【발명의 명칭】

항ᅳ DR5 항체 및 그의 용도 【기술분야】

세포사멸 수용체 5(death receptor 5； DR5)에 특이적으로 결합하여 암세포 사멸 기능을 갖는 항체와 관련된 것으로, 구체적으로， 항 -DR5 항체 또는 이의 항원결합단편， 및 상기 항체 또는 항원결합단편의 암의 예방 또는 치료 용도에 관한 것이다.

【배경 기술】

정상세포에는 영향 없이 암세포 선택적인 세포사멸을 유도하는 TNF- rel ated apoptos i s inducing l igand (TRAIL 또는 Apo2L)와 이의 수용체 중 하나인 DR5 (death receptors 5) 시스템을 통한 세포사멸 경로는 암 치료제 개발의 중요한 표적 물질로 여겨지고 있다 (Ashkenazi 등， Nat Rev Cancer 2： 420 , 2002) .

현재 DR5를 표적으로 하는 암세포 치료제로서 재조합 TRAIL과 세포사멸 수용체 특이적인 항체가 개발되고 있다.

TRAIL의 경우, 세포 사멸 신호를 전달하는 DR4 (Death receptor 4， TRAIL— Receptor 1) , DR5 (Death receptor 5 , TRAIL-Receptor 2)뿐만 아니라 세포 사멸 신호를 전달하지 못하는 DcRKDecoy Receptor 1， TRAIL-Receptor 3) , DcR2(Decoy Receptor 1 , TRAIL-Receptor 4)에도 모두 결합하여 DR5에 대한 특이성이 낮다는 문제가 있다. 또한 재조합 TRAIL은 안정성이 떨어지고 정상세포인 성상세포 (astrocytes ) , 간세포 (hepatocytes) , 각질세포 (kerat inocytes) 등에도 세포 사멸을 유발하는 부작용이 있다 (Jo 등, Nature Medi cine 6， 564—567 , 2000) . 따라서 최근 부작용이 적으며 암 세포 선택적인 세포사멸을 유도하는 항 -DR5 내지 항 DR4 항체 개발이 활발하게 연구되고 있다.

세포사멸 수용체 특이적인 항체와 관련하여， 현재까지 제넨텍 (Genentech Incorporated , 미국)과 암젠 (Amgen , 미국)에서 개발한 항 -DR5 항체와 세포 사멸 활성을 평가하기 위한 임상이 진행된 바 있다. 휴먼제놈사이언스 (Human Genome Sc i ences , 미국)는 항 -DR5 항체인 HGS- ETR2와 항 DR4 항체인 HGSᅳ ETR1을 이용하여 임상 2상을 진행한 바 있으나, 현재 개발이 중단된 상태이며, 이 외에도 Apomab, Conatumumab, tigatuzumab 등의 항 -DR5 항체들의 경우에도 개발이 중단되었다.

세포 사멸 (cell apoptosis)은 크게 외부적 세포 사멸 경로 (extrinsic apoptosis pathway)와 내재적 세포 사멸 경로 ( intrinsic apoptosis pathway)를 통해 발생한다. 대부분의 화학요법약제와 방사선 치료가 p53을 매개하는 내재적 세포 사멸 경로를 통하여 암 세포 사멸을 일으키는 반면 DR5 관련된 세포 사멸은 p53—비 의존적 외부적 경로와 내재적 경로를 통해 유도된다 (Takeda 등, Oncogene, 26， 3745-3757, 2007) . 외부적 세포 사멸 경로에서 TRAIL 내지 항체는 DR5에 결합하여 신호 전달 복합체 (DISC: Death-Inducing Signaling Complex)를 형성하고 Adaptor 단백질 (FADD)을 통해 apoptosisᅳ initiating protease 인 caspase-8, caspase—10을 활성화 시킨다. Caspase一 8는 하위 protease인 caspase-3, caspase-7 등을 활성화시키는 동시에 미토콘드리아를 통한 내재적 세포사멸을 함께 유도한다 (Ohtsuka 등, Oncogene , 22, 2034-2044, 2003).

. TRAIL의 암 치료 용도 개발의 표적으로서의 중요성이 커져가고 있는 상황에서, 보다 효과적이고 강력한 TRAIL 관련 표적 물질의 개발이 요구되고 있다.

【발명의 상세한 설명】

【기술적 과제】

세포사멸 수용체 5(death receptor 5； DR5)에 특이적으로 결합하여 다양한 암세포를 효과적으로 사멸시키는 항 -DR5 항체 및 그 용도를 제공하고자 한다.

일 예는 항 -DR5 항체 또는 이의 항원결합단편을 제공한다.

다른 예는 상기 항 -DR5 항체 및 /또는 이의 항원결합단편을 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

다른 예는 상기 항— DR5 항체 및 /또는 이의 항원결합단편을 암의 예방 또는 치료를 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계를 포함하는， 암의 예방 또는 치료방법을 제공한다.

다른 예는 상기 항— DR5 항체 및 /또는 이의 항원결합단편의， 암의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 용도 또는 항암제 제조에 사용하기 위한 용도를 제공한다.

다른 예는 상기 항 -DR5 항체 또는 이의 항원결합단편을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 분자, 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 백터， 및 상기 재조합 백터를 포함하는 재조합 세포를 제공한다.

다른 예는 상기 폴리뉴클레오타이드 분자를 발현시키는 단계를 포함하는 항 -DR5 항체 또는 이의 항원결합단편의 제조 방법을 제공한다.

【과제의 해결방법】

세포사멸 수용체 5(death receptor 5； DR5)에 특이적으로 결합하여 다양한 암세포를 효과적으로 사멸시키는 항 -DR5 항체， 및 이를 포함하는 암 예방 또는 치료용 조성물이 제공된다.

본 명세서에서 제공되는 항체는 TRAIL (TNF-related apoptosis inducing ligand) 농도와 상관없이 일정 수준의 항원 결합력을 유지하는 TRAIL 비경쟁적 항체인 것을 특징으로 한다. 따라서 , 상기 항체는 기존에 개발된 항체 약물보다 우수한 효과를 지닌 혁신적인 항체 신약 또는 진단제로서 유용하게 개발될 수 있다.

세포사멸 수용체 5(death receptor 5； DR5)는, TRAIL receptor

2 (TRAILR2) 또는 tumor necrosis factor receptor superf ami ly member 10B (TNFRSF10B)라고도 칭해지며, TRAIL 에 결합하는. TNF一 수용체 superfamily 의 세포표면 수용체이고 세포자멸사 (apoptosis) 신호를 전달하여 세포자멸사를 매개한다. DR5는 Caspase 8， Caspase 10, FADD (Fas-Associated protein,, with Death Domain) , TRAIL：등과 상호작용하는 것으로 알려져 있다. DR5는 포유동물로부터 유래된 것일 수 있으며, 예컨대 인간의 DR5 (e.g. , NCBI accession no. UniProtKB/Swiss-Prot： Q6FH58 등)일 수 있다.

일 예는 DR5를 특이적으로 인식하거나 및 /또는 여기에 특이적으로 결합 가능한 폴리펩타이드를 제공한다ᅳ 상기 폴리펩타이드는 서열번호 1 내지 서열번호 16으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 폴리펩타이드는 서열번호 1， 2, 4, 및 7 내지 16으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다.

본 명세서에서, 단백질， 폴리펩타이드, 또는 플리뉴클레오타이드가 아미노산 서열 또는 뉴클레오타이드 서열을 갖는다 함은 단백질, 폴리펩타이드， 또는 폴리뉴클레오타이드가 상기 서열을 포함하거나， 상기 서열을 필수적으로 포함하여 이루어지거나, 상기 서열로 이루어진 것을 모두 의미하기 위하여 사용될 수 있다. 이들 폴리펩타이드는 항— DR5 항체의 상보성결정부위 (complementarity determining region, CDR)로서 사용 가능하다.

상기 폴리펩타이드 및 이들의 적용 가능한 상보성결정부위를 아래의

(상기 표 1에서, VH-CDR1 , V _H -CDR2 , 및 V _H -CDR3는 중쇄 상보성결정부위를 의미하고, V _L — CDRl, V _L -CDR2, 및 V _L -CDR3는 경쇄 상보성결정부위를 의미한다)

다른 예에서， 상기 폴리펩타이드들로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 DR5 표적 풀리펩타이드 분자가 제공된다. 상기 DR5 표적 폴리펩타이드 분자는 DR5의 리간드인 TRAIL과 비경쟁적으로 작용하여 암세포 사멸 (예컨대 암세포의 apoptosis)을 증진시키는 것을 특징으로 한다.

상기 DR5 표적 폴리펩타이드 분자는 앞서 설명한 항— DR5 항체의 중쇄 상보성결정부위， 경쇄 상보성결정부위， 또는 이들의 조합; 또는 상기 중쇄 상보성결정부위를 포함하는 중쇄 가변 영역, 상기 경쇄 상보성결정부위를 포함하는 경쇄 가변 영역, 또는 이들의 조합을 포함하는 것일 수 있다. 상기 DR5 표적 폴리펩타이드 분자는， 이에 한정되지 않지만, 항 -DR5 항체， 상기 항체의 항원결합단편， 또는 항 -DR5 항체 유사체 (항체와 유사한 골격과 기능을 갖는 구조체; 예컨대， 펩티바디, 나노바디, 등) , 또는 다중 결합 항체 등의 전구체 또는 구성 부분 (예컨대， CDR)으로서 역할을 할 수 있다.

용어 "펩티바디 (pept i de + ant i body) "는 펩타이드와 항체의 Fc 부분 등의 불변 부위의 전부 또는 일부가 융합된 융합 단백질로서, 항체와 유사한 골격과 기능올 갖는 단백질을 의미한다. 여기서 앞서 설명한 1종 이상의 펩타이드가 항원 결합 부위 (중쇄 및 /또는 경쇄 CDR 또는 가변 영역)로서 작용할 수 있다.

용어 "나노바디' ¹ 는 단일-도메인 항체 (s ingle-domain ant ibody)라고도 불리며, 항체의 단일 가변 도메인을 모노머 형태로 포함하는 항체 단편을 의미하며， 완전한 구조의 항체와 유사하게 특정 항원에 대하여 선택적으로 결합하는 특성을 갖는다. 나노바디의 분자량은 일반적으로 약 12 kDa 내지 약 15 kDa 정도로, 완전한 항체 (두 개와 중쇄와 두 개의 경쇄 포함)의 일반적인 분자량 (약 150 kDa 내지 약 160 kDa)과 비교하여 매우 작으며 , 경우에 따라서는 Fab 단편이나 scFv 단편보다 작다.. 용어 "다중 결합 항체" (이중 결합 항체를 포함하는 의미임)는 2개 또는 그 이상의 상이한 항원을 인식 및 /또는 결합하거나, 동일한 항원의 서로 다른 부위를 인식 및 /또는 결합하는 항체를 의미하는 것으로， 상기 다중 결합 항체 중 하나의 항원 결합 부위가 앞서 설명한 폴리펩타이드를 포함하는 것일 수 있다.

일 예에서, 상기 폴리펩타이드들로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 상보성결정부위로서 포함하는 항 -DR5 항체 또는 이의 항원결합단편이 제공된다. 본 명세서에서 제공되는 항 -DR5 항체는 DR5의 작용제 (agoni st )로서의 효능을 갖는 것으로, 세포표면에 개별적으로 존재하는 DR5 분자를 집합시켜 세포내에서 세포사멸 신호를 생성 및 전달시킴으로써 세포 사멸을 유도하는 역할을 한다.

상기 항— DR5 힝 - 또는 이의 항원결합단편은, 중쇄의 상보성결정부위로서，

서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 (V _H -CDR1) ,

서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 (V _H — CDR2) , 및 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 (V _H -CDR3)

로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 것일 수 있다. 상기 서열번호 3의 아미노산 서열은 하기 일반식 1의 아미노산 서열과 같다.

[일반식 1] (서열번호 3)

D—A-G-S-X1-C— G-X2-G— G-W-T-G-A-C- I -D-T

XI은 G 또는 P이고,

X2는 S 또는 K임 .

일 구체예에서, 항 -DR5 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 중쇄 CDR3로 사용 가능한 서열번호 3의 폴리펩타이드는， 예컨대， 서열번호 7 서열번호 8， 및 서열번호 9로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다 (하기 기재된 아미노산 서열에서 진하게 밑줄 그은 부분은 서열번호 7의 아미노산 서열에서 변형된 아미노산을 나타낸다) :

서열번호 7 : DAGSGCGSGGWTGACIDT

서열번호 8 : DAGSPCGSGGWTGACIDT

서열번호 9 : DAGSPCGKGGWTGACIDT

다른 예에서, 상기 항 -DR5 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 경쇄의 상보성결정부위로세

서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 (V _L -CDR1) , ^' 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 (V _L — CDR2) 및 서열번호 6의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 (V _L -CDR3)

로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 것일 수 있다. 상기 서열번호 5와 서열번호 6의 아미노산 서열은 각각 하기 일반식 2 및 일반식 3의 아미노산 서열과 같다.

[일반식 2] (서열번호 5)

N-N-N-N-X3-X4-X5

X3는 R, L , 또는 K이고,

X4는 P , M , 또는 A이고,

X5는 S , P , 또는 K임；

[일반식 3] (서열번호 6)

G-S-R-D-S-X6-X7-X8-G-X9

X6는 S , A, 또는 D이고,

X7는 Y 또는 G이고

X8는 V M, G, 또는 A이고, _. X9는 I , R , 또는 G임 .

