Die Zirkulation von Blutzellen wie z. B. Leukozyten, Neutrophilen, Granulozyten und Monozyten ist auf molekularer Ebene ein vielstufiger, sehr komplexer Prozess, der nur in Teilschritten bekannt ist (Review : T. A. Springer, Cell 76, 301-314, 1994).

Jüngste Forschungsergebnisse zeigten, daß die in der Immunüberwachung ent- scheidende Rezirkulation der Lymphozyten sowie die Lokalisierung von Neutrophi- len und Monozyten an Entzündungsherden sehr ähnlichen molekularen Mechanis- men gehorchen. So kommt es bei akuten und chronischen Entzündungsprozessen zur Adhäsion der Leukozyten an Endotheizellen und Auswanderung in den Entzün- dungsherd und in die sekundären lymphatischen Organe.

An diesem Vorgang sind zahlreiche spezifische Signalmoleküle wie z. B. Interleuki- ne, Leukotriene und Tumornekrosefaktor (TNF), deren G-Protein gekoppelte Rezep- toren und insbesondere gewebespezifische Zelladhäsionsmoleküle beteiligt, die ei- ne genau kontrollierte Erkennung der Immun-und Endotheizellen gewährleisten. Zu den wichtigsten hierbei beteiligten Adhäsionsmolekülen, die im folgenden als Rezep- toren bezeichnet werden sollen, gehören die Selektine (E-, P-und L-Selektine), Integrine und die Mitglieder der Immunglobulin-Superfamilie.

Die drei Selektinrezeptoren bestimmen die Anfangsphase der Leukozytenadhäsion.

E-Selektin wird auf Endothelzellen einige Stunden nach der Stimulierung beispiels- weise durch Interleukin-1 (IL-1 ß) oder Tumornekrosefaktor (TNF-a) exprimiert, wäh- rend P-Selektin in Blutplättchen und Endotheizellen gespeichert wird und nach Sti- mulierung durch Thrombin, Peroxidradikale oder Substanz P u. a. auf den Zellober- flächen präsentiert wird. L-Selektin wird dauerhaft auf Leukozyten exprimiert, wird im Verlauf der Entzündung jedoch rasch wieder von den Leukozyten abgespalten.

Die in der Anfangsphase entzündlicher Prozesse durch Selektin-Rezeptoren ver- mittelte Adhäsion von Leukozyten an Endothelzellen ist eine natürliche und notwen- dige Immunantwort auf diverse Entzündungsreize und Verletzungen des vasculären Gewebes. Der Verlauf einer Reihe von akuten und chronischen Erkrankungen wird jedoch durch die übermäßige Adhäsion von Leukozyten und deren Infiltration in das betroffene Gerwebe sowie durch die Schädigung gesunden Gewebes im Sinne ei- ner Autoimmunreaktion ungünstig beeinflußt. Dazu zählen beispielsweise Rheuma, Reperfusionsverletzungen wie myokardiale Ischämie/Infarkt (MI), akute Lungenent- zündung nach operativem Eingriff, traumatischer Schock und Schlaganfall, Psoria- sis, Dermatitis, ARDS (Atemnotsyndrom bei Erwachsenen) sowie die nach chirurgi- schen Eingriffen (Beispiel Angioplastie und By-Pass Operationen) auftretende Re- stenose.

Der natürliche Ligand mit der Struktur des komplexen Oligosaccharids Sialyl Lewis- X (SLeX) wurde schon erfolgreich in Tierversuchen bei P-Selektin abhängigen Lun- genverletzungen (M. S. Mulligan et al., Nature 1993, 364, 149) und bei myokardialen Reperfusionsverletzungen (M. Buerke et al., J. Clin. Invest. 1994, 93, 1140) verwen- det. In ersten klinischen Prüfungen bei Myokarinfarkt mußten jedoch Dosen von mehreren Gramm dieses Wirkstoffes verabreicht werden, da derselbe nur eine sehr geringe Bioverfügbarkeit besitzt (Mitteilung der Firma Cytel Corp/La Jolla, CA., publi- ziert in Scrip No 2137, 14 Juni 1996, Seite 22). Diese hohe Wirkstoffdosis steht auch im Einklang mit der bekanntermaßen schwachen Affinität der natürlichen SleX/A- Liganden zu den Selektin-Rezeptoren in statischen in vitro-Testsystemen : So inhi-

biert SLeX in allen bekannten in vitro-Testsystemen die Zelladhäsion an Selektinre- zeptoren erst bei einer relativ hohen Konzentration im Bereich von IC50 ca. 1 mM oder darüber (Jacob et al., Biochemistry 1995, 34, 1210).

Neben SLeX/A-Liganden inhibieren auch verschiedene anionische Polymere wie Heparin, Fucoidan und Dextransulfat die P-Selektin vermittelte Zelladhäsion (Skin- ner, M. P., et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 164, 1373-1379, 1989 und J.

Biol. Chem., 266, 5371-5374, 1991). Außerdem binden die sogenannten Sulfatide (3-O-sulfatierte Galactosylceramide), die von aktivierten Granulozyten produziert werden, an P-Selektin (Aruffo, A. et al., Cell 67, 35-44, 1991).

Hauptkomponente Nebenkomponente Fig. 1 : Sulfatid Ziel dieser Arbeiten ist die Bereitstellung wirksamerer Inhibitoren der Leukozyten- adhäsion, die sich vom Sulfatid (Fig. 1) ableiten.

Sulfatidanaloga mit Sulfat-oder Carboxymethylgruppen an verschiedenen Hydroxy- gruppen der Galactose oder Glucose und einem a-oder 3-glycosidischen Ceramid sind bereits synthetisiert und biologisch untersucht worden (EP 671 406, EP 671

407 und AU 9537864-A ; Bristol-Myers Squibb). Auch ein Mimetikum welches bis auf das Ceramidaglycon mit dem natürlichen Sulfatid identisch ist wurde bereits be- schrieben (US 5, 486, 536 ; University of Michigan ; ohne Daten). Die 3-O sulfatierte Galactose weist am anomeren Zentrum einen 2, 2-Dialkylethylrest auf.

Der Nachteil dieser Sulfatidanaloga liegt in der aufwendigen Synthese des Agly- cons, besonders im Falle des Ceramids.

