DE CARBONO E USO"

A presente invenção descreve nanotubos de carbono funcionalizados com grupos oxigenados ácidos, apresentando pelo menos um antígeno tumoral acoplado a eles, preferencialmente da família "cancer/testis", seu processo de preparação e seu uso em formulações vacinais antitumorais. Além disso, a esses nanotubos de carbono pode ser acoplado pelo menos um agonista de receptores do tipo Toll, o qual possui potente atividade imunoestimulatória. Esta estratégia de vacinação pode ser usada no tratamento de doenças, como o câncer, as quais necessitam de indução de uma resposta imune mediada tanto por células, como por anticorpos específicos.

Adjuvantes são compostos que intensificam a resposta imune contra antígenos co-inoculados. Um bom adjuvante deve ser estável, ou seja, resistente à degradação, produzido com baixo custo, imunologicamente inerte, compatível com diferentes tipos de antígeno e capaz de promover uma resposta imune humoral e/ou celular apropriada, dependendo da necessidade para a proteção do organismo. Adjuvantes baseados em sais de alumínio (alúmen) são os mais amplamente utilizados em formulações vacinais aprovadas, visto que apresentam resultados satisfatórios. Contudo, apesar do seu uso frequente e global, o modo de ação desse tipo de adjuvante ainda não é bem compreendido (AGUILAR, J. C; RODRIGUEZ; E. G. Vaccine adjuvants revisited. Vaccine, v. 25, n.19, p. 3752-3762, 2007; LINDBLAD, E. B. Aluminium compounds for use in vaccines. Immunology and Celi Biology, v. 82, p. 497-505, 2004).

A eficiência de um adjuvante depende da sua capacidade de entregar os antígenos de forma eficaz para as células apresentadoras de antígenos (APCs) e, por consequência, ativá-las. Atualmente, há um número muito limitado de adjuvantes vacinais licenciados para uso em seres humanos, levando a uma necessidade crítica da busca por novos sistemas alternativos que potencializem a resposta imune e que sejam agentes de entrega de antígenos. Nota-se que há uma tendência em direcionar esforços para o desenvolvimento de novos adjuvantes focados em sistemas que utilizem micro e nanomateriais, os quais apresentam várias vantagens. Por exemplo, as micropartículas são aproximadamente do mesmo tamanho de muitos patógenos que o sistema imunológico já está preparado para reconhecer e eliminar. Além disso, micro e nanopartículas já demonstraram gerar um vigoroso estímulo na imunidade humoral e celular. Devido ao fato de apresentarem uma grande área de superfície, ou uma relação superfície/massa mais elevada, essas partículas têm uma maior área de contato com a membrana celular, bem como uma maior capacidade de adsorção e transporte. Assim, seus efeitos inerentes são realçados e contribuem para a estimulação da resposta imune. A eficiência de um sistema particulado como apresentador de um antígeno dependerá não só de características físico-químicas adequadas, como tamanho, carga e hidrofobicidade, mas também de apresentar um risco mínimo aos indivíduos que serão vacinados (JOHANSEN, P. et al. Anti-mycobacterial immunity induced by a single injection of M. leprae Hsp65-encoding plasmid DNA in biodegradable microparticles. Immunology Letters, v. 90, n. 2-3, p. 81-85, 2003; 0'HAGAN, D.T.; DE GREGORIO, E. The path to a successful vaccine adjuvant - The long and winding road'. Drug Discovery Today, v. 14, n. 1 1-12, p. 541-551 , 2009; 0'HAGAN, D. T.; SINGH, M.; ULMER, J. B. Microparticle- based Technologies for vaccines. Methods, v. 40, n. 1 , p. 10-19, 2006; PEEK, L. J.; MIDDAUGH, C. R.; BERKLAND, C. Nanotechnology in vaccine delivery. Advanced Drug Delivery Reviews, v. 60, n. 8, p. 915-928, 2008; RICE-FICHT, A. C. et al. Polymeric particles in vaccine delivery. Current Opinion in Microbiology, v. 13, n. 1 , p. 106-112, 2010; SMART, S.K. et al. The biocompatibility of carbon nanotubes. Carbon, v. 44, n. 6, p. 1034-1047, 2006).

Dessa forma, o interesse em nanomateriais especializados e sistemas de nanopartículas funcionalizadas é crescente. Como exemplo de partícula nanométrica, citam-se os nanotubos de carbono, os quais têm apresentado importantes implicações no desenvolvimento de nanoformulações para aplicações médicas e farmacêuticas, incluindo biosensores e veículos de entrega de drogas. Entretanto, os nanotubos de carbono puros são inerentemente hidrofóbicos. Este é o principal obstáculo para sua utilização biológica e medicinal, uma vez que a solubilidade é bastante baixa em muitos solventes compatíveis com fluidos biológicos, que são aquosos. A funcionalização de nanotubos tem sido utilizada para administrar esse problema e, em muitos casos, isso permite a ligação de peptídeos biologicamente ativados e de drogas medicinais em sua superfície. Estas propriedades suscitam o interesse de usar os nanotubos de carbono como veículos para entrega de fármacos, fazendo com que diversos estudos sejam conduzidos no uso de nanotubos associados com moléculas de drogas ou vacinas (JIA, G. et a/. Cytotoxicity of carbon nanomaterials: single-wall nanotube, multi-wall nanotube, and fullerene. Environmental Science & Technology, v. 39, p. 1378-1383, 2005; SMART, S. K. et al. The biocompatibility of carbon nanotubes. Carbon, v. 44, n. 6, p. 1034-1047, 2006).