일 구체예에서, 항 -DR5 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 경쇄 CDR2로 사용 가능한 서열번호 5의 폴리펩타이드는, 예컨대， 서열번호 10， 서열번호 11 , 및 서열번호 12로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다 (하기 기재된 아미노산 서열에서 진하게 밑줄 그은 부분은 서열번호 10의 아미노산 서열에서 변형된 아미노산을 나타낸다)：

서열번호 10 : NNNNRPS

서열번호 11 : NNNNLMP

서열번호 12 : NNNNKAK

일 구체예에서, 항 -DR5 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 경쇄 CDR3으로 사용 가능한 서열번호 6의 폴리펩타이드는, 예컨대， 서열번호 13， 서열번호 14， 서열번호 15 , 및 서열번호 16으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다 (하기 기재된 아미노산 서열에서 진하게 밑줄 그은 부분은 서열번호 13의 아미노산 서열에서 변형된 아미노산을 나타낸다) :

서열번호 13 GSRDSSYVGI

서열번호 14 GSRDSAGMGA

서열번호 15 GSRDSDGGGR

서열번호 16 GSRDSSGAGG

일 구체예에서， 항 DR5 항체 또는 이의 항원 결합 단편은,

서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 (V _H -CDR1) , 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 (V _H -CDR2) , 및 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 (V _H -CDR3)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 부위, 또는 상기 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 부위를 포함하는 중쇄 가변 영역;

서열번호 4 의 아마노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 (V _L -CDR1) , 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 (V _L — CDR2) , 및 서열번호 6의 아미노산 서열을 갖는 폴리뎁타이드 (V _L ᅳ CDR3)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 경쇄 상보성 결정 부위 , 또는 상기 하나 이상의 경쇄 상보성 결정 부위를 포함하는 경쇄 가변 영역;

상기 중쇄 상보성 결정 부위와 경쇄 상보성 결정 부위의 조합; 또는 상기 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역의 조합을 포함하는 것일 수 있다.

구체적으로, 항 -DR5 항체 또는 이의 항원 결합 단편은，

서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 (VH-CDRI) , 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 (V _H -CDR2) , 및 서열번호 Ί 내지 서열번호 9로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 (V _H -CDR3)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 부위， 또는 상기 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 부위를 포함하는 중쇄 가변 영역;

서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 (V _L ᅳ CDR1) , 서열번호 10 내지 서열번호 12로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 (V _L — CDR2) , 및 서열번호 13 내지 서열번호 16으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 (V _L — CDR3)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 경쇄 상보성 결정 부위 또는 상기 하나 이상의 경쇄 상보성 결정 부위를 포함하는 경쇄 가변 영역;

상기 중쇄 상보성 결정 부위와 경쇄 상보성 결정 부위의 조합; 또는 상기 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역의 조합을 포함하는 것일 수 있다.

일 구체예에서, 상기 항 -DR5 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 (VH-CDRI) , 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 (V _H — CDR2) , 및 서열번호 7 내지 서열번호 9로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 (V _H -CDR3)를 포함하는 중쇄 가변 영역; 및

서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 (V _L -CDR1) , 서열번호 10 내지 서열번호 12로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 (V _L ᅳ CDR2) , 및 서열번호 13 내지 서열번호 16으로 이루어지는 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 (V _L -CDR3)를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 것일 수 있다.

일구현예에서， 상기 항 -DR5 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 하기 표 2 및 3에 조합된 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역을 포함하는 것일 수 있다.

[표 2】

중쇄의 상보성 결정 부위 서열 번호 번호 번호

1 GFTFSSFNML 2 GIGKSDRYTGYGSAVKG 7 DAGSGCGSGGWTGACIDT

1 GFTFSSFNML 2 GIGKSDRYTGYGSAVKG 8 DAGSPCGSGGWTGACIDT

1 GFTFSSFNML 2 GIGKSDRYTGYGSAVKG 9 DAGSPCGKGGWTGACIDT

【표 3】

경쇄의 상보성 결정 부위 서열

다른 구체예에서， 상기 중쇄 상보성결정부위를 포함하는 중쇄 가변영역， 상기 경쇄 상보성결정부위를 포함하는 경쇄 가변영역， 또는 이들의 조합이 제공된다. 예컨대 , 상기 중쇄 가변영역은 서열번호 17 내지 서열번호 37로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있으며 , 경쇄 가변 영역은 서열번호 38 내지 서열번호 49로 이루어지는 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다ᅳ

따라서 , 상기 항 -DR5 항체 또는 이의 항원 결합 단편은

서열번호 17 내지 서열번호 37로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변영역;

서열번호 38 내지 서열번호 49로 이루어지는 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변영역; 또는

이들의 조합

을 포함하는 것일 수 있다.

일 구체예에서, 상기 항 -DR5 항체는 동물 유래 항체 (예컨대, 마우스 유래 항체)， 키메릭 항체 (예컨대, 마우스 -인간 키메릭 항체)， 또는 인간화 항체일 수 있다. 상기 항체 또는 항원결합단편은 생체로부터 분리된 것 또는 비자연적으로 생산 (non-natural ly occurr ing)된 것일 수 있다. 상기 항체 또는 항원결합단편은 재조합적 또는 합성적으로 생산된 것일 수 있다. 다른 예에서， 상기 항체는 인간을 포함하는 포유동물, 조류 등을 포함한 임의의 동물로부터 유래 (분리)한 것일 수 있다. 예컨대, 상기 항체는 인간, 생쥐, 당나귀， 양, 토끼， 염소 기니피그, 낙타， 말， 또는 닭의 항체일 수 있다. 여기서 인간 항체는 인간 면역글로불린의 아미노산 서열을 가진 항체로서， 인간 면역글로불린 라이브러리로부터 분리된 항체 또는 하나 이상의 인간 면역글로불린에 대하여 형질 이식되고 내재적 면역글로불린은 발현하지 않는 동물로부터 분리된 항체를 포함한다.

항 -DR5 항체는 단클론 항체 또는 다클론 항체일 수 있으며， 예컨대, 단클론 항체일 수 있다. 단클론 항체는 당 업계에 널리 알려진 방법대로 제조될 수 있다. 예컨대, phage display 기법을 이용해서 제조될 수 있다. 또는, 항ᅳ DR5 항체는 마우스 유래의 단클론 항체로 제조될 수 있다.

상기 항 -DR5 항체 또는 이의 항원 결합 단편에서 앞서 정의한 중쇄 CDR 및 경쇄 CDR 부위, 또는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 제외한 나머지 부위는 모든 서브타입의 면역글로블린 (예컨대, IgA, IgD, IgE, IgG (IgGl, IgG2, IgG3, IgG4) , IgM, 등)으로부터 유래한 것일 수 있고， 예컨대, 상기 모든 서브타입의 면역글로불린의 프레임워크 부위, 및 /또는 경쇄 블변 영역 및 /또는 중쇄 불변 영역으로부터 유래한 것일 수 있다.

완전한 항체 (예컨대, IgG 타입)는 2개의 전장 (fuli length) 경쇄 및

2개의 전장 중쇄를 가지는 구조이며， 각각의 경쇄는 중쇄와 이황화 결합으로 연결되어 있다. 항체의 불변 영역은 중쇄 불변 영역과 경쇄 불변 영역으로 나뉘어지며, 중쇄 불변 영역은 감마 ( _Y ), 뮤 ( μ ), 알파 ( α ), 델타 ( δ ) 및 엡실론 ( ε ) 타입을 가지고， 서브클래스로 감마 1( _Υ 1), 감마 2(γ2), 감마 3( γ3), 감마 4( _Υ 4), 알파 1( α1) 및 알파 2( α2)를 가진다. 경쇄의 불변 영역은 카파 ( κ ) 및 람다 (λ) 타입을 가진다.

용어， "중쇄 (heavy chain)' ¹ 는 항원에 특이성을 부여하기 위해 충분한 가변 영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역 도메인 V _H 및 3개의 불변 영역 도메인 C _H1 , C _H2 및 C _H3 과 힌지 (hinge)를 포함하는 전장 중쇄 및 이의 단편을 모두 포함하는 의미로 해석된다. 또한， 용어 "경쇄 (light chain)"는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역 도메인 V _L 및 불변 영역 도메인 C _L 을 포함하는 전장 경쇄 및 이의 단편을 모두 포함하는 의미로 해석된다.

용어 , "상보성결정부위 (complementarity determining region,

CDR)"은 면역글로불린의 중쇄 및 경쇄의 고가변 영역 (hypervariable region)의 아미노산 서열을 의미한다. 중쇄 및 경쇄는 각각 3개의 CDR을 포함할 수 있다 (CDRHl, CDRH2, CDRH3 및 CDRL1, CDRL2, CDRL3). 상기 CDR은 항체가 항원 또는 에피토프에 결합하는 , 데 있어서 주요한 접촉 잔기를 제공할 수 있다. 한편， 본 명세서에 있어서， 용어， "특이적으로 결합" 또는 "특이적으로 인식' '은 당업자에게 통상적으로 공지되어 있는 의미와 동일한 것으로서, 항원 및 항체가 특이적으로 상호작용하여 면역학적 반응을 하는 것을 의미한다.

용어， "항원 결합 단편"은 면역글로불린 전체 구조에 대한 그의 단편으로， 항원이 결합할 수 있는 부분을 포함하는 폴리펩타이드의 일부를 의미한다. . 예를 들어， scFv, (scFv) ₂ , Fab , Fab ' 및 F(ab ' ) ₂ 로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나， 이에 한정되지 않는다.

상기 항원 결합 단편 중 Fab는 경쇄 및 중쇄의 가변영역과 경쇄의 불변 영역 및 중쇄의 첫 번째 불변 영역 (C _H1 )을 가지는 구조로 1개의 항원 결합 부위를 가진다.

Fab '는 중쇄 C _H1 도메인의 C—말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역 (hi nge regi on)을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다.

F( ab ' ) ₂ 항체는 Fab '의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 디설파이드 결합을 이루면서 생성된다. Fv는 중쇄 가변부위 및 경쇄 가변부위만을 가지고 있는 최소의 항체조각으로 Fv 단편을 생성하는 재조합 기술은 당업계에 널리 공지되어 있다.

이중쇄 Fv(two— chain Fv)는 비공유 결합으로 중쇄 가변부위와 경쇄 가변부위가 연결되어 있고 단쇄 Fv(s ingle— chain FV)는 일반적으로 펩타이드 링커를 통하여 중쇄의 가변 영역과 단쇄의 가변 영역이 공유 결합으로 연결되거나 또는 C-말단에서 바로 연결되어 있어서 이중쇄 Fv와 같이 다이머와 같은 구조를 이를 수 있다.

상기 항원 결합 단편은 단백질 가수분해 효소를 이용해서 얻을 수 있고 (예를 들어, 전체 항체를 파파인으로 제한 절단하면 Fab를 얻을 수 있고 펩신으로 절단하면 F( ab ' ) ₂ 단편을 얻을 수 있다) , 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수 있다.

용어 "힌지 영역 (hinge region) "은 항체의 중쇄에 포함되어 있는 영역으로서， CH1 및 CH2 영역 사이에 존재하며 , 항체 내 항원 결합 부위의 유연성 ( f lexi bi l i ty)를 제공하는 기능을 하는 영역을 의미한다.

다른 예는 상기 항 -DR5 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 및 /또는 치료용 약학 조성물을 제공한다. 다른 예는 상기 항 -DR5 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 약학적 유효량을 암의 예방 및 ^' /또는 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 암의 예방 및 /또는 치료 방법을 제공한다. 상기 암의 예방 및 /또는 치료 방법은 상기 투여 단계 이전에 암의 예방 및 /또는 치료를 필요로 하는 환자를 확인 (예컨대， 치료 대상의 진단 또는 선별)하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

항 -DR5 항체는 암의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다. 앞서 설명한 바와 같이, 본 명세서에서 제공되는 항 -DR5 항체는 DR5의 작용제 (agoni st )로서의 기능을 나타내므로， 항ᅳ DR5 항체가 효능 (즉， 암세포 사멸 등의 항암 효능)을 층분히 발휘하기 위해서， 적용 대상 암은 해당 암세포가 DR5를 발현하는 것이 유리할 수 있다. 또한, 상기 암은 TRAIL-민감성 암 또는 TRAIL-저항성 암일 수 있다. 일 예에서， 상기 암은 구체적으로는 혈액암, 폐암, 위암， 간암, 골암, 췌장암, 피부암, 두경부암, 피부 혹색종, 자궁암 난소암, 직장암, 대장암， 결장암， 유방암， 자궁 육종, 나팔관 암종, 자궁내.막 암종, 자궁경부 암종， 질 암종, 외음부 암종, 식도암, 후두암, 소장암， 갑상선암, 부갑상선암， 연조직의 육종, 요도암， 음경암, 전립선암, 만성 또는 급성 백혈병, 유년기의 고상 종양, 분화 림프종, 방광암, 신장암， 신장 세포 암종， 신장 골반 암종, 제 1 중추신경계 림프종， 척수축 종양， 뇌간 신경교종 또는 뇌하수체 아데노마 등을 포함하나， 이에 한정되지 않는다.

일 예에서， 상기 항 -DR5 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 TRAIL과 병용함으로써 .항— DR5 항체 .또는 이의. 항원. 결합 단편만을 사용한 경우와 비교하여 상승된 항암 효과를 얻을 수 있으며， TRAIL—민감성 암뿐 아니라 TRAIL-저항성 암에 대해서도 항암 호과를 얻을 수 있다 (실시예 13 참조) . 따라서, 상기 약학 조성물은, 항ᅳ DR5 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 더하여, TRAIL (TNF— re l ated apoptos i s induc ing l igand)를 추가로 포함하는 것일 수 있다.

즉, 상기 약학 조성물은, 유효성분으로，

( 1) 상기 항 -DR5 항체 또는 이의 항원 결합 단편 ; 및

(2) TRAIL

를 포함하는 것일 수 있다.

