Cette demande de brevet revendique la priorité de la demande de brevet français n°12 00492 déposée le 17 février 2012, qui est incorporée ici par référence.

DOMAINE DE L'INVENTION

La présente invention se rapporte à la production et à l'utilisation de LBP/BPI dans la lutte contre les oomycètes.

ART ANTERIEUR

Les oomycètes (Oomycoto ou Oomycètes) représentent un phylum de protistes filamenteux classés parmi les Chromisto et comprenant environ 600 espèces. Ce sont des organismes aquatiques ou terrestres non photosynthétiques, autrefois classés dans les champignons (d'où la terminologie -mycète), mais qui sont désormais considérés comme très différents des champignons dits « vrais » : Eumycètes (Basidiomycètes et Ascomycètes) tant sur le plan évolutif que physiologique (cf. Figure 4).

Ces organismes peuvent avoir un mode de vie saprophyte, jouant un rôle important dans le recyclage des matières en décomposition, ou bien être des parasites. Ces oomycètes sont ainsi responsables de dégâts majeurs sur de nombreuses cultures : mildiou de la vigne, mildiou de la pomme de terre, fonte de semis des graminées et cultures maraîchères, rouille blanche des crucifères, pourriture racinaire des légumineuses et des crucifères. Les pertes économiques agricoles sont ainsi estimées à plus de 3,5 milliards d'euros par an. A titre d'exemple, la seule culture de la pomme de terre en Europe (couvrant environ 2 millions d'hectares) nécessite un traitement annuel contre Phytophthora infestons d'un coût supérieur à 1,3 milliard d'euros avec, malgré ces traitements, des pertes estimées à près d'un milliard d'euros.

Il est à noter que les dégâts causés par les oomycètes ne se limitent pas aux seules plantes puisque dans le domaine aquacole notamment, les oomycètes de l'ordre des Saprolegniales causent des dégâts majeurs dans les élevages de crustacés et de poissons. A titre d'exemple, on estime ainsi à près de 10% les pertes en écloseries de salmonidés provoquées par des oomycètes et pour la seule industrie écossaise, les oomycètes causent des pertes annuelles évaluées à plusieurs millions d'euros. Les mammifères eux- mêmes sont également menacés par ces organismes puisque les oomycètes du genre Pythium sont responsables de la pythiose, aussi appelée cancer des marais, affectant les chevaux, les chiens, les chats, le bétail ainsi que les populations humaines dans les zones tropicales et subtropicales.

A l'heure actuelle, il existe peu de traitements spécifiques contre les oomycètes qui soient efficaces. Par exemple, le métalaxyl, est souvent utilisé contre les mildious, mais des résistances apparaissent très rapidement (au cours de la première année d'utilisation) rendant cette matière active inutilisable par la suite. D'autres molécules comme des fongicides non-spécifiques à large spectre sont utilisés mais possèdent une toxicité environnementale et humaine importante. Les trois fongicides majeurs utilisés dans la lutte contre les oomycètes sont des dérivés du carbamate : Le manèbe (dont l'usage est restreint depuis la directive 2007/57/CE), le mancozèbe (hautement toxique pour la flore, la faune aquatique et les animaux) et le propamocarbe hydrochloride (forte toxicité vis-à-vis des organismes aquatiques). Du fait de leur toxicité élevée, ces dérivés du carbamate sont susceptibles d'être retirés du marché de l'Union Européenne.

Concernant plus spécifiquement le déroulement du cycle d'un oomycète phytopathogène, notamment Phytophtora, celui-ci implique au départ un stade unicellulaire dépourvu de paroi, nommé zoospore, qui est responsable de la propagation épidémique de la maladie au champ. Les zoospores, produites par les sporanges, sont équipées de flagelles, ce qui leur permet de se déplacer dans l'eau ou dans des films d'eau à la surface des plantes afin de contaminer les plantes alentour. Puis, il se produit un enkystement d'une zoospore à la surface d'une plante, en général à proximité des stomates de la plante mais également au niveau des feuilles, des racines, des tiges, des graines ou encore des tubercules. Ensuite, il y a germination des zoospores et pénétration dans le tissu de l'hôte végétal. Ce cycle peut impliquer une dynamique des populations de zoospores qui, après enkystement, s'organisent en microcolonies puis forment des biofilms à la surface des plantes. Toutes les espèces d'oomycètes présentent ce stade mobile (zoospore), qui est la forme infectieuse par excellence des espèces pathogènes. Cette forme libre et mobile n'existe pas chez les champignons (Eumycètes) et elle représente donc une cible spécifique et d'importance majeure si l'on veut lutter contre les maladies à Oomycètes. A ces différences de biologie du développement s'ajoutent des différences biochimiques importantes. En particulier, la paroi des oomycètes est constituée essentiellement de cellulose et ne contient pas, ou très peu, de chitine et de β 1-3 glucanes. De plus, leurs membranes sont dépourvues de stérols que la plupart des Oomycètes sont incapables de synthétiser. A l'inverse, les champignons possèdent des parois très riches en chitine et glucane, et leurs membranes contiennent des stérols (majoritairement l'ergostérol). Ces constituants, typiques des champignons, sont la cible de nombreux fongicides, ce qui explique leur inefficacité phytosanitaire sur Oomycètes.

Il existe donc un besoin crucial de bénéficier d'un agent de lutte contre les oomycètes qui soit spécifique et non toxique.

SOMMAIRE DE L'INVENTION

Les protéines LBP/BPI (LPS-binding protein/Bactericidal Permeability-lncreasing Protein) sont connues pour interagir avec le lipide A du LPS des bactéries, et présenter une activité bactéricide. Les inventeurs ont d'ailleurs mis en évidence qu'une protéine LBP/BPI recombinante de mollusque présente aussi cette capacité de liaison au lipide A et une faible activité bactéricide. Ces protéines sont aussi connues comme ayant une activité antifongique, ou comme potentialisateur d'antifongique.

De façon surprenante, les inventeurs ont maintenant mis en évidence que ces mêmes protéines LBP/BPI natives, mais aussi recombinantes, induisent la mort rapide des zoospores d'oomycètes (la forme principale de dissémination épidémiquej et notamment de Phytophthora parasitica (pathogène de nombreuses plantes).

Ce résultat est surprenant du fait que, les oomycètes étant très éloignés des bactéries (cf. Figure 4) et ne possédant pas de lipide A, rien ne laissait présager d'une quelconque interaction avec les protéines LBP/BPI, et donc d'une activité biocide des LBP/BPI sur les oomycètes. De plus, les différences aujourd'hui reconnues, tant sur le plan évolutif que sur le plan physiologique, des oomycètes et des champignons (cf. Figure 4), ainsi que l'inefficacité et le manque de spécificité des antifongiques à large spectre actuellement utilisés contre les oomycètes, ne laissaient en rien présager que l'activité fongicide connue des protéines LBP/BPI était transposable aux oomycètes.

En conséquence, un premier objet de l'invention concerne une composition pharmaceutique pour prévenir et/ou traiter des maladies causées par les oomycètes, caractérisée en ce qu'elle comprend un polypeptide choisi dans le groupe comprenant les protéines LBP/BPI (« LPS-Binding Protein/Bactericidal/Permeability-Increasing Prptein »), leurs dérivés et leurs fragments.