O estudo dos nanotubos de carbono em geral e de suas utilizações biomédicas certamente constitui um vasto campo de pesquisas e aplicações tecnológicas, sendo que algumas áreas permanecem ainda pouco exploradas. Por exemplo, sabe-se que um antígeno imunogênico pode ser potencializado quando aliado a um veículo de entrega específico, já que este pode facilitar a entrega e/ou liberação controlada do antígeno às células apresentadoras de antígenos. Uma investigação recente demonstrou o potencial dos nanotubos de carbono na entrega de antígenos pouco imunogênicos ao sistema imunológico, em particular para células dendríticas (DCs), induzindo alta produção de anticorpos específicos. As DCs são consideradas as células apresentadoras de antígenos ativadoras de células T mais eficientes. Dadas essas informações, observa-se um interessante campo de pesquisa, que mescla o uso de nanotubos de carbono e de antígenos específicos na elaboração de vacinas para combate ou prevenção de determinada doença, por exemplo, o câncer. (STORNI, T. et al. Immunity in response to particulate antigen-delivery systems. Advanced Drug Delivery Reviews, v. 57, n. 3, p. 333-355, 2005; MOSER, M; LEO, O. Key concepts in immunology. Vaccine, v. 28S, p. C2-C 3, 2010; VILLA, C. H. et al. Single-Walled Carbon Nanotubes Deliver Peptide Antigen into Dendritic Celis and Enhance IgG Responses to Tumor-Associated Antigens. ACS Nano, v. 5, n. 7, p. 5300-531 1 , 201 1).

Os antígenos proteicos mais promissores para induzir resposta imune específica para células tumorais são os da família "cancer/testis", que não são expressos em células normais, com exceção das células germinativas do testículo - contudo, estas não são reconhecidas pelo sistema imune. O potencial terapêutico deste grupo de antígenos tumorais foi demonstrado por vários estudos, por exemplo, VAN PEL, A. et al. Immunological Reviews, v. 145, p. 229-250, 1995; THURNER, B. et al. Journal of Experimental Medicine, v. 190, n. 11 , p. 1669-1678, 1999; REYNOLDS, S. R. et al. Clinicai Câncer Research, v. 9, p. 657-662, 2003. Entretanto, comparado aos antígenos de diferenciação ou aos antígenos superexpressos, os antígenos "cancer/testis" ainda são pouco utilizados como alvo imunológico devido à alta heterogeneidade na expressão dos diversos membros desta família (KIRKIN, A. F.; DZHAN DZH UGAZYAN , K. N.; ZEUTHEN, J. Cancer/testis antigens: structural and immunobiological properties. Câncer Investigations, v. 20, n. 2, p. 222-236, 2002; ZENDMAN, A. J.; RUITER, D. J.; VAN MUIJEN, G. N. P. Cancer/testis-associated genes: Identification, expression profile, and putative function. Journal of Cellular Physiology, v. 194, n. 3, p. 272-288, 2003).

A proteína NY-ESO-1 é um exemplo de proteína "cancer/testis". Sua função nas células germinativas e no desenvolvimento de tumores continua desconhecida, assim como a da maioria dos antígenos dessa família. Por outro lado, a proteína NY-ESO-1 é conhecida como um dos antígenos tumorais mais imunogênicos, sendo encontrada na maioria dos tipos tumorais. A frequência de expressão em alguns tipos, como melanoma, câncer de pulmão, de esôfago e sarcomas sinoviais, pode chegar a até 80% dos pacientes, sendo variável de um indivíduo para outro (GNJATIC, S. et al. NY- ESO-1 : review of an immunogenic tumor antigen. Advances in Câncer Research, v. 95, p. 1-30, 2006; SCALAN, M. J. et al. Identification of cancer/testis genes by database mining and mRNA expression analysis. International Journal of Câncer, v. 98, n. 4, p. 485-492, 2002). Com o objetivo de oferecer uma aplicação dos nanotubos de carbono no desenvolvimento de novos sistemas vacinais, principalmente relacionados à terapia do câncer, a presente tecnologia é proposta. Trata-se de uma formulação vacinai antitumoral que envolve o emprego de uma proteína da família "cancer/testis", principalmente a NY-ESO-1 e, opcionalmente, de molécula agonista de receptores do tipo Toll, ambas acopladas a nanotubos de carbono de paredes múltiplas oxidados. Assim, essa formulação vacinai é capaz de induzir resposta imune anti-NY-ESO-1 e resistência do hospedeiro contra tumores expressando tal antígeno.

A tecnologia apresentada vem como alternativa para suprir as lacunas deixadas pelos métodos vacinais que são utilizados até o momento. Ao longo da história, a maioria das vacinas foi desenvolvida utilizando organismos vivos, atenuados ou ainda fragmentos de patógenos. Apesar da vantagem de produzir muitas vezes tanto imunidade humoral como celular, o uso de patógenos vivos ou atenuados pode oferecer sério risco e resultar em graves efeitos adversos, como reportado para as vacinas contra coqueluche e contra poliomielite, devido à instabilidade intrínseca dos organismos e consequentemente, ao possível retorno à sua forma virulenta. A formulação vacinai apresentada utiliza proteínas antigênicas, ou fragmentos delas, acopladas a nanotubos de carbono. Portanto, sob o aspecto da segurança, torna-se vantajosa em relação às vacinas que usam patógenos vivos ou atenuados (DONNELLY, S. et al. Whole-cell but not acellular pertussis vaccines induce convulsive activity in mice: evidence of a role for toxin-induced interleukin-1 beta in a new murine model for analysis of neuronal side effects of vaccination. Infection and Immunity, v. 69, n. 7, p. 4217-4223, 2001 ; CHERKASOVA, E. A. ef al. Long-term circulation of vaccine-derived poliovirus that causes paralytic disease. Journal of Virology, v. 76, n. 13, p. 6791-6799, 2002; PEEK, L. J.; MIDDAUGH, C. R.; BERKLAND, C. Nanotechnology in vaccine delivery. Advanced Drug Delivery Reviews, v. 60, n.8, p. 915-928, 2008).

