Antibakterielle Amid-Makrozyklen VI

Die Erfindung betrifft antibakterielle Amid-Makrozyklen und Verfahren zu ihrer Herstellung, ihre Verwendung zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Krankheiten sowie ihre Verwendung zur Herstellung von Arzneimitteln zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Krankheiten, insbeson- dere von bakteriellen Infektionen.

In WO 03/106480, WO 04/012816, WO 05/033129, WO 05/058943, WO 05/100380 und WO 05/118613 werden antibakteriell wirkende Makrozyklen vom Biphenomycin B Typ mit Amid- bzw. Estersubstituenten beschrieben.

In US 3,452,136, Dissertation R. U. Meyer, Universität Stuttgart, Deutschland 1991, Dissertation V. Leitenberger, Universität Stuttgart, Deutschland 1991, Synthesis (1992), (10), 1025-30, J.

Chem. Soc, Perkin Trans. 1 (1992), (1), 123-30, J. Chem. Soc, Chem. Commun. (1991), (10),

744, Synthesis (1991), (5), 409-13, J. Chem. Soc, Chem. Commun. (1991), (5), 275-7, J. Antibiot.

(1985), 38(11), 1462-8, J. Antibiot (1985), 38(11), 1453-61, wird der Naturstoff Biphenomycin B als antibakteriell wirksam beschrieben. Teilschritte der Synthese von Biphenomycin B werden in Synlett (2003), 4, 522-526 beschrieben.

Chirality (1995), 7(4), 181-92, J. Antibiot. (1991), 44(6), 674-7, J. Am. Chem. Soc. (1989), 111(19), 7323-7, J. Am. Chem. Soc. (1989), 111(19), 7328-33, J. Org. Chem. (1987), 52(24), 5435-7, Anal. Biochem. (1987), 165(1), 108-13, J. Org. Chem. (1985), 50(8), 1341-2, J. Antibiot. (1993), 46(3), C-2, J. Antibiot. (1993), 46(1), 135-40, Synthesis (1992), (12), 1248-54, Appl. Environ. Microbiol. (1992), 58(12), 3879-8, J. Chem. Soc, Chem. Commun. (1992), (13), 951-3 beschreiben einen strukturell verwandten Naturstoff, Biphenomycin A, der am Makrozyklus eine weitere Substitution mit einer Hydroxygruppe aufweist.

Die Naturstoffe entsprechen hinsichtlich ihrer Eigenschaften nicht den Anforderungen, die an antibakterielle Arzneimittel gestellt werden. Auf dem Markt sind zwar strukturell andersartige antibakteriell wirkende Mittel vorhanden, es kann aber regelmäßig zu einer Resistenzentwicklung kommen. Neue Mittel für eine gute und wirksamere Therapie sind daher wünschenswert.

Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, neue und alternative Verbindungen mit gleicher oder verbesserter antibakterieller Wirkung zur Behandlung von bakteriellen Erkrankungen bei Menschen und Tieren zur Verfügung zu stellen.

Überraschenderweise wurde gefunden, dass bestimmte Derivate dieser Naturstoffe, worin die Carboxylgruppe des Naturstoffs gegen eine tertiäre Amidgruppe ausgetauscht wird, die eine

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basische Gruppe enthält, gegen Biphenomycin resistente S. aureus Stämme (RN4220Bi ^R und T17) antibakteriell wirksam sind.

Weiterhin zeigen die Derivate gegen S. aureus Wildtyp-Stämme und Biphenomycin resistente S. aureus Stämme eine verbesserte Spontanresistenz-Frequenz.

Gegenstand der Erfindung sind Verbindungen der Formel

bei denen

gleich eine Gruppe der Formel

ist,

wobei

* die Anknüpfstelle an das Kohlenstoffatom ist,

R ¹ gleich Wasserstoff oder Hydroxy ist,

gleich Wasserstoff, Methyl oder Ethyl ist,

gleich eine Gruppe der Formel

ist,

wobei

* die Anknüpfstelle an das Stickstoffatom ist,

R ⁶ gleich eine Gruppe der Formel

ist,

worin

die Anknüpfstelle an das Stickstoffatom ist,

R ¹¹ gleich Wasserstoff, Amino oder Hydroxy ist,

R ¹² gleich Wasserstoff oder Methyl ist,

k eine Zahl 0 oder 1 ist,

1 eine Zahl 1 , 2, 3 oder 4 ist,

und

m und n unabhängig voneinander eine Zahl 1, 2 oder 3 sind,

R ⁷ gleich Wasserstoff, Amino oder Hydroxy ist,

R ⁸ , R ⁹ und R ¹⁰ unabhängig voneinander eine Gruppe der Formel

sind,

woπn

* die Anknüpfstelle an das Stickstoffatom ist,

R ¹³ gleich Wasserstoff, Amino oder Hydroxy ist,

R ¹⁴ gleich Wasserstoff oder Methyl ist,

R ^ls und R ¹⁶ unabhängig voneinander Wasserstoff, Aminoethyl oder Hydroxyethyl sind,

