Composition antivirale

La présente invention concerne le domaine des compositions antivirales, en particulier des compositions antivirales liées au virus de la grippe. Devant la problématique du risque de pandémie de la grippe aviaire, les solutions thérapeutiques existantes sont uniquement d'origines synthétiques et coûteuses.

En effet, comme tous les virus de type A, le sous-type H5N1 a une grande capacité à muter au cours du temps, ainsi qu'à échanger ses gènes avec des virus grippaux appartenant à d'autres types infectants d'autres espèces. Un sous-type de virus peut cesser de circuler pendant plusieurs années dans la population humaine mais rester présent dans une population animale. Si la population animale est alors en contact direct avec un être humain, elle pourra lui transmettre à nouveau le virus.

Un sous-type de virus peut également être nouvellement créé par un réassortiment génétique qui se produit lors d'une co-infection d'un hôte par deux virus différents.

Si ce nouveau virus possède des segments H5 et Nl propres au virus aviaire, il échappera complètement à la reconnaissance du système immunitaire humain. S'il possède également des gènes lui permettant de se multiplier efficacement chez les mammifères, il aura alors la faculté de se transmettre d'homme à homme aussi efficacement que la grippe classique.

L'apparition d'un virus grippal appartenant à un sous-type viral totalement inconnu de la population humaine, comme le H5N1, rend la mémoire immunitaire de l'homme totalement inefficace. C'est ce qui rend plausible une dissémination rapide et mondiale du virus.

Les experts de la grippe reconnaissent aujourd'hui qu'une nouvelle pandémie semble inévitable. Elle sera probablement causée par un virus H5N1 dérivé de la souche grippale aviaire qui circule actuellement en Asie et arrive aux portes de l'Europe. L'idée d'un vaccin n'est pas une solution satisfaisante au regard de l'évolution possible du virus lors du passage à l'homme.

Ce que l'on sait, c'est que la production d'un vaccin demandera au moins six mois une fois la souche circulante isolée et que, compte tenu de la capacité de production mondiale des fabricants de vaccins, ces six mois ne permettront pas de produire plus d'un milliard de doses monovalentes. Deux doses étant nécessaires pour acquérir une protection, moins de 500 millions de personnes, soit 14 % de la population mondiale, pourront être vaccinées. Cela fait une place particulièrement importante aux traitements antiviraux qui seront donc en première ligne pour combattre une éventuelle pandémie dans un premier temps.

La protection des populations contre l'infection par le virus de la grippe, est devenue, devant l'éventualité forte de cette pandémie, un problème de santé public Les inventeurs se sont donc intéressés aux composés permettant de protéger les organismes animaux, incluant les organismes humains, contre l'infection grippale.

Ainsi, la présente invention concerne une composition, de préférence pharmaceutique, destinée à la prévention et au traitement des infections virales induites par les virus de la famille des Orthomyxoviridae caractérisée en ce qu'elle comprend au moins quatre extraits végétaux différents choisis parmi au moins un extrait de feuilles d'olivier, au moins un extrait de pépins de pamplemousse, au moins un extrait de romarin, au moins un extrait de thé vert et/ou du curcumin en combinaison avec tout excipient, le cas échéant pharmaceutique, approprié.

Suivant un premier mode de réalisation, la composition selon l'invention comprend des extraits de feuilles d'olivier, des extraits de pépins de pamplemousse, des extraits de romarin, des extraits de thé vert et du curcumin. Avantageusement, la composition de l'invention comprend 0.01 à 100 mg/kg, de préférence 0.5 à 10 mg/kg d'extraits de feuilles d'olivier.

Avantageusement, la composition de l'invention comprend 0.01 à 100 mg/kg, de préférence 0.5 à 10 mg/kg d'extraits de pépins de pamplemousse.

Avantageusement, la composition de l'invention comprend 0.01 à 100 mg/kg, de préférence 0.5 à 10 mg/kg d'extraits de romarin.

Avantageusement, la composition de l'invention comprend 0.01 à 100 mg/kg, de préférence 0.5 à 10 mg/kg d'extraits de thé vert.

Suivant un mode de réalisation, la composition de l'invention comprend 0.01 à 100 mg/kg, de préférence 0.5 à 10 mg/kg de curcumin. Suivant un second mode de réalisation de l'invention, la composition ne comprend pas de curcumin.