Alle bisher beschriebenen Sulfatidanaloga haben ferner den Nachteil, daß diese Verbindungen eine glycosidische und damit säurelabile Bindung aufweisen.

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung von Sulfatidmi- metika, welche statt des Ceramids einen 1, 2-dialkylierten Glycerinbaustein als Agly- con aufweisen und säurestabil sind. Diese sollten außerdem wesentlich einfacher und billiger herstellbar sein.

Die gestellte Aufgabe wird gelöst durch eine Verbindung der Formel I worin bedeuten Rl, R2 unabhängig voneinander- (CH2) n-CH3, wobei n eine ganze Zahl von 10 bis 30,

R3-R6 unabhängig voneinander OH, OS03H, OCH2COOH, CH (COOH) 2, O (CH2) 2CH (COOH) 2 oder nicht-toxische Salze der entsprechenden Säuren, mit der Maßgabe, daß mindestens ein Rest R3-R6 ungleich OH ist, wobei die Hydroxy-Gruppen mit Schutzgruppen wie beispiels weise Benzyl, Benzyliden oder Isopropyliden versehen sein können, und X 0, S, (CH2) 20 oder CH20.

Nachfolgend sind Beispiele für Verbindungen mit den genannten, bevorzugten Ei- genschaften angeführt, welche vorzugsweise mit den sauren Gruppen -OSO3H, -OCH2COOH,-CH (COOH) 2 und -O-(CH2)2CH(COOH)2 substituiert sind.

Besonders bevorzugt bedeuten R1 und R2 -(CH2)15-CH3 und X Sauerstoff. Wahl- weise bedeuten R3 und R4 oder R3 und R6 OSO3H.

1. Eine Verbindung der Formel 1a, die sich dadurch auszeichnet, daß X Sauerstoff, R1 und R2- (CH2) 15-CH3 R3 und R4 OSO3H und RI und R6 OH bedeuten.

2. Eine Verbindung der Formel 1b, die sich dadurch auszeichnet, daß X Sauerstoff, R1 und R2 -(CH2)15-CH3 RI und R4 OSO3H und R5 und R6 O-Benzyliden bedeuten.

3. Eine Verbindung der Formel 1c, die sich dadurch auszeichnet, daß X Sauerstoff, RI und R2 -(CH2)15-CH3 R3 und R6 OSO3H und R4 und RI OH bedeuten. 4. Eine Verbindung der Formel 1d, die sich dadurch auszeichnet, daß X Sauerstoff, R1 und R2-(CH2) 15-CH3 R3 und R6 OSO3H und R4 und R5 O-Isopropyliden bedeuten.

Eine weitere bevorzugte Ausgestaltung der vorliegenden Erfindung ist eine Verbin- dung der Formel I, in welcher X CH20 und R1 und R2- (CH2) 15-CH3 bedeuten : 5. Eine Verbindung der Formel 1e, die sich insbesondere dadurch auszeichnet, daß X CH20, R1 und R2 -(CH2)15-CH3 R3 und R4 O-Benzoyl und R5 und R6 OCH2COOH bedeuten.

6. Wahlweise bedeuten R3 und R4 OH, wobei die übrigen Variablen die unter Nr. 5 genannten Bedeutungen haben.

7. Eine Verbindung, die sich dadurch auszeichnet, daß X CH20, RI und R2- (CH2) 15-CH3 R3, R4 und R5 OH und R6 CH (COOH) 2 bedeuten.

8. Wahlweise können R3, R4 und R5 O-Benzyl bedeuten, wobei die übrigen Va- riablen die unter Nr. 7 angegebenen Bedeutungen haben (Verbindung 1fl.

Vorzugsweise bedeuten X Schwefel und R1 und R2 -(CH2)15-CH3 in Formel I.

9. Eine Verbindung der Formel 1g, die sich insbesondere dadurch auszeichnet, daß X Schwefel, RI und R2 -(CH2)15-CH3 R3 und R4 O (CH2) 2CH (COOH) 2 und R5 und R6 O-Benzyliden bedeuten.

10. Eine Verbindung, die sich dadurch auszeichnet, daß ferner X Schwefel R1 und R2- (CH2) 15-CH3 R3 und R4 O (CH2) 2CH (COOH) 2 und R5 und R6 OH bedeuten.

Die eingangs gestellte Aufgabe wird ferner gelöst durch ein Verfahren zur Herstel- lung einer Verbindung der Formel I, welches sich dadurch auszeichnet, daß man einen peracetylierten Glycosyldonor, vorzugsweise ein peracetyliertes Galactosyltri- chloracetimidat, vorzugsweise das Imidat 2a, mit einem Alkohol der Formel 111, oder einen Mercaptan der Formel V, wobei die Variablen R1 und R2 die genannten Bedeutungen haben, vorzugsweise mit den leicht erhältlichen Verbindungen 3 oder 5, zum entsprechenden O-Glycosid bzw.

S-Glycosid umsetzt (beispielsweise Verbindungen 4 bzw. 6).

Nach Abspaltung der Acetylschutzgruppen wird ein Teil der freien Hydroxylgruppen entweder direkt oder nach entsprechender Schützung der übrigen Hydroxylgruppen mit den sauren Gruppen, vorzugsweise-OS03H,-OCH2COOH,-CH (COOH) 2 oder -O-(CH2) 2CH (COOH) 2, versehen, wonach gegebenenfalls die eingeführten Schutz- gruppen wieder abgespalten werden.

Zur Herstellung der C-glycosidisch verknüpften Verbindungen (s. Nr. 5 bis 8) wird vorzugsweise ein 1-0-Acetyl-substituierter und im übrigen perbenzylierter Glycosyl- donor, beispielsweise Verbindung 2b (Fig. 3), mit Trimethylsilylcyanid umgesetzt, wonach man das anomere Cyanid, beispielsweise Verbindung 7 (Fig. 3), zu einem Methylester umsetzt (beispielsweise Verbindung 8 in Fig. 3), der zu einem C-1-Hy- droxymethylglycosid (z. B. Verbindung 9 in Fig. 3) reduziert und mit einem zweiketti- gen Alkyldonor, beispielsweise Verbindung 10 (in Fig. 3), alkyliert wird. Nach Ab- spaltung der Benzylschutzgruppen (beispielsweise durch Hydrogenolyse) werden die freien Hydroxylgruppen mit den bevorzugten sauren Gruppen funktionalisiert.