Un autre objet de l'invention concerne l'utilisation d'un polypeptide choisi dans le groupe comprenant les protéines LBP/BPI (« LPS-Binding

Protein/Bactericidal/Permeability-Increasing Protein »), leurs dérivés et leurs fragments comme agent phytosanitaire anti-oomycète, Un autre objet de l'invention concerne une plante transgénique exprimant un polypeptide choisi dans le groupe comprenant les protéines LBP/BPI, leurs dérivés et leurs fragments.

Un autre objet de l'invention concerne la descendance, quelque soit la génération, de la plante transgénique exprimant un polypeptide choisi dans le groupe comprenant les protéines LBP/BPI, leurs dérivés et leurs fragments.

Une méthode de préparation de la plante transgénique exprimant un polypeptide choisi dans le groupe comprenant les protéines LBP/BPI, leurs dérivés et leurs fragments et comprenant les étapes de : a) Transformation d'au moins une de ladite plante avec un vecteur comprenant le polynucléotide codant pour un polypeptide choisi dans le groupe comprenant les protéines LBP/BPI, les dérivés et les fragments de celles-ci ;

b) Sélection d'au moins une cellule de plante transformée qui exprime ledit polypeptide; et

c) Générer une plante transgénique à partir de ladite cellule de plante transformée sélectionnée à l'étape b).

Un autre objet de l'invention concerne un animal transgénique exprimant un polypeptide choisi dans le groupe comprenant les protéines LBP/BPI, leurs dérivés et leurs fragments.

Un autre objet de l'invention concerne la descendance, quelque soit la génération, de l'animal transgénique exprimant un polypeptide choisi dans le groupe comprenant les protéines LBP/BPI, leurs dérivés et leurs fragments.

DESCRIPTION DES FIGURES

Figure 1 : Courbes représentant l'effet de la rBgLBP/BPI (figure la), de la hBPI (figure lb) et de la BSA (figure le) sur la viabilité des zoospores de Phytophtora parasitica. Les concentrations de protéines sont indiquées sur la figure. La viabilité est exprimée en pourcentage de zoospores vivantes.

Figure 2 : Histogrammes représentant l'effet de la rBgLBP/BPI (figure 2a), de la hBPI (figure 2b) et de la BSA (figure 2c) sur la viabilité des zoospores de Saprolegnia parasitica, et S.diclina. Les concentrations de protéines sont indiquées sur la figure. La viabilité est exprimée en pourcentage de zoospores vivantes.

Figure 3 : Masses d'eeufs silencées ou non pour la protéine BgLBP/BPI en présence d'oomycètes. (A) Masse d'œuf saine, pondue par un mollusque contrôle (injecté avec ARNdb LUC) et exposée aux zoospores de S. diclina ; (B) Masse d'œuf pondue par un mollusque silencé (injecté avec ARNdb BgLBP/BPIl) et infectée par 5. diclina. Figure 4 : Arbre phylogénétique de la vie. Ce schéma montre l'appartenance des oomycètes, des champignons et des bactéries à différents groupes de l'évolution, et met ainsi en évidence les différences évidentes entre ces microorganismes, qui ne peuvent être confondus, regroupés ou assimilés.

DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION

Un premier objet de l'invention concerne une composition pharmaceutique pour prévenir et/ou traiter des maladies causées par les oomycètes, caractérisée en ce qu'elle comprend un polypeptide choisi dans le groupe comprenant les protéines LBP/BPI (LPS- Binding Protein/Bactericidal/Permeability-[ncreasing Protein), leurs dérivés et leurs fragments.

Le terme « LPS-Binding Protein/Bactericidal/Permeability-Increasing Protein » ou « protéine LBP/BPI », fait référence, au sens de la présente invention, à une protéine impliquée dans la défense des organismes contre les infections par des bactéries à gram négatif. Les protéines LBP/BPI sont une famille de protéines présentant deux domaines LBP/BPI/CETP. Les domaines LBP/BPI/CETP, N-terminal et C-terminal sont identifiés dans les bases de données du Sanger Institute et du « European Bioinformatic Institute » (EMBL-EBI) avec les références pfam PF01273 et InterPro IPR001124, respectivement. La classification des domaines, tels que cités précédemment, est très caractéristique et utilisée en routine pour l'annotation des protéines. Ces domaines déterminent des fonctions pour les protéines qui les portent.

Ce sont des protéines qui ont une forte affinité avec les lipopolysaccharides des bactéries gram négatif ce qui leur permet de s'y lier.

L'homme du métier sera à même d'identifier simplement les LBP/BPI, notamment des LBP/BPI d'animal.

La LBP/BPI peut ainsi être une protéine de vertébrés ou d'invertébrés. A titre d'exemple de telles LBP/BPI issues d'invertébrés, on peut citer celles décrites chez les mollusques Crassostrea gigas (Numéro d'accession ACQ72939 et ADN05759), Euprymna scolopes (Numéro d'accession AEL03862, AEL03861 et AEL03860), Chlamys farreri (Numéro d'accession ACS72242) ou encore chez Biomphalaria glabrata, de séquence SEQ ID N°l, dont la séquence nucléique est SEQ. ID N°2.

A titre d'exemple de telles LBP/BPI issues de vertébrés, on peut citer celles décrites chez les mammifères tels que la souris (Numéro d'accession Q67E05.1), la vache (Numéro d'accession P17453.2), le lapin (Numéro d'accession Q28739.1), le rat (Numéro d'accession Q6AXU0.1) ; chez les gallinacés, on peut citer celle de la poule (Numéro d'accession BX930367.2) ; chez les oiseaux, on peut citer celle issue du diamant mandarin {Taeniopygia guttata: Numéro d'accession XP002192404.1) ; chez le poisson, on peut citer celles issues du poisson chat {Ictalurus punctatus: Numéro d'accession AAX20011.1), de la morue (Gadus morhua: Numéro d'accession AAM52335.1, AAM52336.1), de la carpe (Cyprinus carpio: Numéro d'accession BAC56095.1), de la truite (Oncorhynchus mykiss : Numéro d'accession NP001118057.1, NP001117670.1), et du tetraodon (Tetraodon nigroviridis Numéro d'accession CAF96904.1, CAG03233.1) ; chez les amphibiens, on peut citer celle du xenope (Xenopus laevis: Numéro d'accession NP001089628.1, NP 001086208.1).

On entend par « dérivé », on entend un polypeptide dont la séquence présente un pourcentage d'identité d'au moins 80 %, par exemple d'au moins 85%, de préférence d'au moins 90%, et de manière particulièrement préférée d'au moins 95% avec la séquence polypeptidique d'une protéine de LBP/BPI.

Un tel dérivé peut être d'origine naturelle, tel qu'un variant issu d'une variation allélique préexistant à l'état sauvage. Un tel dérivé peut être également une séquence polypeptidique non préexistante naturellement et obtenue, par exemple, par des techniques de mutagenèse ou de synthèse nucléotidique. De préférence, un tel dérivé est obtenu à l'issue d'une étape de mutagénèse ou de synthèse.

Par "pourcentage d'identité entre deux séquences polypeptidiques", on entend le pourcentage d'acides aminés identiques, entre deux séquences devant être comparées, obtenu avec le meilleur alignement possible desdites séquences. Ce pourcentage est purement statistique et les différences entre les deux séquences sont réparties aléatoirement sur toute la longueur des séquences d'acides aminés.

