Login| Sign Up| Help| Contact|

Patent Searching and Data


Title:
ANTI-HIV INFECTION POLYPEPTIDE, COMPOSITION, AND USE
Document Type and Number:
WIPO Patent Application WO/2012/000459
Kind Code:
A1
Abstract:
The present invention belongs to the biomedical field, relates to an anti-HIV infection polypeptide, and specifically relates to a polypeptide represented by Y1-IXb1ELXe1BB-SXb2ELXe2BB-IXb3EXd3Xe3BB-Xa4Xb4EXd4Xe4BB-Y2 (formula (I)), a derivative thereof, a three-dimensional isomer thereof, or a physiologically acceptable non-toxic salt thereof. The present invention also relates to a pharmaceutical composition containing the polypeptide represented by formula (I), the derivative thereof, the three-dimensional isomer thereof, or the physiologically acceptable non-toxic salt thereof. The present invention also relates to the use of the polypeptide represented by formula (I), the derivative thereof, the three-dimensional isomer thereof, or the physiologically non-toxic salt thereof in the treatment or the prevention of HIV infection induced diseases, in particular, acquired immune deficiency syndrome (AIDS).

Inventors:
LIU KELIANG (CN)
JIANG SHIBO (CN)
SHI WEIGUO (CN)
JIA QIYAN (CN)
BAI YU (CN)
FENG SILIANG (CN)
CAI LIFENG (CN)
WANG CHAO (CN)
ZHANG SHA (CN)
JIANG XIFENG (CN)
Application Number:
PCT/CN2011/076812
Publication Date:
January 05, 2012
Filing Date:
July 04, 2011
Export Citation:
Click for automatic bibliography generation   Help
Assignee:
INST PHARM & TOXICOLOGY AMMS (CN)
LIU KELIANG (CN)
JIANG SHIBO (CN)
SHI WEIGUO (CN)
JIA QIYAN (CN)
BAI YU (CN)
FENG SILIANG (CN)
CAI LIFENG (CN)
WANG CHAO (CN)
ZHANG SHA (CN)
JIANG XIFENG (CN)
International Classes:
C07K14/16; A61K38/16; A61K39/21
Domestic Patent References:
WO2010019717A22010-02-18
Other References:
PAN, CHUNGEN ET AL.: "Combinations of the First and Next Generations of Human Immunodeficiency Virus (HIV) Fusion Inhibitors Exhibit a Highly Potent Synergistic Effect against Enfuvirtide-Sensitive and -Resistant HIV Type 1 Strains.", JOURNAL OF VIROLOGY., vol. 83, no. 16, August 2009 (2009-08-01), pages 7862 - 7872
IZUMI, KAZUKI ET AL.: "Design of Peptide-based Inhibitors for Human Immunodeficiency Virus Type 1 Strains Resistant to T-20.", THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, vol. 284, no. 8, 20 February 2009 (2009-02-20), pages 4914 - 4920
SHI, WEIGUO ET AL.: "Novel Anti-HIV Peptides Containing Multiple Copies of Artificially Designed Heptad Repeat Motifs.", BIOCHEMICAL AND BIOPHYSICAL RESEARCH COMMUNICATIONS., vol. 374, no. 4, 3 October 2008 (2008-10-03), pages 767 - 772
QI, ZHI ET AL.: "Rationally Designed Anti-HIV Peptides Containing Multifunctional Domains as Molecule Probes for Studying the Mechanisms of Action of the First and Second Generation HIV Fusion Inhibitors.", THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, vol. 283, no. 44, 31 October 2008 (2008-10-31), pages 30376 - 30384
SHI, W. ET AL.: "Research and Development of HIV Fusion Inhibitor", CHINESE JOURNAL OF NEW DRUGS, vol. 15, no. 17, September 2006 (2006-09-01), pages 1429 - 1436
SHI, W. ET AL.: "Research Status and Development Trend of HIV-1 Fusion Inhibitor", JOURNAL OF CHINESE PHARMACEUTICAL SCIENCES, vol. 45, no. 2, February 2010 (2010-02-01), pages 184 - 193
Attorney, Agent or Firm:
CCPIT PATENT AND TRADEMARK LAW OFFICE (CN)
中国国际贸易促进委员会专利商标事务所 (CN)
Download PDF:
Claims:
权 利 要 求

1. 式 I所示的多肽、 其衍生物、 其立体异构体、 或其无生理 毒性的盐,

Yl— IXblELXelBB— SXb2ELXe2BB— IXb3EXd3Xe3BB— Xa4Xb4EXd4Xe4BB— Y2 式 I

其中,

^为能够与 HIV- 1 gp41 N- trimer表面疏水性口袋区结合的 7 - 14个氛基酸残基的肽序列或小分子化合物, 或者 缺失;

Xbi、 Xb2、 Xb3分别独立地为 D型或 L型的天然或非天然的酸性 氨基酸或亲水性氛基酸;

Xb4为 D型或 L型的天然或非天然的酸性氛基酸或疏水性氛基 酸;

Xei. Xe2、 Xe3、 Xe4分别独立地为 D型或 L型的天然或非天然疏 水性氛基酸;

Xd3、 Xd4分别独立地为 D型或 L型的天然或非天然疏水或亲水 性氛基酸;

Xa4为 D型或 L型的天然或非天然亲水性氛基酸;

B为 D型或 L型的天然或非天然碱性氛基酸;