상기 약학 조성물은, ( 1) 상기 항 -DR5 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 (2) TRAIL를 하나의 제형으로 제형화하여 포함하거나, 각각 별개의 제형으로 제형화하여 포함하는 것일 수 있다. 또한， 상기 암의 예방 및 /또는 치료 방법은 항— DR5 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 투여하는 단계에 더하여, TRAIL의 약학적 유효량을 투여하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

즉， 상기 암의 예방 및 /또는 치료 방법은 (1) 상기 항— DR5 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 약학적 유효량 및 (2) TRAIL의 약학적 유효량을 암의 예방 및 /또는 치료를 필요로 하는 .환자에게 병용 투여하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.

상기 병용 투여하는 단계는 (1) 상기 항 -DR5 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 약학적 유효량 및 (2) TRAIL의 약학적 유효량을 하나의 제형에 포함시켜 동시에 투여하거나 (1) 상기 항— DR5 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 약학적 유효량 및 (2) TRAIL의 약학적 유효량을 각각 별개의 제형으로 제형화시켜 동시 또는 순서에 상관없이 순차적으로 투여하여 수행될 수 있다.

상기 TRAIL (TNFᅳ related apoptosi s— inducing ligand)는 CD253( cluster of differentiation 253) 또는 TNFSF OCtumor necrosis factor (ligand) super family, member 10)이라고도 불리며' 세포 사멸 (apoptosis) 과정을 유도하는 리간드로서 기능을 갖는 단백질로서, 정상 조직 세포에서 널리 생산 및 분비되는 사이토카인 중 하나이다. 일 예에서， 상기 TRAIL는 인간 유래의 것일 수 있으며， 예컨대， NCBI Accession number NP_001177871.1 , ΝΡ_003801.1 등으로 표현되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

세포사멸 경로를 이용하는 항— DR5 항체 또는 이의 항원 결합 단편 (또는 TRAIL과의 병용)은 Carboplatin 또는 Pacl i taxel (Recka 등， Lung Cancer, 82, 441-448,2013) , Gemci tabin(Torres 등， Cancer Medicine, 2(6), 925-932, 2013) 등의 화학요법약제들로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상과 병용하여 사용됨으로써 항암 /항종양 효과를 보다 향상시킬 수 있다 (실시예 15 참조).

암의 예방 및 /또는 치료를 위하여 상기 항— DR5 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 이를 포함하는 약학 조성물을 단독으로 사용하는 것은 물론， 수술, 호르몬 치료, .약물 치료 및 /또는 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.

일 예에서， 상기 약학 조성물은 항— DR5 항체 또는 이의 항원 결합 단편 (또는 TRAIL과의 조합)과 함께 항암효과를 갖는 공지의 유효성분 (화학요법 약제)을 1종 이상 추가로 함유할 수 있다. 또한 상기 암의 예방 및 /또는 치료 방법은 항— DR5 항체 또는 이의 항원 결합 단편 (또는 TRAIL과의 조합)에 더하여 항암효과를 갖는 공지의 유효성분 (화학요법 약제)을 1종 이상을 함께 투여하는 단계를 포함할 수 있다.

상기 항— DR5 항체 또는 이의 항원결합단편과 함께 사용할 수 있는 화학요법 약제는 카보플라틴 (Carboplatin), 파클리탁셀 (Paclitaxel; Recka 등， Lung Cancer , 82， 441-448, 2013) 등의 알킬화 계열 항암제; 젬시타빈 (Gemcitabin; Torres 등, Cancer Medicine, 2(6)， 925—932， 2013) 등의 대사 길항제 계열 항암제; 독소루비신 (Doxorubicin:; HM Amm 등， Mol Cancer Res April, 9； 403, 2011) 등의 안트라사이클린 계열 항암제; 보테조 ¾ (Bortezomib; Shanker A 등， J Natl Cancer Inst, May 7； 100(9)： 649-62, 2008)등의 프로테아좀 억제제 계열 항암제 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 항 -DR5 항체, 항원결합단편 등의 유효성분은， 적절한 투여를. 위하여 , 1종 이상의 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 상기 약학 조성물에 포함되거나 투여될 수 있다. 상기 약학적으로 허용가능한 담체는 식염수， 멸균수, 링거액, 완층 식염수， 덱스트로오스 용액， 말토 덱스트린 용액， 리세롤, 에탄올， 또는 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액， 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 당분야의 적정한 방법 및 /또는 Remington's Pharmaceutical Science (최근판), Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 적절하게 제제화할 수 있다.

상기 항 -DR5 항체， 항원결합단편 등의 유효성분 또는 약학 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있다. 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 내피 투여， 국소 투여, 비내 투여， 폐내 투여 및 직장내 투여 등으로 투여할 수 있다. 경구 투여시, 단백질 또는 펩타이드는 소화가 되기 때문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화될 수 있다. 또한, 상기 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.

상기 상기 항— DR5 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 약학적 유효량은 제제화 (제형화) 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태， 음식, 투여 시간， 투여 간격, 투여 경로, 배설 속도 및 반웅 감웅성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 예컨대, 상기 항— DR5 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 1일 투여량은 0. 001 내지 lOOOiiig/kg , 구체적으로 0.01 내지 100mg/kg , 보다 구체적으로 0. 1 내지 50 mg/kg , 더욱 구체적으로 0 . 1 내지 20 mg/kg 범위일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 1일 투여량은 단위 용량 형태로 하나의 제제로 제제화되거나, 적절하게 분량하여 제제화되거나， 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 상기 약학 조성물은 다른 약물과 병용 투여 1

5 _. 가능하며, 그 투여량, 투여 방법 및 다른 약물의 종류는 환자의 상태에 따라서 적절하게 처방될 수 있다.

상기 약학적 조성물은 오일 또는 수성 매질중의 용액， 현탁액， 시럽제 또는 유화액 형태이거나 액스제, 산제， 분말제, 과립제， 정제 또는 캅셀제 등의 형태로 제형화될 수 있으며， 제형화를 위하여 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

특히 , 상기 항 -DR5 항체 또는 그 항원 결합 단편을 포함하는 약학 조성물은 항체 또는 항원 결합 단편을 포함하므로, 면역 리포좀으로 제형화될 수 있다. 항체를 포함하는 리포좀은 당업계에 널리 알려진 방법에 따라 제조될 수 있다. 상기 면역 리포좀은 포스파티딜콜린, 콜레스테를 및 폴리에탈렌글리콜 -유도체화된 포스파티딜에탄올아민을 포함하는 지질 조성물로서 역상 증발법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 항체의 Fab ¹ 단편은 디설파이드 -교체 반응을 통해 리포좀에 접합될 수 있다. 한편， 상기 항— DR5 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 DR5에 특이적으로 결합하므로， 이를 이용하여 DR5의 검출 (즉， 존재 여부 및 /또는 수준 (농도) 측정) 및 /또는 DR5 관련 질병 (예컨대, DR5의 존재 여부 또는 농도 변화 (정상군보다 농도 증가 또는 감소의 특징을 갖는 질병) )의 진단에 사용할 수 있다.

따라서 , 일 예는 상기 항 -DR5 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 DR5 검출용 조성물을 제공한다. 또 다른 예는, 생물 시료에 상기 항ᅳ DR5 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 처리하는 단계; 및 항원—항체 반웅 여부를 확인하는 단계를 포함하는 DR5 검출 방법을 제공한다. 이 때, 항원 -항체 반응이 확인되면 상기 생물 시료 내에 DR5이 존재하는 것으로 판단할 수 91고, 항원—항체 반응의 정도를 측정하여 생물 시료 내의 DR5의 수준 (농도)를 측정할 수 있다.

상기 생물 시료는 환자 (예컨대， 인간 등의 포유동물)로부터 얻어진 세포, 조직， 체액， 또는 이들의 배양물 등으로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다. 정상 시료는 DR5 관련 질병을 앓지 않는 환자 (예컨대 인간 등의 포유동물)로부터 얻어진 세포, 조직， 체액， 또는 이들의 배양물 등으로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다.

상기 항원 -항체 반응 여부를 확인하는 단계 또는 항원ᅳ항체 반응을 측정하는 단계는 당업계에 공지된 다양한 방법을 통하여 수행할 수 있다. 예컨대, 통상적인 효소 반웅, 형광, 발광 및 /또는 방사선 검출을 통하여 수행될 수 있으며, 구체적으로, 면역크로마토그래피 ( Immunochromatography) , 면역조직화학염색 ( I睡 unohi stochemi st ry) , 효소결합 면역홉착 분석 (enzyme 1 iked immunosorbent assay : ELISA) , 방사선 면역즉정법 (radi oimmunoassay: RIA) , 효소 면역분석 (enzyme immunoassay : EIA) , 형광면역분석 (Fl oresence immunoassay: FIA) , 발광면역'분석 ( luminescence immunoassay : LIA) , 웨스턴블라팅 (Western blot t ing) 등으로 이루어진 군으로부터 선택된 방법에 의하여 측정될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

다른 예에서,

앞서 설명한 항 -DR5 항체의 중쇄 상보성 결정 부위를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 경쇄 상보성 결정 부위를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드， 또는 이들의 조합; 중쇄 가변 영역을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 경쇄 가변 영역을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 또는 이들의 조합; 또는 중쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드， 경쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 또는 이들의 조합,

상기 폴리뉴클레오타이드 또는 이들의 조합을 포함하는 재조합 백터, 및

상기 재조합 백터를 포함하는 재조합 세포가 제공된다.

일 예에서， 상기 재조합 백터는 항ᅳ DR5 항체의 중쇄 상보성 결정 부위 및 경쇄 상보성 결정 부위; 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역; 또는 중쇄. 및 경쇄를 암호화하는 각각의 폴리뉴클레오타이드를 별개의 백터에 각각 포함하거나 하나의 백터에 함께 포함하는 것일 수 있다.

용어 "백터 (vector ) "는 숙주 세포에서 목적 유전자를 발현시키기 위한 수단을 의미한다. 예를 들어, 플라스미드 백터, 코즈미드 백터 및 박테리오파아지 백터, 아데노바이러스 백터， 레트로바이러스 백터 및 아데노 -연관 바이러스 백터와 같은 바이러스 백터를 포함한다. 상기 재조합 백터로 사용될 수 있는 백터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드 (예를 들면， pSClOl, pGV1106, pACYC177, ColEl, pKT230, ρΜΕ290, pBR322, pUC8/9, pUC6, pBD9, pHC79, pIJ61, pLAFRl , pHV14, pGEX 시리즈， pET 시리즈 및 PUC19 등)， 파지 (예를 들면, λ^4λΒ, λ -Charon, λ Δζΐ 및 M13 등) 또는 바이러스 (예를 들면, SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있다.

상기 재조합 백터에서 상기 단백질 복합체를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 프로모터에 작동적으로 연결될 수 있다. 용어 "작동 가능하게 연결된 (operatively linked)"은 뉴클레오타이드 발현 조절 서열 (예를 들어, 프로모터 서열)과 다른 뉴클레오타이드 서열 사이의 기능적인 결합을 의미한다. 상기 조절 서열은 "작동 가능하게 연결 (operatively 1 inked)"됨으로써 다른 뉴클레오타이드 서열의 전사 및 /또는 해독을 조절할 수 있다.

상기 재조합 백터는， 전형적으로 클로닝을 위한 백터 또는 발현을 위한 백터로서 구축될 수 있다. 상기 발현용 백터는 당업계에서 식물, 동물 또는 미생물에서 외래의 단백질을 발현하는 데 사용되는 통상의 것을 사용할 수 있다. 상기 재조합 백터는 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있다.

상기 재조합 백터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 예를 들어， 사용되는 백터가 발현 백터이고,. 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터 (예를 들어， pL ^A 프로모터 , CMV 프로모터 , trp 프로모터 , lac 프로모터 , tac 프로모터， T7 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사 /해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는， 백터에 포함되는 진핵 세포에서 작동하는 복제원점은 fl 복제원점, SV40 복제원점ᅳ pMBl 복제원점, 아데노 복제원점， MV.복제원점 및 BBV 복제원점 등을 포함하나， 이에 한정되는 것은 아니다. 또한， 포유동물 세포의 게놈으로부터 유래된 프로모터 (예를 들어, 메탈로티오닌 프로모터) 또는 포유동물 바이.러스로부터 유래된 프로모터 (예를 들어, ^: 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터， 사이토메갈로바이러스 프로모터 및 HSV의 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다. 상기 재조합 세포는 상기 재조합 백터를 적절한 숙주 세포에 도입시킴으로써 얻어진 것일 수 있다. 상기 숙주세포는 상기 재조합 백터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 또는 발현시킬 수 있는 세포로서 당업계에 공지된 어떠한 숙주 세포도 이용할 수 있으며, 원핵 세포로는， 예를 들어， E. coli , 바실러스 서브틸리스， 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있으며， 진핵 세포에 형질 전환시키는 경우에는 숙주 세포로서， 효 S—( Saccharomyce cerevisiae) , 곤충 세포， 식물 세포 및 동물 세포， 예를 들어, Sp2/0 , CHO(Chinese hamst er ovary) l , CHO DG44 , PER . C6 , l38 , BHK , COS-7 , 293 , HepG2 , Huh7 , 3T3 , RIN , MDCK 세포주 등이 이용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 폴리뉴클레오타이드 또는 이를 포함하는 재조합 백터의 숙주 세포.내로의 운반 (도입)은， 당업계에 널리 알려진 운반 방법을 사용할 수 있다. 상기 운반 방법은 예를 들에 숙주 세포가 원핵 세포인 경우, CaCl ₂ 방법 또는 전기 천공 방법 등을 사용할 수 있고, 숙주 세포가 진핵 세포인 경우에는， 미세 주입법， 칼슴 포스페이트 침전법, 전기 천공법, 리포좀- 매개 형질감염법 및 유전자 밤바드먼트 등을 사용할 수 있으나, 이에 한정하지는 않는다.