o eine Zahl 0 oder 1 ist,

p, q und w unabhängig voneinander eine Zahl 1, 2, 3 oder 4 sind,

R ⁴ gleich Wasserstoff, Hydroxy, Halogen, Amino oder Methyl ist,

und ihre Salze, ihre Solvate und die Solvate ihrer Salze.

Erfindungsgemäße Verbindungen sind die Verbindungen der Formel (I) und deren Salze, Solvate und Solvate der Salze, sowie die von Formel (T) umfassten, nachfolgend als Ausführungs- beispiel(e) genannten Verbindungen und deren Salze, Solvate und Solvate der Salze, soweit es sich bei den von Formel (T) umfassten, nachfolgend genannten Verbindungen nicht bereits um Salze, Solvate und Solvate der Salze handelt.

Die erfmdungsgemäßen Verbindungen können in Abhängigkeit von ihrer Struktur in stereoisomeren Formen (Enantiomere, Diastereomere) existieren. Die Erfindung betrifft deshalb die Enantiomeren oder Diastereomeren und ihre jeweiligen Mischungen. Aus solchen Mischungen von Enantiomeren und/oder Diastereomeren lassen sich durch bekannte Verfahren wie Chromato- graphie an chiraler Phase oder Kristallisation mit chiralen Aminen oder chiralen Säuren die stereoisomer einheitlichen Bestandteile in bekannter Weise isolieren.

Die Erfindung betrifft in Abhängigkeit von der Struktur der Verbindungen auch Tautomere der Verbindungen.

Als Salze sind im Rahmen der Erfindung physiologisch unbedenkliche Salze der erfindungsgemäßen Verbindungen bevorzugt.

Physiologisch unbedenkliche Salze der Verbindungen (I) umfassen Säureadditionssalze von Mineralsäuren, Carbonsäuren und Sulfonsäuren, z.B. Salze der Chlorwasserstoffsäure, Bromwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure, Methansulfonsäure, Ethansulfonsäure, Toluolsulfonsäure, Benzolsulfonsäure, Naphthalindisulfonsäure, Essigsäure, Propionsäure, Milch- säure, Weinsäure, Äpfelsäure, Zitronensäure, Fumarsäure, Maleinsäure, Trifluoressigsäure und Benzoesäure.

Physiologisch unbedenkliche Salze der Verbindungen (T) umfassen auch Salze üblicher Basen, wie beispielhaft und vorzugsweise Alkalimetallsalze (z.B. Natrium- und Kaliumsalze), Erdalkalisalze (z.B. Calcium- und Magnesiumsalze) und Ammoniumsalze, abgeleitet von Ammoniak oder organischen Aminen mit 1 bis 16 C-Atomen, wie beispielhaft und vorzugsweise Ethylamin, Di- ethylamin, Triethylamin, Ethyldiisopropylamin, Monoethanolamin, Diethanolamin, Triethanolamin, Dicyclohexylamin, Dimethylaminoethanol, Prokain, Dibenzylamin, N-Methylmorpholin, Dihydro- abietylamin, Arginin, Lysin, Ethylendiamin und Methylpiperidin.

Als Solvate werden im Rahmen der Erfindung solche Formen der Verbindungen bezeichnet, welche in festem oder flüssigem Zustand durch Koordination mit Lösungsmittelmolekülen einen Komplex bilden. Hydrate sind eine spezielle Form der Solvate, bei denen die Koordination mit Wasser erfolgt.

Halogen steht für Fluor, Chlor, Brom und Jod.

Ein Symbol # an einem Kohlenstoffatom bedeutet, dass die Verbindung hinsichtlich der Konfiguration an diesem Kohlenstoffatom in enantiomerenreiner Form vorliegt, worunter im Rahmen der vorliegenden Erfindung ein Enantiomerenüberschuss (enantiomeric excess) von mehr als 90 % verstanden wird (> 90% ee).

Ki den Formeln der Gruppen, die für R ³ stehen, steht der Endpunkt der Linie, neben der jeweils ein * steht, nicht für ein Kohlenstoffatom beziehungsweise eine CH ₂ -Gruppe sondern ist Bestandteil der Bindung zu der Carbonyl-Gruppe, an das R ³ gebunden ist.