L为与脂膜作用的 7- 14个 ^酸残基的肽序列、胆固醇、或 6个碳原子以上的长链脂肪酸, 或者 L缺失。

2. 根据权利要求 1所述的式 I多肽、 其衍生物、 其立体异构 体、 或其无生理毒性的盐,

其中,

Yi选自如下的序列或小分子: MEWDRE -、 WEEWDKK -、 WEEWRKK -、 WEEWAKK、 WEEWIKK、 WEEWSKK、 T MEWDRE-、 MT MEWDRE-、 腿 T MEWDRE -、 NNMTWMEWDRE-, 腿 TWMEWDRE -、 1 腿 TWMEWDRE -、 和 QIWNNMTWMEWDRE-;

Xbl、 Xb2、 Xb3、 Xb4分别独立地选自 D型或 L型的如下氛基酸: 谷氨酸、 谷酰胺、 天冬酰胺、 丝氨酸、 苏氨酸、 和酪氛酸;

Xel、 Xe2、 Xe3、 Xe4分别独立地选自 D型或 L型的如下氛基酸: 异亮氨酸、 纈氨酸、 正亮氨酸、 亮氨酸、 和丙氨酸;

Xd3、 Xd4分别独立地选自 D型或 L型的如下氛基酸: 亮氨酸、 正亮氨酸、 谷酰胺、 天冬酰胺、 和丝氨酸;

Xa4选自 D型或 L型的如下氛基酸: 丝氨酸、 谷酰胺、 天冬酰 胺;

B为 D型或 L型的赖氨酸或精氨酸;

L选自如下的序列或小分子: - WASLWNWF、 胆固醇、 和 CH3 (CH2) X00H, 其中, n为 4 - 16的整数。

3. 根据权利要求 2所述的式 I多肽、 其衍生物、 其立体异构 体、 或其无生理毒性的盐, 其中, n为 4, 6, 10, 12, 14, 16。

4. 根据权利要求 1所述的式 I多肽、 其衍生物、 其立体异构 体、 或其无生理毒性的盐, 其中, 所述式 I多肽选自 SEQ ID N0: 2

- 12、 SEQ ID NO: 14、 SEQ ID NO: 16- 34和 SEQ ID NO: 44-53 所示序列的多肽中的至少一种。

5. 根据权利要求 1所述的式 I多肽、 其衍生物、 其立体异构 体、 或其无生理毒性的盐, 其中, 所述式 I多肽选自 SEQ ID N0: 2

- 9、 SEQ ID NO: 20、 SEQ ID NO: 24-26 、 SEQ ID NO: 30- 34以及 SEQ ID NO: 44- 53所示序列的多肽中的至少一种。

6. 一种药物组合物, 其含有至少一种权利要求 1-5中任一项 所述的式 I多肽、 其衍生物、 其立体异构体、 或其无生理毒性的 盐, 以及药学上可接受的载体或辅料。

7. 一种 HIV融合抑制剂, 其含有至少一种权利要求 1-5中任 一项所述的式 I多肽、 其衍生物、 其立体异构体、 或其无生理毒 性的盐。

8. 权利要求 1-5中任一项所述的式 I多肽、 其衍生物、 其立 体异构体、或其无生理毒性的盐在制备 HIV融合抑制剂中的用途。

9. 权利要求 1-5中任一项所述的式 I多肽、 其衍生物、 其立 体异构体、 或其无生理毒性的盐在制备用于治疗或预防 HIV感染 相关疾病尤其是艾滋病的药物中的用途。

10. 权利要求 1-5中任一项所述的式 I多肽、 其衍生物、 其立 体异构体、 或其无生理毒性的盐的使用方法, 其包括将有效量的 权利要求 1-5中任一项所述的式 I多肽、 其衍生物、 其立体异构 体、 或其无生理毒性的盐施用给有此需要的受试者。

Description:
抗 H I V感染的多肽、 组合物以及用途 技术领域

本发明属于生物医药领域, 涉及一种抗 HIV感染的多肽, 具 体地, 涉及式 I所示的多肽、 其衍生物、 其立体异构体、 或其无 生理毒性的盐。 本发明还涉及含有上述的式 I多肽、 其衍生物、 其立体异构体、 或其无生理毒性的盐的药物组合物, 以及式 I多 肽、 其衍生物、 其立体异构体、 或其无生理毒性的盐在治疗或预 防 HIV感染所致相关疾病尤其是获得性免疫缺陷综 合征 ( AIDS, 即艾滋病) 的用途。

Yl— IXblELX e lBB— SXb2ELX e 2BB— IXb3EXd3Xe3BB— X a 4Xb4EXd4Xe4BB— Y2 式 I 。 背景技术

艾滋病目前在世界范围内流行, 给人类健康带来严重威胁。 人免疫缺陷病毒 I型 ( HIV- 1 )是造成 AIDS感染的主要病原体。 由于传统的逆转录酶抑制剂及蛋白酶抑制剂耐 药性问题日益突 出, 使得开发作用于 HIV- 1 生命周期新靶点药物成为共识。 HIV 融合抑制剂 ( HIV fus ion inhibi tors )是干扰病毒进入靶细胞的 新一类抗 HIV药物, 与传统的酶抑制剂不同, 它作用于细胞外, 在感染的初始环节切断病毒的传播, 这对于预防及控制 HIV- 1感 染具有特殊意义, 因而成为新机制抗 HIV药物研究的热点。