Ausgehend von 2b läßt sich beispielsweise C-1-Hydroxymethyl-2, 3, 4, 6-tetra-0- benzyl-ß-D-galactopyranosid 9 herstellen, welches mit dem Bromid 10 (oder dem entsprechenden Tosylat oder Triflat) zum C-Glycosid 11 alkyliert wird.

Die Verbindungen 4, 6 und 11 werden zu den Verbindungen 12, 15 und 19 ent- schützt und zu den Verbindungen der Formel I derivatisiert.

Fig. 4

Sollen statt der soeben vorgestellten ß-Glycoside, die entsprechenden a-Glycoside synthetisiert werden, so wird zur Synthese der 0-und S-Gtycoside statt des perace- tylierten Donors 2a, der entsprechende perbenzylierte Donor verwendet. Die ver- schiedenen Möglichkeiten zur Steuerung der anomeren Konfiguration bei Glycosy- lierungen sind hinreichend bekannt.

Auch bei der Synthese der C-Glycoside, beispielsweise über das anomere Cyanid 7 (Fig. 3), kann durch Veränderung der experimentellen Parameter-bei der Cyanid- einführung-wie Lösungsmittel, Katalysator und Temperatur sowie der Wahl der Ab- gangsgruppe, die gewünschte anomere Konfiguration des Cyanids erhalten werden.

Bei der anschließenden Behandlung des anomeren Cyanids mit methanolischer Na- triummetanolatlösung ist zu beachten, daß aufgrund der CH-Acidität der C-glycosi- dischen Cyanide und Carbonsäureester, beispielsweise der Verbindungen 7 und 8 (Fig. 3) bei zu hohem pH-Wert das a-Cyanid (z. B. 7a) zum ß-Ester (z. B. 8ß, Fig. 3) isomerisiert. Dieser Effekt, der bei der gezielten Synthese der ß-C-Glycoside durch- aus erwünscht ist, läßt sich bei der Synthese der a-C-Glycoside dadurch ausschlie- ßen, daß mit ausreichend verdünnter Methanolatlösung gearbeitet wird.

Die in den Abbildungen vorgestellten Entschützungsreaktionen wie Debenzylierung und Deacetylierung sowie die Einführung verschiedener Schutzgruppen (z. B. Ben- zyliden, Isopropyliden) und saurer Gruppen (z. B. Sulfat, Carboxymethyl, Malonyl) sind dem Fachmann hinreichend bekannt und bedürfen keiner besonderen Erläute- rung.

Die Affinität der erfindungsgemäßen Verbindungen der Formel I an Selektine kann anhand der nachfolgend beschriebenen Zelladhäsionsassays überprüft werden.

Primärassays zur Untersuchung der Wirkung der Verbindungen gemäß der vorlie- genden Erfindung auf die Zellanheftung an rekombinante, lösliche Selektin-Fusions- proteine.

Um die Wirksamkeit der erfindungsgemäßen Verbindungen auf die Interaktion zwi- schen den E-und P-Selektinen (alte Nomeklatur ELAM-1 bzw. GMP-140) mit ihren Liganden zu testen, wird ein Assay verwendet, der jeweils nur für eine dieser Inter- aktionen spezifisch ist. Die Liganden werden in ihrer natürlichen Form als Oberflä- chenstrukturen auf promyelozytischen HL60 Zellen angeboten. Da HL60 Zellen Liganden und Adhäsionsmoleküle unterschiedlichster Spezifität aufweisen, kann die gewünschte Spezifität des Assays nur über den Bindungspartner erbracht werden.

Als Bindungspartner wurden gentechnisch hergestellte lösliche Fusionsproteine aus der jeweils extrazytoplasmatischen Domäne von E-bzw. P-Selektin und der kon- stanten Region eines humanen Immunglobulins der Subklasse IgG1 verwendet.

Herstellung von L-Selektin-IgG1 Zur Herstellung von löslichem L-Selektin-IgG1 Fusionsprotein wurde das von Walz et al., 1990 publizierte genetische Konstrukt"ELAM-Rg"verwendet. Zur Expression wurde die Plasmid DNA in COS-7 Zellen (ATCC) mittels DEAE-Dextran transfiziert (Molekularbiologische Methoden : siehe Ausubel, F. M., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Seidman, J. G., Struhl, K. und Smith, J. A. 1990. Current Protocols in Molecular Biology, John Nlley, New York). Sieben Tage nach der Transfection wird der Kulturüberstand gewonnen, durch Zentrifugation von Zellen und Zellfragmenten befreit und auf 25 mM Hepes pH 7, 0, 0, 3 mM PMSF, 0, 02 % Natriumazid gebracht und bei + 4 °C aufgehoben. (Walz, G., Aruffo, A., Kolanus, W., Bevilacqua, M. und Seed, B. 1990. Recognition by ELAM-1 of the sialyl-Lex determinant on myeloid and tumor cells. Science 250, 1132-1135.) Herstellung von P-Selektin-IgG1 Zur Herstellung des löslichen P-Selektin-IgG1 Fusionsproteins wird das von Aruffo et al., 1991 publizierte genetische Konstrukt"CD62Rg"verwendet. Die weitere Vor- gehensweise entspricht der unter A1 dargestellten Herstellung von L-Selektin-lgG1.

Aruffo, A., Kolanus, W., Walz, G., Fredman, P. und Seed, B. 1991. CD62/-P-Selectin recognition of myeloid and tumor cell sulfatides. Cell 67, 35-44.

Herstellung von CD4-lgG1 Zur Herstellung des löslichen CD4-lgG1 Fusionsproteins wird das von Zettlemeissl et al., 1990 publizierte genetische Konstrukt"CD4 : 1gG1 hinge"verwendet. Die weite- re Vorgehensweise entspricht der unter A1 dargestellten Herstellung von L-Selektin- lgG1. (Zettelmeissl, G., Gregersen, J.-P., Duport, J. M., Mehdi, S., Reiner, G. und Seed, B. 1990. Expression and characterization of human CD4 : Immunoglobulin Fusion Proteins. DNA and Cell Biology 9, 347-353.) Durchführung des HL60 Zelladhäsionsassays auf rekombinanten, löslichen Adhä- sionsmolekülen 1. 96er Mikrotitertestplatten (Nunc Maxisorb) werden mit 100 NI eines in 50 mM Tris pH 9, 5 verdünnten (1 + 100) Ziege anti human IgG Antikörpers (Sigma) 2 Std. bei Raumtemperatur inkubiert. Nach Entfernen der Antikörperlösung wird einmal mit PBS gewaschen.