Une composition préférée de l'invention comprend un extrait de feuilles d'olivier, un extrait de pépins de pamplemousse, un extrait de romarin, et un extrait de thé vert.

De préférence, la composition selon l'invention se présente sous forme de poudres compactées ou non, sous forme liquide, sous forme de solution ou dispersion, sous forme semi-solide ou gélifiée ou émulsionnée ou dispersée, ou sous forme d'aérosol.

La composition selon l'invention peut être administrée par voie orale, par injection intraveineuse, par inhalation, soit à l'aide d'un spray, d'un diffuseur, ou par imprégnation préalable dans un tissu. L'invention a également pour objet une utilisation de la composition selon l'invention, pour la prévention et/ou le traitement de maladies associées à une infection par un virus, de préférence un virus influenza.

Suivant un premier mode de réalisation, le virus est un virus influenza saisonnier. Suivant un second mode de réalisation, la composition selon l'invention est particulièrement utile pour la prévention et/ou le traitement de maladies associées à une infection par le virus influenza de type HlNl et/ou H5N1 et/ou H3N2.

L'invention a également pour objet un dispositif comprenant une composition de l'invention. Suivant un mode de réalisation préféré, ce dispositif comprend un textile tissé ou non-tissé sur lequel est apposé ou qui est imprégné d'une composition selon l'invention.

L'invention a également pour l'utilisation de la composition selon l'invention pour assainir l'air dans les lieux publics ou privés, notamment par diffusion de ladite composition dans les gaines d'aération. Plus généralement, un objet de l'invention concerne tout dispositif permettant la diffusion de la composition selon l'invention.

Ainsi, la présente invention porte sur des compositions comprenant des antioxydants, et plus particulièrement comprenant des extraits végétaux possédant des propriétés antioxydantes ayant la propriété de protéger les organismes animaux contre les attaques virales ou de traiter des organismes animaux atteints d'affection virale. Les antioxydants entrant dans les compositions selon l'invention, de par leur activité antibactérienne constituent une barrière aidant dans la prévention de nouvelles infections favorisées par l'attaque des virus. La présente invention réside dans l'association desdites substances qui permet d'en potentialiser l'efficacité.

La présente invention porte sur les virus de la famille des Orthomyxoviridae dont le virus de la grippe et plus particulièrement celui de la Grippe aviaire. La présente invention porte également des compositions pharmaceutiques ou thérapeutiques permettant l'amélioration, le traitement et la prévention de maladies associées avec les virus grippaux.

L'atteinte de l'organisme par le H5N1, virus de la grippe aviaire, se caractérise par le déclenchement d'une réaction inflammatoire exagérée, qui se traduit par une sécrétion de mucosité, type pneumonie qui entraîne une détresse respiratoire chez le sujet atteint. C'est ce symptôme qui est responsable de l'exceptionnelle sévérité de la maladie.

Les compositions selon l'invention permettent de diminuer cette réponse inflammatoire. En effet, les différents composants de la composition selon l'invention interfèrent avec les mécanismes généraux de la réponse inflammatoire de l'organisme au virus de la grippe aviaire. Les compositions selon l'invention permettent de diminuer le phénomène de détresse respiratoire qui a souvent un effet létal chez le sujet atteint, lui permettant de passer le stade critique de la maladie.

La diversité des modes d'actions sur le virus, sur sa multiplication et ses effets permettent d'envisager de nombreuses applications des compositions selon l'invention, notamment grâce aux différentes formes galéniques envisageables qui représentent un avantage essentiel de lutte contre la pandémie de la grippe aviaire.

Ainsi, les compositions selon l'invention permettent de concevoir une barrière prophylactique de contamination entre humains, dans le cas d'une pandémie, par

exemple par imprégnation des masques de protections leur assurant une efficacité plus sure et plus durable.

Dans un autre mode de réalisation, les compositions selon l'invention pourront servir d'assainisseur de l'air des lieux publics par leur diffusion, notamment en aérosol dans les gaines d'aération, ce qui permettrait de diminuer les conséquences financières d'une pandémie pour la société.