In den Formeln der Gruppen, für die R ⁵ stehen kann, steht der Endpunkt der Linie, neben der jeweils ein * steht, nicht für ein Kohlenstoffatom beziehungsweise eine CH ₂ -Gruppe sondern ist Be- standteil der Bindung zu dem Kohlenstoffatom, an das R ⁷ gebunden ist.

In den Formeln der Gruppen, die für R ⁶ , R ⁸ , R ⁹ und R ¹⁰ stehen, steht der Endpunkt der Linie, neben der jeweils ein * steht, nicht für ein Kohlenstoffatom beziehungsweise eine CH ₂ -Gruppe sondern ist Bestandteil der Bindung zu dem Stickstoffatom, an das R ⁶ , R ⁸ , R ⁹ und R ¹⁰ gebunden sind.

Bevorzugt im Rahmen der vorliegenden Erfindung sind auch Verbindungen der Formel

bei denen

R ¹ gleich Wasserstoff oder Hydroxy ist,

R ² gleich Wasserstoff, Methyl oder Ethyl ist,

R ³ wie oben definiert ist,

R ⁴ gleich Wasserstoff, Hydroxy, Halogen, Amino oder Methyl ist,

und ihre Salze, ihre Solvate und die Solvate ihrer Salze.

Bevorzugt im Rahmen der vorliegenden Erfindung sind auch Verbindungen der Formel (I) oder (Ia), bei denen

R ² gleich Wasserstoff ist.

Bevorzugt im Rahmen der vorliegenden Erfindung sind auch Verbindungen der Formel (T) oder (Ia), bei denen

R ⁴ gleich Wasserstoff, Hydroxy, Chlor oder Methyl ist.

Bevorzugt im Rahmen der vorliegenden Erfindung sind auch Verbindungen der Formel (T) oder (Ia), bei denen

R ⁴ gleich Hydroxy ist.

Bevorzugt im Rahmen der vorliegenden Erfindung sind auch Verbindungen der Formel (T) oder (Ia), bei denen

R ⁵ gleich eine Gruppe der Formel

ist,

wobei

* die Anknüpfstelle an das Kohlenstoffatom ist,

R ¹ gleich Wasserstoff oder Hydroxy ist.

Bevorzugt im Rahmen der vorliegenden Erfindung sind auch Verbindungen der Formel (I) oder (Ia), bei denen

R ⁵ gleich eine Gruppe der Formel

ist,

wobei

* die Anknüpfstelle an das Kohlenstoffatom ist,

R ¹ gleich Wasserstoff oder Hydroxy ist,

R ² gleich Wasserstoff ist,

R ³ gleich eine Gruppe der Formel

ist,

wobei

* die Anknüpfstelle an das Stickstoffatom ist,

R ⁶ gleich eine Gruppe der Formel

ist,

worm

* die Anknüpfstelle an das Stickstoffatom ist,

R ¹¹ gleich Wasserstoff, Amino oder Hydroxy ist,

R ¹² gleich Wasserstoff oder Methyl ist,

k eine Zahl 0 oder 1 ist,

1 eine Zahl 1 , 2, 3 oder 4 ist,

und

m und n unabhängig voneinander eine Zahl 1, 2 oder 3 sind,

R ⁴ gleich Hydroxy ist,

und ihre Salze, ihre Solvate und die Solvate ihrer Salze.

Bevorzugt im Rahmen der vorliegenden Erfindung sind auch Verbindungen der Formel (I) oder (Ia), bei denen

R ⁵ gleich eine Gruppe der Formel

ist,

wobei

* die Anknüpfstelle an das Kohlenstoffatom ist,

R ¹ gleich Wasserstoff oder Hydroxy ist,

R ² gleich Wasserstoff ist,

R ³ gleich eine Gruppe der Formel

ist,

wobei

* die Anknüpfstelle an das Stickstoffatom ist,

R ⁷ gleich Wasserstoff, Amino oder Hydroxy ist,

R ⁸ und R ¹⁰ unabhängig voneinander eine Gruppe der Formel

sind,

woπn

* die Anknüpfstelle an das Stickstoffatom ist,

R ¹³ gleich Wasserstoff, Amino oder Hydroxy ist,

R ¹⁴ gleich Wasserstoff oder Methyl ist,

R ¹⁵ und R ¹⁶ unabhängig voneinander Wasserstoff, Aminoethyl oder

Hydroxyethyl sind,

o eine Zahl 0 oder 1 ist,

p, q und w unabhängig voneinander eine Zahl 1, 2, 3 oder 4 sind,

R ⁴ gleich Hydroxy ist,

und ihre Salze, ihre Solvate und die Solvate ihrer Salze.