2. 150 NI des Blockierungspuffers werden für 1 Std. bei Raumtemperatur in den Näpfchen belassen. Die Zusammensetzung des Blockierungspuffers ist : 0, 1 % Gelatine, 1 % BSA, 5 % Kalbserum, 0, 2 mM PMSF, 0, 02 % Natriuma- zid. Nach Entfernen des Blockierungspuffers wird einmal mit PBS ge- waschen.

3. In die Näpfchen werden je 100 lul Zellkulturüberstand von entsprechend transfektierten und exprimierenden COS-Zellen pipettiert. Die Inkubation er- folgt 2 Std. bei Raumtemperatur. Nach Entfernen des Zelikulturüberstandes wird einmal mit PBS gewaschen.

4. In die Näpfchen werden 20 pl Bindungspuffer gegeben. Der Bindungspuffer hat die Zusammensetzung : 50 mM Hepes, pH 7, 5 ; 100 mM NaCI ; 1 mg/ml BSA ; 2 mM MgCI2 ; 1mM CaCI2 ; 3 mM MnCI2 ; 0, 02 % Natriumazid ; 0, 2 mM PMSF.

Dazu werden 5 ut der Testsubstanz pipettiert, durch Schwenken der Platte vermischt und 10 Min. bei Raumtemperatur inkubiert.

5. 50 ml einer HL60 Zellkultur mit 200. 000 Zellen/ml werden 4 Min. bei 350 g zentrifugiert. Das Pellet wird in 10 ml RPMI 1640 resuspendiert und die Zellen erneut zentrifugiert. Zur Markierung der Zellen werden 50 ug BCECF-AM (Molecular Probes) in 5 u ! wasserfreiem DMSO aufgelöst ; anschließend wer- den 1, 5 ml RPMI 1640 auf die BCECF-AM/DMSO-Lösung gegeben. Mit die- ser Lösung werden die Zellen resuspendiert und 30 Min. bei 37°C inkubiert.

Nach zweiminütiger Zentrifugation bei 350 g wird das markierte Zellpellet in 11 ml Bindungspuffer resuspendiert und die resuspendierten Zellen in 100 ul Aliquots in die Mikrotiterplatten-Näpfchen verteilt. Die Platte wird 10 Min. bei Raumtemperatur stehen gelassen, um die Zellen auf den Boden der Test- platte sedimentieren zu lassen. Dabei haben die Zellen Gelegenheit an das beschichtete Plastik zu adhärieren.

6. Zum Abstoppen des Tests wird die Mikrotiterplatte im 45 Winkel gänzlich in den Stoppuffer getaucht (25 mM Tris, pH 7, 5 ; 125 mM NaCI ; 0, 1 % BSA ; 2 mM MgCl2 ; 1 mM CaC'2 ; 3 mM MnC'2 ; 0, 02 % Natriumazid). Durch Invertie- rung wird der Stoppuffer aus den Näpfchen entfernt und die Prozedur noch zweimal wiederholt.

7. Die Messung der in den Näpfchen festhaftenden, BCECF-AM-markierten Zel- len erfolgt in einem Cytofluorimeter (Millipore), bei einer Empfindlichkeitsein- stellung von 4, einer Anregungswellenlänge von 485/22 nm und einer Emis- sionswellenlänge von 530/25 nm.

Leukozyten-Adhäsion-Prüfung der Wirksamkeit der erfindungsgemäßen Verbin- dungen in vivo (Intravitalmikroskopie an der Ratte) : Bei entzündlichen Prozessen und anderen, die Zytokine aktivierenden Zuständen spielt die Gewebszerstörung durch einwandernde oder die Mikrozirkulation blockie- rende Leukozyten eine entscheidende Rolle. Die erste und für den weiteren Krank- heitsprozeß entscheidende Phase ist die Aktivierung von Leukozyten innerhalb der Blutbahn, insbesondere im prä-und postkapillären Bereich. Dabei kommt es, nach- dem die Leukozyten den Axialstrom des Blutes verlassen haben, zu einem ersten Anheften der Leukozyten an der Gefäßinnenwand, d. h. am Gefäßendothel. Alle dar- auf folgenden Leukozyteneffekte, d. h. die aktive Durchwanderung durch die Gefäß- wand und die anschließende orientierte Wanderung im Gewebe, sind Folgereaktio- nen (Harlan, J. M., Leukocyte-endothelial interaction, Blood 65, 513-525, 1985).

Diese rezeptorvermittelte Interaktion von Leukozyten und Endotheizellen wird als ein initiales Zeichen des Entzündungsprozesses angesehen. Neben den schon physio- logisch exprimierten Adhäsionsmolekülen kommt es unter der Einwirkung von Ent- zündungsmediatoren (Leukotriene, PAF) und Zytokinen (TNF-alpha, Interleukinen) zur zeitlich gestuften, massiven Expression von Adhäsionsmolekülen auf den Zellen.

Sie werden derzeit in drei Gruppen eingeteilt : 1. Immunglobulin-Gensuperfamilie, 2.

Integrine und 3. Selektine. Während die Adhäsion zwischen Molekülen der Ig-Gen- superfamilie und den Protein-Protein-Bindungen abläuft, stehen bei der Kooperation zwischen Selektinen Lektin-Kohlehydrat-Bindungen im Vordergrund (Springer, T. A., Adhesion receptors of the immune system. Nature 346, 425-434, 1990 ; Huges, G., Cell adhesion molecules-the key to an universal panacea, Scrips Magazine 6, 30- 33, 1993 ; Springer, T. A., Traffic signals for lymphocyte recirculation and leukocyte emigration ; The multistep paradigm. Cell 76, 301-314, 1994).