HIV融合抑制剂以 HIV- 1 融合蛋白 gp41为作用靶标, gp41 是介导 HIV- 1与靶细胞膜融合的功能蛋白质。 HIV融合抑制剂通 过抑制 gp41促进膜融合的核心六聚体结构( 6- HB )的形成, 从而 抑制病毒进入靶细胞。 T- 20是第一个也是目前唯一上市的 HIV-1 融合抑制剂, 它是衍生于 HIV- 1 gp41 HR2功能区的天然序列 36 肽(称为 C肽) , 于 2003年被 FDA批准。 T20能够与 gp41结合, 从而竟争性抑制 gp41 介导融合的功能性核心结构形成, 阻断 HIV-1与靶细胞膜的融合过程, 抑制病毒感染靶细胞。

尽管 T- 20的发现开辟了利用肽类药物控制 HIV的新领域,但 由于其本身存在的一些缺陷和不足, 限制了 T20的广泛应用。 首 先是耐药性, 由于 T20完全衍生于 gp41天然序列,对靶标突变的 敏感性高, 靶标序列单个氛基酸残基突变即会导致 T20活性降低 10倍, 两个残基突变则会使其活性降低 100倍。 因此, T20的天 然序列虽然最大限度地保持了天然配基的结构 , 但亦由于靶标 HIV-1 gp41序列的高突变性而导致病毒容易对 T20产生耐药性。 其次, T20 易被蛋白酶降解, 体内生物利用度低。 因此, 如何克 服耐药性以及提高酶解稳定性, 是新一代 HIV融合抑制剂研究的 主要方向。

目前的 HIV- 1肽类融合抑制剂, 主要是基于活性天然配基序 列的优化及改造。 如第一代融合抑制剂 T- 20, C34等是直接衍生 于 gp41 HR2的天然序列; 第二代 T1249、 西夫韦肽、 T1144等则 是在天然序列的^?上, 对其中非保守 ^酸残基进行删除替换 而得到的。 基于天然配基序列的设计有其合理性及可行性 , 但由 于天然起源序列对耐药性突变的高敏感性, 这种设计具有一定局 限性。

基于上述原因, 本发明人提出了基于靶标结构的非天然起源 序列的抗 HIV活性肽设计思想:基于靶标 gp41 HR1螺旋三聚体的 三维晶体结构, 应用计算机辅助的理性设计方法, 从头设计非天 然序列的 (X螺旋肽, 模拟天然 C肽的活性构象, 与靶标结合而产 生相应的生物学功能, 由此设计全新结构的抗 HIV活性多肽。 利 用非天然序列与天然序列完全非同源性特点, 探索抑制耐药性的 新思路。 由此而完成了本发明内容。 发明内容

本发明目的是设计新的完全非天然序列的抗 HIV感染多肽, 并具有与天然序列相当或更高的抑制 HIV感染活性, 同时能够抑 制 T20耐药性 HIV毒株。

本发明的一个方面涉及式 I所示的多肽、 其衍生物、 其立体 异构体、 或其无生理毒性的盐,

Yl— IXblELX e lBB— SXb2ELX e 2BB— IXb3EXd3Xe3BB— X a 4Xb4EXd4Xe4BB— Y2 式 I

其中,

^为能够与 HIV- 1 gp41 N- trimer表面疏水性口袋区结合的 7 - 14个氛基酸残基的肽序列或小分子化合物, 或者 缺失;

X bi 、 X b2 、 X b3 分别独立地为 D型或 L型的天然或非天然的酸性 氨基酸或亲水性氛基酸;

X b4 为 D型或 L型的天然或非天然的酸性氛基酸或疏水性氛 酸;

Xei. X e2 、 X e3 、 X e4 分别独立地为 D型或 L型的天然或非天然疏 水性氛基酸;

X d3 、 X d4 分别独立地为 D型或 L型的天然或非天然疏水或亲水 性氛基酸;

X a4 为 D型或 L型的天然或非天然亲水性氛基酸;

B为 D型或 L型的天然或非天然碱性氛基酸;

L为与脂膜作用的 7- 14个 ^酸残基的肽序列、胆固醇、或 6个碳原子以上的长链脂肪酸, 或者 L缺失。 本发明所用术语"立体异构体"是指式 I多肽的 D-或 L-立体构 型。

在本发明的一个实施方案中, L选自如下的序列: MEWDRE- (完整序列对应于 SEQ ID NO: 4) 、 WEEWDKK- (完整序列对应于 SEQ ID NO: 49 ) 、 WEEWRKK- (完整序列对应于 SEQ ID NO: 50 ) 、 WEEWAKK (完整序列对应于 SEQ ID NO: 51 ) 、 WEEWIKK- (完整序 列对应于 SEQ ID NO: 52 ) 、 WEEWSKK- (完整序列对应于 SEQ ID NO: 53), TWMEWDRE-(完整序列对应于 SEQ IDN0: 36)、 MT MEWDRE- (完整序列对应于 SEQ ID NO: 37) 、 NMT MEWDRE- (完整序列 对应于 SEQ ID NO: 38) 、 NNMTWMEWDRE- (完整序列对应于 SEQ ID NO: 39 )、 WNNMTWMEWDRE- (完整序列对应于 SEQ ID NO: 40 )、 IWNNMTWMEWDRE- (完整序列对应于 SEQ ID NO: 41 ) 、 和 QI WNNMTWMEWDRE- (完整序列对应于 SEQ ID NO: 42) ;

X bl 、 X b2 、 X b3 、 X b4 分别独立地选自 D型或 L型的如下氛基酸: 谷氨酸( E ) 、 谷酰胺( Q )、 天冬酰胺( N )、 丝氨酸( S )、 苏 氨酸(T) 、 和酪氛酸(Y) ;