La présente invention est une association méthodique de différents actifs dont chacun est décrit dans la littérature scientifique comme agissant sur plusieurs bactéries et virus pathogènes. Le concept de l'invention est basé sur la synergie des différents actifs entrant dans les compositions de l'invention.

En effet, la multiplication du virus de la grippe est un mécanisme complexe décrit sous la forme de plusieurs étapes. La combinaison de ces différents actifs permet d'agir sur la plupart de ces étapes au lieu de se focaliser sur une étape particulière ; c'est cette approche qui permet de gagner en efficacité.

D'autre part, les compositions de l'invention comprennent des produits naturels non toxiques et pourront donc être utilisé plus facilement au niveau des différents facteurs de propagation du virus sans toxicité pour l'environnement et ses habitants.

Les extraits employés sont du type commercialisés par la société Naturex, par exemple l'extrait de pépins de pamplemousse commercialisé sous la référence

« grapefruit seed pe ws », l'extrait de feuilles d'olivier commercialisé sous la référence

« extrait de feuilles d'olivier 10% », « extrait de thé vert concentré» à 4 à 6% de caféine, de l'extrait de romarin 2%.

Suivant un premier mode de réalisation, les compositions selon l'invention ont une concentration en extraits, tous extraits confondus de 0,04 à 15 g/1, de préférence 0,04 à 10 g/1.

Avantageusement, les compositions comprennent 0,01 à 10 g/1, de préférence 0,4 à 3 g/1 d'extrait de feuilles d'olivier du type commercialisé par Naturex « extrait de feuilles d'olivier 10% ». Avantageusement, les compositions comprennent 0,01 à 10 g/1, de préférence 0,3 à 3 g/1 d'extrait de pépins de pamplemousse du type commercialisé par Naturex « grapefruit seed pe ws ».

Avantageusement, les compositions comprennent 0,01 à 10 g/1, de préférence 0,3 à 3 g/1 d'extrait de thé vert du type commercialisé par Naturex à 4 à 6% de caféine.

Avantageusement, les compositions comprennent 0,01 à 10 g/1, de préférence 0,3 à 3 g/1 d'extrait de romarin du type commercialisé par Naturex sous le nom Rosemary PE 2%.

Avantageusement, les compositions comprennent 0 à 10 g/1, de préférence 0,3 à 3 g/1 d'extrait de curcuma type commercialisé par Naturex.

Suivant un mode de réalisation préféré, les compositions selon l'invention ne comprennent que des extraits naturels végétaux et de l'eau.

Une composition préférée de l'invention comprend 0,01 à 10 g/1 d'extrait de feuilles d'olivier, 0,01 à 10 g/1 d'extrait extrait de pépins de pamplemousse, 0,01 à 10 g/1 d'extrait de romarin, et 0,01 à 10 g/i d'extrait de thé vert. Très préférentiellement, la composition de l'invention est constituée, ou constituée essentiellement, d'eau et de 0,01 à 10 g/1 d'extrait de feuilles d'olivier, 0,01 à 10 g/1 d'extrait extrait de pépins de pamplemousse, 0,01 à 10 g/1 d'extrait de romarin, et 0,01 à 10 g/1 d'extrait de thé vert.

Les concentrations décrites dans la composition de l'invention sont basées sur la mise en œuvre des extraits ci-dessus mentionnés. Il est de la compétence de l'homme du métier mettant en œuvre différentes concentrations d'extraits, d'adapter les formulations des compositions de l'invention.

Les exemples qui suivent illustrent non limitativement l'invention et se lisent en regard de la figure 1.

La figure 1 représente l'effet du ND235 sur l'infection des cellules MDCK par Influenza A Virus. En abscisse sont données des concentrations croissantes de virus et en ordonnée les valeurs d'absorption proportionnelles au nombre de cellules. Les mesures sont effectuées en absence (Control) et en présence de formulations de ND235 plus ou moins concentrées en extraits (0,04 %, 0,4 % et 4 %).

Exemple 1 : exemples de compositions de l'invention, efficacité, titre viral

Titre viral : en TCID50.

Effet : + : destruction > 60% des cellules ; + - : destruction de 30 % à 60 % des cellules ;

- : présence de 70 % à 100% des cellules.

La composition selon l'invention référencée ND235, est testée dans les exemples.