Par "meilleur alignement possible ou alignement optimal", on entend l'alignement permettant d'obtenir le pourcentage d'identité le plus élevé. Les comparaisons de séquences entre deux séquences d'acides aminés sont habituellement réalisées en comparant lesdites séquences après que celles-ci aient été alignées selon le meilleur alignement possible ; la comparaison est alors réalisée sur des segments de comparaison de façon à identifier et comparer des régions de similarité.

Le meilleur alignement possible pour effectuer une comparaison peut être réalisé en utilisant l'algorithme d'homologie globale développé par Smith et Waterman (Ad. App. Math., vol.2, p:482, 1981), en utilisant l'algorithme d'homologie locale développé par Neddleman et Wunsch (J. Mol. Biol., vol.48, p:443, 1970), en utilisant la méthode de similarité développé par Pearson et Lipman (Proc. Natl. Acd. Sci. USA, vol.85, p:2444, 1988), en utilisant des programmes d'ordinateur basés sur de tels algorithmes (GAP, BESTFIT, BLAST P, BLAST N, FASTA, TFASTA, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wl USA), en utilisant les algorithmes d'alignement multiples MUSCLE (Edgar, Robert C, Nucleic Acids Research, vol. 32, p:1792, 2004). Pour obtenir le meilleur alignement possible, on utilisera de préférence le programme BLAST avec la matrice BLOSUM 62 ou la matrice PAM 30. Le pourcentage d'identité est déterminé en comparant les deux séquences alignées de façon optimale, lesdites séquences pourront comprendre des additions ou des délétions au regard de la séquence de référence de sorte d'obtenir le meilleur alignement possible entre ces deux séquences. Le pourcentage d'identité est calculé en déterminant le nombre de positions identiques entre les deux séquences, en divisant le nombre obtenu par le nombre total de positions comparées et en multipliant le résultat obtenu par 100 pour obtenir le pourcentage d'identité entre ces deux séquences.

Par « fragment » de protéine LBP/BPI, on entend un polypeptide d'au moins 25 acides aminés, à titre d'exemple d'au moins 50 ou 100 ou 150 acides aminés, de préférence d'au moins 200 acides aminés, à titre d'exemple d'au moins 250 ou 350 acides aminés, et de manière particulièrement préférée un polypeptide d'au moins 400 acides aminés.

Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, on entend par fragment un polypeptide d'au moins 10, préférentiellement au moins 15 acides aminés. Dans un autre mode de réalisation particulier, ledit fragment est un polypeptide d'au plus 50 acides aminés.

Les termes "acide aminé" et "acides aminés" au sens de la présente invention correspondent à tout acide aminé présent naturellement ou à leurs résidus. Les acides aminés peuvent être identifiés soit par leur abréviation à une seule lettre, soit par leur abréviation à trois lettres. (Asp D acide aspartique ; Ile I isoleucine ; Thr T threonine ; Leu L leucine ; Ser S serine ; Tyr Y tyrosine ; Glu E acide glutamique ; Phe F phenylalanine ; Pro P proline ; His H histidine ; Gly G glycine ; Lys K lysine ; Ala A alanine ; Arg R arginine ; Cys C cysteine ; Trp W tryptophane ; Val V valine ; Gin Q glutamine ; Met M methionine ; Asn N asparagine). Selon la présente invention, les acides aminés naturels peuvent être remplacés par des acides aminés chimiquement modifiés.

De préférence, ledit polypeptide est un polypeptide isolé.

Le terme "isolé" au sens de la présente invention désigne un matériel biologique qui a été soustrait à son environnement originel (l'environnement dans lequel il est localisé naturellement). Par exemple, un polypeptide présent à l'état naturel dans une plante n'est pas isolé. Le même polypeptide séparé des autres polypeptides adjacents au sein de la cellule dans laquelle il est naturellement présent est isolé.

On entend par « agent anti-oomycète », un composé capable de prévenir et/ou traiter les maladies causées par des oomycètes.

Par « maladies causées par des oomycètes », on entend, au sens de la présente invention, les troubles, désordres, causées par un individu, quelque soit son stade de développement, appartenant au phylum des oomycètes et parasitant un hôte quelque soit son stade de développement. Les hôtes peuvent être végétaux ou animaux, aquatiques ou terrestres. Les maladies causées par des oomycètes peuvent conduire, ou non, à la mort de l'organisme hôte touché. Chez les plantes, les maladies sont de deux types :

- maladies affectant seulement ou principalement les parties aériennes de la plante telles que les feuilles, les tiges et les fruits ; - les maladies affectant les parties de la plante en contact avec le sol telles que les racines, les tubercules, la partie base de la tige, les graines et les fruits touchant le sol.

A titre d'exemple, les maladies causées par les oomycètes sur les parties aériennes des plantes peuvent être le mildiou de la tomate, de la pomme de terre ou de la vigne, la rouille blanche des crucifères, etc. Les maladies causées par les oomycètes sur les parties en contact avec le sol sont par exemple : la pourriture racinaire du pois, du haricot ou du radis, la stèle rouge du fraisier, la pourriture du collet et des fruits chez les cucurbitacées et les solanacées.

Dans le cas d'hôtes aquatiques, les oomycètes sont responsables d'épizooties. Par exemple, les poissons peuvent être victimes de saprolégniose, aussi appelée « la maladie de la mousse » des poissons à cause de l'aspect mousseux que prennent les poissons quand ils sont recouverts de mycélium.

Chez les mammifères, tels que les équidés, les bovidés, les canidés ou encore les hommes, la principale maladie causée par les oomycète est la pythiose, aussi appelée « cancer du marais ». Au sens de la présente invention, les termes « prévenir » et « prévention » signifient éviter l'apparition d'une maladie, d'un trouble ou d'un ou plusieurs signes et/ou symptômes d'une maladie et/ou d'un trouble.

Au sens de la présente invention, les termes « traiter » et « traitement » signifient éliminer, améliorer, les symptômes d'un trouble et/ou d'une maladie et permettre la régression de ce trouble et/ou de cette maladie.

La composition de l'invention contient en outre un ou plusieurs excipients acceptables selon la destination de la composition, à savoir composition phytosanitaire, dans le cas où la maladie causée par les oomycètes touche les plantes ; composition à usage aquacole, dans le cas où la maladie causée par les oomycètes touche des poissons et les crustacés ; et composition à usage en médecine humaine et vétérinaire.

Un excipient a pour but de modifier au moins une propriété physicochimique de la composition choisie dans la groupe comprenant la stabilité, le pH, le pKa, la densité, la solubilité, la viscosité, la coloration, le coefficient de partage eau/octanol, ou encore des propriétés olfactives ou gustatives. Un homme du métier et capable, au regard de ses connaissances d déterminer un ou plusieurs excipients acceptables.

Selon un mode de réalisation préféré, la composition pharmaceutique selon l'invention est caractérisée en ce que les protéines LBP/BPI sont des protéines d'animaux choisis parmi les vertébrés et les invertébrés.

