白斑症病毒 蛋白 P28 特型 休及其制各方法 木領域 本 涉及 休 及其制各方法 休是 白斑症病毒 h eSpo Synd ome V s 蛋白 P28 v s P o e n 28 的 特型 及其制各 方法 于 于免疫羊和病毒羊 又 木領域。 背景 木 是一 具有 的 DN 病毒 具有很高的 能力和 能力 十分 。 內外 有的研究涉及 的形 、化羊組成和理化特性、基因 及其銅 多 、 和 往及流行病羊等方面 感染的分于 、 預防和控制 感染的 有效方法和 是目前研究的 。 病毒入侵細胞的路往之一是病毒 蛋白 特 細胞 休相 合 而侵入 感染細胞 因此 研究 吸附和侵入 細胞 中 作用的蛋白以及 細胞上的病毒特 休蛋白 研究 感染的 理和預防控制具有 又。 目前研究表明 在 和 的 蛋白中 蛋白 P28的特 休 中 和 的感染 因此 P28 在病毒感染 中 若非常 的作用。 特型 休 具有模似抗原的特性 在 羊上被 于 休研究、 自身免疫病友病 理研究和新型疫苗研究 等方面 而在水 疾病研究上 甚少 于 或 相夫蛋白的 特型 休的研究 。 及 內容 本 的目的是提供 由 細胞分泌的 S P28 特型 及其制各方法 一步 P28在病毒感染中所起的作用 S 的黏附蛋白和 細胞 休 蛋白提供新的研究思路和研究方法 而深入研究 的感染 通 病毒的感染 往 預防控制 病的目的。

本 的目的是由以下 木方案 的 W V-VP28 特型 Ab2 是由保藏 中 典型 物保藏中心 保藏日期 2009 5 11 比 保藏 CCTCC C200938的 細胞A 分泌的 是以 P28 b 抗原 各的 兔 P28 休 合 具有 合兔 P28 休的能力 且以 抗力抗原 各的 P28 特型 休 b3

合 其拮合 在 的 上 中和 感染 具有 b 特性。 各 S P28 特型 的方法 的 各方法是 純化 休內、休外中和 的具有中和性的 P28 b 抗原 免疫小鼠 以 得 細胞 小鼠P3 63 g8U1骨髓 細胞 至 將 細胞 骨髓 細胞 行細胞融合 融合細胞 免疫羊方法 得到分泌 P28 特型 的 細胞 有限 法克 得到 細胞 以 方法 所得到的 細胞 收集 或注入小 鼠腹腔 各 水 以硫酸 和 和 析方法純化 得到 P28 特型 。

的免疫羊的 方法是同接 免疫吸附 和 免疫吸附 。 的免疫羊 的 定方法是 免疫吸附 、 同接免疫 光法、 金 免疫 和 休內中和 。同接 免疫吸附 兔 P28 休 合 竟 免疫吸附 抑制兔 P28 休 的 合 同接免疫 光法、金 免疫 征安 b3 b 都能 合 休內中和 b3具有中和性。

S P28 特型 的 定方法是 以純化的 P28 特型 b2 免疫小 鼠 各 P28 特型 休 b3 免疫羊的 定方法 b3 的抗原決定 b 于 的 上 休內中和 b3具有中和性 表明 b3具有 b 特性 也就 T b2具有模似 P28特性 是 P28 特型 。

本 免疫吸附 S 合兔 P28 休 b3 同 接免疫 光法、 金 免疫 特 合井且其拮合 于 S 上 休內中和 b3 部分中和 感染 死亡。

在 品微鏡下 良好的 細胞 其外 滿、 、 光性 、 細胞大小均一、 良好 細胞有 分裂增殖能力 仗勢良好的 細胞 2 3 其 由桃紅色特 黃色 中含有 細胞分泌的 P28 特型 。

本 的抗原決定 是 b 的可 b 有中和 S 感染的特性。 本 將 特型 休 于 研究中 且建立 同接 免疫吸附 和 免疫吸附 洲的 休 同接免疫 光法、 金 免疫 和 休內中和

具有 b 特性 而 本 具有模似最初抗原 P28的特性。 的研 一步 P28在 感染中所起的作用 黏附蛋白和 細胞 休蛋白 而深入研究 的感染 的感染 往具有 的 又。 b 的特 免疫 。