Exemple 2 : Etude de toxicité

La composition ND235 est testée dans le présent exemple 2.

Les résultats de l'étude de toxicité sont présentés dans le tableau 2 ci-dessous. Ils montrent l'innocuité du ND235.

Concentration (g/1) ND235 Témoin Cellules

Moyenne Ecart Type Moyenne Ecart Type

INDICE DE VIABILITE CELLULAIRE

7,50E+00 0,553 0,18275393 0,126 0,05201653

2,50E+00 0,84733333 0,26023515 0,173 0,05201653

8,33E-Ol 1,073 0,20751626 0,273 0,05201653

2,78E-Ol 1,70266667 0,07965132 0,282 0,05201653

9,26E-02 1,44666667 0,1268122 0,266 0,05201653

3,09E-02 0,70166667 0,04101626 0,302 0,05201653 l,03E-02 0,361 0,09534674 0,265 0,05201653

3,43E-03 0,24666667 0,09856132 0,235 0,05201653

1.14E-03 0,219 0,08758425 0,283 0,05201653

3,81E-04 0,19466667 0,0903567 0,269 0,05201653 l,27E-04 0,206 0,10742905 0,298 0,05201653

4,23E-05 0,203 0,05973274 0,259 0,05201653

Tableau 2 : Effet dose — réponse de ND235 sur la viabilité des lymphocytes humains en Culture.

Interprétation :

1) Quelle que soit la concentration de ND235, les valeurs des indices de viabilité (de 0,2 à 1,7) sont supérieures aux valeurs des témoins cellules sans produit (de 0,2 à 0,3). Ceci montre que le ND235 n'est pas toxique même aux concentrations les plus élevées de IgJl.

2) Dans les concentrations supérieures à 2 10 ^"3 g/1 (lignes 8 à 1), le ND235 stimule la croissance cellulaire par rapport au témoin cellulaire avec un pic d'activité à la concentration de 0,3 g/1 (ligne 4)

On remarque que le ND235 n'est pas toxique puisqu'au contraire, il stimule la croissance cellulaire lorsque ses concentrations sont supérieures ou égales à 2 10 ^"3 g/1.

Après avoir vérifié la non-toxicité du ND235 sur des cellules humaines sanguines en culture, nous avons étudié l'éventuelle toxicité sur d'autres types tissulaires qui sont plus susceptibles à l'infection par le virus de la grippe, les cellules rénales MDCK.

Exemple 3 :

La toxicité a été évaluée dès l'ajout du produit (toxicité aiguë) et 24h après l'ajout du produit (éventuel effet cytostatique).

Concentration Témoin Association 1 Association 2 Association 3 Association 4 ND235

(g/1) Sans Produit

INDICE DE VIABILITE CELLULAIRE

1.00E+01 0,370 ± 0,039 1,773 ± 0,022 1,896 ± 0,061 1,764 ± 0,022 1,726 ± 0,013 1,839 ± 0,020

3,33E+00 0,353 ± 0,045 1,820 ± 0,136 1,682 ± 0,389 1,634 ± 0,099 1,749 ± 0,061 1,817 ± 0,053

1,11E+OO 0,350 ± 0,065 1,746 + 0,122 1,617 ± 0,182 1,476 ± 0,029 1,686 + 0,105 1,531 ± 0,100

3,70E-Ol 0,364 ± 0,067 1,545 ± 0,089 1,305 ± 0,051 1,443 ± 0,127 1,421 ± 0,036 1,198 ± 0,048

1,23E-Ol 0,391 ± 0,081 0,772 ± 0,088 0,692 ± 0,073 0,720 ± 0,082 0,775 ± 0,072 0,692 ± 0,042

4,12E-02 0,398 ± 0,038 0,489 ± 0,039 0,484 ± 0,058 0,484 ± 0,071 0,479 + 0,075 0,515 ± 0,055 l,37E-02 0,389 ± 0,050 0,431 ± 0,029 0,446 ± 0,035 0,440 ± 0,037 0,449 ± 0,042 0,444 ± 0,037

4,57E-03 0,336 ± 0,061 0,412 ± 0,053 0,411 ± 0,075 0,393 ± 0,059 0,376± 0,068 0,365 ± 0,078

Tableau 3 : Effet direct en dose - réponse de ND235 et de diverses associations de ses principes actifs sur la viabilité des MDCK en Culture.