Selon un mode de réalisation préféré, la composition pharmaceutique selon l'invention est caractérisée en ce que la protéine LBP/BPl ^' est une protéine de mollusques, de préférence la protéine LBP/BPI de Biomphalaria glabrata. Selon un mode de réalisation préféré, la composition pharmaceutique selon l'invention est caractérisée en ce que la protéine LBP/BPI est une protéine de mammifères, de préférence la protéine LBP/BPI d'Homo sapiens.

Selon un mode de réalisation préféré, la composition pharmaceutique de l'invention est caractérisée en ce qu'elle est utilisée en médecine humaine. Selon un mode de réalisation préféré, la composition pharmaceutique de l'invention est caractérisée en ce qu'elle est utilisée en médecine vétérinaire.

De manière préférée, la composition pharmaceutique selon l'invention vise les espèces d'oomycètes touchant les poissons et crustacés appartenant au genre Saprolegnia. De manière encore préférée, les espèces d'oomycètes touchant les poissons et les crustacés sont Saprolegnia parasitica, Saprolegnia ferax et Saprolegnia diclina. Les oomycètes peuvent parasiter de nombreuses espèces de poissons et crustacés, notamment les poissons comme les saumons, et les crustacés comme les crevettes, les crabes, les bernard l'ermite, le homard ou encore les écrevisses.

De manière préférée, les maladies induites par les espèces d'oomycètes touchant les mammifères appartiennent au genre Pythium.

De manière encore préférée, l'espèce oomycète touchant les mammifères est l'espèce Pythium insidiosum.

Selon l'invention, la composition utilisée est spécifique des oomycètes, c'est-à-dire qu'elle a une action spécifiquement dirigée contre les oomycètes : les inventeurs ont démontré que les protéines LBP/BPI avaient une action biocide sur les zoospores d'oomycètes, les zoospores étant une forme spécifique à un stade de développement des oomycètes, et étant inexistante chez les champignons notamment.

Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne une composition pharmaceutique telle que décrite ci-dessus pour la prévention et/ou le traitement des maladies causées par les zoospores d'oomycètes.

Dans un mode de réalisation particulier, la composition pharmaceutique de l'invention comprend un polypeptide choisi dans le groupe comprenant les protéines LBP/BPI, leurs dérivés et leurs fragments, ledit polypeptide étant présent à une concentration d'au plus 2 μΜ, préférentiellement au plus 1 μΜ. Ladite concentration est sensiblement inférieure aux concentrations utilisées pour éradiquer des oomycètes avec des antifongiques non sélectifs.

Un autre objet de l'invention concerne une utilisation d'un polypeptide choisi dans le groupe comprenant les protéines LBP/BPI (« LPS-Binding Protein/Bactericidal/Permeability-Increasing Protein »), leurs dérivés et leurs fragments comme agent phytosanitaire anti-oomycète. Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne une utilisation d'un polypeptide choisi dans le groupe comprenant les protéines LBP/BPI (« LPS-Binding Protein/Bactericidal/Permeability-Increasing Protein »), leurs dérivés et leurs fragments comme agent phytosanitaire contre les zoospores d'oomycètes. Dans un mode de réalisation préféré, l'invention concerne une utilisation d'un polypeptide choisi dans le groupe comprenant les protéines LBP/BPI, leurs dérivés et leurs fragments comme agent phytosanitaire anti-oomycète spécifique.

On entend par là que le polypeptide de l'invention a une action biocide spécifique et démontrée sur les oomycètes. Il peut ainsi être utilisé à faible concentration, notamment comparé à des antifongiques non sélectifs utilisés contre les oomycètes. Cela permet notamment de diminuer le coût d'utilisation, la toxicité environnementale et pour la santé, animale et humaine, des agents anti-oomycètes.

Dans un mode de réalisation préféré, ledit polypeptide est utilisé à une concentration d'au plus 2 μΜ, préférentiellement au plus 1 μΜ. De manière préférée, les espèces oomycètes touchant les plantes sont les espèces phytophages, appartenant aux genres Phytophthora, Pythium, Plasmospora, Aphanomyces ou encore Hyaloperonospora.

De manière encore préférée, l'espèce oomycète touchant les plantes appartient au genre Phytophthora et plus particulièrement il s'agit de Phytophthora parasitica. Les espèces de plantes susceptibles d'être touchées par les espèces oomycètes citées ci-dessus appartiennent par exemple à la famille des Solanaceae, parmi laquelle les genres Solanum- e.g. Solanum tuberosum, Solanum lycopersicum, Solanum melongena, etc-, Capsicum- e.g Capsicum annuum, etc-, Nicotiana- e.g. Nicotiana tabacum, etc-, Physalis- e.g. Physalis alkekengi, etc- ; Lycopersicum- e.g. Lycopersicum: esculentum etc- ; des Brassicaceae, parmi laquelle les genres Arabidopsis- e.g. Arabidopsis thaliana-, Brassica- e.g. Brassica oleracea, Brassica napus, Brassica rapa, Brassica negra, etc-, Eruca- e.g. Eruca sativa, etc-, Raphanus- e.g. Raphanus raphanistrum, Raphanus sativus, Raphanus caudatus, etc- ; Vitaceae parmi laquelle les genres Ampélopsis- e.g. Ampélopsis aconitifolia, Ampélopsis brevipedunculata, Ampélopsis vitifolia, etc-, Cissus- e.g. Cissus antartica, Cissus rhombifolia, Cissus verticillata, etc-, Parthenocissus- e.g. Parthenocissus quinquefolia, parthenocissus tricuspidata, etc-, Vitis- e.g. Vitis acerifolia, Vitis coignetiae, Vitis labrusca, Vitis vinifera, etc- ; des Poaceae parmi laquelle les espèces Saccharum, Sorghum, Hordeum e.g. Hordeum murinum, Hordeum vulgare etc- , Avena e.g. Avena sativa etc- Secale- e.g. Secale céréale, etc- Triticum- e.g. Triticum turgidum, Triticum aestivum, Triticum monoccocum, Triticum durum, Triticum dicoccon, etc-, Oryza- e.g. Oryza sativa, Oryza glaberrima, etc-, Zea mays, etc- ; des Cucurbitaceae parmi laquelle les genres Cucumis- e.g. Cucumis melo, Cucumis sativus, etc-, Citrullus- e.g. Citrullus lanatus, etc-, Cucurbita- e.g. Cucurbita pepo, Cucurbita maxima, etc- ; des Fabaceae parmi lesquelles Pisum sativum, Phaseolus vulgaris, Trifolium sp. etc-; des Chenopodiaceae parmi lesquelles Beta vulgaris ou Spinacia oleracea etc- ; ou encore des Rutaceae parmi lesquelles le genre Citrus e.g. C/trus sinensis etc-, des Rosaceae parmi lesquelles le genre Malus e.g. Malus domestic etc-; des Fagaceae parmi lesquelles le genre Quercus e.g. Quercus robur etc-, le genre Castanea e.g. Castanea sativa etc; des Betulaceae parmi lesquelles le genre Λ/πι/s e.g. /Wm/s glutinosa etc-; des Malavaceae parmi lesquelles le genre Theobroma e.g. Theobroma cacao etc-; des Euphorbiaceae parmi lesquelles le genre Hevea e.g. Hevea brasilensi etc-; des Arecaceae parmi lesquelles le genre f/oe s e.g. E/ae/s oleifera etc. Selon un mode de réalisation préféré, l'utilisation selon l'invention est caractérisée en ce que les protéines LBP/BPI sont telles que définies dans la présente invention.