Outro problema que pode ser mencionado se refere aos adjuvantes atualmente utilizados. Conforme já foi colocado, há um número muito limitado de adjuvantes vacinais permitidos para uso em seres humanos. Aqueles que são baseados em sais de alumínio, apesar de manterem um bom perfil de segurança por mais de sete décadas, apresentam problemas peculiares. Um deles se relaciona a sintomas alérgicos, como eritema, hipersensibilidade de contato, inflamação granulomatosa e nódulos subcutâneos, bem como ocorrência de miofascite macrofágica. Esses sintomas já foram relatados por pacientes que receberam vacinas contendo esse tipo de adjuvante. O outro problema está no fato dos sais de alumínio oferecerem melhoria na resposta imune para apenas alguns tipos de vacinas, o que torna seu uso limitado (GHERARDI, R. K. et al. Macrophagic myofasciitis lesions assess long-term persistence of vaccine-derived aluminium hydroxide in muscle. Brain, v. 124, n. 9, p. 1821-1831 , 2001 ; FROST, L. et al. Persistent subcutaneous nodules in children hyposensitized with aluminium-containing allergen extracts. Allergy, v. 40, n. 5, p. 368-372; 1985). Esses transtornos são significativamente reduzidos com a formulação vacinai proposta na presente invenção.

Estudos recentes têm demonstrado que antígenos associados a ligantes de receptores do tipo Toll podem elevar significativamente a produção de anticorpos e induzir rápida resposta imune celular. Assim, formulações de vacinas em experimentação contra tumores e outras doenças já vêm sendo feitas combinando-se antígenos protéicos com agonistas de receptores do tipo Toll (TLR), os quais agem como adjuvantes imunológicos. Essa estratégia aumenta a capacidade de ativar células dendríticas (DCs), favorecendo o desenvolvimento de uma forte imunidade mediada por células T e por linfócitos Th1. (HULEATT, J. W. et al. Vaccination with recombinant fusion proteins incorporating Toll-like receptor ligands induces rapid cellular and humoral immunity. Vaccine, v. 25, n. 4, p. 763-775, 2007; WILLE-REECE, U. et al. HIV Gag protein conjugated to a Toll like receptor 7/8 agonist improves the magnitude and quality of Th1 and CD8 T cell responses in nonhuman primates. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America, v. 102, n. 42, p. 15190-15194, 2005). De modo diferenciado do que foi exposto, a atividade adjuvante do complexo vacinai desenvolvido na presente tecnologia caracteriza-se pela entrega eficiente do antígeno protéico, através de nanotubo de carbono, aliado ao sinal co- estimulatório da outra molécula. Além disso, esse sistema vacinai é capaz de estimular o sistema imune de forma mais efetiva e duradoura.

Foram encontrados no estado da técnica alguns documentos de patente relacionados com a presente tecnologia. Os mais relevantes estão listados abaixo.

O documento PI0510570-6 descreve uma vacina para tratamento de antígenos do câncer a qual compreende um antígeno MAGE-3 modificado, um antígeno NY-ESO-1 e um adjuvante. Este compreende uma saponina, a QS21 , formulada em um lipossoma contendo colesterol, e um oligonucleotídeo imunoestimulador, o CpG. A presente invenção, apesar de também utilizar o antígeno NY-ESO-1 e o oligonucleotídeo CpG como imunoestimulante, se diferencia desta encontrada no estado da técnica por apresentar esses componentes associados a nanotubos de carbono.

O documento US2009/0246213 trata de uma vacina de DNA para desenvolver imunidade tumor-específica. Sua composição compreende dois vetores de expressão plasmidiais, cada um contendo uma sequência que codifica um antígeno. O primeiro vetor de expressão contém a sequência de um antígeno que é expresso restritamente em tumores, o NY-ESO-1 , e é reconhecido por células T auxiliares CD4+; o segundo vetor de expressão contém a sequência de um antígeno tumoral específico ou de um antígeno associado a tumor que é reconhecido por células T citotóxicas CD8+ e é diferente daquele expresso no primeiro vetor. Esta tecnologia é diferente da presente invenção, a qual se baseia em nanotubos de carbono e não em DNA recombinante.

O documento CN 1647821 descreve uma nanovacina construída pelo processo de ultrassom magnético. A vacina é composta por um carreador intracorpóreo de medicamentos (no caso, uma nanoemulsão biológica), o antígeno MG7, específico do câncer gástrico, e um adjuvante imunológico que é uma sequência de oligonucleotídeos contendo motivo CpG. Conforme descrito, trata-se de uma vacina específica para câncer de estômago e portanto, diferente da tecnologia apresentada, a qual se trata de uma vacina para câncer em geral, dado o uso da proteína NY-ESO-1 como antígeno. Conforme já foi explicado, essa proteína é expressa na maioria dos tipos tumorais. Além disso, a nanoemulsão relatada no documento CN1647821 não se trata especificamente de um nanotubo de carbono, como na tecnologia apresentada.