Interprétation :

1) Quelle que soit la concentration de ND235 ou des différentes associations de ses principes actifs, les valeurs des indices de viabilité (de 0,3 à 1,9) sont supérieurs aux

valeurs des témoins cellules sans produit (de 0,3 à 0,4, colonne 2). Ceci montre que le ND235 n'est pas toxique même aux concentrations les plus élevées de 10 g/1.

2) Dans les concentrations supérieures à 1,7 10 ^'2 g/1 (lignes 7 à 1), le ND235 et les différentes associations de ses principes actifs stimulent la croissance cellulaire par rapport aux témoins cellulaires.

Concentration Témoin Association Association Association Association ND235

(g/1) Sans Produit 1 2 3 4

INDICE DE VIABnLITE CEL LULAπUE

1.00E+01 0,429 + 0,010 1,856 ± 0,061 1,829 ± 0,048 1,733 ± 0,118 1,770 ± 0,076 1,819 ± 0,078

3.33E+00 0,385 ± 0,004 1,638+ 0,044 1,750 ± 0,046 1,657 ± 0,044 1,715 ± 0,080 1,839 ± 0,079

U1E+00 0,429 ± 0,011 0,962+ 0,068 0,760 ± 0,019 0,866 ± 0,043 0,897 ± 0,036 0,689 + 0,018

3,70E-Ol 0,448 ± 0,018 0,610 ± 0,036 0,469 ± 0,027 0,610 ± 0,066 0,601 ± 0,030 0,477 ± 0,027

1,23E-Ol 0,476 ± 0,001 0,464 ± 0,006 0,440 ± 0,005 0,455 + 0,006 0,448 ± 0,006 0,443 ± 0,007

4,12E-02 0,443 ± 0,018 0,427 ± 0,023 0,436 ± 0,028 0,437 ± 0,035 0,437 ± 0,012 0,440 + 0,026

1.37E-02 0,448 ± 0,024 0,431 ± 0,028 0,397 ± 0,021 0,391 ± 0,020 0,403 ± 0,004 0,401 ± 0,030

4,57E-03 0,454 ± 0,047 0,462 ± 0,053 0,422 ± 0,021 0,413 ± 0,009 0,406 ± 0,034 0,389 ± 0,009 l,52E-03 0,442 ± 0,032 0,437 ± 0,014 0,434 ± 0,001 0,397 ± 0,051 0,392 ± 0,075 0,444 ± 0,004

Tableau 4 : Effet à 24h en dose - réponse du ND235 et de diverses associations de ses principes actifs sur la viabilité des MDCK en Culture.

Interprétation :

1) Quelle que soit la concentration de ND235 ou des différentes associations de ses principes actifs, les valeurs des indices de viabilité (de 0,38 à 1,84) sont supérieures aux valeurs des témoins cellules sans produit (de 0,38 à 0,45). Ceci montre que le

ND235 n'est pas toxique même aux concentrations les plus élevées de 10g/l (première ligne).

2) Dans les concentrations supérieures à 3 10 ^" g/1 (lignes 4 à 1), le ND235 et les différentes associations de ses principes actifs stimulent la croissance cellulaire par rapport aux témoins cellulaire.

On remarque que le ND235 n'est pas toxique puisqu'au contraire, il stimule la croissance cellulaire des MDCK lorsque ses concentrations sont supérieures ou égales à 0,3 g/1 .

Exemple 4 : Mode d'action du ND 235

Les phases de multiplication du virus de la grippe A peuvent être détaillées comme suit :

I) Attachement du virus à la cellule 2) Entrée dans la cellule par endocytose

3) Diminution du pH

4) Fusion, libération du contenu du virus dans la cellule

5) Entrée de TARN viral dans le noyau

6) Fabrication de nouveaux brins d'ARN viral 7) Fabrication des protéines virales

8) Sortie de TARN viral du noyau

9) Migration des éléments

10) Assemblage

I I) Bourgeonnement 12) Libération des nouveaux virus

Le ND235 agit au niveau de la cellule infectée de la manière suivante :