X el 、 X e2 、 X e3 、 X e4 分别独立地选自 D型或 L型的如下氛基酸: 异亮氨酸(I) 、 纈氨酸(V)、 正亮氨酸(Nle)、 亮氨酸(L) 、 和丙氨酸(A);

X d3 、 X d4 分别独立地选自 D型或 L型的如下氛基酸:亮氨酸 ( L )、 正亮氨酸(Nle) 、 谷酰胺(Q)、 天冬酰胺(N)、 和丝氨酸(S);

X a4 选自 D型或 L型的如下氛基酸:丝氨酸(S)、谷酰胺(Q)、 天冬酰胺 (N);

B选自 D型或 L型的赖氨酸(K)或精氨酸(R) ;

L选自如下的序列或小分子: - WASLWNWF (完整序列对应于 SEQ ID NO: 43) 、 胆固醇、 和 CH 3 (CH 2 ) n C00H, 其中, n为 4一16 的整数; 优选地, n为 6, 10, 12, 14, 16。

在本发明的一个实施方案中, 所述的式 I多肽、 其衍生物、 其立体异构体、 或其无生理毒性的盐, 其中, 所述式 I多肽选自 如下的化合物:

1. ME DRE AEELAKK AEELAKK AEELAKK AEELAKK (SEQ ID NO: 1)

2. ME DRE IEELAKK SEELAKK IEEQAKK QEESAKK (SEQ ID NO: 2)

3. WMEWDRE IEELIKK SEELAKK IEEQAKK QEESAKK (SEQ ID NO: 3)

4. WMEWDRE IEELIKK SEELIKK IEEQIKK QEESIKK (SEQ ID NO: 4)

5. WMEWDRE IEELIRR SEELIRR IEEQIRR QEESIRR (SEQ ID NO: 5)

6. WMEWDRE IAELIKK SAELIKK IAEQIKK QAESIKK (SEQ ID NO: 6)

7. WMEWDRE IQELIKK SIELIKK IQEQIKK QIESIKK (SEQ ID NO: 7)

8. WMEWDRE IEELAKK SEELAKK AEELAKK AEELAKK (SEQ ID NO: 8)

9. WMEWDRE IEELAKK SEELIKK IEEQIKK QEESIKK (SEQ ID NO: 9)

10. WMEWDRE IEELIKK SEELIKK IEEQAKK QEESIKK ( SEQ ID NO: 10)

11. WMEWDRE IEELIKK SEELAKK IEEQIKK QEESIKK ( SEQ ID NO: 11)

12. WMEWDRE IEELIKK SEELIKK IEEQIKK QEESAKK ( SEQ ID NO: 12)

13. AEELAKK AEELAKK AEELAKK AEELAKK ASL N F (SEQ ID NO: 13)

14. IEELAKK AEELAKK AEELAKK AEELAKK ASL N F (SEQ ID NO: 14)

15. AEEFAKK AEELAKK AEELAKK AEELAKK WASLWNWF (SEQ ID NO: 15)

16. IEEFAKK AEELAKK AEELAKK AEELAKK WASLWNWF (SEQ ID NO: 16)

17. IEEYAKK AEELAKK AEELAKK AEELAKK WASLWNWF (SEQ ID NO: 17)

18. IEEFAKK QEEVAKK AEELAKK AEELAKK WASLWNWF (SEQ ID NO: 18)

19. IEEFAKK QEELAKK AEELAKK AEELAKK WASLWNWF (SEQ ID NO: 19)

20. IEEFAKK QEELAKK IEELAKK AEELAKK WASLWNWF (SEQ ID NO: 20)

21. IEEFAKK QEELAKK VEELAKK AEELAKK WASLWNWF (SEQ ID NO: 21)

22. IEEFAKK QEEVAKK IEELAKK AEELAKK WASLWNWF (SEQ ID NO: 22) 23. IEEFAKK QEEVAKK IEELAKK IEELAKK ASL N F (SEQ ID NO: 23)

24. IEEFAKK SEELAKK AEELAKK AEELAKK ASL N F (SEQ ID NO: 24)

25. IEEFAKK SEELAKK IEELAKK AEELAKK WASLWNWF (SEQ ID NO: 25)

26. IEEFAKK SEELAKK VEELAKK AEELAKK WASLWNWF (SEQ ID NO: 26)

27. IEEFMKK QEEVMKK IEELMKK IEELMKK WASLWNWF (SEQ ID NO: 27)

28. IEEFSKK SEELSKK IEELSKK AEELSKK WASLWNWF (SEQ ID NO: 28)

29. ISEFAKK SSELAKK ISELAKK ASELAKK WASLWNWF (SEQ ID NO: 29)

30. EEFAKK SEELAKK IEELAKK AEELAKK WASLWNWF (SEQ ID NO: 30)

31. YEEFAKK SEELAKK IEELAKK AEELAKK WASLWNWF (SEQ ID NO: 31)

32. Nal-EEFAKK SEELAKK IEELAKK AEELAKK WASLWNWF ( SEQ ID NO: 32) ;

33. IEEFAKK SEELAKK IEELAKK AEELAKK ASL N FRGD ( SEQ ID NO: 33);