O documento US201 1/0236495 trata de uma composição composta por uma sequência de ácido nucleico anticâncer, codificando UDP- glucuronosiltransferase ou p53, anexada não-covalentemente a uma nanopartícula, que pode ser um nanotubo de carbono. Essa composição é usada para tratamento de células tumorais. A diferença entre esta tecnologia e a presente invenção está no antígeno utilizado.

Diante do que foi exposto, avalia-se que os documentos supracitados não comprometem a tecnologia apresentada.

DESCRIÇÃO DAS FIGURAS A Figura 1 apresenta imagens de microscopia eletrônica de transmissão da amostra de nanotubos de carbono de paredes múltiplas (MWCNT) bruta. A imagem A da figura mostra uma visão geral representativa de toda a amostra. As imagens B e C ilustram, em maior detalhe, a presença ainda de impurezas metálicas (esferas mais escuras) envolvidas por camadas grafíticas (B) e de tubos de diferentes diâmetros internos e externos (B e C).

A Figura 2 apresenta imagem de microscopia eletrônica de transmissão da amostra de MWCNT após oxidação severa. A imagem A mostra uma visão geral representativa de toda a amostra. As imagens B e C evidenciam, em ampliação, a obtenção de uma amostra mais livre de impurezas e a presença de nanotubos de carbono com paredes defeituosas.

A Figura 3 apresenta gráficos referentes à análise termogravimétrica das amostras de MWCNT antes e após oxidação severa. A e B mostram as curvas TG, enquanto C e D mostram as curvas DTG, para as amostras de MWCNT bruta e oxidada, respectivamente. Os parâmetros "posição" e "área relativa (%)" do ajuste lorentziano estão indicados na figura. A Figura 4 mostra os espectros Raman, obtidos utilizando um comprimento de onda de excitação de 514,5 nm, das amostras de MWCNT severamente oxidadas (A.1 e B.1) e bruta (A.2 e B.2). Os espectros A apresentam a região espectral das bandas D (aproximadamente em 1350 cm ^{* 1} ) e G (aproximadamente em 1590 cm ^"1 ). Esses espectros foram normalizados pela banda G. Já os espectros B mostram a região espectral da banda G' (aproximadamente em 2700 cm ^"1 ).

A Figura 5 mostra os espectros Raman das amostras de MWCNT oxidada (A), ovalbumina (OVA) (B) e MWCNT-OVA (C), no intervalo espectral entre 900 e 2100 cm ^"1 . Os espectros foram obtidos utilizando o comprimento de onda de excitação de 325 nm.

A Figura 6 apresenta imagens referentes à avaliação da viabilidade celular, na presença de diferentes concentrações de MWCNT, por meio da metabolização do MTT. Os cristais de formazan formados (indicados pelas setas) são indicativos da presença de células viáveis. A imagem A da figura representa o controle negativo, somente com células dendríticas (sem MWCNT). A imagem B representa o teste em células dendríticas na presença de 1 μg/mL de MWCNT. A imagem C representa o resultado do teste em células dendríticas na presença de 10 μg/mL de MWCNT. A imagem D representa o teste em células dendríticas na presença de 20 g/mL de MWCNT. Por fim, a imagem E representa o resultado do teste em células dendríticas na presença de 50 μg/mL de MWCNT.

A Figura 7 apresenta imagens, por microscopia confocal, referentes à avaliação da internalização do complexo MWCNT-OTI-FITC. São observadas células dendríticas após ensaio de fagocitose, evidenciando presença, em seu interior, dos MWCNTs acoplados a peptídeos marcados com fluorescência. Na imagem B, observa-se o peptídeo OTI marcado com FITC; na imagem C, o núcleo corado com Dapi; na imagem D, o citoplasma marcado com Celi Mask ^® ; na imagem A, a imagem transmitida e, por último, na imagem E, a sobreposição das quatro imagens.

A Figura 8 mostra gráficos referentes à caracterização da resposta imune induzida por vacinação com MWCNT. Animais Balb/c foram imunizados com formulações contendo o antígeno OVA acoplado aos nanotubos de carbono. O gráfico A representa a produção de anticorpos IgG Total, lgG1 e lgG2a anti-OVA presentes no soro dos animais, avaliada por ELISA. O gráfico B representa a produção de IFN-γ após 72 horas de cultivo, quantificada por ELISA, obtida em ensaio com esplenócitos dos animais imunizados que foram re-estimulados com o peptídeos TCD4 ⁺ e TCD8 ⁺ OVA-específicos.

A Figura 9 mostra gráficos referentes à avaliação da resposta celular e humoral anti-NY-ESO-1 induzida por vacinação com nanotubos de carbono (MWCNT). Animais C57BL/6 foram imunizados com formulações contendo NY-ESO-1 acoplado aos nanotubos de carbono. O gráfico A representa a produção de anticorpos IgG total, lgG1 e lgG2c anti-NY-ESO-1 presentes no soro dos animais avaliada por ELISA. O gráfico B representa a produção de IFN-γ verificada após 72h de cultivo, quantificada por ELISA, obtida de ensaio com esplenócitos de animais imunizados que foram re-estimulados com peptídeos T CD4 ⁺ ou T CD8 ⁺ específicos ou com a proteína recombinante NY- ESO-1. O gráfico C representa o resultado da quantificação por ELISPOT de células produtoras de IFN-γ, após re-estimulação com NY-ESO-1 dos esplenócitos dos animais imunizados.