Bevorzugt im Rahmen der vorliegenden Erfindung sind auch Verbindungen der Formel (I) oder (Ia), bei denen

R ⁵ gleich eine Gruppe der Formel

ist,

wobei

* die Anknüpfstelle an das Kohlenstoffatom ist,

R ¹ gleich Wasserstoff oder Hydroxy ist,

R ² gleich Wasserstoff ist,

R ³ gleich eine Gruppe der Formel

ist,

wobei

* die Anknüpfstelle an das Stickstoffatom ist,

R ⁹ eine Gruppe der Formel

ist,

worin

* die Anknüpfstelle an das Stickstoffatom ist,

R ¹³ gleich Wasserstoff, Amino oder Hydroxy ist,

R ¹⁴ gleich Wasserstoff oder Methyl ist,

R ¹⁵ und R ¹⁶ unabhängig voneinander Wasserstoff, Aminoethyl oder Hydroxyethyl sind,

o eine Zahl 0 oder 1 ist,

p, q und w unabhängig voneinander eine Zahl 1, 2, 3 oder 4 sind,

R ⁴ gleich Hydroxy ist,

und ihre Salze, ihre Solvate und die Solvate ihrer Salze.

Gegenstand der Erfindung ist weiterhin ein Verfahren zur Herstellung der Verbindungen der Formel (I) oder ihrer Salze, ihrer Solvate oder der Solvate ihrer Salze, wobei nach Verfahren

[A] Verbindungen der Formel

worin R ² , R ⁴ und R ⁵ die oben angegebene Bedeutung haben und boc gleich ferf-Butoxycarbonyl ist,

in einem zweistufigen Verfahren zunächst in Gegenwart von einem oder mehreren De- hydratisierungsreagenzien mit Verbindungen der Formel

worin R ³ die oben angegebene Bedeutung hat,

und anschließend mit einer Säure und/oder durch Hydrogenolyse umgesetzt werden,

oder

[B] Verbindungen der Formel

worin R , R und R die oben angegebene Bedeutung haben und Z gleich Benzyloxycarbonyl ist,

in einem zweistufigen Verfahren zunächst in Gegenwart von einem oder mehreren De- hydratisierungsreagenzien mit Verbindungen der Formel

worin R ³ die oben angegebene Bedeutung hat,

und anschließend mit einer Säure oder durch Hydrogenolyse umgesetzt werden.

Die freie Base der Salze kann zum Beispiel durch Chromatographie an einer Reversed Phase Säule mit einem Acetonitril-Wasser-Gradienten unter Zusatz einer Base erhalten werden, insbesondere durch Verwendung einer RPl 8 Phenomenex Luna Cl 8(2) Säule und Diethylamin als Base.

Weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung der Verbindungen der Formel (I) oder ihrer Solvate nach Anspruch 1, bei dem Salze der Verbindungen oder Solvate der Salze der Verbindungen durch Chromatographie unter Zusatz einer Base in die Verbindungen überführt werden.

Die Hydroxygruppe an R ¹ ist gegebenenfalls während der Umsetzung mit Verbindungen der Formel (DI) mit einer ϊert-Butyldimethylsilyl-Gruppe geschützt, die im zweiten Reaktionsschritt abgespalten wird.

Reaktive Funktionalitäten in dem Rest R ³ von Verbindungen der Formel (IE) werden bereits geschützt mit in die Synthese eingebracht, bevorzugt sind säurelabile Schutzgruppen (z.B. boc). Nach erfolgter Umsetzung zu Verbindungen der Formel (I) können die Schutzgruppen durch Entschützungsreaktion abgespalten werden. Dies geschieht nach Standardverfahren der

Schutzgruppenchemie. Bevorzugt sind Entschützungsreaktionen unter sauren Bedingungen oder durch Hydrogenolyse.

Die Umsetzung der ersten Stufe der Verfahren [A] und [B] erfolgt im Allgemeinen in inerten Lösungsmitteln, gegebenenfalls in Gegenwart einer Base, bevorzugt in einem Temperaturbereich von 0 ⁰ C bis 40 ⁰ C bei Normaldruck.