34. RGDIEEFAKK SEELAKK IEELAKK AEELAKK WASLWNWF ( SEQ ID NO: 34 ) ;

35. ME DRE I EEL IKK QEELIKK IEESIKK QEESIKK (SEQ ID NO: 35);

36. T ME DRE I EEL IKK SEELIKK lEEQIKK QEESIKK ( SEQ ID NO: 36 );

37. MT ME DRE IEELIKK SEELIKK lEEQIKK QEESIKK ( SEQ ID NO: 37);

38. NMT ME DRE IEELIKK SEELIKK lEEQIKK QEESIKK ( SEQ ID NO: 38 );

39. NNMT ME DRE IEELIKK SEELIKK lEEQIKK QEESIKK ( SEQ ID NO: 39 );

40. WNNMTWMEWDRE IEELIKK SEELIKK lEEQIKK QEESIKK ( SEQ ID NO: 40);

41. I WNNMTWMEWDRE IEELIKK SEELIKK lEEQIKK QEESIKK ( SEQ ID NO: 41 );

42. QIWNNMTWMEWDRE IEELIKK SEELIKK lEEQIKK QEESIKK ( SEQ ID NO: 42)

43. IEELIKK SEELIKK lEEQIKK QEESIKK WASLWNWF ( SEQ ID NO: 43)

44. WMEWDRE IEELAKK SEELAKK IEELAKK AEELAKK (SEQ ID NO: 44 )

45. WMEWDRE IEELAKK SEELAKK IEEQAKK AEELAKK (SEQ ID NO: 45)

46. WMEWDRE IEELAKK SEELAKK IEEQAKK QEELAKK (SEQ ID NO: 46)

47. WMEWDRE IEELIKK SEELIKK IEEQAKK QEESAKK (SEQ ID NO: 47)

48. WMEWDRE IEELIKK SEELIKK lEEQIKK QEESAKK (SEQ ID NO: 48 ) 49. EE DKK I EEL IKK SEEL IKK IEEQIKK QEESIKK ( SEQ ID NO: 49 ) ;

50. EE RKK I EEL IKK SEEL IKK IEEQIKK QEESIKK ( SEQ ID NO: 50 ) ;

51. EE SKK I EEL IKK SEEL IKK IEEQIKK QEESIKK ( SEQ ID NO: 51 ) ;

52. EE IKK I EEL IKK SEEL IKK IEEQIKK QEESIKK ( SEQ ID NO: 52 ) ; 以 及

53. EE AKK I EEL IKK SEEL IKK IEEQIKK QEESIKK ( SEQ ID NO: 53 ) 。 其中, SEQ ID NO: 1、 SEQ ID NO: 13、 SEQ ID NO: 15所示 序列为阴性对照序列。 在本发明的一个实施方案中, 所述的式 I多肽、 其衍生物、 其立体异构体、或其无生理毒性的盐,其选自 上面的化合物 2 - 9、 20、 24 - 26、 30 - 34以及 44 - 53。 本发明的另一个方面涉及一种药物组合物, 其含有至少一种 上述的式 I多肽、 其衍生物、 其立体异构体、 或其无生理毒性的 盐, 以及药学上可接受的载体或辅料。 本发明的还一个方面涉及一种 HIV融合抑制剂, 其含有至少 一种上述的式 I多肽、 其衍生物、 其立体异构体、 或其无生理毒 性的盐。 本发明的还一个方面涉及上述的式 I多肽、 其衍生物、 其立 体异构体、或其无生理毒性的盐在制备 HIV融合抑制剂中的用途。 本发明的还一个方面涉及上述的式 I多肽、 其衍生物、 其立 体异构体、 或其无生理毒性的盐在制备用于治疗或预防 HIV感染 相关疾病尤其是艾滋病的药物中的用途。 本发明的还一个方面涉及一种治疗或预防 HIV感染相关疾病 尤其是艾滋病的方法, 所述的方法包括对给予接受治疗或者预防 的对象有效量的式 I多肽、 其衍生物、 其立体异构体、 或其无生 理毒性的盐。 在本发明中, 术语 "天然" 是指自然存在的, 未经人为修饰 的, 如 HIV- 1 gp41本身的氛基酸序列等。

在本发明中, 术语 "非天然" 是指人为设计的, 与天然不同 的, 如对直接衍生的天然序列经改造、 修饰后的序列等。

在本发明中, 术语 "疏水性氛基酸" 是指侧链为疏水性基团 的 ^酸, 包括: Ala, Val, Leu, He, Met, Phe, Trp等。

在本发明中, 术语 "亲水性氛基酸" 是指侧链含有能与水作 用形成氢键的亲水基团的 ^酸,包括: Ser, Thr, Cys, Asp, Asn, Glu, Gin, Arg, Lys, His, Tyr等。

在本发明中, 术语 "酸性氨基酸"是指侧链含羧基的氛基酸, 包括: Glu, Asp等。

在本发明中, 术语 "碱性 ^酸" 是指侧链含 ^或胍基的 氛基酸, 包括: Lys, Arg等。

在本发明中, 术语 "与脂膜作用" 是指能够与细胞膜的脂质 双份子层作用的疏水基团或肽序列, 包括: 胆固醇, 长链脂肪酸 等。 具体实施方式 下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详 细描述, 但是 本领域技术人员将会理解, 下列实施例仅用于说明本发明, 而不 应视为限定本发明的范围。 实施例中未注明具体条件者, 按照常 规条件或制造商建议的条件进行。 所用试剂或仪器未注明生产厂 商者, 均为可以通过市购获得的常规产品。

在本发明中使用的缩写具有下面的含义:

AIDS (Acquired Immure Def iciency Syndrome) 艾滋病, 获得 性免疫缺陷综合征

Ala (Alanine, A) 丙氨酸 Arg (Arginine, R) 精氨酸 Asn (Asparagine, N) 天冬醜氨

Asp (Aspartic acid, D) 天冬氨酸

DCM (Dichloromethane) 二氯甲坑

DMF (N, N-Dimethyl malonate) 二甲基甲酰胺

Env (Envelope glycoprotein) 包膜糖蛋白

ESI- MS (Electronic spray ion mass spectroscopy)电喷雾廣谱 Fmoc (Fluorenylmethoxycarbonyl) 努甲氧叛基

Gly (Glycine, G) 甘氨酸 Gin (Glutamine, Q) 谷酰氨 Glu (Glutamic acid, E) 谷氨酸 6-HB (s ix-hel ix bundle) 六螺旋体

HBTU 2- (1Η-1 -羟基苯并三唑) - 1, 1, 3, 3 -四甲基脲六氣磷酸 His (Hist idine, H) 組氨酸 HoBt (1-Hydroxylbenzotriazole anhydrous) 1 -幾基苯并三氮唾 HR1 ( N- terminal heptad repeat , NHR ) N末端重复序列

HR2 ( C-terminal heptad repeat , CHR ) C末端重复序列

HIV ( Human Immunodef iciency Virus) ) 人免疫缺陷病毒

HIV- 1 人免疫缺陷病毒 I型

HPLC (High performance l iquid chromatography)高效液相色谱 I le (Isoleucine, I) 异亮氨酸

Leu (Leucine, L) 亮氨酸 Met ( Methionine, M) 甲破氨酸

Nal 正亮氨酸 Lys (Lys ine, K) 赖氨酸

Phe ( Phenylalanine, F ) 苯丙氨酸

Ser (Serine, S) 丝氨酸

TFA (trif luoroacetic acid) 三氟乙酸

Thr (Threonie, T)

Trp (Tryptophan, W)

Tyr (Tyrosine, Y)

Val ( Val ine, V)

实施例所用固相合成载体 Rink 酰胺树脂为天津南开合成责 任有限公司产品; HBTU、 H0BT、 DIEA以及 Fmoc保护的天然氛基 酸或 D型的非天然氛基酸为上海吉尔生化公司以及 都诚诺新技 术有限责任公司产品。 N-甲基吡咯烷酮(腿 P )为 ACR0S公司产品; 三氟乙酸(TFA )为北京博迈杰科技有限公司产品; DMF、 DCM为 韩国三星公司产品; 色谱纯乙腈为 Fisher公司产品。其它试剂如 无说明均为国产分析纯产品。

实施例 1: 化合物 4的制备

采用标准的 Fmoc固相多肽合成方法。所有肽序列均 C端为酰 胺化, N端为乙酰化。 选用 Rink Amide树脂, 氛基酸为 L酪构翔苏色型, 肽链由 C端向 N端延长。 缩合剂为 HBTU/H0Bt/DIEA。 脱保护剂氣氣氣氣为 酸酸酸酸 哌啶 /DMF 溶液。 裂解剂为三氟乙酸(TFA ) , 粗肽水溶解后冻干 保存。 用中压液相色谱法或高压液相色谱法 (HPLC )进行分离纯 化, 纯肽含量>90%。 基质辅助激光解析飞行时间质谱 ( MALDI-T0F-MS )确定肽序列分子量。

微波多肽合成条件如下:

氛基酸: 0. 2M 的 DMF溶液,

活化剂: 0. 45M HBTU/HOBt 的 DMF溶液,

活化碱: 2M DIEA 的腿 P溶液,

脱保护剂: 20% v/v 哌啶的 DMF溶液, 封闭试剂: 20% v/v 乙酸酐的 DMF溶液。

称取 Rink Amide树脂 0. 5g (0. 25mmol)置入 CEM微波多肽合 成仪反应器中, 然后将氛基酸, 活化剂, 活化碱, 脱保护试剂, 封闭试剂按上述浓度配置好后, 用 CEM微波全自动多肽合成仪进 行合成。 完成后肽树脂用 DMF洗涤 3遍后用无水甲醇收缩, 室温 真空干燥, 得肽树脂 2. 05g。

裂解液(体积百分比): 三氟乙酸: 乙二硫醇: 间甲盼: 水= 82. 5 : 10 : 5 : 2. 5。

肽树脂的裂解: 称取微波合成仪合成好的肽树脂 2. 05g, 放 入 250ml 茄形瓶中, 冰浴, 电磁搅拌。 按 1克肽树脂加入 10ml 的量配制裂解液。 TFA需预先冰浴降温 30min或者预先存放于冰 箱中使用; 将配制好的裂解液加入到冰浴条件下的肽树脂 中, 电 磁搅拌, 树脂变橙红色, 冰浴条件下反应 30min, 然后, 撤冰浴, 室温再继续搅拌反应 90min, 反应完成。 剧烈搅拌下向反应器中 加入冷乙醚 200ml, 析出白色沉淀, 继续搅拌 30min; 用 G4的砂 芯抽虑漏斗滤出析出物, 用冷乙醚反复洗涤 3遍, 晾干。 加入双 蒸水 50ml, 乙腈 5ml 使固体充分溶解, 抽虑, 滤液冻干得粗肽 1. 03g e