A Figura 10 mostra gráficos referentes ao acompanhamento do crescimento tumoral após vacinação com MWCNT. Animais C57BL/6 imunizados com o antígeno NY-ESO-1 e oligonucleotídeo CpG acoplados aos nanotubos de carbono e seus controles foram desafiados com 5x10 ⁴ células de melanoma B16 expressando NY-ESO-1. No gráfico A, o crescimento tumoral foi acompanhado por 35 dias. No gráfico B, os animais foram acompanhados também quanto à porcentagem de sobrevivência após o desafio. O símbolo (†) significa morte.

A Figura 11 mostra gráficos referentes à avaliação da resposta celular anti-NY-ESO-1 induzida por vacinação terapêutica com nanotubos de carbono (MWCNT) e gráficos referentes ao acompanhamento do crescimento tumoral após o tratamento. Animais C57BL/6 foram desafiados com 5x10 ⁴ células de melanoma B16 expressando NY-ESO-1 e, em seguida, tratados com formulações contendo NY-ESO-1 e oligonucleotídeo CpG acoplados aos nanotubos de carbono e seus controles. O gráfico A representa a produção de IFN-γ verificada após 72h de cultivo, quantificada por ELISA, obtida de ensaio com esplenócitos de animais tratados que foram re-estimulados com peptídeos T CD4 ⁺ ou T CD8 ⁺ específicos ou com a proteína recombinante NY- ESO-1. No gráfico B, o crescimento tumoral foi acompanhado por 30 dias. No gráfico C, os animais foram acompanhados também quanto à porcentagem de sobrevivência após o desafio.

A Figura 12 mostra gráficos referentes ao acompanhamento do crescimento tumoral e mortalidade após vacinação profilática e terapêutica com nanotubos de carbono (MWCNT). No ensaio profilático, animais Balb/c imunizados com o antígeno NY-ESO-1 e oligonucleotídeo CpG acoplados aos nanotubos de carbono e seus controles foram desafiados com 1x10 ⁶ células de carcinoma de cólon CT26 expressando NY-ESO-1. No gráfico A, o crescimento tumoral foi acompanhado por 30 dias após o desafio. No gráfico B, os animais foram acompanhados também quanto à porcentagem de sobrevivência após o desafio. No ensaio terapêutico, animais Balb/c foram desafiados com 1x10 ⁶ células de carcinoma de cólon CT26 expressando NY- ESO-1 e, em seguida, tratados com formulações contendo NY-ESO-1 e oligonucleotídeo CpG acoplados aos nanotubos de carbono e seus controles. No gráfico C, o crescimento tumoral foi acompanhado por 30 dias após o tratamento. No gráfico D, os animais foram acompanhados também quanto à porcentagem de sobrevivência após o desafio tratamento.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

A presente invenção descreve nanotubos de carbono de paredes múltiplas funcionalizados com grupos oxigenados ácidos, que apresentam pelo menos um antígeno tumoral, como uma proteína da família "cancer/testis", preferencialmente a proteína NY-ESO-1 , acoplada covalentemente ou, preferencialmente, não-covalentemente. Opcionalmente, também pode estar acoplado aos nanotubos pelo menos um agonista de receptores do tipo Toll, preferencialmente um oligonucleotídeo CpG derivado de Trypanosoma cruzi apresentando o motivo representado por uma sequência selecionada do grupo que compreende [PyPy(GTCGTPyPy)n], [polyGPuPuCGPuPyCGPyPypolyG] ou [PyPy(GTCGTPyPy)nPal], onde: Py é uma base pirimídica; Pu é uma base púrica; Pai representa um palíndromo que pode apresentar diversas sequências, como [CGGC], [CGTTGC] e [CGTTTTGC], não limitante a estas; e

n > 1.

Esses nanotubos podem, portanto, ser usados como adjuvantes e veículos em formulações vacinais antitumorais, associados a excipientes farmacêutica e farmacologicamente aceitáveis. As formulações vacinais podem ser líquidas, sólidas ou semissólidas.

Os excipientes podem ser selecionados do grupo que compreende água, solução salina, soluções tamponadas com fosfato, solução de Ringer, solução de dextrose, solução de Hank, soluções salinas biocompatíveis contendo ou não polietilenoglicol, veículos não aquosos, como óleos fixos, óleo de sésamo, oleato de etila ou triglicerídeos, isolados ou em mistura, incluindo nanoformulações farmacêuticas. Além disso, os excipientes podem conter aditivos, como tampões, conservantes, aglutinantes, desintegrantes, diluentes, lubrificantes e/ou tensoativos.

A formulação vacinai pode ser administrada pelas vias oral, inalatória, dérmica, transdérmica, intramuscular, intravenosa, subcutânea, intraperitoneal ou por dispositivos que possam ser implantados ou injetados.

Para uma melhor compreensão da tecnologia, seguem exemplos, os quais não são limitantes da mesma. Exemplo 1 : Funcionalização dos Nanotubos de Paredes Múltiplas

1) Síntese e Oxidação dos Nanotubos de Carbono de Paredes Múltiplas

A amostra bruta dos nanotubos de carbono de paredes múltiplas (MWCNT, sigla em inglês para Multi-Wall Carbon Nanotubes) utilizados na presente invenção foi crescida por deposição química em fase de vapor (Chemical Vapor Deposition - CVD) a uma temperatura de crescimento de entre 700 e 900°C, utilizando hidrocarbonetos, como o etileno, como gás precursor de carbono e gás inerte, como argônio, como gás carreador. O processo de pirólise foi catalisado por nanopartículas de óxidos de ferro e cobalto ancoradas a um suporte de óxido de magnésio. Os MWCNTs obtidos possuem 10-40 nm de diâmetro e 10-80 μιη de comprimento (Figura 1) (UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS. Luiz Orlando Ladeira, Gustavo Catão Alves, Sérgio de Oliveira. Processos e sistema de produção contínua em larga escala de nanoestruturas de carbono. BR n. PI 0404543-2, 02 mar. 2004).