상기 형질 전환된 숙주 세포를 선별하는 방법은. 선택 표지에 의해 발현되는 표현형을 이용하여, 당업계에 널리 알려진 방법에 따라 용이하게 실시할 수 있다. 예를 들어， 상기 선택 표지가 특정 항생제 내성 유전자인 경우에는， 상기 항생제가 함유된 배지에서 형질전환체를 배양함으로써 형질전환체를 용이하게 선별할 수 있다. ·

다른 예는 상기 폴리뉴클레오타이드 또는 재조합 백터를, 예컨대 적절한 숙주세포에서, 발현시키는 단계를 포함하는 항 -DR5 항체 또는 이의 항원결합단편의 제조 방법을 제공한다. 일 예에서， 상기 제조 방법은 상기 폴리뉴클레오타이드 또는 재조합 백터를 포함하는 세포를 배양하는 단계; 및 임의로, 생산된 항체를 분리 및 /또는 정제하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.

【발명의 효과】

본 발명은 DR5에 대한 표적 치료용 항 -DR5 항체를 제공하는 것으로， 본 발명의 항체는 TRAIL 농도와 상관없이 일정 수준의 항원 결합을 유지하는 TRAIL 비경쟁적 항체인 바, 기존의 항체 약물보다 우수한 효과를 지닌 혁신적인 항체 신약 또는 진단제로서 유용하게 개발될 수 있다. 【도면의 간단한 설명】

도 1은 항체 DO 의 결합속도 및 해리속도를 분석한 결합 및 해리 센소그램을 도시한 것이다.

도 2a 내지 도 2f 는 항체 DO 및 DA1 내지 DA35의 DR5에 대한 결합력을 대조군 AP와 비교한 실험 결과 그래프이다.

도 3a 및 도 3b는 본 발명에 따른 예시적인 항체의 SDS- 폴리아크릴아미드젤 전기영동 (SDS-PAGE) 분석 결과를 나타낸다.

도 4a 내지 도 4h는 본 발명에 따른 예시적인 항체의 크기 배제 크로마토그래피 (s i ze exc lus ion chromatography, SEC) 분석결과를 나타내는 그래프이다.

도 5는 본 발명에 따른 항체의 약동학적 지표값을 산출한 결과를 나타낸다ᅳ

도 6a 내지 도 6ι "은 본 발명에 따른 항체가 종양 세포 사멸 활성을 갖는 것을 나타내는 결과이다.

도 7a 및 도 7b 는 이종이식 동물모델에서 본 발명에 따른 항체의 종양 성장 억제 효과를 나타내는 결과이다.

도 8a 및 도 8b는 본 발명에 따른 항체가 TRAIL 비경쟁적으로 DR5에 결합함을 보여주는 실험 결과이다.

도 9a 및 도 9b는 본 발명에 따른 항체가 TRAIL과 병용시 상승효과가 있음을 보여주는 세포 사멸 유도 실험 결과이다.

도 10a 내지 도 10c는 본 발명에 따른 항체가 apoptos i s로 세포사멸을 유도하는 것을 보여주는 Caspase 활성 측정 결과이다.

도 11a 및 도 lib는 항체를 일정 농도의 젬시타빈과 병용 처리시 세포 사멸 활성을 나타내는 결과이다. 【발명을 실시하기 위한 형태】

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 ^ᅵ 설명하기 위해 제공되는 것이다. 실시예 1.DR5 면역 및 cDNA 라이브러리 제작

DR5에 특이적으로 결합하는 항체를 선별하기 위하여， 동물 면역 항체 라이브러리를 구축하였다. 상기 라이브러리는 항원을 면역한 동물의 면.역세포로부터 mRNA를 얻은 후 항체 유전자의 프라이머 조합을 이용한 PCR을 ^ᅵ 통해 항체 유전자를 증폭시키고 이를 파아지 디스플레이 백터로 클로닝하여 제작되었다.

구체적으로， 화이트 레그흔 종의 닭 3마리에 인간 DR5 (R&D systems, 미국)를 완전 프로인트 보강제 (complete Freund's adjuvant) 및 불완전 프로인트 보강제 (Sigma, 미국)와 흔합하여 3주 간격으로 5회 피하 주사하였다. 면역한 동물의 혈청을 얻은 후, PBSB(3% 우 혈청 알부민을 포함하는 인산완충용액)를 이용하여 1:100, 1:500, 1： 2500 및 1:12500의 농도로 희석하여 보관한 후， 인간 DR5의 결합여부를 효소면역측정법으로 확인하였다. ELISA 플레이트에 인간 DR5 (R&D systems, 미국) lug/ml을 4 ^° C에서 밤새 코팅한 후, 상기에서 희석한 혈청을 넣고 2시간 동안 반웅시켰다. PBST(0.1% tween— 20을 포함하는 PBS)로 3회 세척한 후, 항-닭 면역글로불린ᅳ HRP(horse radish peroxidase)(l:3000)를 넣고 _. 1시간 동안 반응시켰다. PBST로 3회 세척한 후 ABTS(Thermo, 미국)을 넣고 20분 동안 발색시킨 후 405 nm에서의 흡광도를 마이크로플레이트 리더 (mi crop late reader)로 측정하였다. 면역 전 혈청은 DR5와 결합하지 않았으며, 인간 DR5에 강하게 결합하는 혈청을 생산하는 동물을 선별하였다.

마지막 주사 후 5일 후에 선별된 닭의 골수, 지라 및 파브리시우스낭 조직을 채취하였다. 조직을 10ml TRI 시약 (Molecular research center, 미국)과 흔합하여 호모게나이저로 분쇄한 후 20ml TRI 시약을 추가한 후 원심 분리하여 상층액을 얻었다. 여기에 1-브로모—3-클로로프로판(1-1 0^10- 3-chloropropane, BCP) 3ml을 넣고 원심 분리하여 상층액을 얻었다. 이소프로판올 15ml로 전체 RNA를 침전시켜 얻었다. 랜덤 핵사머 (random hexamer)를 프라이머로 이용하여 수퍼스크립트 전사 시스템 (Invitrogen, 미국)을 이용하여 역전사 반응 (65 ^° C에서 5분; 4 ^° C에서 5분; 50 ^° C에서 50분; 85 ^° C에서 5분; 및 4 ^° C)을 수행하였다. 역전사 반웅의 결과물인 cDNA를 포함하는 반웅액 5uKmicroliter)를 1% 아가로스 젤에 전기 영동하여 다양한 길이의 cDNA 밴드를 확인하였다. 실시예 2. 항체 라이브러리 제작

(2-1) 면역 항체 유전자 증폭

닭 항체의 중쇄와 경쇄의 가변영역인 V _H 와 V _L 도메인을 증폭하기 위하여 다음과 같이 PCR 반응을 수행하였다. PCR 반옹은 상기 실시예 1에서 제조한 cDNA를 주형으로 하여， 중쇄 가변영역， _. 경쇄 가변영역 및 이를 연결한 scFv(single chain Fv) 영역에 맞게 고안된 하기 표 4의 프라이머 조합을 이용하였다. V _H 및 V _L 각각의 cDNA 라이브러리 0.5ul, 30 pmole 순방향 프라이머, 30 pmole 역방향 프라이머, 10x PCR 버퍼, 200 uM dNTPs 및 0.5ul Taq DNA 폴리머라제를 흔합하여 최종 50 ul를 맞추어 준 후, 94 ^° C에서 5분 반웅시킨 후， 94 ^° C에서 15초， 56 ^° C에서 30초 및 72 ^° C에서 90초간 반응시키는 과정을 30사이클 반복하였다. PCR 증폭된 항체 DNA를 1% 아가로스 젤에 전기 영동하여 증폭된 DNA를 각각의 크기에 따라 분리하고， 겔 추출 키트 (Gel extraction kit, Qiagen, 미국)를 이용하여 정제하였다.

scFv DNA를 얻기 위해， .정제된 V _H 50ng, V _L 50ng DNA를 주형으로 하여 30 pmole 순방향 프라이머， 30 pmole 역방향 프라이머， 10x PCR 버퍼， 200 uM dNTPs 및 0.5 ul Taq DNA 폴리머라제를 흔합하여 최종 50 ul를 맞추어 준 후 94;C에서 5분 반응시키고， 94 ^° C에서 30초， 56 ^° C에서 30초 및 72 ^° C에서 2분간 반응시키는 과정을 20사이클 반복하여 PCR을 수행하였다. 상기 PCR을 통해 증폭된 DNA를 1% 아가로스 젤에 전기 영동하여 각각의 증폭된 DNA를 크기에 따라 분리하고, 겔 추출 키트 (Gel extraction kit, Qiagen, 미국)를 이용하여 정제하였다.

상기 PCR 반웅에 사용된 프라이머를 아래의 표 4에 정리하였다:

【표 4】

PCR 반응에 사용된 프라이머

o o GAG GAG GAG GAG GAG GAG GTG GCC CAG GCG GCC CTG ACT CAG 54 scFV GAG GAG GAG GAG GAG GAG GAG CTG GCC GGC CTG GCC ACT AGT

ΰ c 55 GGA GG

(2-2) 항체 DNA의 제한효소 절단

상기에서 제조된 scFv와 파지미드 백터인 pComb3X(the Scripps Research Institute, CA, 미국)를 제한효소 Sfil (Roche, 미국)로 절단하였다. scFv를 코딩하는 PCR 절편 10ug, 360 units Sfil (Roche, 미국), 20ul IOX 버퍼를 넣고 최종 볼륨이 200ul가 되게 하여 50 ^° C에서 밤샘 반응시켰다. 또한, pComb3X 백터 20ug, 120 units Sfil 및 20ul IOx buffer를 넣고 최종 볼륨이 200ul가 되게 하여 50 ^° C에서 밤샘 반웅시켰다. 상기 제한효소로 절단한 각각의 절편을 아가로스 젤에 전기영동한 후 겔 추출 키트 (Qiagen, 미국)를 이용하여 정제하였다.

(2-3) 항체 DNA의 라이게이션 및 라이브러리의 제조

scFv 절편을 _P Comb3X 백터에 삽입하기 위하여， 상기 (2-2)에서 제한효소 Sfil을 이용하여 절단한 scFv를 코딩하는 PCR 절편 700ng 및 pComb3X 1.4ug을 흔합하고, T4 DNA 라이게이즈 ( Invi trogen, 미국)를 첨가하여 16 ^° C에서 밤새 반응시켰다. 상기 라이게이션 흔합물을 에탄올 침강법으로 정제하고, 대장균 ER2738( New England Biolab, 미국)에 전기 천공법 (electroporation)으로 형질 전환시켜 46ug/ml 카베니실린 및 70ug/ml 카나마이신 하에서 배양하여 5 xlO ⁹ complexity를 가진 라이브러리를 제작하여 이용하였다. 실시예 3. 항 -DR5 scFv를 포함하는 파지 클론의 선별

상기 실시예 2에서 수득한 scFV의 형태로 랜덤화된 중쇄와 경쇄를 갖는 라이브러리로부터 인간 DR5에 결합하는 항체를 고체에 지지된 DR5를 이용하여 선별하였다.

(3-1) DR5에 결합하는 항체 선별

먼저, 마그네틱 비드에 인간 DR5 (R&D systems, 미국) lOug(microgram)을 컨쥬게이션시켰다. 상기 실시예 2에서 수득한 scFv 형태의 항체를 파아지의 코트 단백질 PIII와 융합하여 파아지 표면에 발현될 수 있게 만들어진 항체 라이브러리 DNA를 대장균 ER2738(New Engl and Biol ab)에 전기천공법으로 형질전환시키고, 37 ^° C에서 배양 후 VCSM13 헬퍼 파지 (Stratagene , 미국)를 넣은 후 46ug/ml 카베니실린과 7.0ug/ml 카나마이신을 넣고 SB 배지 (30g/L 트립톤 , 20g/L 효모 추출물 및 10g/L MOPS , pH 7.0)에서 밤새 배양하였다. 상기에서 수득한 대장균과 파아지를 포함하는 배양액을 원심분리하여 침전된 대장균을 제거하였다. 상등액만을 회수한 후 , 40mg/ml 폴리에틸렌글리콜 8000과 30mg/ml NaCl을 첨가하고 원심 분리하여 PEG에 의해 침전된 파아지를 모아 PBS로 재 현탁하였다. 마그네틱 비드에 컨쥬게이션된 인간 DR5와 파아지를 상온에서 2시간 동안 반웅시킴으로써 DR5 에 친화력을 가진 파아지를 결합시킨 후， 이를 0.5% Tween 20을 포함하는 PBS로 세척하고， 0. 1M 글리신 (pH 2.2)용액으로 용출하고 2M 트리스 용액으로 중화시켰다. 용출된 파아지는 다음 라운드 패닝 (panning)을 위해 대장균 ER2738에 감염시켜 밤새 배양하여 증식시켰다ᅳ 이러한 과정을 4차례 반복하며 패닝 (panning)을 진행하였다. 반복적인 패닝 단계를 통해 결합력이 높은 _. 파아지를 축적하였다. 4차 패닝 결과물의 플레이트로부터 선별된 개별 클론을 96 딥웰 (deep wel l ) 플레이트에서 100ug/ml 카베니실린， 70ug/ml 카나마이신 및 VCSM13 헬퍼 파아지 ( 1 : 1000)를 넣고 37 ^° C에서 밤새 배양하여 항체가 발현된 파아지의 증식을 유도하였다. 상기에서 수득한 배양액을 원심분리하여 얻어진 배지 상등액 내 파아지와 TRAIL을 미리 결합시킨 후 이를 DR5가 코팅되어 있는 ELISA 플레이트에 넣고 37 ^° C에서 2시간 동안 배양하였으며, HRP가 컨쥬게이션되어 있는 항 -M13 항체를 이용하여 DR5에 결합하는 항체를 ELISA로 확인하였다.