所得粗肽用中压或高压色谱进行纯化。 色傳柱为 C18柱, 洗 脱剂为乙腈, 7j及少量乙酸。 具体操作步骤: 称取粗肽 1. 00g, 加水 20ml, 乙腈 5ml使固体溶解, 离心 10min (3000转 /分钟), 取上清液上样。色谱柱预先用 15%乙腈 /水 /0. 1%冰乙酸溶液 200ml 平衡。 上样后继续用 15%乙腈 /水 /0. 1%冰乙酸溶液 200ml冲洗, 高效液相检测洗脱液成分。根据液相检测结果 逐渐升高乙腈含量, 直至所纯化的多肽主峰被洗脱出来。 合并洗脱液, 旋转蒸发去除 大部分溶剂, 冻干得纯肽, HPLC检测含量大于 90%。 纯肽经 MALDI- TOF- MS或者 ESI质谱确证其分子量(见表 1 )。 实施例 2 - 53: 化合物 1-3, 5 - 53的制备

编号 1 -编号 3以及编号 5-编号 53的化合物按实施例 ( 1 ) 方法合成, 所述氛基酸均为 L构型, 只是相应的氨基酸残基进行 了替换。 化合物 1 - 34以及 44 - 53的分子量见下面的表 1。 实施例 45: 抑制 HIV- 1生物活性检测

1 )化合物抑制 HIV- 1介导的细胞-细胞融合活性评价( IC 5 。) 染色转移法检测 HI V-1介导的细胞-细胞融合: HIV- 1„ IB 感染 的 H9细胞(H9/HIV- 1„ IB )被一种荧光试剂 Calcein- AM (Molecular Probes, Inc. , Eugene, OR)标记, 然后, 在 96孔板中每孔加入 50μ1已标记的 H9/HIV-l mB 细胞(2 x l07ml), 再加入 50μ1不同浓 度的受试样品(所测试实施例 1 - 34和 44-53制备的化合物 ,从 25(^g/ml浓度两倍梯度稀释), 37 温育 30 min; 然后每孔加入 MT-2细胞 100 u 1 (1 x 107ml) , 37 温育 2 h。 融合及未融合的

Calcein标记 HIV- 1感染的 MT- 2细胞(MT- 2为一种常用的效应细 胞, 在本实验中用于模拟 HIV感染的靶细胞, 商购获得)用反向 荧光显微镜(Zeiss, Germany )计数。 计算 IC 5 。值。

2 ) ELISA检测化合物抑制 gp41 6- HB形成活性 ( IC 5 。) 在该检测中, 使用化合物 1 - 34作为待测化合物, 同时使用 T - 20 ( SEQ ID NO: 54 )和 C34 ( SEQ ID NO: 55 ) , 作为阳性对 照物(这二者分别为已知结构及活性的阳性对 照物)。夹心 ELISA 方法检测 C肽(C肽是对衍生于 gp41 CHR功能区的多肽的简称, 系本研究领域熟知的名词, 本发明中的所有化合物均属于 C肽范 围。 )抑制 gp41 6- HB形成活性:测试化合物(实施例 1 - 34制备 的化合物)从 25(^g/ml浓度两倍梯度稀释。 Ν36肽 (与 C肽类似, Ν肽系衍生于 gp41 NHR区域的多肽, N36是 N肽的一种, 为本研 究领域所熟知。 )2μΜ)与待测样品混合, 在 37 C预培养 30min 再加入 C34 (2μΜ) , 37 C温育 30min, 然后将它们加入到己封闭 好的酶标板(Costar, Corning Inc. , Corning, NY)中, 37 C温 育 lh;依次加入 6- HB特异性单克隆抗体 NC- 1,生物素标记的 IgG SA-HRP, TMB。 检测 O nm处(以 5 7 0 nm为参比)的吸光度值。 计 算 IC 5 。值。