2 b 的 休內中和 。 3力本 的 免疫吸附 。

4力本 及 b3的 免疫吸附 。

5 a b 的同接免疫 。

b b3的同接免疫 。

5 6 a 提純 的 。

b b 的金 免疫 。

c b3的金 免疫 。

7 b3的 休內中和 。 休 方式 0 合 休 一步 明本 。

本 的 P28 特型 是由保藏 CTCC C200938的 細胞分泌 的 具有模似 P28的特性。

本 的 各 P28 特型 的方法如下

1

15 的分泌 P28 b 的一株 細胞 其制各方法如下

一、 抗原的 各

1 病毒的提純 感染 瀕死中 的 胸部(去除 ) 加入以T 0. 5 T - c 01 aC m TA p 7.4 制的25 W/W 蔗糖溶液中研 磨 研磨 的 6009萬 2 m n 上 8 9萬 2 m n 上 200 9萬 2h 20 去上 以 25 蔗糖溶液 于不 蔗糖 200 9萬 2 萬

病毒 以T 6倍 200 9萬 g m n 所得 P 137m aC 2．7m C 。

8．0gm a 1．47m P p 7.4 分裝 于 80C各 。

2 將步驟 1 提純的 加入等休 十二 的 在沸水中 3 5m n 加入 n P TE N B o ad 上 中 。 取出 的 25 放在C C 可逆染色 C C 2H 5.11 于 1 m 水中 中染色 P28蛋 白各 、 、 透析、 冷冰 以PB溶解 蛋白 至 mg 分裝 50 于 。

80C。

二、 免疫小鼠

以步驟一提純的 P28蛋白 抗原 免疫Ba b c小鼠 免疫共分4 前2 30 同 2 2 免疫同 1 前2 免疫力腹腔 2 免疫力 靜脈注 1 免疫 提純的 S P28蛋白 相 完全 等休 只 100 2 加強免疫 提純的 P28蛋白 相 不完全 等休 只 10