Un autre objet de l'invention concerne l'utilisation d'un polypeptide choisi dans le groupe comprenant les protéines LBP/BPI (« LPS-Binding

Protein/Bactericidal/Permeability-Increasing Protein »), leurs dérivés et leurs fragments comme agent de lutte contre les oomycètes.

Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne l'utilisation d'un polypeptide choisi dans le groupe comprenant les protéines LBP/BPI (« LPS-Binding Protein/Bactericidal/Permeability-lncreasing Protein »), leurs dérivés et leurs fragments comme agent de lutte spécifique contre les oomycètes.

Dans un mode de réalisation plus particulier, l'invention concerne l'utilisation d'un polypeptide choisi dans le groupe comprenant les protéines LBP/BPl (« LPS-Binding Protein/Bactericidal/Permeability-Increasing Protein »), leurs dérivés et leurs fragments comme agent de lutte contre les zoospores d'oomycètes.

L'invention concerne par ailleurs un polynucléotide isolé, un vecteur et une cellule hôte tels que décrits ci-dessous. Pour les besoins de la présente invention, un polynucléotide isolé comprend une séquence codant pour un polypeptide de LBP/BPl selon l'invention, ou des variants ou fragments de celui-ci.

Par "polynucléotide", on entend, au sens de la présente invention, une chaîne nucléotidique simple brin ou son complémentaire ou une chaîne nucléotidique double brin pouvant être de type ADN ou ARN. De préférence, les polynucléotides de l'invention sont de type ADN, notamment d'ADN double brin.

Le terme "séquence d'acide nucléique" se réfère à une séquence d'ADN (par exemple un ADNc (ADN complémentaire) ou de l'ADN génomique ou synthétique) ou à une séquence d'ARN (par exemple un ARN messager ou encore de l'ARN synthétique), aussi bien qu'à des analogues d'ADN ou ARN contenant des analogues de nucléotides non naturels, des liens internucléotidiques non naturels ou encore les deux. De manière préférée, ladite séquence nucléotidique est une séquence ADN. Les séquences nucléotidiques peuvent présenter toute conformation topologique, telle que linéaire ou circulaire. Aux fins de la présente description, l'expression "séquence d'acide nucléique" peut être employée pour désigner indifféremment un polynucléotide ou un acide nucléique. L'expression "séquence d'acide nucléique" englobe le matériel génétique lui- même et n'est donc pas restreinte à l'information concernant sa séquence. Le terme "nucléotide" désigne à la fois les nucléotides naturels (Adénine : A, Thymine : T, Guanine : G, Cytosine : C) ainsi que des nucléotides modifiés qui comprennent au moins une modification telle que (i) un analogue d'une purine, (ii) un analogue d'une pyrimidine, ou (iii) un sucre analogue, de tels nucléotides modifiés étant décrits par exemple dans la demande PCT N° WO 95/04064.

Selon l'invention, un vecteur comprend un polynucléotide codant pour un polypeptide de LBP/BPI selon l'invention.

Ledit vecteur peut être un vecteur de clonage ou un vecteur d'expression, préférentiellement un vecteur d'expression et peut être sous la forme d'un plasmide, d'un cosmide, d'un phagemide, d'une particule virale ou encore d'un phage.

De tels vecteurs peuvent être des plasmides bactériens, des phages à ADN, des plasmides de levures, des vecteurs dérivés de plasmides et de phages à ADN, de l'ADN viral. Un homme du métier, au regard de ses connaissances est capable de déterminer un vecteur approprié à la situation de la présente invention. La séquence nucléotidique, préférentiellement la séquence d'ADN, dans le vecteur d'expression est liée de manière opérationnelle à un promoteur pour diriger la synthèse d'ARN. A titre d'exemple, les promoteurs peuvent être des promoteurs eucaryotes ou procaryotes tels que CMV immédiate early, HSV thymidine kinase, early and late SV40, LTRs de retrovirus et métallothionéine-l de souris. Le vecteur d'expression comporte également un site de fixation de ribosome pour l'initiation de la traduction et un vecteur de transcription. Le vecteur devrait également comporter des séquences d'amplification de l'expression.

De plus, le vecteur d'expression comporte un ou plusieurs gènes marqueurs pour conférer un trait phénotypique pour la sélection des cellules hôtes transformées. Le vecteur de l'invention contenant la séquence nucléotidique d'intérêt telle que décrite dans la présente invention, ainsi qu'un promoteur approprié devrait être employé pour transformer un hôte pour permettre à cet hôte d'exprimer un polypeptide de LBP/BPI tel que décrit dans la présente invention. De manière préférée, le vecteur d'expression utilisé est pPIC9 de Pichia pastoris.

Selon l'invention, une cellule hôte transformée comprend un polynucléotide codant pour un polypeptide de LBP/BPI selon l'invention ou le vecteur contenant un polynucléotide codant pour un polypeptide selon l'invention. Les termes « cellule hôte transformée », « transformé » et « transformation » au sens de la présente invention font référence à l'introduction d'ADN dans une cellule. La cellule est appelée « cellule hôte » et peut être une cellule procaryote ou une cellule eucaryote. Les cellules procaryotes typiques incluent différentes souches d'E.coli. Les cellules eucaryotes typiques sont les cellules de plantes, de levures, d'insectes ou d'animaux. Un homme du métier, au regard de ses connaissances est capable de déterminer une cellule hôte adaptée à la présente invention.

La cellule hôte transformée selon l'invention est eucaryote ou procaryote. L'introduction d'un polynucléotide ou d'un vecteur tel que décrit dans la présente invention dans la cellule hôte peut être effectuée par des méthodes bien connues de l'homme du métier telles que la transfection par phosphate de calcium, la transfection par DEAE-Dextran ou encore l'électrolocation.

De manière préférée, la cellule hôte transformée selon l'invention est une cellule procaryote choisie dans le groupe consistant en les eubactéries, les archaebactéries et les cyanobactéries. Préférentiellement, la cellule hôte transformée selon la présente invention est une cellule procaryote à'E.coli.

Les cellules hôtes peuvent aussi être utilisées comme cellules hôtes pour les étapes initiales de clonage de la présente invention. Ils sont particulièrement utiles pour permettre une production rapide de grandes quantités d'ADN, pour la production de matrices d'ADN simple brin utilisés pour la mutagénèse dirigée, pour le screening de plusieurs mutants simultanément et pour le séquençage des mutants générés. Les cellules hôtes procaryotes adaptées incluent E. coli K12 souche 94 (ATCC No. 31,446), E. coli souche W3110 (ATCC No. 27,325) E. coli X1776 (ATCC No. 31,537), and E. coli B; Néanmoins, de nombreuses autres souches of E.coli peuvent être utilisées telles que HB101, JM101, NM522, NM538, NM539 et de nombreuses autres espèces et genres de procaryotes peuvent être utilisés tels que les bacilles comme Bacillus subtilis, d'autres Enterobacteriaceae telle que Salmonella typhimurium ou Serratia marcesans et différentes espèces de Pseudomonos peuvent aussi être utilisées.

De manière encore préférée, la cellule hôte transformée selon l'invention est une cellule eucaryote choisie dans le groupe consistant en les cellules animales, fongiques, de levure et de plantes.