A remoção das impurezas provenientes de materiais catalisadores e de outras formas de carbono, como fulerenos, carbonos amorfos e nanopartículas grafíticas, foi realizada via oxidação térmica e química por digestão em ácido clorídrico. Em seguida, foi realizada uma oxidação severa, visando à criação de defeitos nas extremidades e paredes dos tubos e à funcionalização desses defeitos com grupos oxigenados ácidos (por exemplo, ácidos carboxílicos). O tratamento oxidativo foi feito em mistura de ácido sulfúrico e ácido nítrico, sob refluxo assistido por micro-ondas. Em seguida, a mistura foi neutralizada com solução de hidróxido de sódio, filtrada e secada em estufa. Ao final deste processo, foi obtida uma amostra de nanotubos de carbono de múltiplas paredes funcionalizados com grupos oxigenados ácidos, incluindo ácido carboxílico (-COOH), com pureza aproximada de 95% em massa (Figura 2). A dispersão dessa amostra foi feita em água MilliQ, após entre 15 e 240 minutos de sonificação direta (em ponta).

O grau de pureza e a composição das amostras de MWCNT antes e após os procedimentos de purificação e oxidação foram ilustrados nas imagens de microscopia eletrônica de transmissão (Figuras 1 e 2) e determinados quantitativamente por termogravimetria (Figura 3). Para a amostra bruta (Figura 3C), observam-se três perdas de massa significativas, com percentuais de aproximadamente 28, 32 e 25% em massa, centradas respectivamente em aproximadamente 200, 520 e 560 °C. A primeira refere- se à decomposição de provavelmente carbono amorfo, termicamente menos estável devido à falta de organização estrutural; seguida da decomposição dos nanotubos de carbono de menores tamanhos ou baixa qualidade estrutural; e da decomposição dos nanotubos de maior pureza e melhor qualidade estrutural (TRIGUEIRO, J. P. C. et al. Purity Evaluation of Carbon Nanotube Materials by Thermogravimetric, TEM, and SEM Methods. Journal of Nanoscience and Nanotechnology, v.7, n. 10, p. 3477-3486, 2007). O resíduo (aproximadamente 12% em massa) é composto por partículas metálicas catalisadoras oxidadas. Para a amostra fortemente oxidada (Figura 3D), foi caracterizada uma perda inicial de aproximadamente 5% em massa, a aproximadamente 150°C, referente à decomposição de material orgânico (grupos funcionais na superfície). A quantidade relativa de nanotubos na amostra oxidada aumentou devido à remoção de carbono amorfo e resíduos metálicos, indo de 32 para 46% em massa na primeira decomposição e de 25 para 37% na segunda decomposição. O pico da temperatura de degradação dos nanotubos diminuiu em relação à amostra bruta, devido à formação de defeitos na superfície dos tubos oxidados (ilustrados na Figura 2C). O percentual correspondente ao resíduo reduziu significativamente para aproximadamente 5% em massa. As decomposições observadas a temperaturas mais altas, 750°C em C e 675°C em D, são características de partículas grafíticas.

As presenças de carbono amorfo (principalmente na amostra bruta) e de defeitos nas extremidades e paredes dos nanotubos quimicamente processados foram também caracterizadas nos espectros Raman, pela alta intensidade das bandas D em torno de 1350 cm ^"1 e D' em torno de 1620 cm ^"1 (Figura 4 A1 e A2) (PIMENTA, M. A. et. ai Studying disorder in graphite- based systems by Raman Spectroscopy. Physical Chemistry Chemical Physics, v. 9, p. 1276-1291 , 2007). A diminuição da intensidade relativa dessas bandas para a amostra oxidada (A1) em relação à amostra bruta (A2) deve-se à remoção de carbono amorfo durante a oxidação, como observado por termogravimetria (KIM, U.J. et. al. Raman and IR spectroscopy of chemically processed single-walled carbon nanotubes. J. Am. Chem. Soe, v. 127, p. 15437-15445, 2005; VIEIRA, H. S. et. al. Decarboxylation of oxidized single-wall carbon nanotubes. Journal of Nanoscience and Nanotechnology, v. 7, n. 10, p. 3421-3430, 2007). O deslocamento para frequências menores das bandas G (A1) e G' (B1), nos espectros das amostras oxidadas, é uma evidência de transferência de carga entre os nanotubos e os grupos funcionais introduzidos durante a oxidação (PAN, H., et al. Ab initio study of OH-functionalized single-wall carbon nanotubes; Physical Review B, v. 70, p. 245425-1-245425-5, 2004; KIM, U.J. et. al. Raman and IR spectroscopy of chemically processed single-walled carbon nanotubes. Journal of the American Chemical Society, v. 127, p. 15437-15445, 2005).