(3-2) 선별된 항체의 시퀀싱

상기 (3-1)의 선별조건에서 인간 DR5에 양성 시그널을 나타내는 클론을 가지고 있는 ER2738을 SB 배지로 밤새 배양한 후 원심분리하여 대장균을 얻는다. DNA 미니 프랩 키트 (진올， 한국)를 이용하여 플라스미.드 DNA를 얻어 염기서열을 분석하였다ᅳ 염기서열 결정을 위해 하기 표 5에 나타낸 바와 같은 시퀀싱 프라이머를 이용하여 분^하였다.

【표 5】

PCR 반응에 사용된 프라이머

프라이머 서열 서열번호 o o o ACA CTT TAT GCT TCC GGC TC 56

역 ^H ¾ CAA AAT CAC CGG AAC CAG AG 57 실시예 4. 항체최적화 - 인간화 및 친화도 개선

동물 면역 항체라이브러리로부터 얻은 항체 클론들 중 친화도와 활성이 우수한 모클론 DO ( chimer i c ant i body)을 선별한 후, 이 항체의 프레임워크를 인간 항체 프레임워크로 변환하는 과정을 진행하였다 (Ni shi bor i et al . , Molecular Immunology, 43 (2006) ) . 또한, 친화도 개선을 위해 중쇄 및 경쇄영역의 CDR의 서열을 랜덤화시켜 새로운 파아지 라이브러리를 제작하였다. 상기 실시예 2와 같은 방법으로 수득한 파아지 라이브러리를 마그네틱 비드에 고정시킨 인간 DR5 10ug과 상온에서 2시간 반응시킨 후 0 . 5% Tween 20을 포함하는 PBS로 5회 세척하였다. 세척 후 결합되어 있는 파아지를 0. 1M 글리신 (pH 2 .2) 용액으로 용출하고 2M 트리스 용액으로 중화시켰다. 2차 패닝 시에는 마그네틱 비드에 인간 DR5 lug를 고정하고 Tween 20을 포함하는 PBS로 10회 세척하고 3차 패닝 시에는 마그네틱 비드에 인간 DR5 O . lug를 고정하고 Tween 20을 포함하는 PBS로 20회 세척하여 선택 압력을 증가시켰다. 위와 같은 인간화 및 친화도 향상 방법 외에, 모클론의 가변영역의 프레임워크 서열에서 인체 면역세포에서 높은 면역성을 보일 것으로 예측되는 아미노산을 치환시킨 탈면역화 변이체들도 제작하였다. 상기와 같이 인간화 또는 탈면역화 과정을 거친 모클론의 변이 클론들을 "DA1 내지 DA35 ¹ '으로 명명하였다.

상기 D0 및 DA1 내지 DA35 클론으로부터 얻어진 상보성결정부위 및 가변영역의 서열을 아래의 표 6 내지 9에 정리하였다:

【표 6】

중쇄의 상보성 결정 부위 서열

DA7 1 GFTFSSFNML 2 GIGKSDRYTGYGSAVKG 7 DAGSGCGSGGWTGACIDT

DA8 1 GFTFSSFNML 2 GIGKSDRYTGYGSAVKG 7 DAGSGCGSGGWTGACIDT

DA9 1 GFTFSSFNML 2 GI GKSDRYTGYGSAVKG 7 DAGSGCGSGGWTGACIDT

DA 10 1 GFTFSSFNML 2 G IGKSDRYTGYGSAVKG 7 DAGSGCGSGGWTGACI DT

DA 11 1 GFTFSSFNML 2 GIGKSDRYTGYGSAVKG 7 DAGSGCGSGGWTGACIDT

DA 12 1 GFTFSSFNML 2 GIGKSDRYTGYGSAVKG 7 DAGSGCGSGGWTGACIDT

DA13 1 GFTFSSFNML 2 GIGKSDRYTGYGSAVKG 7 DAGSGCGSGGWTGACIDT

DA 14 1 GFTFSSFNML 2 GIGKSDRYTGYGSAVKG 7 DAGSGCGSGGWTGACIDT

DA 15 1 GFTFSSFNML 2 GIGKSDRYTGYGSAVKG 7 DAGSGCGSGGWTGACIDT

DA 16 1 GFTFSSFNML 2 GIGKSDRYTGYGSAVKG 7 DAGSGCGSGGWTGACIDT

DA17 1 GFTFSSF丽 L 2 GIGKSDRYTGYGSAVKG 7 DAGSGCGSGGWTGACIDT

DA18 1 GFTFSSFNML 2 GIGKSDRYTGYGSAVKG 7 DAGSGCGSGGWTGACIDT

DA 19 1 GFTFSSFNML 2 GIGKSDRYTGYGSAVKG 7 DAGSGCGSGGWTGACIDT

DA20 1 - GFTFSSFNML 2 G IGKSDRYTGYGSAVKG 7 DAGSGCGSGGWTGACIDT

DA21 1 GFTFSSFNML 2 G IGKSDRYTGYGSAVKG 7 DAGSGCGSGGWTGAC IDT

DA22 1 GFTFSSFNML 2 GIGKSDRYTGYGSAVKG 8 DAGSPCGSGGWTGACIDT

DA23 1 GFTFSSFNML 2 G IGKSDRYTGYGSAVKG 9 DAGSPCGKGGWTGACIDT

DA24 1 GFTFSSFNML ^• 2 GI GKSDRYTGYGSAVKG 7 DAGSGCGSGGWTGACIDT

DA25 1 GFTFSSFNML 2 GIGKSDRYTGYGSAVKG 7 DAGSGCGSGGWTGACIDT

DA26 1 GFTFSSFNML 2 GIGKSDRYTGYGSAVKG 7 DAGSGCGSGGWTGACIDT

DA27 1 GFTFSSFNML 2 GIGKSDRYTGYGSAVKG 7 DAGSGCGSGGWTGACIDT

DA28 1 GFTFSSFNML 2 GIGKSDRYTGYGSAVKG 7 DAGSGCGSGGWTGACIDT

DA29 1 GFTFSSF醒 L 2 GIGKSDRYTGYGSAVKG 7 DAGSGCGSGGWTGACIDT

DA30 1 GFTFSSFNML 2 GIGKSDRYTGYGSAVKG 7 DAGSGCGSGGWTGACIDT

DA31 1 GFTFSSFNML 2 G IGKSDRYTGYGSAVKG 7 DAGSGCGSGGWTGACI DT

DA32 1 GFTFSSFNML 2 GIGKSDRYTGYGSAVKG 7 DAGSGCGSGGWTGACIDT

DA33 1 GFTFSSFNML 2 GIGKSDRYTGYGSAVKG 7 DAGSGCGSGGWTGACIDT

DA34 1 GFTFSSFNML 2 G IGKSDRYTGYGSAVKG 7 DAGSGCGSGGWTGAC IDT

DA35 1 GFTFSSFNML 2 GI GKSDRYTGYGSAVKG 7 DAGSGCGSGGWTGACIDT

【표 7】

경쇄의 상보성 결정 부위 서열

DA5 4 SGGDSYAGSYYYG 10 NNNNRPS 13 GSRDSSYVGI

DA6 4 SGGDSYAGSYYYG 10 NNNNRPS 13 GSRDSSYVGI

DA7 4 SGGDSYAGSYYYG 10 NNNNRPS 13 GSRDSSYVGI

DA8 4 SGGDSYAGSYYYG 10 NNNNRPS 13 GSRDSSYVGI

DA9 4 SGGDSYAGSYYYG 10 NNNNRPS 13 GSRDSSYVGI

DA 10 4 SGGDSYAGSYYYG 10 NNNNRPS 13 GSRDSSYVGI

DA11 4 SGGDSYAGSYYYG 10 . NNNNRPS 13 GSRDSSYVGI

DA12 4 SGGDSYAGSYYYG 11 NNNLMP 13 GSRDSSYVGI

DA13 4 SGGDSYAGSYYYG 10 NNNNRPS 14 GSRDSAGMGA

DAW 4 SGGDSYAGSYYYG 12 NNNNKAK 13 GSRDSSYVGI

DA 15 4 SGGDSYAGSYYYG 10 NNNNRPS 15 GSRDSDGGGR

DA16 4 SGGDSYAGSYYYG 10 NNNNRPS 16 GSRDSSGAGG

DA 17 4 SGGDSYAGSYYYG 12 NNNNKAK 13 GSRDSSYVGI

DA 18 4 SGGDSYAGSYYYG 10 NNNNRPS 15 GSRDSDGGGR

DA 19 4 SGGDSYAGSYYYG 11 NNNNLMP 13 GSRDSSYVGI

ΌΑ20 4 SGGDSYAGSYYYG 10 NNNNRPS 14 GSRDSAGMGA

DA21 4 SGGDSYAGSYYYG 10 NNNNRPS 16 GSRDSSGAGG

DA22 4 SGGDSYAGSYYYG 10 NNNNRPS 13 GSRDSSYVGI

DA23 4 SGGDSYAGSYYYG 10 NNNNRPS 13 GSRDSSYVGI

DA24 4 SGGDSYAGSYYYG 10 NNNNRPS 13 GSRDSSYVGI

DA25 4 SGGDSYAGSYYYG 1 ^. 0 NNNNRPS 13 GSRDSSYVGI

DA26 4 SGGDSYAGSYYYG 10 NNNNRPS 13 GSRDSSYVGI

DA27 4 SGGDSYAGSYYYG 10 NNNNRPS 13 GSRDSSYVGI

DA28 4 SGGDSYAGSYYYG 10 NNNNRPS 13 GSRDSSYVGI

DA29 4 SGGDSYAGSYYYG 10 NNNNRPS 13 GSRDSSYVGI

DA30 4 SGGDSYAGSYYYG 10 NNNNRPS 13 GSRDSSYVGI

DA31 4 SGGDSYAGSYYYG 10 NNNNRPS 13 GSRDSSYVGI

DA32 4 SGGDSYAGSYYYG 10 NNNNRPS 13 GSRDSSYVGI

DA33 4 SGGDSYAGSYYYG 10 NNNNRPS 13 GSRDSSYVGI

DA34 4 SGGDSYAGSYYYG 10 NNNNRPS 13 GSRDSSYVGI

DA35 4 SGGDSYAGSYYYG 10 NNNNRPS 13 GSRDSSYVGI

【표 8】

중쇄 가변영역 서열

EVQLVESGG WVRQA GIGKSD RFTISRDDSKST DAGSGCG

GFTFS WGQGTL

DAI GLVQPGGSL PGKGL YTGYG VYLQMNSLRAED SGGWTGA 18

SFNML VTVSS RLSCAAS EWVA SAVKG TAVYYCVR CIDT

EVQLVESGG WVRQA GIGKSD RFTISRDDSKST DAGSGCG

GFTFS WGQGTL

DA2 GLVQPGGSL PGKGL RYTGYG VYLQMNSLRAED SGGWTGA 18

SFNML VTVSS RLSCAAS EWVA SAVKG TAVYYCVR CIDT

EVQLVESGG WVRQA GIGKSD RFTISRDTSKST DAGSGCG

GFTFS WGQGTL

DA3 GLVQPGGSL PGKGL RYTGYG VYLQMNSLRAED SGGWTGA 19

SFNML VTVSS RLSCAAS EWVA SAVKG TAVYYCVR CIDT

EVQLVESGG ffVRQA GIGKSD RFTISRDDS NT DAGSGCG

GFTFS WGQGTL

DA4 GLVQPGGSL PGKGL RYTGYG VYLQMNSLRAED SGGWTGA 20

SFNML VTVSS RLSCAAS EWVA SAVKG TAVYYCVR CIDT

EVQLVESGG . WVRQA GIGKSD RFTISRDDSKST DAGSGCG

GFTFS WGQGTL

DA5 GLVQPGGSL PGKGL RYTGYG AYLQMNSLRAED SGGWTGA 21

SFNML VTVSS RLSCAAS EWVA SAVKG TAVYYCVR CIDT

EVQLVESGG WVRQA GIGKSD RFTISRDDSKST DAGSGCG

GFTFS WGQGTL

DA6 GLVQPGGSL PGKGL RYTGYG VYLQMNSLRAED SGGWTGA 22

SFNML VTVSS RLSCAAS EWVA SAVKG TAVYYCAR CIDT

EVQLVESGG WVRQA GIGKSD RFTISRDDSKST DAGSGCG

GFTFS WGQGTL

DA7 GLVQPGGSL PGKGL RYTGYG VYLQMNSLRAED SGGWTGA 23

SFNML VTVSS RLSCAAS EWVA SAVKG TAVYYCSR CIDT

EVQLVESGG WVRQA GIGKSD RFTISRDDSKST DAGSGCG

GFTFS WGQGTL

DA8 GLVQPGGSL PGKGL RYTGYG VYLQMNSLRAED SGGWTGA 18

SFNML VTVSS RLSCAAS EWVA SAVKG TAVYYCVR CIDT

EVQLVESGG WVRQA GIGKSD RFTISRDDSKST DAGSGCG

GFTFS WGQGTL

DA9 GLVQPGGSL PGKGL RYTGYG LYLQ删 SLRAED SGGWTGA 24

SFNML VTVSS RLSCAAS EWVA SAVKG TAVYYCVR CIDT

EVQLVESGG WVRQA GIGKSD RFTISRDTSKNT DAGSGCG

GFTFS WGQGTL

DA 10 GLVQPGGSL PGKGL RYTGYG AYLQMNSLRAED SGGWTGA 25

SFNML VTVSS RLSCAAS EWVA SAVKG TAVYYCSR CIDT

EVQLVESGG WVRQA GIGKSD RFTISRDTSKNT DAGSGCG

GFTFS WGQGTL

DA11 GLVQPGGSL PGKGL RYTGYG AYLQ删 SLRAED SGGWTGA 26

SFNML VTVSS RLSCAAS EWVA SAVKG TAVYYCAR CIDT

EVQLVESGG WVRQA GIGKSD RFTISRDTSKNT DAGSGCG

GFTFS WGQGTL

DA 12 GLVQPGGSL PGKGL RYTGYG AYLQMNSLRAED SGGWTGA 27

SFNML VTVSS RLSCAAS EWVA SAVKG TAVYYCSR CIDT

EVQLVESGG WVRQA GIGKSD RFTISRDTSKNT DAGSGCG

GFTFS WGQGTL

DA 13 GLVQPGGSL PGKGL RYTGYG AYLQMNSLRAED SGGWTGA 27

SFNML VTVSS RLSCAAS EWVA SAVKG TAVYYCSR CIDT EVQLVESGG WVRQA GIGKSD RFTISRDTSKNT DAGSGCG

GFTFS WGQGTL

DA 14 GLVQPGGSL PGKGL RYTGYG AYLQMNSLRAED SGG TGA 27

SFNML VTVSS RLSCAAS EWVA SAVKG TAVYYCSR CIDT

EVQLVESGG WVRQA GIGKSD RFTISRDTSKNT DAGSGCG

GFTFS WGQGTL

DA 15 GLVQPGGSL PGKGL RYTGYG AYLQMNSLRAED SGGWTGA 27

SFNML VTVSS RLSCAAS EWVA SAVKG TAVYYCSR CIDT

EVQLVESGG WVRQA GIGKSD RFTISRDTSKNT DAGSGCG

GFTFS WGQGTL

DA 16 GLVQPGGSL PGKGL RYTGYG AYLQMNSLRAED SGGWTGA 27

SFNML VTVSS RLSCAAS EWVA SAVKG TAVYYCSR CIDT

EVQLVESGG WVRQA GIGKSD RFTISRDDSKST DAGSGCG

GFTFS WGQGTL

DA 17 GLVQPGGSL PGKGL RYTGYG VYLQMNSLRAED SGGWTGA 18

SFNML VTVSS RLSCAAS EWVA SAVKG TAVYYCVR CIDT

EVQLVESGG WVRQA GIGKSD RFTISRDDSKST DAGSGCG

GFTFS WGQGTL

DA 18 GLVQPGGSL PGKGL RYTGYG VYLQMNSLRAED SGGWTGA 18

SFNML VTVSS RLSCAAS EWVA SAVKG TAVYYCVR CIDT

EVQLVESGG WVRQA GIGKSD RFTISRDDSKST DAGSGCG

GFTFS WGQGTL

DA 19 GLVQPGGSL PGKGL RYTGYG VYLQMNSLRAED SGGWTGA 18

SFNML VTVSS RLSCAAS EWVA SAVKG TAVYYCVR CIDT

EVQLVESGG WVRQA GIGKSD RFTISRDDSKST DAGSGCG

GFTFS WGQGTL

DA20 GLVQPGGSL PGKGL RYTGYG VYLQMNSLRAED SGGWTGA 18

SFNML VTVSS RLSCAAS EWVA SAVKG TAVYYCVR CIDT

EVQLVESGG WVRQA GIGKSD RFTISRDDSKST DAGSGCG

GFTFS WGQGTL

DA21 GLVQPGGSL PGKGL RYTGYG VYLQMNSLRAED SGGWTGA 18

SFNML VTVSS RLSCAAS EWVA SAVKG TAVYYCVR CIDT

EVQLVESGG WVRQA GIGKSD RFTISRDDSKST DAGSPCG

GFTFS WGQGTL

DA22 GLVQPGGSL PGKGL RYTGYG VYLQMNSLRAED SGGWTGA 28

SFNML VTVSS RLSCAAS EWVA SAVKG TAVYYCVR CIDT

EVQLVESGG WVRQA GIGKSD RFTISRDDSKST DAGSPCG

GFTFS WGQGTL

DA23- GLVQPGGSL PGKGL RYTGYG VYLQMNSLRAED KGGWTGA 29

SFNML VTVSS RLSCAAS EWVA SAVKG TAVYYCVR CIDT

AVTLDESGG WVRQA GIGKSD RATISRDDGQST DAGSGCG

GFTFS WGHGTE

DA24 GLQTPGGGL PGKGL RYTGYG VRLQLNNLRAED SGGWTGA 17

SFNML VIVSS SLVC GS EWVA SAVKG TGTYYCVK CIDT

AVTLDESGG WVRQA GIGKSD RATISRDDGQST DAGSGCG

GFTFS WGHGTE

DA25 GLQTPGGGL PGKGL RYTGYG VYLQ陋 SLRAED SGGWTGA 30

SFNML VIVSS SLVCKGS EWVA SAVKG TGTYYCVK CIDT

AVTLDESGG WVRQA GIGKSD RATISRDDGQST DAGSGCG

GFTFS WGHGTE

DA26 GLQTPGGGL PGKGL RYTGYG VYLQMNSLRAED SGGWTGA 30

SFNML VIVSS SLVCKGS EWVA SAVKG TGTYYCVK CIDT AVTLDESGG WVRQA GIGKSD RATISRDDGQST DAGSGCG

GFTFS WGHGTE

DA27 GLQTPGGGL PGKGL RYTGYG VRLQLNNLRAED SGG TGA 17

SFNML VIVSS SLVCKGS EWVA SAVKG TGTYYCVK CIDT

AVTLDESGG WVRQA GIGKSD RATISRDDGQST DAGSGCG

GFTFS WGHGTE

DA28 GLQTPGGGL PGKGL RYTGYG ARLQLNNLRAED SGGWTGA 31

SFNML VIVSS SLVCKGS EWVA SAVKG TGTYYCVK CIDT

AVTLDESGG WVRQA GIGKSD RATISRDDGQST DAGSGCG

GFTFS WGHGTE

DA29 GLQTPGGGL PGKGL RYTGYG ARLQLNNLRAED SGGWTGA 31

SFNML VIVSS SLVCKGS .EWVA SAVKG TGTYYCVK _ CIDT

AVTLDESGG WVRQA GIGKSD RATISRDDGQST DAGSGCG

GFTFS WGHGTE

DA30 GLQTPGGGL PGKGL RYTGYG AYLQMNSLRAED SGGWTGA 32

SFNML VIVSS SLVCKGS EWVA. SAVKG TGTYYCVK CIDT

AVTLDESGG WVRQA GIGKSD RATISRDDGQST DAGSGCG

GFTFS WGHGTE

DA31 GLQTPGGGL PGKGL RYTGYG ARLQMNSLRAED SGGWTGA 33

SFNML VIVSS SLVCKGS EWVA SAVKG TGTYYCVK CIDT

AVTLDESGG WVRQA GIGKSD RATISRDDGQST DAGSGCG

GFTFS WGHGTE

DA32 GLQTPGGGL PGKGL RYTGYG VRLQLNNLRAED SGGWTGA 34

SFNML VIVSS SLVCKGS EWVA SAVKG TAVYYCVK CIDT

AVTLDESGG WVRQA GIGKSD RATISRDDGQST DAGSGCG

GFTFS WGHGTE

DA33 GLQTPGGGL PGKGL RYTGYG ARLQLNNLRAED SGGWTGA 35

SFNML VIVSS SLVCKGS EWVA SAVKG TAVYYCVK CIDT

AVTLDESGG WVRQA GIGKSD RATISRDDGQST DAGSGCG

GFTFS WGHGTE

DA34 GLQTPGGGL PGKGL RYTGYG AYLQMNSLRAED SGGWTGA 36

SFNML VIVSS SLVCKGS EWVA SAVKG TAVYYCVK CIDT

AVTLDESGG WVRQA GIGKSD RATISRDDGQST DAGSGCG

GFTFS WGHGTE

DA35 GLQTPGGGL PGKGL RYTGYG . ARLQ删 SLRAED SGGWTGA 37

SFNML VIVSS SLVCKGS EWVA SAVKG TAVYYCVK CIDT

(상기 표 8에서, VH-FWl , VH-FW2 및 VH-FW3는 중쇄 가변영역의 프레임워크를 나타낸다)