Préférentiellement, la cellule eucaryote est un microorganisme fongique, plus particulièrement une levure.

Une liste non exhaustive de microorganismes adaptés inclut : une espèce appartenant au genre Saccharomyces -e.g. S. cerevisiae, S. bayanus, S. pastorianus, S. paradoxus, S. exiguous, S. servazzi, S. uvarum, S. kluyveri, et S. castellii ; une espèce appartenant au genre Kluyveromyces -e.g. K. lactis, K marxianus var. marxianus, K. thermotolorens, K. waltii, K. delphensis, K. nonfermentas, et K. wickerhamii ; une espèce appartenant au genre Candida -e.g. C. utilis, C. tropicalis, C. castellii, et C. humilis ; une espèce appartenant au genre Zygosaccharomyces -e.g. Z. rouxii, Z. bailii, Z. fermentati, Z. bisporus, et Z. florentinus ; une espèce appartenant au genre Pichia -e.g. P. stipidis, P. pastoris, P. sorbithophila, et P. anomala ; ou d'autres espèces telles que Hansenuia polymorpha, Yarrowia lipolytica, Debaromyces hansenii, Schizosaccharomyces pombe, Torulaspora delbueckii, Ashbya gossipie, Aspergillus niger, Aspergillus awamori, Aspergillus oryzae, Aspergillus nidulans, Penecillium chrysogenum, Rhizopus oryzae, et Mucor circenelloides.

De manière encore préférée, la cellule eucaryote est une levure et le microorganisme est Pichia pastoris.

Autrement, la cellule eucaryote est une cellule de plante, de manière préférée sélectionnée dans le groupe comprenant par exemple les familles des Solanaceae, parmi laquelle les genres Solanum- e.g. Solanum tuberosum, Solanum lycopersicum, Solanum melongena, etc-, Capsicum- e.g Capsicum annuum, etc-, Nicotiana- e.g. Nicotiana tabacum, etc-, Physalis- e.g. Physalis alkekengi, etc- ; Lycopersicum- e.g. Lycopersicum: esculentum etc- ; des Brassicaceae, parmi laquelle les genres Arabidopsis- e.g. Arabidopsis thaliana-, Brassica- e.g. Brassica oleracea, Brassica napus, Brassica rapa, Brassica negra, etc-, Eruca- e.g. Eruca sativa, etc-, Raphanus- e.g. Raphanus rophanistrum, Raphanus sativus, Raphanus caudatus, etc- ; Vitaceae parmi laquelle les genres Ampélopsis- e.g. Ampélopsis aconitifolia, Ampélopsis brevipedunculata, Ampélopsis vitifolia, etc-, Cissus- e.g. Cissus antartica, Cissus rhombifolia, Cissus verticillata, etc-, Parthenocissus- e.g. Parthenocissus quinquefolia, parthenocissus tricuspidata, etc-, Vitis- e.g. Vitis acerifolia, Vitis coignetiae, Vitis labrusca, Vitis vinifera, etc- ; des Poaceae parmi laquelle les espèces Saccharum, Sorghum, Hordeum e.g. Hordeum murinum, Hordeum vulgare etc- , Avena e.g. Avena sativa etc- Secale- e.g. Secale céréale, etc- Triticum- e.g. Triticum turgidum, Triticum aestivum, Triticum monoccocum, Triticum durum, Triticum dicoccon, etc-, Oryza- e.g. Oryza sativa, Oryza glaberrima, etc-, Zea mays, etc- ; des Cucurbitaceae parmi laquelle les genres Cucumis- e.g. Cucumis melo, Cucumis sativus, etc-, Citrullus- e.g. Citrullus lanatus, etc-, Cucurbita- e.g. Cucurbita pepo, Cucurbita maxima, etc- ; des Fabaceae parmi lesquelles /sum sativum, Phaseolus vulgaris, Trifolium sp. etc-; des Chenopodiaceae parmi lesquelles Sera vulgaris ou Spinacia oleracea etc- ; ou encore des Rutaceae parmi lesquelles le genre C/irus e.g. C/fo/s sinensis etc-, des Rosaceae parmi lesquelles le genre Malus e.g. Malus domestic etc-; des Fagaceae parmi lesquelles le genre Quercus e.g. Quercus robur etc-, le genre Castanea e.g. Castanea sativa etc; des Betulaceae parmi lesquelles le genre /Wnus e.g. Wnus glutinosa etc-; des Malavaceae parmi lesquelles le genre Theobroma e.g. Theobroma cacao etc-; des Euphorbiaceae parmi lesquelles le genre Hevea e.g. Hevea brasilensi etc-; des Arecaceae parmi lesquelles le genre E/oe/ ^' s e.g. F/oe/ ^' s oleifera etc-. Par "cellule de plante", on entend, au sens de la présente invention, les protoplastes, les gamètes produisant des cellules et les cellules régénérant des plantes complètes. Le terme "cellule de plante" fait également référence, sans limitations, aux cellules obtenues ou isolées de : graines, cultures en suspension, embryons, méristèmes, feuilles, racines, pousses, gamétophytes, sporophytes, pollen et microspores. Une "cellule de plante" peut faire référence à une seule cellule ou une population de cellules. Une population de cellules de plantes peut être pure, c'est-à-dire composée d'un seul type de cellule, ou bien composée de différents types de cellules. Une cellule de plante au sens de la présente invention peut être isolée ou comprise dans un tissu de plante, un organe de plante ou une plante quelque soit son stade de développement

Pour les besoins de la présente invention, une bactérie transgénique comprend un polynucléotide codant pour un polypeptide de LBP/BPI selon l'invention ou le vecteur contenant un polynucléotide codant pour un polypeptide de LBP/BPI selon l'invention.

La transformation de cellules de plantes cultivées est normalement effectuée par l'intermédiaire de Agrobacterium tumefaciens Ainsi, la plante transgénique peut être obtenue, par exemple, en transférant le vecteur de la présente invention et un gène marqueur (par exemple le gène de résistance à la kanamycine) dans Agrobacterium tumefaciens contenant un plasmide helper -Ti comme décrit dans HOECKEMA et al. [Nature, 303:179-181, 1983) et en cultivant les cellules de Agrobacterium tumefaciens avec des morceaux de feuilles ou d'un autre tissu de la plante à transformer, tel que décrit par AN et al. (Plant Physiology, 81:301-305, 1986). Néanmoins, d'autres méthodes pour introduire l'ADN dans les cellules peuvent être utilisées telles que le Polybrène (Kawai and Nishizawa, Mol. Cell. Biol., 4:1172 [1984]), la fusion de protoplastes (Schaffner, Proc. Natal. Acad. Sci. USA, 77:2163 [1980]), l'électroporation (Neumannet al., EMBOJ., 1:841 [1982]), et la microinjection directe dans les noyaux des cellules (Capecchi, Cell, 22:479 [1980]). Les cals de plantes transformées peuvent être sélectionnées grâce à un marqueur de sélection en cultivant les cellules dans un milieu contenant par exemple de la kanamycine et une quantité suffisante de phytohormone telles que l'acide naphtalène acétique et la benzyladénine. Les cellules de plantes peuvent ensuite être régénérées et les plantes en résultant transférées dans la terre en utilisant des techniques bien connues de l'homme du métier.