5 3 4 加強免疫 只 提純的 P28蛋白 5 u

三、 細胞融合

1 麻醉免疫小鼠 取出 和胸腺 分別 100 阿 P 40 溶液 形成串細胞

2 分別將 細胞 和胸腺細胞 8009萬 3m n 去上 細胞 0 RP 1640溶液 胸腺細胞 含有 1 H T的 P 1640 ( 10 牛 ) 擇性細 胞

3 3X10 她于 期的P3 63 g8U1骨髓 細胞 8009萬 3m n 去 上 P 1640溶液

4 將 細胞 骨髓 細胞 混合均勻 8009萬 3m n 去上

。

15 萬心管 使西神細胞 充分 吸管吸取 到37C的聚 溶液 m 。

到萬心管內 然 在37C水浴中 5m n

。

5 欲滴 到37C的 P 1640溶液 15m

6 P 1640溶液至40m 8009萬 3m n 去上

。

7 的細胞以 到37C的 P 164 ( 10 牛 )細胞 3m1 20 8 將細胞 加入步驟(2) 各的胸腺細胞 混合均勻 到96 中

9 將 放入37C 中 品微鏡 細胞生 況 細胞 。

、 和

1 初步

25 細胞 到 96 的 底面 1 3 同接免疫 光法初步 的 細胞 。

感染 的 生理 水 水分 CT 冰冰切片 。

切片厚度5 。 切片 至 玻片上 自然 固定 2 C保存各

。

吸取 細胞 加在切片上 37C況 中孵育45m n

30 (3) 0．05 2 的PB PB T 3 5m n

。

將 的羊 小鼠 休 加在切片上 37C況 中 孵育 45m n 取出 玻片 同步驟 。

2

有限 孔的 細胞 步驟如下

麻醉小鼠 胸腺 成串細胞

胸腺細胞 8009萬 3m n 去上 m P 1640( 10 牛 ) 細胞

孔的 細胞 100 加入 m 胸腺細胞 中

細胞 滴管 均勻 到96 中 100 1 平均每 含有 一介 細胞

放入37C 中

西周 按照本 步驟 1 方法 孔的 細胞

把所得 孔的 細胞 上 方法再 隆一 以 休 。

3

用特 免疫 初步 得到的 的 細胞 中

P28 細胞

步驟一 1 中提純的病毒加入 煮沸 十二 聚丙烯 取出

剪取 相同大小的硝酸 ( 往 0．22 m)以 特

25mmo/ - a e 1g2mmo/ 20% p .3 況 剪取比 稍大的 以 特 況 按照 硝酸 的順序 有 特 液的 內 將硝酸 面向 2 mA 5h

特 取出硝酸 將硝酸 P m n 然 放入3%的 。

牛 蛋白溶液中37C封閉 h

O P T 3 5m n

。

將硝酸 休 細胞 中 37C孵育 h 同 法 洗

。 將硝酸 放入 磷酸 的羊 小鼠 9 休(1:4000 )中 37C孵 育 h 同 法洗

將硝酸 放入 磷酸 T- CP 中 百到顏色 萬于水 終止反 。

4 休內中和 具有中和性的 P28 休

將上 1中的一 1 提純的 PB 100 以

細胞 等休 混合力 以 S 骨髓 細胞 等休 混合力 以骨髓 細胞 各 室溫 2h

休內中和 。

分別 的腹面第三 皮下注 5 u

和 各 相同 每天 水 。 之 每天早晚 汞死亡 。 同接免疫 光法初步 得到的 10 細胞分泌的 特 合 有限 10 細胞 特 免疫 、 休內中和 T 抗原決定 于 蛋白 P28 上 具有明品中和性的 P28 于 特型 的研 。 1、 2。 1 中 M是 于 蛋白 的 染色 是提純 的 染色 1是將 b 特 的 S 蛋白帶反 b 于量力 28kDa的蛋白。 2中 是將骨髓 細胞 孵育 休內 15 中 的死亡率 化 在 1 死亡 7 死亡率即 到 100 是將骨髓 細胞

休內 15 中 的死亡率 化 到 15 死亡率 5 b 是將 b 孵育 休內 15 中 的死亡率 化 5 死亡 15 死亡率 到 0

2

P28 特型 休的 各

一、 抗原的 各

Ba b c小鼠 只腹腔 0．5m 休 10天后腹腔 分泌 P28 休( b )的 細胞 密切 小鼠 14 左右小鼠腹部膨大 抽取 水。 水 辛酸 硫酸 初步純化 再以 P o n ga ose ( me ham) 純化 2mg m 分裝各 。

二、 免疫小鼠

以本 一提純的 b 作力抗原 免疫Ba b c小鼠 免疫共分5 前2 免 疫同 2 3 免疫同 1 前2 免疫力腹腔 3 免疫力 靜脈注 。

1 免疫 提純的 b 相 完全 等休 只 0

2 加強免疫 提純的 b 相 不完全 等休 只 10 u 3 5 加強免疫 只 提純的 b 5 三、 細胞融合

按照 1步驟三所 方法 行細胞融合。

、 和

1 初步

融合 的 細胞 到96 的 底面 1 3 同接 免疫吸附 初步 S P28 特型 休 細胞。

以純化的 P28蛋白免疫新西 白兔 各兔 S P28 休 辛 酸硫酸 純化 碳酸 p .6 至蛋白 0． 2mg m 以 100 1加 。

入96 4C

P T 3 r

。

加入200 3 的牛 蛋白 37C封閉

同步驟

。

加入 細胞 1 以骨髓 細胞 37C孵育 h 同步驟

加入 磷酸 的羊 小鼠 9 1 4000 37 h 同步驟 加入 1 4硝基 磷酸 pNPP 她反 5 3 m n 加入 2 的Na 終止 3 5m n 以 洲各 405nm 她 的 D佰。 各 D佰之比 P N 尚P N 2．1 。