4.1 Action du ND235 sur l'attachement du virus à la cellule

L'amarrage du virus de la grippe à la cellule cible est permis par l'interaction entre une hémagglutinine virale et des récepteurs d'acide sialique situés à la surface des cellules (Lamb, 1989). On peut comparer ce fonctionnement à un système de clé et de serrure. Une partie de la sous unité HAl (la clé), tournée vers l'extérieur, a une forme bien particulière et reconnaît une molécule précise : l'acide sialique (la serrure), qui est présente à la surface de certaines cellules. Les deux formes se reconnaissent parfaitement. Cette reconnaissance entre l'HA et l'acide sialique entraîne l'attachement de la particule virale à la cellule cible (la clé est insérée dans la serrure).

Le ND235 bloque la multiplication du virus et diminue donc les interactions cellulaires dues à l'infection, ce concept a un effet directement destructeur du virus au niveau de la cellule atteinte, ce qui diminue l'excès de réponse immunitaire qui entraîne dans le cas de la grippe aviaire la détresse respiratoire souvent responsable de la mort du sujet infecté.

4.2 Action du ND235 sur l'étape de libération des nouveaux virus

Libération des nouveaux virus : les nouvelles particules virales restent attachées à la membrane de la cellule qui les a produits, à cause de la liaison entre l'Hémagglutinine (du virus) et l'acide sialique (de la cellule). Les protéines NA cassent cette liaison, permettant ainsi aux nouveaux virus de se détacher et d'aller infecter de nouvelles cellules cibles. Une des actions du principe actif contenu dans le ND235 va empêcher l'action de la neuraminidase (NA) qui est responsable du détachement du virus de la cellule hôte et de la libération de nouveaux virus infectieux.

Le blocage de cette libération des particules infectées dans la cellule va de ce fait diminuer le nombre de virus mis en circulation. Le ND235 va modérer la réponse inflammatoire des différentes cellules atteintes par l'attaque virale.

4.3 Conclusion sur les modes d'actions cellulaires duND235

Plusieurs principes actifs contenus dans le ND235 présentent une action reconnue contre le virus de la grippe aviaire. Les actions antivirales décrites démontrent leur efficacité en bloquant la production du virus dans la cellule, notamment au niveau des étapes 6 et 7 de régulation de la production des protéines virales et de synthèse des protéines virales efficaces.

Ainsi le nombre de virus produit sera diminué et le ND235 agira sur la cellule à l'identique des mécanismes précédents en agissant sur l'infection et ses conséquences

Une deuxième étude a été menée afin de vérifier l'effet antiviral du ND235 contre le virus de la grippe Influenza A.

Principe de l'étude :

Les cellules MDCK sont les cellules de référence pour l'étude de la multiplication du virus de la grippe de type A. Pour notre étude d'effet antiviral, nous avons choisi d'utiliser une souche de référence du virus influenza de type HlNl, la souche A/PR/8/34. Cette souche virale a été obtenue chez un patient Portoricain et ce virus de référence est accessible au niveau de la banque Américaine de tissus et virus (American Type Culture Collection).

L'infection virale est suivie par son effet cytopathogène (CPE ) sur les cellules en culture. Cet effet peut être observé par l'apparition de plages de lyse sur des monocouches cellulaires (Plaque Forming Unit ; PFU). Si l'on augmente la concentration virale on peut étendre la lyse cellulaire à tout ou partie de la monocouche cellulaire. Les expériences sont réalisées dans des plaques de culture 96 puits qui sont colorées au cristal violet. La coloration va résulter de la présence de cellules. Ainsi la disparition de la couleur attestera de la destruction viro-induite des cellules. Par ailleurs, nous vérifierons en parallèle dans des puits contenant différentes concentrations de notre produit sans virus, qu'il n'entraîne pas de lyse cellulaire confirmant son absence de toxicité dans notre système. L'activité antivirale du ND235 est établie en comparant les effets de différentes dilutions du ND235 en présence de quantités décroissantes de virus.

Les quantités de virus utilisées pour l'infection sont données en TCID50. La TCID50 est la concentration virale qui va donner un effet CPE sur 50% des cellules en culture.

Les expériences sont réalisées en triplicate.