Methode : Die induzierte Adhäsion von Leukozyten wird mit einer intravitalmikroskopischen Untersuchungstechnik im Mesenterium der Ratte quantifiziert (Atherton A. and Born

G. V. R., Quantitative investigations of the adhesiveness of circulating polymorphnu- clear leukocytes to blood vessel walls. J. Physiol. 222, 447-474, 1972). Unter Inhalations-Äthernarkose wird eine Dauernarkose durch intramuskuläre Injektion von Urethan (1, 25 mg/kg KG) eingeleitet. Nach Freipräparation von Gefäßen (V. femora- lis zur Injektion von Substanzen und A. carotis zur Blutdruckmessung) werden Ka- theter in diese eingebunden. Danach wird das entsprechende transparente Gewebe (Mesenterium) nach den in der Literatur bekannten Standardmethoden freigelegt und auf dem Mikroskoptisch ausgelagert und mit 37 °C warmen Paraffine) über- schichtet (Menger, M. D. and Lehr, H., A. Scope and perspetives of intravital microscopy-bridge overfrom in vitro to in vivo, Immunology Today 14, 519-522, 1993). Die Applikation der Testsubstanz erfolgt i. v. am Tier (10mg/kg). Die experi- mentelle Erhöhung der Blutzell-Adhäsion wird durch systemische Verabreichung von Lipopolysaccharid (LPS, 15 mg/kg) 15 Min. nach Applikation aus Testsubstanz durch Zytokin-Aktivierung ausgelöst (Foster S. J., Mc Cormick L. M., Ntolosi B. A. and Campbell D., Production of TNF-alpha by LPS-stimulated murine, rat and hu- man blood and its pharmacological modulation, Agents and Actions 38, C77-C79, 1993, 18. 01. 1995). Die dadurch verursachte erhöhte Adhäsion von Leukozyten am Endothel wird direkt vitalmikroskopisch oder mit Hilfe von Fluoreszenzfarbstoffen quantifiziert. Alle Meßvorgänge werden per Videokamera aufgenommen und auf einem Videorekorder gespeichert. Über einen Zeitraum von 60 Min. wird alle 10 Min. die Anzahl der rollenden Leukozyten (d. h. alle sichtbar rollenden Leukozyten, die langsamer als die strömenden Erythrozyten sind) und die Anzahl an haftenden Leu- kozyten am Endothel (Verweildauer länger als 5 Sek.) erfaßt. Nach Beendigung des Versuches werden die narkotisierten Tiere schmerzfrei durch systemische Injektion von T61 exzitationsfrei eingeschläfert. Zur Auswertung werden die Ergebnisse je- weils von 8 behandelten mit 8 unbehandelten Tieren (Kontrollgruppe) verglichen (Angabe der Ergebnisse in Prozenten).

Reperfusionsmodell zur Untersuchug des Einflusses der Adhäsion von Neutrophilen im Verlauf der Ischämie/Reperfusion am offenen Kaninchen-Herzen :

Die Herzen werden bei konstantem Druck nach der Langendorff-Technik mit Nähr- lösung sowie mit/ohne Leukozyten bzw. Wirkstoff perfundiert. Danach wird eine Ischämie durch Unterbinden der linken Koronarartherie (30 min) hervorgerufen.

Nach Reperfusion (30 min) wird die Leukozytenakkumulierung histologisch ausge- wertet. Im Versuchsverlauf werden außerdem an 256 Elektroden Potentiale und Arrhythmien gemessen (Gesamtversuchsdauer ca. 90 min). Bei 6 von 7 unbehan- delten mit Leukozyten perfundierten Herzen treten ausgeprägte Arrhythmien auf- grund der Leukozyteninfiltration auf, während die mit einem Wirkstoff (RGDS-Pepti- de, Chondroitinsulfat) behandelten Herzen verminderte Leukozyten Akkumulierung und Arrhythmien entwickeln. Die untersuchte Verbindung 3a war im Bereich von ca.

1 uM hochwirksam (starke Verminderung der Arrhythmien).

Die Verbindungen gemäß der vorliegenden Erfindung sowie deren physiologisch verträglichen Salze eignen sich aufgrund ihrer wertvollen pharmakologischen Eigen- schaften sehr gut zur Anwendung als Heilmittel bei Säugern, insbesondere dem Menschen.

Die vorliegende Erfindung betrifft daher ferner ein Arzneimittel enthaltend wenig- stens eine Verbindung gemäß Formel I sowie deren Verwendung für die Herstellung eines Arzneimittels zur Therapie oder Prophylaxe von Krankheiten, welche mit einer übermäßigen, durch Selektinrezeptoren vermittelten Zelladhäsion in dem von der Krankheit betroffenen Gewebe einhergehen, beispielsweise Rheuma, Herz-Kreis- lauf-Erkrankungen, wie Reperfusionsverletzungen, Ischämie oder Herzinfarkt. Die Arzneimittel eignen sich im besonderen zur Behandlung von akuten und chroni- schen Entzündungen, die sich pathophysiologisch durch eine Störung der Zellzirku- lation, beispielsweise von Lymphozyten, Monozyten und neutrophilen Granulozyten, kennzeichnen lassen. Hierzu zählen Autoimmunerkrankungen wie akute Polyarthri- tis, rheumatoide Arthritis und Insulin-abhängige Diabetes (Diabetes mellitus IDDM) akute und chronische Transplantatabstoßungen, Schocklunge (ARDS, adult respira- tory distress syndrome), entzündliche und allergische Hauterkrankungen wie bei- spielsweise Psoriasis und Kontakt-Ekzeme, Herz-Kreislauf-Erkrankungen wie Myo-

kardinfarkt, Reperfusionsverletzungen nach Thrombolyse, Angioplastie oder By- Pass-Operationen, septischer Schock und systemischer Schock. Eine weitere po- tentielle Indikation ist die Behandlung metastasierender Tumoren, denn Tumorzellen tragen Oberflächenantigene, die sowohl Sialyl-Lewis-X als auch Sialyl-Lewis-A- Strukturen als Erkennungsepitope besitzen. Darüberhinaus können diese Arznei- mittel, die stabil im sauren Milieu des Magens sind, zur antiadhäsiven Therapie von Helicobacter pylori und verwandten Mikroorganismen ggf. auch in Kombination mit Antibiotika eingesetzt werden. Ferner ist mit Hilfe dieser Arzneimittel eine Therapie der cerebralen Form der Malaria denkbar.

