por 5 min para separação fisica do extrato e da biomassa; f ) Extrair em fase sólida e em sistema fechado , preferencialmente utilizando uma coluna de aço inoxidável contendo como adsorvente a silica do tipo C-18 ou resinas equivalentes (adsorventes baseados em octadecilsilica substituídos ou não) ou resinas do tipo macroporo, na proporção 5:2 em peso/peso de silica : extrato, em coluna de alta pressão com 100 bar e fluxo de ImL/min; g) Eluir o solvente eutético da coluna usando água por 15 min; h) Eluir a antocianinas usando etanol 50 a 100% volume/volume, preferencialmente 70% volume/volume por 10 min;

1) Recuperar solvente eutético: i) A solução obtida na etapa (g) pode ser submetida a um evaporador rotativo (70 bar, 70°C) para evaporação da água e recuperação do solvente eutético, sendo a taxa de recuperação do solvente eutético maior que 90%, mais precisamente 91,85%; ii) obter o solvente eutético, o qual pode ser recuperado em novos processos de extração ou então descartado; j ) remover o etanol da solução com antocianina obtida na etapa (h) por evaporação ou liofilização; e k) Obter antocianina sólida.

[20] Sendo que :

- A silica (C-18 ou adsorventes baseados em octadecilsilica substituídos ou não, ou silica do tipo macroporo) utilizada na extração em fase sólida pode ser reutilizada em novos ciclos de extração em fase sólida, nomeadamente 8 ciclos sem que haja quaisquer prejuízos de eficiência (Figura 3) ;

- Se não houver necessidade em recuperar o etanol utilizado na etapa de eluição/adsorção (etapa (h) ) , é possivel realizar a aplicação de silicas de grau alimentar (Dióxido de silica - SiO2, especificações: diâmetro de partícula 320 pm, área de superfície 190m2/g, e absorção de 225 mL/lOOg) para transformar soluções em material particulado, facilitando o processo operacional, devido a não necessidade de evaporação do etanol para obtenção das antocianinas ; e

- Caso opte pela remoção do etanol, o mesmo pode ser reutilizado em outros processos.

- Caso opte pela remoção do etanol, as antocianinas podem também ser adicionadas em silica aprovada para uso alimentar.

Caracterização

[21]Ao final do processo, foi realizado a caracterização do produto obtido, antocianina sólida por cromatograf ia, conforme segue abaixo.

[22] Este método cromatográf ico é realizado uma coluna de HPLC (fase estacionária composta por C-18) , e fase móvel contendo água acidificada com ácido citrico (ácido aprovado no ramo alimentar, em uma concentração de 0,25 mol/L) , e bioetanol.

[23] O método é realizado em 8 minutos totais de análise, com fluxo de ImL/min, em gradiente de água realizado da seguinte maneira: Omin: 97%, 1 min: 87%, 2 min: 85%, 3 min: 82%, 3,5 min: 80%, 4 min: 75%, 4.5 min: 73%, 6 min: 73%, 6.5 min: 50% (fase de lavagem) , 7.5 min: 50%, e 8 min: 97% (retorno das condições iniciais) ; temperatura de coluna fixada em 55 °C (± 3) .

[24] No fim tem-se um extrato com pureza maior que 90% de antocianinas , com estabilidade colorante superior aos pigmentos obtidos por meio de extração com etanol e/ou água, e analisado com método sustentável de cromatograf ia liquida de alta eficiência (sem solventes orgânicos tóxicos) . A tabela 1 mostra as antocianinas identificadas no produto final do presente processo .

Tabela 1. Identificação de antocianinas de uva obtidas pelo processo da presente invenção

[ 25 ] Todos os materiais utilizados no processo de extração podem ser recuperados e reutilizados , diminuindo o custo ambiental e econômico inerente ao processo .

Estabilidade térmica dos pigmentos

[ 26 ] A tabela 1 mostra a influência de solvente e temperatura na estabilidade das antocianinas . Verifica- se que com o aumento de temperatura, há uma diminuição do tempo de meia vida dos pigmentos ( isto é perda de cor ) . Entretanto , essa diminuição é menor pronunciada quando as antocianinas são extraídas com a solução de nicotinamida-ácido acético (pH 3) . Além do mais, quando as antocianinas extraidas pela solução de nicotinamida- ácido acético são adicionadas à silica aprovada para uso alimentício, o tempo de meia vida dos pigmentos a 95 °C passa de 1,83 para 6,42 horas, o que demonstra avanços em direção a aplicação comercial do pigmento de forma estável e segura.

Tabela 2. Influência do solvente de extração na estabilidade térmica (55, 75 e 95°C) de antocianinas provenientes do residue agroindustrial de uva.

Kd = Constante de degradação térmica; T (1/2) = tempo de meia-vida ; Ea = Energia de ativação térmica .

Pureza do processo de extração

[ 27 ] A pureza de antocianinas em solução foi avaliada por meio do método de sólidos totais . I sto é , após a purificação das antocianinas por extração em fase sólida com resina C-18 ( retirada do solvente eutético) , uma solução etanólica contendo 120 mg de antocianinas foi submetida a um aquecimento de 95 °C por 5 dias para que houvesse a completa remoção do solvente . Após este periodo, a massa sobressalente neste becker ( 132 mg) representa o total de componentes sólidos presentes no extrato ( incluindo antocianinas e outros compostos ) , esta massa sobressalente corresponde a uma pureza de 90 , 90% . Este resultado demonstra que o extrato obtido pelo processo desenvolvido utilizando a solução aquosa de nicotinamida-ácido acético é altamente seletiva .

Comparação com outras técnicas de extração

[ 28 ] A Figura 2 destaca a eficiência do rendimento de extração do processo otimizado desenvolvido com solução aquosa de nicotinamida-ácido acético comparado à outras técnicas convencionais , nomeadamente : maceração ( 5 dias ) , agitação magnética ( 500 rpm) e ultra-dispersão ( 15000 rpm por 5 minutos ) . É possivel notar que o processo desenvolvido via ultrassom utilizando associado a solução aquosa de nicotinamida- ácido acético como solvente de extração é bastante promissor em comparação à outras técnicas de extração . É possivel notar que ao substituir a solução de nicotinamida-ácido acético por água ou etanol não promove elevados rendimentos de extração , mesmo quando as condições otimizadas de extração são empregadas igualmente .