按照上述方法, 活性测定结果见下面的表 1

表 1: 多肽抑制 HIV介导的细胞融合及 6- HB形成活性结果

21. 06 士 376. 58士 lEELAKK AEELAKK AEELAKK AEELAKK WASLWNWF 4272

3. 16 10. 47

124. 28 士

AEEFAKK AEELAKK AEELAKK AEELAKK WASLWNWF 4972 >1000

2. 04

134. 26 士

IEEFAKK AEELAKK AEELAKK AEELAKK WASLWNWF 4306 >1000

5. 76

178· 46 士

IEEYAKK AEELAKK AEELAKK AEELAKK WASLWNWF 4322 >1000

3. 11

45. 12 士 415. 28士

IEEFAKK QEEVAKK AEELAKK AEELAKK WASLWNWF 4349

1. 27 12. 27

6. 72士

IEEFAKK QEELAKK AEELAKK AEELAKK WASLWNWF 4363 4. 59 ± 0. 28

0. 46

4. 14士

IEEFAKK QEELAKK lEELAKK AEELAKK WASLWNWF 4322 2. 87 ± 0. 15

0. 52

11. 29 士 12· 79士

IEEFAKK QEELAKK VEELAKK AEELAKK WASLWNWF 4391

0. 62 0. 78

151. 37 士

IEEFAKK QEEVAKK lEELAKK AEELAKK WASLWNWF 4391 >1000

5. 46

517· 76 士

IEEFAKK QEEVAKK lEELAKK lEELAKK WASLWNWF 4433 >1000

10. 24

5. 41 士

IEEFAKK SEELAKK AEELAKK AEELAKK WASLWNWF 4322 4. 24 士 0· 24

0. 28

2. 17 ±

IEEFAKK SEELAKK lEELAKK AEELAKK WASLWNWF 4364 1· 66 ± 0· 09

0. 15

3. 63 ±

IEEFAKK SEELAKK VEELAKK AEELAKK WASLWNWF 4350 2· 20 ± · 31

0. 24

10. 58士

IEEFMKK QEEVMKK IEELMKK IEELMKK WASLWNWF 4674 8· 59 ± 0· 54

0. 76

IEEFSKK SEELSKK IEELSKK AEELSKK WASLWNWF 4428 7· 79 ± 0· 42 >100

ISEFAKK SSELAKK ISELAKK ASELAKK WASLWNWF 4196 3. 45 ± 0· 24 >100

11. 58士

WEEFAKK SEELAKK lEELAKK AEELAKK WASLWNWF 4437 2. 74 士 0· 17

0. 50

40. 34士

YEEFAKK SEELAKK lEELAKK AEELAKK WASLWNWF 4414 6. 81 ± 0. 51

1. 63

9. 68 ±

Nal-EEFAKK SEELAKK lEELAKK AEELAKK WASLWNWF 4448 2. 75 士 0· 21

0. 35

15. 33士

IEEFAKK SEELAKK lEELAKK AEELAKK WASLWNWFRGD 4692 7· 55 ± 0. 73

0. 67

46· 26士

RGDIEEFAKK SEELAKK lEELAKK AEELAKK WASLWNWF 4692 1· 58 ± 0· 05

2. 4

1. 6074士

WMEWDRE lEELAKK SEELAKK lEELAKK AEELAKK 4271

0. 1979

12. 6940士

WMEWDRE lEELAKK SEELAKK IEEQAKK AEELAKK 4287

2. 4426

WMEWDRE lEELAKK SEELAKK IEEQAKK QEELAKK 4344 13. 7187 ± 2. 5253

0. 0428 ±

47 WMEWDRE I EEL IKK SEELIKK IEEQAKK QEESAKK 4402

0. 0372

0. 1326 士

48 WMEWDRE I EEL IKK SEELIKK IEEQIKK QEESAKK 4444

0. 0159

0. 0026 ±

49 WEEWDKK I EEL IKK SEELIKK IEEQIKK QEESAKK 4455

0. 0003

0. 0030 ±

50 WEEWRKK I EEL IKK SEELIKK IEEQIKK QEESAKK 4496

0. 0025

0. 0053 ±

51 WEEWSKK I EEL IKK SEELIKK IEEQIKK QEESAKK 4427

0. 0030

0. 0289 ±

55 WEEWIKK I EEL IKK SEELIKK IEEQIKK QEESAKK 4453

0. 0049

0. 0082 ±

53 WEEWAKK I EEL IKK SEELIKK IEEQIKK QEESAKK 4411

0. 0026

0. 0021 ±

T-20 YTSLIHS LIEESQN QQEKNEQ ELLELDK WASLWNWF 4450

0. 0004

0. 0063士

C34 WMEWDRE INNYTSL IHSLIEE SQNQQEK NEQELL 4289

0. 0012 表 1结果表明,受试化合物化合物 1 - 34以及 44 - 53均显示 了一定程度的抑制 HIV- 1介导的细胞融合及抑制 6- HB形成活性。 其中化合物 4、 49、 50、 51、 52、 53抑制 HIV- 1介导的细胞融合 活性水平与 T-20以及 C34相当。

实施例 46: 非天然 HR序列抑制 T - 20耐药性病毒株的活性 用 ELISA检测 HIV- 1衣壳蛋白 p24含量方法测定 HR序列对 T- 20耐药株的作用。96孔聚苯乙烯板用 HIVIG在 0. 85M碳酸盐緩 冲液(PH 9. 6)包被, 4°C过夜, 然后用 PBS- T緩冲液( 0. 01M PBS, 含 0. 05%吐温- 20 )洗涤,用含 1%干脱脂奶的 PBS溶液阻断。 HIV-1 病毒溶胞产物加入到反应孔中, 置 37 孵育 1小时, 洗涤。 连续 加入抗 - p24 mAb (183-12H-5C) , 生物素标记的鼠抗 IgGl, SA-HRP和 TMB。 反应完成后用 1N H2S04终止液终止反应。 用酶标 仪记录 450nm处吸光度。 计算 IC50值。 结果见表 2。 HR序列肽抑制 T- 20耐药性毒株活性结果

aNL4-3 D36G是 T-20敏感病毒林, 由它衍生出的 NL4-3 ( 36G ) V38A/N42T 和 NL4-3 ( 36G ) V38E/N42S为 T-20耐药性突变病毒林。 每个样品均检测了 3次。

由表 2结果可知, 对于敏感病毒株, T- 20抑制病毒复制形成 p24的能力较强, IC50为 18· 7ηΜ, 对于抗性病毒株 V38E/N42S , Τ-20 抑制病毒复制能力下降了约 135 倍, 对于抗性病毒株 V38A/N42T, Τ- 20的抗病毒能力下降了 267倍以上。 然而, 非天 然 HR序列 4和序列 49能够显著抑制 Τ- 20耐药毒株。其中,序列 4抑制两种 Τ- 20耐药株活性比 Τ- 20高 30及 25倍;序列 49分别 比 Τ- 20高约 25及 20倍。 表明非天然 HR序列系的作用机制可能 与 Τ-20不同。 尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描 述, 本领域技 术人员将会理解。 根据已经公开的所有教导, 可以对那些细节进 行各种修改和替换, 这些改变均在本发明的保护范围之内。 本发 明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物 给出。