Die erfindungsgemäßen Arzneimittel werden im allgemeinen intravenös, oral oder parenteral oder als Implantate verabreicht, aber auch eine rektale Anwendung ist prinzipiell möglich. Geeignete feste oder flüssige galenische Zubereitungsformen sind beispielsweise Granulate, Pulver, Tabletten, Dragees, (Mikro-) Kapseln, Zäpf- chen, Sirupe, Emulsionen, Suspensionen, Aerosole, Tropfen oder injizierbare Lö- sungen in Ampullenform sowie Präparate mit protrahierte Wirkstoff-Freigabe, bei deren Herstellung üblicherweise Trägerstoffe und Zusätze und/oder Hilfsmittel wie Spreng-, Binde-, Überzugs-, Quellungs-, Gleit-oder Schmiermittel, Geschmacks- stoffe, Süßungsmittel oder Lösungsvermittler Verwendung finden. Als häufig ver- wendete Träger-oder Hilfsstoffe seien z. B. Magnesiumcarbonat, Titandioxid, Lakto- se, Mannit und andere Zucker, Talkum, Milcheiweiß, Gelatine, Stärke, Vitamine, Cel- lulose und ihre Derivate, tierische und pflanzliche Öle, Polyethylenglykole und Lö- sungsmittel, wie etwa steriles Wasser, Alkohole, Glycerin und mehrwertige Alkohole genannt.

Vorzugsweise werden die pharmazeutischen Präparate in Dosierungseinheiten her- gestellt und verabreicht. Feste Dosierungseinheiten sind Tabletten, Kapseln und Suppositorien.

Für die Behandlung eines Patienten sind je nach Wirksamkeit der Verbindung, Art der Applikation, Art und Schwere der Erkrankung, Alter und Körpergewicht des Pa-

tienten, unterschiedliche Tagesdosen notwendig. Unter Umständen können jedoch auch höhere oder niedrigere Tagesdosen angebracht sein. Die Verabreichung der Tagesdosis kann sowohl durch Einmalgabe in Form einer einzelnen Dosierungsein- heit oder aber mehrerer kleiner Dosierungseinheiten ais auch durch Mehrfachgabe unterteilten Dosen in bestimmten Intervallen erfolgen. Die zu verabreichende Tages- dosis kann außerdem von der Anzahl der während des Krankheitsverlaufs expri- mierten Rezeptoren abhängig sein. Es ist vorstellbar, daß im Anfangsstadium der Krankheit nur wenige Rezeptoren auf der Zelloberfläche exprimiert werden und demzufolge die zu verabreichende Tagesdosis geringer ist als bei stark erkrankten Patienten.

Die erfindungsgemäßen Arzneimittel werden dadurch hergestellt, daß man eine Ver- bindung gemäß der vorliegenden Erfindung mit üblichen Träger-sowie gegebenen- falls Zusatz-und/oder Hilfsstoffen in die bzw. eine geeignete Darreichungsform bringt.

Ferner ist die Verwendung von Verbindungen gemäß der Formel I für die Herstel- lung eines Mittels zur Diagnose einer Krankheit, welche mit einer übermäßigen, durch Selektinrezeptoren vermittelten Zelladhäsion in dem von der Krankheit betrof- fenen Gewebe einhergeht, denkbar.

Beispiele für die Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen : Beispiel 1 : a) Synthese von 3-hydroxy-1, 2-di-hexadecyloxy-propan (3) : Eine Mischung aus NaH (3, 55 g, 148, 2 mmol), (R)-3-Benzyloxy-1, 2-propandiol (9 g, 49, 4 mmol) und Dimethylformamid (675 mi) wird 30 min bei Raumtemperatur ge- rührt. Dann wird 1-Bromhexadecan (42, 2 ml, 138, 32 mmol) zugetropft. Nach 18 h wird Eiswasser zugegeben, dreimal mit Diethylether extrahiert und die vereinigten organischen Extrakte dreimal mit Wasser gewaschen. Es wird über Natriumsulfat

getrocknet, filtriert und chromatografiert (Hexan-Hexan/Essigester 50 : 1-20 : 1- 10 : 1). Man erhält (R)-3-Benzyloxy-1, 2-di-hexadecyloxy-propan (30, 8 g ; 99 %). Die- se Verbindung wird in Methanol/Dioxan/Essig-säure (2 : 3 : 0, 01 ; 255 ml) gelöst, mit Pd/C (10 % ; 5 g) versetzt und 18 h in einer Wasserstoffatmosphäre unter Normal- druck hydriert. Es wird filtriert, eingeengt und der Rückstand chromatografiert (He- xan/Essigester 6 : 1-5 : 1). Man erhält Verbindung 3 (21, 38 g, 81 %).

1H-NMR (300 MHz, CDCI3) : a = 0. 88 (2t, 6H, 2CH3), 1. 28 (m, 52H, 26 (CH) 2), 1. 58 (m, 4H, 2 (CH) 2), 2. 19 (dd, 1H, OH), 3. 40-3. 77 (m, 9H, 4 O (CH) 2, O (CH)). b) Synthese von 2, 3-di-hexadecyloxy-propyl-0-2, 3, 4, 6-tetra-O-acetyl-ß-D-galac topyranosid (4) : Zu einer Mischung aus 0- (2, 3, 4, 6-Tetra-O-acetyl-D-galactopyranosyl)-trichloraceti- midat (3 g, 6, 1 mmol) und Verbindung 3 (4, 1 g, 7, 6 mmol) in Dichlormethan (30 ml) gibt man eine 1 M Trimethylsilyltrifluormethansulfonat-Lösung (0, 61 ml). Nach 30 Min. wird mit Natriumhydrogencarbont (0, 5 g) neutralisiert, filtriert, eingeengt und der Rückstand chromatografiert (Hexan/Essigester 10 : 1-7 : 1-5 : 1). Man erhält Verbindung 4 (4, 14 g, 78 %).