Un autre objet de l'invention concerne une plante transgénique contenant un polypeptide de LBP/BPI selon l'invention. De manière préférée, la plante transgénique de l'invention a intégré dans son génome le polynucléotide ou le vecteur tels que décrits dans l'invention.

De manière encore préférée, la plante transgénique de l'invention est résistante aux oomycètes. Par exemple, ladite plante transgénique peut être choisie dans le groupe comprenant par exemple la famille des Solanaceae, parmi laquelle les genres Solanum- e.g. Solanum tuberosum, Solanum lycopersicum, Solanum melongena, etc-, Capsicum- e.g Capsicum annuum, etc-, Nicotiana- e.g. Nicotiana tabacum, etc-, Physalis- e.g. Physalis alkekengi, etc- ; Lycopersicum- e.g. Lycopersicum: esculentum etc- ; des Brassicaceae, parmi laquelle les genres Arabidopsis- e.g. Arabidopsis thaliana-, Brassica- e.g. Brassica oleracea, Brassica napus, Brassica rapa, Brassica negra, etc-, Eruca- e.g. Eruca sativa, etc-, Raphanus- e.g. Raphanus raphanistrum, Raphanus sativus, Raphanus caudatus, etc- ; Vitaceae parmi laquelle les genres Ampélopsis- e.g. Ampélopsis aconitifolia, Ampélopsis brevipedunculata, Ampélopsis vitifolia, etc-, Cissus- e.g. Cissus antartica, Cissus rhombifolia, Cissus verticillata, etc-, Parthenocissus- e.g. Parthenocissus quinquefolia, parthenocissus tricuspidata, etc-, Vitis- e.g. Vitis acerifolia, Vitis coignetiae, Vitis labrusca, Vitis vinifera, etc- ; des Poaceae parmi laquelle les espèces Saccharum, Sorghum, Hordeum e.g. Hordeum murinum, Hordeum vulgare etc- , Avena e.g. Avena sativa etc- Secale- e.g. Secale céréale, etc- Triticum- e.g. Triticum turgidum, Triticum aestivum, Triticum monoccocum, Triticum du ru m, Triticum dicoccon, etc-, Oryza- e.g. Oryza sativa, Oryza glaberrima, etc-, Zea mays, etc- ; des Cucurbitaceae parmi laquelle les genres Cucumis- e.g. Cucumis melo, Cucumis sativus, etc-, Citrullus- e.g. Citrullus lanatus, etc-, Cucurbita- e.g. Cucurbita pepo, Cucurbita maxima, etc- ; des Fabaceae parmi lesquelles Pisum sativum, Phaseolus vulgaris, Trifolium sp. etc-; des Chenopodiaceae parmi lesquelles Beta vulgaris ou Spinacia oleracea etc- ; ou encore des Rutaceae parmi lesquelles le genre Citrus e.g. Citrus sinensis etc-, des Rosaceae parmi lesquelles le genre Malus e.g. Malus domestic etc-; des Fagaceae parmi lesquelles le genre Quercus e.g. Quercus robur etc-, le genre Castanea e.g. Castanea sativa etc; des Betuiaceae parmi lesquelles le genre Alnus e.g. Alnus glutinosa etc-; des Malavaceae parmi lesquelles le genre Theobroma e.g. Theobroma cacao etc-; des Euphorbiaceae parmi lesquelles le genre Hevea e.g. Hevea brasilensi etc-; des Arecaceae parmi lesquelles le genre Elaeis e.g. Elaeis oleifera etc.

Un autre objet de l'invention concerne la descendance, quelque soit la génération, de la plante transgénique exprimant un polypeptide choisi dans le groupe comprenant les protéines LBP/BPI, les dérivés et les fragments de celles-ci.

La descendance peut être sous la forme d'une graine ou d'une plante.

De manière encore préférée, ladite descendance de la plante transgénique de l'invention est résistante aux oomycètes.

Un autre objet de l'invention concerne une méthode de préparation de la plante transgénique exprimant un polypeptide choisi dans le groupe comprenant les protéines LBP/BPI, les dérivés et les fragments de celles-ci et comprenant les étapes de : a) Transformation d'au moins une de ladite plante avec un vecteur comprenant le polynucléotide codant pour un polypeptide choisi dans le groupe comprenant les protéines LBP/BPI, les dérivés et les fragments de celles-ci ;

b) Sélection d'au moins une cellule de plante transformée qui exprime ledit polypeptide; et

c) Générer une plante transgénique à partir de ladite cellule de plante transformée sélectionnée à l'étape b).

De manière préférée, la plante transgénique obtenue par une telle méthode est résistante aux oomycètes.

L'étape a) de transformation peut être réalisée par des méthodes bien connues telles que décrites précédemment comme l'électroporation, la transfection, la génération de protoplastes, le transfert direct d'ADN dans le pollen, l'embryon ou les cellules pluripotentes, la transformation par Agro-bactérie, le bombardement de particules ou le bombardement de microprojectiles.

L'étape b) de sélection peut être faite par des méthodes bien connues.

L'étape c) de générer une plante transgénique à partir de ladite cellule de plante transformée peut être réalisée par des méthodes bien connues comme la génération de cellules pluripotentes à partir de ladite cellule de plante transformée.

De manière préférée, ladite méthode est pour préparer une graine de plante, ladite méthode comprend en outre une étape d) d'obtention d'une graine à partir de la plante transgénique de l'invention. De manière préférée, ladite plante transgénique est obtenue par des méthodes bien connues telles que celles décrites par Klee H. ₍ Horsch R., Rogers S. (1987) Agrobacterium-Mediated Plant Transformation and its Further Applications to Plant Biology. Annual Review of Plant Physiology 38, 467-486 et par Potrykus I. (1991) Gene Transfer to Plants: Assessment of Published Approaches and Results. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology 42, 205-225.

Par « production en bioréacteur », on entend, au sens de la présente invention, une méthode de production de biomasse et/ou de métabolite, ici un polypeptide de LBP/BPI, grâce à la multiplication de micro-organismes, transformés ou non, produisant ce métabolite en grande quantité, dans un bioréacteur, aussi appelé fermenteur, permettant de contrôler les conditions de culture du micro-organisme afin d'optimiser sa croissance et sa production de métabolite d'intérêt.

Un autre objet de l'invention concerne un animal transgénique contenant un polypeptide de LBP/BPI selon l'invention. Ledit animal transgénique est obtenu par transformation à l'aide d'au moins un vecteur comprenant un transgène codant pour un polypeptide choisi dans le groupe comprenant les protéines LBP/BPI, leurs dérivés et leurs fragments. De manière préférée, l'animal transgénique selon l'invention est un poisson ou un crustacé.

De manière préférée, l'animal transgénique de l'invention a intégré dans son génome le polynucléotide ou le vecteur tels que décrits dans l'invention. De manière encore préférée, l'animal transgénique de l'invention est résistant aux oomycètes.

De même, l'animal transgénique de l'invention exprime des protéines LBP/BPI dans ses pontes.