【표 9】

경쇄 가변영역 서열

VTITC YYG LIY EDFATYYC

DIQMTQSPS SGGDS WYQQKP GVPSRFSGSRSG

NNNNR GSRDS FGQGT

DA2 SLSASVGDR YAGSY GKAPKT TDFTLTISSLQP 40

PS SYVGI KVEIK VTITC YYG LIY EDFATYYC

DIQMTQSPS SGGDS WYQQKP GVPSRFSGSTSG

NNNNR GSRDS FGQGT

DA3 SLSASVGDR YAGSY GKAPKT TDFTLTISSLQP 39

PS SYVGI KVEIK VTITC YYG LIY EDFATYYC

DIQMTQSPS SGGDS WYQQKP GVPSRFSGSTSG

NNNNR GSRDS FGQGT

DA4 SLSASVGDR YAGSY G _ς KAPKT TDFTLTISSLQP 39

PS SYVGI KVEIK VTITC YYG LIY EDFATYYC

DIQMTQSPS SGGDS WYQQKP GVPSRFSGSTSG

NNNNR GSRDS FGQGT

DA5 SLSASVGDR YAGSY GKAPKT TDFTLTISSLQP 39

PS SYVGI KVEIK VTITC YYG LIY EDFATYYC

DIQMTQSPS SGGDS WYQQKP GVPSRFSGSTSG

NNNNR GSRDS FGQGT

DA6 SLSASVGDR YAGSY GKAPKT TDFTLTISSLQP 39

PS SYVGI KVEIK VTITC YYG LIY EDFATYYC

DIQMTQSPS SGGDS WYQQKP GVPSRFSGSTSG

NNNNR GSRDS FGQGT

DA7 SLSASVGDR YAGSY GKAPKT TDFTLTISSLQP 39

PS SYVGI KVEIK VTITC YYG LIY EDFATYYC

DIQMTQSPS SGGDS WYQQKP GVPSRFSGSGSG

NNNNR GSRDS FGQGT

DA8 SLSASVGDR YAGSY GKAPKT TDFTLTISSLQP 41

PS SYVGI KVEIK VTITC . YYG LIY EDFATYYC

DIQMTQSPS SGGDS WYQQKP GVPSRFSGSRSG

NNNNR GSRDS FGQGT

DA9 SLSASVGDR YAGSY GKAPKT TDFTLTISSLQP 40

PS SYVGI KVEIK VTITC YYG LIY EDFATYYC

DIQMTQSPS SGGDS GVPSRFSGSRSG

NNNNR GSRDS FGQGT

DA 10 SLSASVGDR YAGSY TDFTLTISSLQP 40

PS SYVGI KVEIK VTITC YYG EDFATYYC

DIQMTQSPS SGGDS WYQQKP GVPSRFSGSRSG

NNNNR GSRDS FGQGT

DA11 SLSASVGDR YAGSY GKAPKT TDFTLTISSLQP 40

PS SYVGI KVEIK VTITC YYG LIY EDFATYYC

DIQMTQSPS SGGDS WYQQKP GVPSRFSGSRSG

NNNNL GSRDS FGQGT

DA 12 SLSASVGDR YAGSY GKAPKT TDFTLTISSLQP 42

MP SYVGI KVEIK VTITC YYG LIY EDFATYYC

DIQMTQSPS SGGDS WYQQKP GVPSRFSGSRSG

NNNNR GSRDS FGQGT

DA 13 SLSASVGDR YAGSY GKAPKT TDFTLTISSLQP 43

PS AGMGA KVEIK VTITC YYG LIY EDFATYYC

DIQMTQSPS SGGDS WYQQKP NNNNK GVPSRFSGSRSG GSRDS FGQGT

DAM ^' 44 SLSASVGDR YAGSY GKAPKT AK _, TDFTLTISSLQP SYVGI KVEIK VTITC YYG LIY EDFATYYC

DIQMTQSPS SGGDS WYQQKP GVPSRFSGSRSG

NNNNR GSRDS FGQGT

DA15 SLSASVGDR YAGSY GKAPKT TDFTLTISSLQP 45

PS DGGGR KVEIK VTITC YYG LIY EDFATYYC

DIQMTQSPS SGGDS WYQQKP GVPSRFSGSRSG

NNNNR GSRDS FGQGT

DA 16 SLSASVGDR YAGSY GKAPKT _. TDFTLTISSLQP 46

PS SGAGG KVEIK VTITC YYG σ LIY EDFATYYC

DIQMTQSPS SGGDS WYQQKP GVPSRFSGSRSG

NNNNK GSRDS FGQGT

DA 17 SLSASVGDR YAGSY GKAPKT TDFTLTISSLQP 44

AK SYVGI KVEIK VTITC YYG LIY EDFATYYC

DIQMTQSPS SGGDS WYQQKP GVPSRFSGSRSG

NNNNR GSRDS FGQGT

DA 18 SLSASVGDR YAGSY GKAPKT TDFTLTISSLQP 45

PS DGGGR KVEIK VTITC YYG LIY EDFATYYC

DIQMTQSPS WYQQKP GVPSRFSGSRSG

NNNNL GSRDS FGQGT

DA 19 SLSASVGDR GKAPKT TDFTLTISSLQP 42

MP SYVGI KVEIK VTITC LIY EDFATYYC

DIQMTQSPS SGGDS WYQQKP GVPSRFSGSRSG

NNNNR GSRDS FGQGT

DA20 SLSASVGDR YAGSY GKAPKT TDFTLTISSLQP 43

PS AGMGA KVEIK VTITC YYG LIY EDFATYYC

DIQMTQSPS SGGDS WYQQKP GVPSRFSGSRSG

NNNNR GSRDS FGQGT

DA21 SLSASVGDR YAGSY GKAPKT TDFTLTISSLQP 46

PS SGAGG KVEIK VTITC YYG LIY EDFATYYC

DIQMTQSPS SGGDS WYQQKP GVPSRFSGSTSG

NNNNR GSRDS FGQGT

DA22 SLSASVGDR YAGSY GKAPKT TDFTLTISSLQP 47

PS SYVGI KVEIK VTITC YYG LIY EDFATYYC

DIQMTQSPS SGGDS WYQQKP GVPSRFSGSTSG

NNNNR GSRDS FGQGT

DA23 SLSASVGDR YAGSY GKAPKT TDFTLTISSLQP 47

PS SYVGI KVEIK VTITC YYG LIY EDFATYYC

LTQPSSVSA SGGDS WYQQKA NIPSRFSGSTSG

NNNNR GSRDS FGAGT

DA24 NLGGTVEIT YAGSY PGSAPV STATLTITGVQA 48

PS SYVGI TLTVL C YYG TVIY EDEATYYC

LTQPSSVSA SGGDS WYQQKA NIPSRFSGSTSG

NNNNR GSRDS FGAGT

DA25 NLGGTVEIT YAGSY PGSAPV STATLTITGVQA 38

PS SYVGI TLTVL C YYG TVIY EDEAVYFC

LTQPSSVSA SGGDS WYQQKA NIPSRFSGSTSG

NN刚 R GSRDS FGAGT

DA26 NLGGTVEIT YAGSY PGSAPV STATLTITGVQA 48

PS SYVGI TLTVL C YYG TVIY EDEATYYC

LTQPSSVSA SGGDS WYQQKA NNNNR NIPSRFSGSTSG GSRDS FGAGT

DA27 49 NLGGTVEIT YAGSY PGSAPV PS STATLTITGVQA SYVGI TLTVL C YYG TVIY EDEATYFC

LTQPSSVSA SGGDS WYQQ A NIPSRFSGSTSG

NNNNR GSRDS FGAGT

DA28 NLGGTVEIT YAGSY PGSAPV STATLTITGVQA 38

PS SYVGI TLTVL C YYG TVIY EDEAVYFC

LTQPSSVSA SGGDS WYQQKA NIPSRFSGSTSG

NNNNR GSRDS FGAGT

DA29 NLGGTVEIT YAGSY PGSAPV STATLTITGVQA 49

PS SYVGI TLTVL C YYG TVIY EDEATYFC

LTQPSSVSA SGGDS WYQQKA NIPSRFSGSTSG

NNNNR GSRDS FGAGT

DA30 NLGGTVEIT YAGSY PGSAPV STATLTITGVQA 48

PS SYVGI TLTVL C YYG TVIY EDEATYYC

LTQPSSVSA SGGDS WYQQKA NIPSRFSGSTSG

NNNNR GSRDS FGAGT

DA31 NLGGTVEIT YAGSY PGSAPV STATLTITGVQA 49

PS SYVGI TLTVL C YYG TVIY EDEATYFC

LTQPSSVSA SGGDS WYQQKA NIPSRFSGSTSG

NNNNR GSRDS FGAGT

DA32 NLGGTVEIT YAGSY PGSAPV STATLTITGVQA 38

PS SYVGI TLTVL C YYG TVIY EDEAVYFC

LTQPSSVSA SGGDS WYQQKA NIPSRFSGSTSG

NNNNR GSRDS FGAGT

DA33 NLGGTVEIT YAGSY PGSAPV STATLTITGVQA 49

PS SYVGI TLTVL C YYG TVIY EDEATYFC

LTQPSSVSA SGGDS WYQQKA NIPSRFSGSTSG

NNNNR GSRDS FGAGT

DA34 NLGGTVEIT YAGSY PGSAPV STATLTITGVQA 48

PS SYVGI TLTVL C YYG TVIY EDEATYYC

LTQPSSVSA SGGDS WYQQKA NIPSRFSGSTSG

NNNNR GSRDS FGAGT

DA35 NLGGTVEIT YAGSY PGSAPV STATLTITGVQA 49

PS SYVGI TLTVL C YYG TVIY EDEATYFC

(상기 표 9에서， VL-FWl , VL-FW2 및 VL-FW3는 경쇄 가변영역의 프레임워크를 나타낸다) 실시예 5 . 항체의 생산

상기에서 수득한 항체의 친화도 측정 및 활성 분석을 위하여 면역글로불린 ( IgG) 단백질을 생산하였다. scFv를 포함하는 pComb3x로부터 중쇄 및 경쇄의 가변영역과 불변영역의 절편을 하기 표 10의 프라이머 조합을 이용해서 실시예 2와 같은 조건의 PCR을 통해 수득하였다.

각 가변영역 (Var i ab l e Regi on , V _H 내지 VL)과 불변영역 (Const ant Reg i on , C _H 내지 Ck)을 하기 표 10의 HC 및 IX 프라이머 조합을 이용하여 PCR로 각각 중쇄와 경쇄를 얻어냈고, pcDNATM3 . 3-T0P0®TA 클로닝 키트 및 _P 0pt i TMVEC-T0P0®TA 클로닝 키트 ( I nvi t rogen , 미국)를 이용하여 포유류 세포 발현 플라스미드로 옮겼다. 각 백터 (pcDNATM3.3-T0P0 ^® 백터와 pOptiTM VEC-T0P0® 백터) lul와 절편을 200 mM NaCl 및 10 mM .MgCl ₂ 이 포함된 완층액에 총 6ul가 되게 첨가하여 상온에서 5분 동안 반웅시켰다. DH 5a 대장균 competent cell에 열층격을 가하여 형질전환하여 콜로니를 얻은 후 대량 배양하여 플라스미드를 얻었다. 상기에서 제조된 플라스미드를 이용하여 HEK293F 세포 (Invitrogen, 미국)에 형질감염시킨 후， 7일 동안 배양하여 수득한 항체를 단백질 A 컬럼 (GE, 미국)을 사용하여 정제하였다. 배양액을 컬럼에 로딩하여 배양액 중에 있는 항체 (IgG)를 단백질 A와 결합시키고 20mM 구연산 나트륨 버퍼 (pH3.0)로 용출하였다. SDS—PAGE를 통해 경쇄와 중쇄의 SDS-PAGE를 통해 경쇄와 중쇄의 이론적 계산치와 일치하는 분자량과 높은 순도를 확인하였다.

【표 10】

실시예 ,6. 인간 DR5에 대한 항체의 결합 친화도 분석

친화도를 측정하기 위해 인간 DR5 각각을 카르복시메틸화 텍스트란 바이오센서 칩 (CM5, GE)을 이용하여 제조자의 지시에 따라 커플링하였다. 결합 및 해리 속도 측정을 위해 IgG 단백질을 5nM, 2.5ηΜ, 1.25ηΜ, 0.625 ^η Μ,

0.313ηΜ 및 0.156ηΜ로 2배 연속 희석하여 주입하였다.

결합속도 및 해리속도는 결합 및 해리 센소그램 (sensogram)으로 표시되고, 단순 일대일 랭뮈어 결합 모델 (BIAcore X100 평가 소프트웨어， 버전 2.0)을 사용하여 계산하였다. 평형해리 상수 (KD)는 해리 속도 상수 (Kd)를 결합 속도 상수 (Ka)로 나눈 값으로서， 실제 값을 계산한 결과 nM 이하로 높은 수준의 KD 값을 확인하였다. DR5에 대한 본 발명의 항체 DO 및 DA1 내지 DA35의 측정값을 하기 표 11에 나타냈으며 (항체명을 항체가 유래한 클론명으로 표기함)， 대표적으로 DO의 센소그램을 도 1에 나타내었다.

【표 111

DA27 Human DR5 1.17 X 10^06 2.24 Χ1(Γ-6 1.92 XIC 一 12

DA28 Human DR5 1.16 ΧΚΓ06 4.52 X10"-6 3.89 ΧΚΓ— 12

DA29 Human DR5 1.21 ΧΚΓ06 8.47 ΧΚΓ—5 6.98 Χ1(Γ-11

DA30 Human DR5 1.03 Χ10 ^Λ 06 7.97 Χ Γ-5 7.74 XICT— 11

DA31 Human DR5 1.24 X 10^06 8.79 ΧΚΓ-5 7.06 ΧΚΓ-11

DA32 Human DR5 1.14 ΧΚΓ06 8.59 Xl(r-5 7.51 ΧΚΓ-11

DA33 Human DR5 1.24 Χ1(Γ06 9.77 ΧΚΓ-5 7.88 XlC —ll

DA34 Human DR5 1.00 ΧΚΓ06 9.50 Χ1(Γ-5 9.42 Χ1(Γ-11

DA35 Human DR5 1.13 Χ10 ^Λ 06 9.12 ΧΚΓ-05 8.01 ΧΚΓ-11 실시예 7. 인간 DR5에 대한 항체의 결합력 분석

본 발명의 항체의 인간 DR5에 대한 결합력을 효소면역측정법을 이용하여 확인하였다. 10ng/ml 농도의 인간 DR5 단백질을 96웰 면역 플레이트 (Nunc, 미국)에 웰 당 150ul씩 분주하고 상온에서 1시간 동안 흡착시켰다. 완충 용액으로 3회 세척한 후， 순차적으로 희석한 일정 농도 (0.1~2000ng/ml)의 항체를 웰 당 150uL씩 _. . 처리하고 상은에서 1시간 내지 2시간 동안 반응시켰다. 완충 용액으로 세척 후， HRP( horseradish peroxidase)가 결합되어 있는 항 -인간 면역글로불린 Fc에 대한 항체 (Serotec, 미국)를 1:20, 000으로 희석하여 웰 당 150 uL씩 분주하고 상온에서 1시간 동안 결합시켰다. 세척 후 ΤΜΒ(3,3'，5,5'- Tetramethylbenzidine; Sigma, 미국) 용액을 웰 당 lOOuL씩 넣,고 3분 내지 10분 정도 발색시켰다. 반웅이 일정 수준이 도달하면 1N 황산 (¾S0 ₄ )용액으로 반응을 종결시켰다. 분광 광도계 (Molecular Device, 미국)를 이용하여 450 围에서 흡광도를 측정하여 그 결과를 도 2a 내지 도 2f에 나타내었다. 본 시험에서 특허 PCT—US2006— 03577 (W02006— 083971)에 명시된 항ᅳ DR5 항체 서열을 이용하여 합성한 항체 AP를 대조 항체로 이용하였다. 도 2a 내지 도 2f에서 확인되는 바와 같이， 항체 D0 및 DA1 내지 DA35는 대조 항체 AP 대비 항원 결합력이 높게 관찰되었다. 실시예 8. 물리화학적 특성 분석

[8-1] 항체 크기 확인

본 발명에 따른 항체의 크기를 SDS-PAGE 를 이용하여 분석하였다. NuPAGE 4-12% Bis—Tris 젤 (Invitrogen, 미국)을 이용하였다. 상기 제조된 항 DR5 항체 (DO , DAI , DA4, DA16 , DA 18 , DA20 , DA23 , DA26 , 및 DA29)에 DTTC lnvi trogen, 미국)를 처리하여 이황화 결합을 제거한 환원 조건과 DTT를 처리하지 않은 비 환원 조건에서 각각 SDS-폴리아크릴아미드젤 전기영동 (SDS-PAGE)을 수행하여 전체 항체의 경쇄와 중쇄의 존재를 확인하였다. 상기 얻어진 결과를 각각 도 3a (비환원 조건하에서의 결과) 및 도 3b (환원 조건 하에서의 결과)에 나타내었다. 도 3a에서 보여지는 바와 같이, 비환원 조건 (Non— Reduced condi t ion)에서 분석한 검체는 98kDa 사이즈 마커와 188kDa 사이즈 마커 사이 위치에서 항체 전체 크기에 해당되는 밴드의 존재가 확인되었다 . 또한 , 도 3b에서 보여지는 바와 같이 , 환원 조건 (Reduced Condi t ion)의 검체는 49 kDa 사이즈 마커와 28 kDa 사이즈 마커 부근에서 각각 항체의 중쇄와 경쇄에 해당하는 2개의 밴드가 확인 되었다. 이와 같이 SDS—폴리아크릴아미드젤 전기영동 분석을 통해 전체 항체와 항체의 중쇄 및 경쇄에 해당되는 밴드를 확인하였다. [8-2] 항체 순도 확인

TSKgel G3000SWxl 컬럼 (Tosoh, 일본)을 이용한 크기 배제 크로마토그래피 (si ze exclusion chromatography, SEC)로 항체의 순도 및 응집체 (불순물의 한 종류로 soluble aggregate를 지칭함)를 분석하여， 그 결과를 도 4a (대조항체 AP) , 도 4b (DO) , 도 4c (DAI) , 도 4d (DA4) , 도 4e (DA15) , 도 4f (DA23) , 도 4g (DA26) , 및 도 4h (DA29)에 각각 나타내었다. lOOmM 인산 완층액 (pH 6.6)을 이동상으로 하여 등용매 용리 방법으로 분리하고 흡광도 280nm에서 분석하였을 때, 단량체의 피크 면적이 전체 피크면적의 94% 이상을 차지하였으며， 응집체 피크의 비율은 6% 미만으로, 대체적으로 94% 이상의 높은 순도를 나타내었다 실시예 9. 항체의 약동력학 (Pharmacokinet ics)

상기 제조된 항체의 생체 내 동태를 알아보기 위해 마우스 혈중 반감기를 평가하였다. 항체를 누드 마우스의 정맥을 통해 l~10mg/kg로 투여하고 투여 시작 시점을 기준으로 주사 후 5분에서 14일까지 안와 정맥 채혈을 수행하였다. 채혈은 해파린이 처리된 모세관을 사용하여 수행하였다. 채취한 혈액에서 원심 분리하여 획득된 혈장 (Pl asma)을 일정 농도로 희석하여 ELISA용 샘플로 사용하였다. 10ng/ml의 농도로 희석한 인간 DR5 lOOul를 96웰 면역 플레이트 (Nunc , 미국)에 넣고， 넁장에서 12시간 내지 14시간 동안 흡착시켰다. 0.1% Tween20이 포함된 완층용액으로 3회 세척한 후， 우 혈청 알부민 (Sigma, 미국)이 포함된 완충용액으로 상온에서 1시간 반웅시켰다. 완충용액으로 3회 세척하고 희석된 각 마우스 혈장 시료와 순차적 희석된 표준 물질을 처리한 다음 2시간 내지 3시간 동안 상온에서 결합시켰다. 완충용액으로 3회 세척하고 HRP가 부착된 항 -인간 면역글로불린 Fc-HRP 항체 (Bethyl, 미국)를 1:20000으로 희석하여 웰당 100 uL씩 넣고 상온에서 1시간 결합시켰다. 3희 세척한 후, TMB(Sigma, 미국) 용액을 각 웰당 100 uL씩 넣고 반응시켰다. 반웅이 일정한 수준에 도달하면 0.2N ^. 황산용액을 이용하여 반웅을 종결한 후, 분광 광도계 (Molecular Device, 미국)를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 측정된 Optical Density(OD) 값을 기반으로 각 혈장 시료내 항체의 농도를 계산하였고 원놀린 (Winnonlin ver . 6.2.0.495)을 이용하여 약동학적 지표값을 산출하여 그 결과를 도 5 및 하기의 표 12에 나타내었다.