2 按照 1 2 中步驟 © 出力 孔的 細胞 。 西周 按照本 1 步驟 ® 孔的 細胞 把所得 孔的 細胞再 隆一 以 休 。

3

初步 得到的 細胞 6 分別命名 、 B、 C、 D、 E、 F 分別注 入小鼠腹腔 水 免疫吸附

1一 1 中提純的 碳酸 1 40 以 1 。

加入96 中 4C

PB T 3 m n

。

加入2 3 的牛 蛋白 37C封閉 h

同步驟

兔 P28 休 40 g m 、 B、 C、 D、 E、 F分別以 PB

。 1 00 000倍 休 分別 兔 P28 休等休 混合力 4C 加入 1 混合 37 CW h 以 PB 代替 抗力 同步驟

加入 100 1 磷酸 的羊 兔 9 1 4000 37

同步驟 加入 100 14硝基 磷酸 pNPP 她反 5 m n 加入 1 2 的Na H終止 3 5m n 以 洲各 405nm 她的 D佰。 按照抑制 = 1 O O " X 0 的公式 抑制 。

出的 合兔 S P28 休 休 倍 的 增加 抑制 降低 3。 是由保藏 CTCC C200938的 細胞分泌的 抗力 P28 特型 休。

、

旺盛 良好的 細胞 細胞 2009萬 5m n 去上 存 液 g P 40 +1 二甲 使最終細胞密度 5X m 將 m 細胞 。

于2m 中 于 80C超低溫冰箱內 8 12h 再 氮 內 保存。 本 得 旺盛 良好的 細胞 定名 細胞 P 保藏 CTCC C200938 保藏日期 2009 5 11 。

3

本 S P28 特型 休的 免疫吸附

1步驟一 1 提純的 以碳酸 1 40 以 100 1加入 。

96 中 4C

PB T 3 5m n

。

(3) 加入2 3 的牛 蛋白 37C封閉 h

同步驟

以辛酸 硫酸 純化的本 抗力抗原 免疫Ba b c小鼠 得 b3 本 和 b3分別以 PB 10 20 40 80 160 320 640 1 280 2 560 5120倍 本 和 b3的各 再分別 40ug m 的兔 P28 。

休等休 混合力 4C 加入 1 混合 37 h 以 PB 代替本 和 b3

余步驟及拮 判定同安 2中的 3 步驟 ®

本 及 b3 抑制兔 P28 休 的 合 倍 的增加 抑制 降低 4。 P28 休 b S P28 特型 休 b3 的同接免疫 光法 。 將 b b3分別 于 1中的 1 步驟® 各的切片上 37C況 中孵育 45 n 其余步驟同安 1中的 1 步驟3

b 和 b3都能 特 合 再 的羊 小鼠 休 合 感染 的 上可 黃綠色 5a 5b。 表明 b3 合 具有 b 特性。 5 中 a是感染 的 b 孵育 再 的羊 小 鼠 g 休孵育 可 到黃綠色 。 b是感染 S 的 b3孵育 再

的羊 小鼠 g 休孵育 可 到黃綠色 。 圈中 50 。

5

P28 休 b S P28 特型 休 b3 的金 免疫 1 吸取 1 中的一 1 提純的 1 在 有支持 的 阿上 吸附 10 5m n 多余的 休 。

2 吸取 b 和 b3 各 0 1分別 在 阿上 室溫 合 2 m n

3 PB 沖洗5

4 吸取 休金 的羊 小鼠 g 休 10 1 在 阿上 室溫 合3 m n 5 同步驟 3 沖洗 再 水沖洗2

6 2 pH 6.5 30 。

在 于上 合有 休金 于 此 百接征安 b 和 b3的抗原決定 于 的 上 6b 6c。 6中 a是提純 的 照片 病毒 于純度高 完整 。 b中可 休金顆粒 合在 上 此 b 的抗原決定 于 上。c中可 休金顆粒 合在 上 此 b3的抗原決定 于 上。 圈中 1 nm

6

按照 1中的 方法 休內中和 征安 P28 特 休 b3 的中和性。 將 1中的一 1 提純的 PB 100 以 b3等休 混合力 以 正常小鼠 等休 混合力 以正常小鼠 活力 各 室溫 2h 休內中和 。 其余 步驟同安 1中的 4 步驟

本 用的 休內中和 是將正常小鼠 休內15 中 的死亡率 化 15 中元死亡 是將 正常小鼠 孵育的 休內 15 中 的死亡率 化 在 1 死亡 7 死亡率 100 b3是將 b3孵育的 休內 15 中 的死亡率 化 在 5 死亡 百到 15 仍有近20 的 存活 7。

本領域的普通 木人 都合理解 在本 的保 內 于上 修改 添加和 都是可能的 都沒有超出本 的保 。