Par exemple, ledit animal transgénique peut être choisi dans le groupe comprenant les poissons d'élevage, notamment de la famille des salmonidés et plus particulièrement les espèces de saumon (e.g. Oncorhynchus tshowytscha, Oncorhynchus nerka, Oncorhynchus kisutch, Oncorhynchus gorbuscha, Oncorhynchus keta et Salmo salar) et les espèces de truites (e.g. Salmo trutta, Salmo obtusirostris, Salvelinus fontinalis, Oncorhynchus mykiss, Oncorhynchus clarkii). Ledit animal transgénique peut également être choisi dans le groupe comprenant les crustacés d'élevage tels que les crabes, les crevettes, les langoustes, les langoustines, les homards, le krill ou encore les écrevisses.

La méthode de préparation de tels animaux transgéniques est décrite dans Soroldoni D. et al. Simple and efficient transgenesis with meganuclease constructs in Zebrafish. Methods Mol Biol. (2009); ou encore dans Pavlopoulos A. et al. Establishing genetic transformation for comparative developmental studies in the crustacean Parhyale hawaiensis. Proc Natl Acad Sci USA. (2005).

Un autre objet de l'invention concerne la descendance, quelque soit la génération, de l'animal transgénique de l'invention, exprimant un polypeptide choisi dans le groupe comprenant les protéines LBP/BPI, leurs dérivés et leurs fragments.

Selon l'invention, ledit animal transgénique est non humain. De manière préférée, ladite descendance de l'animal transgénique de l'invention est résistante aux oomycètes.

Les exemples qui suivent sont fournis à titre d'illustration et ne sauraient limiter la portée de la présente invention.

EXEMPLES

Matériels et Méthodes

Culture des oomycètes Les espèces d'oomycètes utilisées sont Phytophtora parasitica, Saprolegnia porasitica et Saprolegnia diclina.

Phytophtora parasitica fut cultivé dans des boites de Pétri de 90-mm de diamètre sur du milieu agar à 1 % V8 (350ml V8, 5g CaC03, 3.5g agar) à 25°C durant 6-8 jours sous une lumière constante. La production de zoospores fut induite en plaçant les cultures de Phytophtora à 4°C pendant 30min. Le mycélium fut recouvert de 10ml d'eau stérile et laissé à 28°C pendant 30min. Les zoospores furent récoltées et comptées en chambre de Malassez.

Saprolegnia parasitica et S. diclina furent cultivés sur milieu PDA (potato dextrose agar) durant 5 jours à 18± 1C. Pour obtenir des zoospores, de fines lamelles de milieu couvertes de mycélium furent transférées dans des boites de Pétri contenant un milieu "petit pois" (125 g/L_petits pois congelés, autoclavés, volume ajusté à IL et autoclavé à nouveau) puis laissés 2 jours à 18°C. La formation de sporanges fut induite en lavant les cultures 3 fois dans de l'eau distillée, puis ajout d'eau minérale stérile. Après 14h d'incubation à 18°C, les zoospores furent récoltées. Evaluation de l'activité anti-oomycète des protéines LBP/BPI L'activité des protéines recombinantes de B. glabrata BgLBP/BPI et humaine hBPI fut testée sur les 3 espèces citées ci-dessus.

Les suspensions de zoospores furent ajustées à 500000cellules/ml et 10000cellules/ml pour Phytophtora et Saprolegnia, respectivement. Les rBgLBP/BPI furent utilisées à des concentrations de 0 (contrôle), 5, 10, 30, et 100ug/ml. Le nombre de zoospores vivantes ou mortes fut compté au microscope optique (Axioplan 2, Cari Zeiss) après 10, 30, 60, 120 et 240min de traitement pour P. parasitica.

Pour les espèces de Saprolegnia, les observations furent réalisées à 30 min car la dynamique du développement de ces espèces ne permet pas de réaliser une cinétique de l'effet des protéines.

La protéine BSA (albumine de sérum bovin) fut utilisée également aux mêmes concentrations pour servir de contrôle négatif. Toutes les expériences ont été répétées 3 fois de façon indépendante.

ARN interférence de LBP/BPI chez B. glabrata Des amorces spécifiques du gène LBP/BPI1 de B. glabrata contenant une séquence de promoteur T7 ont été utilisées pour amplifier une région de 420 nucléotides dudit gène codant pour la protéine LBP/BPI de B. glabrata. Les produits PCR furent purifiés et utilisés comme matrice pour la synthèse d'ARN double brin (ARNdb).

Le gène luciférase de la luciole Photinus pyralis fut utilisé comme matrice pour l'amplification de produits PCR puis la synthèse d'ARNdb luciférase (LUC), comme précédemment indiqué, et destiné à servir de contrôle pour l'injection d'ARNdb non- relevant.

Les ARNdb (15μg dans 10 μΐ de CBSS stérile) furent injectés dans le sinus cardiaque des mollusques à l'aide d'une seringue (Hamilton 10 ul). Une seconde injection fut réalisée 12 jours après la première injection. Des groupes de 10 mollusques ont été injectés avec l'un ou l'autre des ARNdb puis maintenus en conditions standard. Les masses d'œufs produites durant les 28 jours suivant la première injection furent récoltées, observées et les œufs furent comptés sous une loupe binoculaire. Les masses d'ceufs pondues entre 12 et 21 jours après la première injection d'ARNdb furent séparées en deux groupes : l'un maintenu en conditions standard, l'autre exposé à des zoospores de Saproleigna parasitica (concentration finale de 10 ⁴ zoospores/ml).

Résultats

Mise en évidence d'une activité oomycète des protéines LBP/BPI

La protéine de mollusque BgLBP/BPI recombinante a montré une forte activité dose-dépendante contre les zoospores de Phytophtora (fig. la). Cet effet est observable dès 10 min de traitement et conduit à une survie de 63%, pour une concentration de 100ug/ml. Après deux heures de traitement, 100% des zoospores sont mortes.

La protéine humaine hBPI a montré une activité similaire contre les zoospores de Phytophtora (fig. lb). La survie des zoospores est réduite à 40 % après 10 min de traitement pour une concentration de hBPI de 100ug/ml et à 2% après lh d'incubation. Aucun effet ne fut observé en présence de BSA, quelle que soit la concentration utilisée (fig. le).

Les zoospores de Saprolegnia parasitica et S. diclina furent traitées avec rBgLBP/BPI et hBPI dans les mêmes conditions que celles utilisées pour P. parasitica et observées après 30 min de traitement. Les résultats de la figure 2 montrent que les protéines rBgLBP /BPIl et hBPI sont également actives contre les zoospores des deux espèces de Saprolegnia, avec un effet dose-dépendant.

Effet de l'ARN interférence de la protéine LBP/BPI chez B. glabrata sur les infections par oomycètes

L'efficacité de l'interférence ARN a été validée par PCR quantitative (observation de la diminution de la quantité de transcrits chez les individus injectés) et par western- blot (observation de la diminution de la protéine BgLBP/BPI chez les individus injectés, et les masses d'ceufs produites après injection). En présence de l'oomycète Saproleigna diclina, les œufs provenant de parents injectés par l'ARNdb de BgLBP/BPIl sont significativement moins viables (table 1) et sont infectés par le pathogène (figure 3).

Table 1. L'expression de BgLBP/BPIl est nécessaire à la survie des œufs en présence d'oomycètes. ** Significativement différent du contrôle (ARNdb LUC) P < 0.01, (likelihood ratio test sur données brutes).

Ces résultats démontrent, in vivo, que l'expression de BgLBP/BPI dans les masses d'ceufs est cruciale pour lutter contre une infection à oomycète.