【표 12】

및 ^■ DA23) 모두 시험에 사용된 마우스에서 6.68일 내지 8.37일의 혈중 반감기를 나타내었다. 실시예 10· 항체의 종양 세포 사멸 활성 확인

상기 제조된 항체의 생물학적 활성을 시험관 내 세포 사멸 분석법을 이용하여 결정하였다. 상기 시험에는 인간 대장암 세포주 Colo205 (ATCC, 미국)와 인간 췌장암 세포주 Miapaca-2(ATCC, 미국)， 인간 폐암 세포주 H2122(ATCC, 미국)를 이용하였다.

각각의 종양 세포를 ι*ΐ(Γ5 cells/ml 농도가 되도록 현탁하여 96웰 세포 배양 플레이트에 웰 당 50ul의 부피로 분주하고 정온 습식 배양기에서 16시간 내지 24시간 동안 배양하였다. 일정한 농도 (0.06~66,0(X)pM)의 항체를 단독으로 처리 (Ab alone)하거나 가교결합 항체 (항—인간 FcKSerotec, 미국)와 흔합하여 처리 (Ab linked)하였다. 48시간 동안 배양한 후에 웰 당 lOul의 리자주린 용액 (Invitrogen, 미국)을 넣고 1시간 내지 2시간 동안 정온 습식 배양기에서 반응시켰다. 반웅 후, 분광 광도계 (Molecular Device)를 사용하여 590 nm에서 방출되는 형광을 판독하였다. 배양 배지 처리군의 상대적 형광 값 (Untreated RFU: Relative Fluorescence Unit) 대비 실험 물질 처리군의 형광 값 (treated RFU)의 백분율로 계산되는 웰 당 상대적 세포 생존율 (Cell viability (%) = treated RFU/ Untreated RFU x 100)을 수치화하여, 그 결과를 도 6a 내지 도 6ιᅳ에 나타내었다. 비교를 위하여, 대조 항체 AP에 대하여 상기와 동일한 시험을 수행하였다.

도 6a 내지 도 6r에서 나타낸 바와 같이， 상기 제작된 항체들은 시험된 3 종의 인간 암 세포주에서 모두에서 우수한 세포 사멸 활성을 나타내었다. 실시예 11. 이종이식 동물모델에서 항 종양 활성 평가

인간 암 세포주를 이식한 누드 마우스에 항체를 투여하여 항 종양 활성을 평가하였다. 항 -DR5 . 인간 암 세포주로는 인간 폐암 세포주 H2122(ATCC, 미국)와 인간 췌장암 세포주 Miapaca-2(ATCC, 미국)를 이용하였다. 종양 세포 2~5백만개를 6~8주령의 암컷 BALB/c 누드 마우스 (오리엔트바이오)의 측면 피하에 이식하고 캘리퍼스를 사용하여 종양의 부피를 측정하였다. 종양의 평균 부피가 100 내지 300 誦 ³ 에 도달했을 때 군을 분리한 후 분리된 군에 따라 상기 제작된 항체 (대조 항체 AP 및 D0 항체)를 투여하였다. 항체 투여는 군 분리 당일부터 28일 내지 50일 동안 0.05~2mg/kg의 용량으로 주 1희 간격으로 총 3회 (투여 개시 당일, 7일 및 14일 후) 복강 내 주사하였으며，. 투여 개시 후 28일 내지 50일까지 주 2회 종양의 부피를 측정하였다. 음성 대조군은 완충 용액 (PBS)를 투여하였다.

상기 얻어진 결과를 도 7a (H2122 이식 마우스 결과) 및 7 b (Miapaca-2 이식 마우스 결과)에 나타내었다. 도 7a 및 도 7b에 제시된 바와 같이, D0 항체가 대조 항체 AP보다 우수한 종양 억제 활성을 나타냄을 확인하였다. 실시예 12. TRAIL 비경쟁적 결합 확인

상기 실시예 3에서 선별된 항체의 항원 결합 특성을 확인하기 위하여 TRAIL을 이용한 경쟁적 효소면역측정법을 진행하였다. ELISA 플레이트에 인간 DR5 (R&D systems, 미국) 0. lug/ml을 4°C에서 코팅한 후, 0.01 nM ~ 1440 nM의 항체 (DO, DA20, DA21, DA21, DA22, 및 0八23)를 0.01~400^의 TRAIL 단백질과 함께 플레이트에 2시간 동안 반웅시켰다. PBST(0.1% 우 혈청 알부민, tween-20을 포함하는 PBS)로 3회 세척한 후， HRP(horse radish peroxidase)가 결합된 항 -인간 면역글로블린 Fc을 넣고 1시간 동안 반응시켰다. PBST로 3회 세척한 후 ABTS (Thermo, 미국)을 넣고 20분 동안 발색시킨 후 반응이 일정 수준에 도달하면 1N 황산 용액으로 반웅을 종결하였다. 분광광도계 (Molecular Device, 미국)를 이용하여 405 讓에서의 측정된 흡광도를 도 8a 및 도 8b 에 나타내었다. 대조 항체로는 실시예 (7-1)에 명시된 항체 AP를 사용하였다.

도 8a 및 도 8b에서 TRAIL 농도 의존적으로 항원 결합이 감소한 대조 항체 AP와 달리 DO, DA20, DA21, DA21, DA22, 및 DA23 항체들은 TRAIL 농.도와 상관없이 일정 수준의 항원 결합을 유지하는 것으로 보아, TRAIL과 비경쟁적으로 결합함을 알 수 있었다. 실시예 13. 항체의 TRAIL 병용효과 확인

항원 결합 부위에 따른 항체의 특성을 분석하기 위해， 상기 제작된 항체와 TRAIL 단백질을 병용 처리했을 때의 세포 사멸 활성을 분석하였다. 시험에는 인간 대장암 세포주 Colo205 (ATCC, 미국)와 인간 췌장암 세포주 Miapaca-2 (ATCC, 미국)을 사용하였다. 1*1CT5 eel ls/ml로 현탁된 종양 세포를 96웰 세포 배양 플레이트에 웰 당 50 ul씩 분주한 뒤， 정온 습식 배양기에서 16시간 내지 24시간 동안 배양하였다. 순차적 농도 (0.1~10000 ng/ml)로 희석한 항체와 일정 농도 (0.5， 1, 10 ng/mi)의 TRAIL 단백질을 96웰 플레이트에 조합 처리하였다. 48시간 내지 72시간 동안 정온 습식 배양한 후에 웰 당 lOul의 리자주린 용액 (Invitrogen, 미국)을 넣고 1시간 내지 2시간 동안 반응시켰다. 반웅이 일정 수준에 도달하면 분광 광도계 (Molecular Device)를 사용하여 590 nm에서 방출되는 형광올 판독하였다. 배양 배지 처리군의 상대적 형광 값 (Untreated RFU: Relative Fluorescence Unit) 대비 실험 물질 처리군의 형광 값 (treated RFU)의 백분율로 계산되는 웰 당 상대적 세포 생존율 (Cell viability (%) = treated RFU/ Untreated RFU x 100)을 수치화하였다.

그 중 대표적인 결과를 도 9a (Colo205 결과) 및 도 9b (Miapaca-2 결과)에 나타내았다. 대조 항체로는 전술한 항체 AP를 사용하였다. 이는 대조 항체 AP가 TRAIL과 유사한 항원 결합 부위를 갖는 것을 제시한 문헌 (Cell Death and Differentiation, 15， 751-761， 2008)을 근거로 한다.

도 9a 및 에 나타난 바와 같이, lOng/tnl 정도의 저농도의 DO 항체 또는 DA23를 일정 농도의 TRAIL과 함께 처리하였을 때， 각 물질을 단독 사용했을 때와 비교하여 세포 사멸 활성이 증가되어 항체와 TRAIL의 병용효과가 관찰되었으나， 대조 항체 AP의 경우， 활성이 증가가 관찰되지 않았다. 실시예 14. 세포 내 caspase 활성 분석

상기 제작된 항체의 세포 사멸 기전을 규명하기 위하여 caspase 활성을 측정하였다. Caspase-3/7의 활성을 측정하기 위하여 Apo-ONE® Homogeneous Caspase-3/7 Assay kit (Promega, 미국)을 이용하였다. 시험에는 인간 대장암 세포주 Co 1 o205(ATCC 미국)와 인간 췌장암 세포주 Miapaca-2(ATCC, 미국) , 및 인간 폐암 세포주 H2122(ATCC, 미국)를 이용하였다. 1*10 ^Λ 5 eel ls/ml로 현탁한 각각의 종양 세포를 96웰 세포 배양 플레이트에 웰 당 50ul씩 분주한 뒤, 정은 습식 배양기에서 16시간 내지 24시간 동안 배양하였다.. 일정한 농도 (0.01~10000ng /ml)의 항체를 단독으로 처리하거나 (Ab alone) 가교결합 항체 (항ᅳ인간 Fc)(Serotec, 미국)와 흔합하여 처리 (Ab linked)한 후 4시간 동안 배양하였다. 웰 당 lOOul의 Apo-ONE® Caspase-3/7 Reagent (Promega, 미국)을 처리하고 3시간 내지 16시간 동안 정온 습식 배양기에서 반응시켰다. 반웅이 일정 수준에 도달했을 때, 분광 광도계 (Molecular Device)를 사용하여 520 画에서 방출되는 형광을 판독하였다. 배양 배지 처리군의 형광 값 (Untreated RFU: Relative Fluorescence Unit) 대비 실험 물질 처리군의 형광 값 (treated RFU)의 배수 (Fold)로 웰 당 상대적 _. Caspase act ivity(Caspase ^■ RFU/Untreated RFU)을 수치화하였다.

대표적인 결과를 도 10a (Colo205 결과), 도 10b (H2122 결과)， 및 도 10c(Miapaca-2 결과) 에 나타내었다. 대조 항체로는 전술한 항체 AP을 동일한 방식으로 처리하였다.

도 10a 내지 도 10c에 나타난 바와 같이, 항체 D0 또는 DA29를 암 세포주에 처리하였을 때， Casapse-3/7의 활성이 증가하는 것을 확인함으로써, 본 발명의 항체의 세포사멸기전에 apoptosis가 관여되어 있음을 확인할 수 있었다. 실시예 15. 항체 -약물 병용효과

상기 제작된 항체와 젬시타빈을 병용하여 처리하였을 ·때의 효과를 시험관 내 종양 세포 사멸 분석법으로 결정하였다. 본 시험은 췌장암 세포에 젬시타빈과 항 -DR5 항체를 병용 처리했을 때 종양 세포 사멸과 caspase의 활성이 증가됨을 제시한 문헌 (J Gastrointest Surg. 2006 Nov; 10(9) :1291-300)을 근거로 한다.

인간 췌장암 세포주 Miapaca-2(ATCC, 미국)와 Panc-1(ATCC, 미국)을 각각 1*1(Γ5 eel ls/ml로 현탁하여 96웰 세포 배양 플레이트에 웰 당 50ul의 세포 현탁액을 넣고 정온 습식 배양기에서 16시간 내지 24시간 동안 배양하였다. 본 발명의 항체 DO를 포함한 항 -DR5 항체를 일정 농도 (3nM~300nM)의 젬시타빈과 함께 암 세포주에 처리한 후， 48시간 내지 72시간 동안 배양하였다. 웰 당 lOul의 리자주린 용액 (Invitrogen, 미국)을 넣고 1시간 내지 3시간 동안 배양기에서 반웅시켰다. 반웅이 일정 수준에 도달했을 때， 분광 광도계 (Molecular Device) 사용하여 590 nm에서 방출하는 형광을 판독하였다. 배양 배지 처리군의 상대적 형광값 (Untreated RFU: Relative Fluorescence Unit) 대비 실험 물질 처리군의 형광값 (treated RFU)의 백분율로 계산되는 웰 당 상대적 세포 생존율 (Cell viability (%) - treated RFU/ Untreated RFU x 100)을 수치화하여， 그 대표적인 결과를 도 11a (Miapaca-2 결괴-) 및 도 lib (Panc-1 결과)에 나타내었다. 대조 물질로 전술한 항체 AP도 동일한 방식으로 처리하였다. 도 11a 및 도 lib에 나타난 바와 같이， 항체 D0 또는 DA29를 젬시타빈과 함께 투여하였을 때, 각 물질을 단독 사용했을 때 대비 세포 사멸 활성이 증가 됨을 알 수 있었다. 이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바， 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시예일뿐이며， 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.