A identificação e a análise quantitativa dos sítios ácidos ionizáveis adicionados às extremidades e defeitos da superfície dos MWCNT oxidados foram realizadas por titulação ácido-base potenciométrica (VIEIRA, H. S. et. al. Decarboxylation of oxidized single-wall carbon nanotubes. Journal of Nanoscience and Nanotechnology, v. 7, n. 10, p. 3421-3430, 2007). Considerando os valores de pKa entre 2,0 e 6,0 associados aos ácidos carboxílicos, e entre 9,0 e 12,0 aos grupos fenólicos, obteve-se um total de aproximadamente 0,78 mmol/g de grupos ácidos carboxílicos e aproximadamente 0,92 mmol/g de grupos fenólicos. Estes valores podem ser alterados, variando a composição da mistura ácida oxidante.

2) Interação MWCNT oxidado-antípeno

O antígeno OVA foi adicionado a uma dispersão da amostra MWCNT oxidada em água MilliQ. Essa dispersão foi depositada sobre substrato de silício e o espalhamento Raman desses depósitos foi investigado para caracterização da interação MWCNT oxidado-proteína. Os espectros na Figura 5 foram obtidos utilizando um comprimento de onda de excitação de 325 nm. Na Figura 5A são observadas as bandas D (1417 cm ^"1 ) e G do (1584 cm ^"1 ) do MWCNT oxidado. Bandas da proteína OVA aparecem na mesma região espectral. Na Figura 5B, as bandas em aproximadamente 1382, 1428, 1474 e 1583 cm ^"1 são provavelmente atribuídas aos modos vibracionais amida III, do grupo -COO-, de deformação da ligação C-H alifática e do estiramento do anel fenila, respectivamente, da estrutura peptídica da OVA (NGARIZE S. et al. Comparison of Changes in the Secondary Structure of Unheated, Heated, and High-Pressure-Treated β-Lactoglobulin and Ovalbumin Proteins Using Fourier Transform Raman Spectroscopy and Self-Deconvolution. Journal of Agricuture and Food Chemistry. V. 52, p. 6470-6477, 2004). Já no espectro da amostra MWCNT oxidado-proteína (Figura 5C), uma superposição das bandas de ambos os constituintes, MWCNT e OVA, estende-se por um maior intervalo espectral, devido ao deslocamento em freqiiência dessas bandas em relação aos seus valores originais em A e B (por exemplo, a banda G do MWCNT encontra-se agora em aproximadamente 1605 cm ^"1 ). O deslocamento em freqiiência evidencia a transferência de cargas entre os nanotubos e a proteína, decorrente do acoplamento não- covalente promovida entre as duas espécies (TSANG, J. C. et al. Doping and phonon renormalization in carbon nanotubes. Nature Nanotechnology, v. 2, p. 725-730 2007).

3) Cultivo de Células Dendríticas

A partir do cultivo e diferenciação de células tronco hematopoiéticas murinas, na presença da citocina GM-CSF (20 ng/mL), foram obtidas células dendríticas (DCs) CD11c ⁺ imaturas no décimo dia de cultivo com características fenotípicas e funcionais conservadas, caracterizadas por citometria de fluxo e microscopia ótica. 4) Microscopia confocal

Células dendríticas, no décimo dia de cultivo, foram incubadas em estufa a 37°C e 5% CO ₂ , durante 24 horas, com MWCNTs (1-50 pg/mL) acoplados ao peptídeo OVA-OTI (5-100 pg/mL) conjugado com FITC. As células foram marcadas, fixadas em formaldeído 4% e, em seguida, observadas por meio de microscopia confocal. As lâminas foram analisadas em microscópio confocal Zeiss 5Live e as imagens foram adquiridas e formatadas pelo software ZEN Light Edition.

A presença dos nanotubos de carbono na região citoplasmática demonstra a capacidade fagocítica e viabilidade funcional dessas células. Foi possível observar co-localização evidente entre os nanotubos e os peptídeos fluorescentes, confirmando a eficácia do acoplamento. Além disso, observa-se um aumento significativo da fluorescência no interior das células incubadas com o complexo MWCNT-OTI-FITC, em comparação com aquelas que foram incubadas apenas com o peptídeo (Figura 7).

5) Cultivo de linhagem tumoral de melanoma B16 NY-ESO-1 e CT26 NY-ESO- 1

Células da linhagem celular transgênica de melanoma B16 e carcinoma de cólon CT26 expressando NY-ESO-1 foram cultivadas em RPMI suplementadas com 10% SFB e penicilina/estreptomicina em estufa a 37°C, 5% CO ₂ . Foram adicionados 300 pg/mL de geneticina para a manutenção do plasmídeo de expressão.

Exemplo 2: Avaliação da Viabilidade Celular

Com o objetivo de demonstrar a biocompatibilidade dos nanotubos de carbono utilizados na presente tecnologia, foi realizado um ensaio de viabilidade celular por meio da metabolização do sal tetrazolico MTT por enzimas mitocondriais. Trata-se de um método colorimétrico sensível e quantitativo que mensura o metabolismo celular, proliferação e estado de ativação das células (MOSMANN, T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. Journal of Immunological Methods, v. 65, n.1-2, p. 55-63, 1983). Células dendríticas (DCs) imaturas no décimo dia de cultivo foram colocadas em contato com diferentes concentrações de nanotubos de carbono de paredes múltiplas (1 , 10, 20 e 50 pg/mL) e mantidas em cultura em estufa a 37°C e 5% CO ₂ . A viabilidade das DCs foi comprovada e visualizada por meio de microscopia ótica, após 2 horas de cultura, a partir da formação dos cristais de Formazan, insolúveis em água. Em seguida, foi acrescentada a cada poço uma solução de SDS-HCI para a solubilização dos cristais. Após 20 horas de cultura, foi realizada a leitura dos valores de absorbância da solução resultante a 595 nm em um leitor automático de microplacas. As células com 20 pg/mL de MWCNTs apresentaram 75% de viabilidade, assumindo-se 100% para aquelas cultivadas sem os nanotubos de carbono oxidados. Somente a partir de 50 pg/mL foi observada uma queda significativa na viabilidade das células (Figura 7).