Cellules :

Les cellules MDCK dérivent de cellules isolées par S.H. Madin et N.B. Darby en 1958 à partir d'un rein d'une chienne adulte de race cocker epagneul. Ces cellules sont accessibles au niveau de la banque Américaine de tissus et virus ATCC. Les cellules MDCK sont cultivées à 37°C en atmosphère humide contenant

5% de CO ₂ dans du milieu DMEM avec 10% de sérum de veau fœtal en présence d'antibiotiques Pénicilline Streptomycine.

Virus : La souche virale d'influenza A utilisée est la souche A/PR/8/34 de type

HlNl (ATCC VR- 1249).

Lors de l'infection, les cellules MDCK sont cultivées à 33°C en atmosphère humide contenant 5% de CO ₂ et dans du milieu MEM avec de la BSA 0,125 % et en présence de 1 μg / ml de trypsine traitée à la TPCK (Perbio SA, Be).

Protocole :

Des plaques de culture de 96 puits sont ensemencées à raison de 5 10 cellules MDCK par puits. Ces cellules sont cultivées à 37°C en atmosphère humide contenant 5% de CO ₂ dans du milieu DMEM avec 10% de sérum de veau fœtal en présence d'antibiotiques Pénicilline Streptomycine. Lorsqu'elles forment une monocouche confluente elles sont infectées par des quantités décroissantes de virus résultant de dilutions au tiers en cascade d'une solution stock de virus. Le titre de la solution stock de départ du virus établi dans des plaques de culture 96 puits est de 81 TCID50. Ces infections sont effectuées en absence ou présence de ND235 à différentes concentrations. Les cellules sont ensuitre maintenues en culture à 33°C en atmosphère humide contenant 5% de CO ₂ pendant quatre jours puis sont colorées au Cristal Violet. Les effets cytopathogènes sont alors enregistrés afin d'établir le

pourcentage d'inhibition de l'infection virale obtenu par les différentes concentrations de ND235.

Les quantités de cellules restantes sont estimées par la mesure de l'absorption de la monocouche à 595 nm réalisée dans un lecteur de microplaque. Les valeurs d'absorption à 595 nm sont corrigées par celles des absorptions non spécifiques mesurées à 405 nm.

Les résultats des valeurs moyennes et des écarts types sont présentés dans le tableau 3 et sous forme de diagramme.

Résultats :

Viral Input Concentration en ND 23 ₅

0 % 0 % 0 % 4 % 4 % 4 % 0,4 % 0,4 % 0,4 % 0,04 % 0,04 % 0,04 %

81 27 9 3 1

0,3 0,1 Ctrl

Tableau 5 : Données brutes des absorbances en fonction de la concentration en ND235 et des quantités virales.

Viral Input : quantités de virus en TCID50 utilisées pour l'infection au temps 0.

Tableau 6 : Inhibition de l'infection par le virus Influenza A par différentes concentrations de ND235 Titre viral : en TCID50. Effet : + : destruction > 60% des cellules ; + - : destruction de 30 % à 60 % des cellules ; - : présence de 70 % à 100% des cellules.

Interprétation :

Les différentes concentrations de produit ND235 sont efficaces contre le viras. On peut calculer le pourcentage d'inhibition virale en comparant les puits infectés par les plus faibles dilutions virales efficaces en présence et absence du produit. Ainsi il résulte que :

ND235 4 % : 80 % d'inhibition virale ND235 0,4 % : 84 % d'inhibition virale

ND235 0,04 % : 73 % d'inhibition virale

Dans les puits témoins contenant les différentes concentrations de ND235 en absence de virus (ligne Ctrl) la coloration n'est pas diminuée en présence de ND235. La diminution de l'intensité de la coloration aurait attesté d'une toxicité. On confirme les résultats de

nos études préalables de toxicité montrant que le ND235, même aux concentrations les plus élevées ne présente pas de toxicité.

Tableau 7 : Valeurs moyennes et déviation standard des absorbances en fonction de la concentration en ND235 et des viral input.

Viral input : en TCID50.

Les valeurs d'absorptions à 595 nm ont été corrigées par les valeurs d'absorption à

405nm.

Interprétation :

La présente interprétation se lit en regard de la figure 1.