1H-NMR (300 MHz, CDCI3) : 5 = 0. 88 (2t, 6H, 2CH3), 1. 26 (m, 52H, 26 (CH) 2), 1. 55 (m, 4H, 2 (CH) 2), 1. 98, 2. 05, 2. 05, 2. 15 (4s, 12H, 4 OAc), 3. 36-3. 66 (m, 8H), 3. 88 (m, 2H), 4. 16 (m, 2H), 4. 52 (d, 1H, 1-H), 5. 02 (dd, 1 H, 3-H), 5. 19 (dd, 1H, 2-H), 5. 38 (dd, 1 H, 4-H). c) Synthese von 2, 3-di-hexadecyloxy-propyl-O-ß-D-galactopyranosid (12) : Verbindung 4 (3, 3 g, 3, 8 mmol) wird in Methanol gelöst und mit einer 1 M Natrium- methanolatlösung (1, 2 ml) versetzt. Nach 2 h wir mit 1 M Essigsäure neutralisiert und eingengt. Verbindung 12 wird ohne Reinigung direkt in die nächste Stufe einge- setzt.

H-NMR (300 MHz, DMSO-d6) : 5 = 0. 87 (2t, 6H, 2CH3), 1. 25 (m, 52H, 26 (CH) 2), 1. 50 (m, 4H, 2 (CH) 2), 4. 13 (d, 1H, 1-H). d) Synthese von 2, 3-di-hexadecyloxy-propyl-0-4, 6-O-benzyliden-o-D-galactopy-

ranosid (13) : Eine Mischung aus Verbindung 12 (1, 5 g, 2, 1 mmol), Acetonitril (250 ml), Benzalde- hyddimethyacetal (2, 36 ml, 15, 75 mmol) und p-Toluolsulfonsäure (300 mg) wird 5 h bei 50°C gerührt. Man läßt auf Raumtemperatur abkühlen, neutralisiert mit Kalium- carbonat (500 mg), filtriert und engt das Filtrat im Vakuum ein. Der Rückstand wird chromatografiert (Toluol/Aceton 4 : 1). Man erhält Verbindung 13 (1, 14 g, 68 %).

1H-NMR (300 MHz, CDCI3) : a = 0. 88 (2t, 6H, 2CH3), 1. 25 (m, 52H, 26 (CH) 2), 1. 55 (m, 4H, 2 (CH) 2), 4. 33 (d, 1 H, 1-H), 5. 55 (s, 1 H, CHPh), 7. 35-7. 50 (m, 5H, Ph). e) Synthese von 2, 3-di-hexadecyloxy-propyl-O-4,6-O-benzyliden-2,3-di-O- oxysulfonyl-ß-D-galactopyranosid (1b) : Eine Mischung aus Verbindung 13 (0, 32 g, 0, 40 mmol) und SO3-Pyridin-Komlex (0, 64 g, 4, 0 mmol) in Pyridin (10 ml) wird 3 h bei Raumtemperatur gerührt. Zur Auf- arbeitung gibt man Wasser (5 ml) und Natriumhydrogencarbonat (0, 5 g) zu. Nach beendeter Gasentwicklung wird eingeengt, der Rückstand in Methanol (5 ml) aufge- nommen, filtriert und eingeengt. Nach Chromatografie (Dichlormethan/Methanol 7 : 1) erhält man Verbindung 1b (0, 28 g, 74 %).

1H-NMR (300 MHz, CDCI3/CD30D) : 5 = 0. 89 (2t, 6H, 2CH3), 1. 28 (m, 52H, 26 (CH) 2), 1. 57 (m, 4H, 2 (CH) 2), 3. 96 (dd, 1H), 4. 14, 4. 26 (2d, 2H), 5. 62 (s, 1H, CHPh), 7. 35, 7. 45 (2m, 5 H, Ph).

Synthese von 2, 3-di-hexadecyloxy-propyl-0-4, 6-O-benzyliden-2, 3-di-O- oxysulfonyl-ß-D-galactopyranosid (1a) : Verbindung 1b (157 mg, 0, 165 mmol) wird in Essigsäure/Methanol 1 : 1 (10 ml) ge- löst und mit Palladiumkohle (10 %, 200 mg) versetzt. Die Mischung wird in einer Wasserstoffatmosphäre 18 h gerührt. Zur Aufarbeitung werden Wasser (20 mi) und Methanol (20 ml) zugegeben, auf 40-50°C erwärmt und filtriert. Der Filter wird mit warmem Methanol nachgespült. Das Filtrat wird eingeengt, der Rückstand mit war- mem Methanol (20 ml) aufgenommen, filtriert und bei 0°C auskristallisiert. Man er- hält Verbindung 1a (108 mg, 76 %).

1H-NMR (300 MHz, CDCI3/CD30D) : 5 = 0. 88 (2t, 6H, 2CH3), 1. 26 (m, 52H, 26

(CH) 2), 1. 53 (m, 4H, 2 (CH) 2).

Massenspektrum (TSQ 700, Finnigan/MAT), Electrospray ionization (ESI) : (M-H)-= 862.

Beispiel 2 : a) Synthese von 2, 3-di-hexadecyloxy-propyl-0-3, 4-O-isopropyliden-ß-D-galacto- pyranosid (14) : Eine Mischung aus Verbindung 12 (2, 03 g, 2, 89 mmol), Dimethoxypropan (120 ml) und p-Toluolsulfonsäure (150 mg) wird 18 h bei Raumtemperatur gerührt. Zur selek- tiven Abspaltung der gemischten Acetale werden Wasser (75 ml) und p-Toluolsul- fonsäure (150 mg) zugegeben. Nach 2 h werden Essigsäureethylester (1200 ml) und gesättigte Natriumhydrogencarbonatlösung (400 ml) zugegeben und 30 Min. gerührt. Die organische Phase wird abgetrennt und mit Natriumhydrogencarbonatlö- sung (3 x 150 ml) gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und im Vakuum eingengt. Flash-Chromatografie (Toluol/Essigsäureethylester 2 : 1) liefert Verbin- dung 14 (1, 85 g, 86 %).

H-NMR (300 MHz, CDC13) : 5 = 0. 88 (2t, 6H, 2CH3), 1. 26 (m, 52H, 26 (CH) 2), 1. 28, 1. 34 (2 s, 6 H, isoprop.), 1. 56 (m, 4H, 2 (CH) 2), 2. 45 (bd, 1 H, OH), 3. 01 (bs, 1 H, OH), 4. 23 (d, 1H, 1-H). b) Synthese von 2, 3-di-hexadecyloxy-propyl-0-3, 4-O-isopropyliden-2, 6-di-O- oxysulfonyl-6-D-galactopyranosid (1d) : Verbindung 1d wird wie bei 1b beschrieben aus Verbindung 14 hergestellt.