Exemplo 3: Caracterização da resposta imune induzida pelos MWCNTs

Visando caracterizar o papel dos MWCNTs em formulações vacinais, bem como a eficiência do acoplamento não-covalente de antígenos à sua superfície oxidada, camundongos Balb/c foram submetidos a um protocolo de uma a três imunizações equivalentes, com intervalos de 15 dias. Essas imunizações se deram pela administração de 100 pl_ da formulação vacinai, via subcutânea.

Cada solução imunizante continha 1-50 pg dos MWCNTs oxidados, devidamente caracterizados, para a avaliação da atividade destes como adjuvantes imunológicos, acoplados a 5-100 pg da proteína ovalbumina (OVA) livre de endotoxina, contendo ou não 1-100 pg de oligonucleotídos CpG derivado de Trypanosoma cruzi. O acoplamento foi feito por meio de sonificação durante 30 minutos. Como controle positivo, um dos grupos foi imunizado com 30% (v/v) de alúmem, 5-100 pg de OVA livre de endotoxina e na presença de oligonucleotídeos CpG (1-100 pg).

Os soros dos animais submetidos às imunizações foram coletados nove dias após a última imunização e foram utilizados para avaliação da produção de anticorpos anti-OVA específicos por meio de ELISA. A resposta celular induzida pelo protocolo de imunização foi medida 21 dias após a última imunização.

Os resultados demonstram que as formulações contendo os nanotubos de carbono foram mais eficazes, tanto na indução da resposta imune humoral (Figura 8A), quanto da resposta imune celular (Figura 8B).

Exemplo 4: Avaliação da resposta imune antitumoral induzida por imunização com formulações contendo MWCNTs

Após a comprovação da atividade imunoadjuvante dos MWCNTs, os mesmos foram testados em outro sistema visando a utilização em protocolo vacinai antitumoral. Camundongos C57BL/6 foram imunizados com nova formulação, contendo 5-100 pg do antígeno tumoral NY-ESO-1 adsorvido não- covalentemente, por meio de sonificação, durante 30 minutos, às paredes dos nanotubos de carbono oxidados (1-50 pg), com a adição ou não de 1-100 pg do oligonucleotídos CpG derivado de Trypanosoma cruzi. As imunizações foram feitas de uma a três doses equivalentes, por via subcutânea, com intervalos de 21 dias.

O soro dos animais imunizados foi utilizado para verificar a produção de anticorpos específicos anti-NY-ESO-1 (Figura 9A). A resposta celular induzida pelo protocolo de imunização foi medida 21 dias após a última imunização (Figuras 9B e 9C). Os resultados mostram que os grupos de animais imunizados com formulações contendo os antígenos acoplados aos MWCNTs apresentaram melhor resposta imune específica para o antígeno NY-ESO-1 em comparação aos demais grupos.

Exemplo 5: Desafio com melanoma B16 e carcinoma de cólon CT26

Camundongos imunizados foram desafiados com a linhagem celular de melanoma B16 ou de carcinoma de cólon CT26 expressando o antígeno tumoral NY-ESO-1. Cada animal recebeu 5x10 ⁴ (B16) ou 1x10 ⁶ (CT26) células, pela via subcutânea na região dorso posterior. O crescimento tumoral foi acompanhado duas vezes por semana, por um período de 90 dias. A medida dos tumores foi dada como a área em mm ² . Este dado mostra que a imunização com as formulações contendo os nanotubos de carbono foram capazes de retardar o crescimento do tumor específico para o antígeno NY- ESO-1 (Figuras 10A e 12B), além de aumentar a expectativa de vida dos animais (Figuras 10B e 12C).

Exemplo 6: Protocolo terapêutico para tratamento tumoral

As mesmas formulações contendo os nanotubos de carbono testadas no protocolo vacinai antitumoral foram também avaliadas visando a utilização como tratamento antitumoral para ambas as linhagens tumorais avaliadas, melanoma B16 (animais C57BL/6) e carcinoma de cólon CT26 (animais Balb/c). Os camundongos foram desafiados e, em seguida, foram tratados com as formulações, contendo 5-100 pg do antígeno tumoral NY-ESO-1 adsorvido não-covalentemente, por meio de sonificação, durante 30 minutos, às paredes dos nanotubos de carbono oxidados (1-50 g), com a adição ou não de 1-100 g do oligonucleotídos CpG derivado de Trypanosoma cruzi. As imunizações foram feitas de uma a três doses equivalentes, por via subcutânea, com intervalos de 7 dias, começando pelo terceiro dia após o desafio. O crescimento tumoral foi acompanhado duas vezes por semana, por um período de 90 dias. A medida dos tumores foi dada como a área em mm ² . Este dado mostra que o tratamento com as formulações contendo os nanotubos de carbono foram capazes de retardar o crescimento do tumor específico para o antígeno NY-ESO-1 (Figuras 11 B e 12C), além de aumentar a expectativa de vida dos animais (Figuras 11C e 12D).