Les valeurs d'absorption dans les puits contrôle sans virus (première série, 0 TCID50) sont de l'ordre de 0,75 et 0,45 en présence respectivement de 4 % ND235 et de 0 % (control) de ND235. Ainsi, le ND235 aux concentrations les plus élevées (ND235 4 %) va favoriser le développement des cellules en comparaison des cellules témoin n'ayant pas de ND235 (Control). Pour les concentrations 10 et 100 fois inférieures en ND235, cet effet stimulant la croissance cellulaire est moins prononcé mais semble toutefois présent. Ces résultats sont en accord avec ceux que nous avons obtenus lors de l'étude de toxicité in vitro de notre produit indiquant un effet bénéfique sur la croissance cellulaire.

Les différentes concentrations présentées de ND235 (série 1) bloquent efficacement des doses de virus détruisant 50 % des cellules. Pour les infections virales effectuées avec trois fois et neuf fois plus de virus (séries 3 et 9) on observe encore une inhibition du virus par le ND235 mais de façon dose-dépendante, les concentrations en ND235 les plus élevées conférant la meilleure protection.

Conclusion :

Le ND235 est un antiviral efficace contre l'infection in vitro par le virus influenza de type A. Nous avons démontré que son efficacité est dose - dépendante.

Il ressort de cette étude que le ND235 à une concentration de 0,4 % présente une efficacité antivirale de 84 %. Il est important de noter qu'à une dose dix fois inférieure, l'efficacité du ND235 reste remarquable. En effet elle est de l'ordre de 75 %.

D'autre part, il est utile de rappeler que ce produit est complètement naturel.

Exemple 5 : Exemple comparatif

Les activités antivirales de chacun des composants aux concentrations respectives contenues dans ND235 ont été mesurées et comparées à l'activité synergique de la composition selon l'invention ND235. Les résultats sont présentés dans le tableau 4 ci- dessous.

Tableau 8 : Inhibition de l'infection par le virus Influenza A par les différents composants de ND235

Les concentrations des produits curcumin (Cu), extraits de pépins de pamplemousse (PP), de romarin (Ro), de feuille d'olivier (01) et de thé vert (Tv) sont les mêmes que celles contenues dans le ND235. La dernière colonne (ND235 - Cu) correspond à la formulation contenant les composants du ND235 aux concentrations du ND 235 sans Curcumin. Le contrôle (contrôle) correspond à la même charge virale que les autres colonnes sans produit. Titre viral : en TCID50.

Effet : + : destruction > 60% des cellules ; + - : destruction de 30 % à 60 % des cellules ; - : présence de 70 % à 100% des cellules.

Interprétation :

Les différents produits contenus dans ND235 sont efficaces contre le virus. On peut calculer le pourcentage d'inhibition virale en comparant les puits infectés par les plus faibles dilutions virales efficaces en présence et absence du produit. Ainsi il résulte que :

- ND235 0,4 % : 86 % d'inhibition virale Curcumin : 7 % d'inhibition virale

- Pépin de pamplemousse : 21 % d'inhibition virale - Extraits de romarin : 28 % d'inhibition virale

Extraits de feuilles d'olivier : 36 % d'inhibition virale

- Extraits de thé vert : 50 % d'inhibition virale

- ND235 0,4 % sans curcumin : 64 % d'inhibition virale

Ceci montre que les différents composants du ND235 utilisés séparément à la même concentration que celui-ci sont bien moins efficaces que lorsqu'ils sont réunis.

Conclusion :

Le ND 235 est un mélange de produits actifs contre le virus de la grippe qui agissent en synergie permettant ainsi une efficacité augmentée.

Le ND235 est un antiviral efficace contre l'infection in vitro par le virus mfluenza de type A. Nous avons démontré que son efficacité est dose-dépendante.

Il ressort de cette étude que le ND235 à une concentration de 0,4 % présente une efficacité antivirale de 84 %. Il est important de noter qu'à une dose dix fois inférieure, l'efficacité du ND235 reste remarquable. En effet elle est de l'ordre de 75 %.

D'autre part, il est utile de rappeler que ce produit est complètement naturel et que l'efficacité de ses constituants tant au niveau antiviral qu'au niveau de la diminutjpn de la réponse immunitaire a été décrite dans la littérature scientifique. Enfin, l'intérêt de ce produit réside également dans le fait qu'il va bloquer le virus de la grippe par différents mécanismes.