H-NMR (300 MHz, CDCI3/CD30D) : 5 = 0. 89 (2t, 6H, 2CH3), 1. 28 (m, 52H, 26 (CH) 2), 1. 33, 1. 51 (2 s, 6 H, isoprop.), 1. 57 (m, 4H, 2 (CH) 2), 3. 88 (dd, 1 H), 4. 32 (dd, 1 H), 4. 40 (dd, 1 H), 4. 51 (dd, 1 H), 4. 74 (d, 1 H, 1-H). c) Synthese von 2, 3-di-hexadecyloxy-propyl-0-2, 6-di-O-oxysulfonyl-ß-D-galacto- pyranosid (1c) : Eine Lösung aus Vebindung 1d (1, 4 g, 1, 55 mmol) wird in einer Mischung aus Triflu-

oressigsäure/Wasser (1 : 1, 84 mi) 4 h bei 40°C gerührt. Die Mischung wird einge- engt und mittels Flash-Chromatografie (Dichlormethan/Methanol 20 : 1-10 : 1-5 : 1) gereinigt. Man erhält Verbindung 1c (1, 18 g, 88 %).

1H-NMR (300 MHz, CDCI3/CD30D) : 5 = 0. 89 (2t, 6H, 2CH3), 1. 28 (m, 52H, 26 (CH) 2), 1. 57 (m, 4H, 2 (CH) 2).

Beispiel 3 : a) Synthese von 3-Mercapto-1, 2-di-hexadecyloxy-propan (5) : Die primäre Hydroxy-Gruppe von Verbindung 3 wird mit Trifluormetansulfonsäurean- hydrid in Pyridin umgesetzt und das so erhaltene Triflat mit Kaiiumthioacetat umge- setzt. Die S-Acetyl-Gruppe wird mit Natriummethanolat in Methanol abgespalten.

Man erhält Verbindung 5. b) Synthese von 2, 3-Di-hexadecyloxy-propyl-S-2, 3, 4, 6-tetra-O-acetyl-ß-D-galac- tothiopyranosid (6) : Verbindung 6 wird aus 2a und 5 analog zu Verbindung 4 hergestellt. c) Synthese von 2, 3-Di-hexadecyloxy-propyl-S-ß-D-galactothiopyranosid (15) : Verbindung 15 wird aus 6 analog zu Verbindung 12 hergestellt. d) Synthese von 2, 3-Di-hexadecyloxy-propyl-S-4, 6-O-benzyliden-ß-D-galactot hiopyranosid (16) : Verbindung 16 wird aus 15 analog zu Verbindung 13 hergestellt. e) Synthese von 2, 3-Di-hexadecyloxy-propyl-S-2, 3-di-0-2-allyloxy-ethyl-4, 6-O- benzyliden-ß-D-galactothiopyranosid (18) : Verbindung 18 wird durch Alkylierung von 16 mit 17 in Dimetylformamid mit Natrium- hydrid hergestellt.

Synthese von 2, 3-Di-hexadecyloxy-propyl-S-4, 6-O-benzyliden-2, 3-di-0-2-

malonyl-ethyl-ß-D-galactothiopyranosid (1 g) : Verbindung 1g wird durch Deallylierung, Tosylierung, Malonylierung und alkalische Verseifung aus Verbindung 18 hergestellt.

Beispiel 4 : a) Synthese von (2, 3, 4, 6-Tetra-O-benzyl-D-galactopyranosyl)-cyanid (7) : Verbindung 7 wird durch Umsetzung von 2b mit Trimethylsilylcyanid unter der Kata- lyse von Bortrifluorid-Etherat in Acetonitril hergestellt. b) Synthese von C-1-Hydroxymethyl-2, 3, 4, 6-tetra-O-benzyl-ß-D-galactopyrano- sid (9) : Cyanid 7 wird mit Natriummethanolatlösung behandelt und anschließend mit 1 M Salzsäure angesäuert. Man erhält den Methylester 8. Dieser wird mit etherischer Lithiumaluminiumhydrid-Lösung bei 0°C zu Verbindung 9 reduziert. c) Synthese von C-1-2, 3-Di-hexadecyloxy-propyloxymethyl-2, 3, 4, 6-tetra-O- benzyl-ß-D-galactopyranosid (11) : C-Glycosid 11 wird durch Alkylierung von 9 mit 10 erhalten.

Verbindung 10 wird durch Bromierung von Verbindung 3 erhalten. d) Synthese von C-1-2, 3-Di-hexadecyloxy-propyloxymethyl-ß-D-galactopyrano sid (19).

Verbindung 19 wird durch Hydrogenolyse von 11 mit 10 % iger Palladiumkohle in einer Wasserstoffatmosphäre unter Normaldruck erhalten. e) Synthese von C-1-2, 3-Di-hexadecyloxy-propyloxymethyl-2, 3, 4-tri-O-benzyl-ß- D-galactopyranosid (20) : Verbindung 20 wird durch selektive 6-O-Tritylierung von 19, Benzylierung der ver- bliebenen freien OH-Gruppen und anschließende Abspaltung der 6-O-Tritylgruppe erhalten.

Synthese von C-1-2, 3-Di-hexadecyloxy-propyloxymethyl-6-bromo-2, 3, 4-tri-O- benzyl-ß-D-galactopyranosid (21) : Verbindung 21 wird durch Bromierung von Verbindung 20 hergestellt. g) Synthese von C-1-2, 3-Di-hexadecyloxy-propyloxymethyl-6-malonyl-2, 3, 4-tri- O-benzyl-ß-D-galactopyranosid (1f): Verbindung 1f wird durch Malonylierung von Verbindung 21 mit Malonsäuredimethy- lester und anschließende alkalische Verseifung hergestellt.

Beispiel 5 : Hemmung der Zelladhäsion in vitro : IC5O-Werte für E-Selektin [mM] und für P-Selektin [mM] : E [mM] P [mM] 1a 1b 0, 16-1, 3 0, 12-0, 8 1c 1, 6-2, 05 0, 04-0, 082 1d 0, 64-2, 08 0, 058-0, 063