Als Dehydratisierungsreagenzien eignen sich hierbei beispielsweise Carbodiimide wie z.B. N ₁ N'- Diethyl-, N,N'-Dipropyl-, N.N'-Diisopropyl-, N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid, N-(3-Dimethylamino- isopropyl)-N'-ethylcarbodiimid-Hydrochlorid (EDC), N-Cyclohexylcarbodiimid-N'-propyloxy- methyl-Polystyrol (PS-Carbodiimid) oder Carbonylverbindungen wie Carbonyldiimidazol, oder 1,2-Oxazoliumverbindungen wie 2-Ethyl-5-phenyl-l,2-oxazolium-3-sulfat oder 2-tert.-Butyl-5- methyl-isoxazolium-perchlorat, oder Acylaminoverbindungen wie 2-Ethoxy-l-ethoxycarbonyl-l,2- dihydrochinolin, oder Propanphosphonsäureanhydrid, oder Isobutylchloroformat, oder Bis-(2-oxo- 3-oxazolidinyl)-phosphorylchlorid oder Benzotriazolyloxy-tri(dimethylamino)phosphoniumhexa- fluorophosphat, oder O-(Benzotriazol-l -yl)-N,N,N',N'-tetra-methyluroniumhexafluorophosphat (HBTU), 2-(2-Oxo-l-(2H)-pyridyl)-l,l,3,3-tetramethyluroniumtetrafluo roborat (TPTU) oder O-(7-Azabenzotriazol-l -yl)-N,NN' N -tetramethyluroniumhexafluorophosphat (HATU), oder 1-Hydroxybenztriazol (HOBt), oder Benzotriazol-l-yloxytris(dimethylamino)-phosphonium- hexafluoro-phosphat (BOP), oder Benzotriazol-l-yloxytris(pyrrolidino)-phosphoniumhexafluoro- phosphat (PyBOP), oder Mischungen aus diesen, oder Mischung aus diesen zusammen mit Basen.

Basen sind beispielsweise Alkalicarbonate, wie z.B. Natrium- oder Kaliumcarbonat, oder -hydrogencarbonat, oder organische Basen wie Trialkylamine z.B. Triethylamin, N-Methyl- morpholin, N-Methylpiperidin, 4-Dimethylaminopyridin oder Diisopropylethylamin.

Vorzugsweise wird die Kondensation mit HATU in Gegenwart einer Base, insbesondere Diisopropylethylamin, oder mit PyBOP in Gegenwart einer Base, insbesondere Diisopropylethyl- amin, durchgeführt.

Inerte Lösungsmittel sind beispielsweise Halogenkohlenwasserstoffe wie Dichlormethan oder Trichlormethan, Kohlenwasserstoff wie Benzol, oder Νitromethan, Dioxan, Dimethylformamid oder Acetonitril. Ebenso ist es möglich, Gemische der Lösemittel einzusetzen. Besonders bevorzugt ist Dimethylformamid.

Die Umsetzung mit einer Säure in der zweiten Stufe der Verfahren [A] und [B] erfolgt bevorzugt in einem Temperaturbereich von 0 ⁰ C bis 40 ⁰ C bei Normaldruck.

AIs Säuren eignen sich hierbei Chlorwasserstoff in Dioxan, Bromwasserstoff in Essigsäure oder Trifluoressigsäure in Methylenchlorid.

Die Hydrogenolyse in der zweiten Stufe des Verfahrens [B] erfolgt im Allgemeinen in einem Lösungsmittel in Gegenwart von Wasserstoff und Palladium auf Aktivkohle, bevorzugt in einem Temperaturbereich von 0°C bis 40°C bei Normaldruck.

Lösungsmittel sind beispielsweise Alkohole wie Methanol, Ethanol, n-Propanol oder iso-Propanol, in einem Gemisch mit Wasser und Eisessig, bevorzugt ist ein Gemisch aus Ethanol, Wasser und Eisessig.

Die Verbindungen der Formel (Hl) sind bekannt oder können analog bekannten Verfahren hergestellt werden.

Die Verbindungen der Formel (Η) sind bekannt oder können hergestellt werden, indem Verbindungen der Formel

worin R ² , R ⁴ und R ⁵ die oben angegebene Bedeutung haben,

mi utyl)-dicarbonat in Gegenwart einer Base umgesetzt werden.

Die Umsetzung erfolgt im Allgemeinen in einem Lösungsmitteln, bevorzugt in einem Temperaturbereich von 0°C bis 40°C bei Normaldruck.

Basen sind beispielsweise Alkalihydroxide wie Natrium- oder Kaliumhydroxid, oder Alkali- carbonate wie Cäsiumcarboηat, Natrium- oder Kaliumcarbonat, oder andere Basen wie DBU, Triethylamin oder Diisopropylethylamin, bevorzugt ist Natriumhydroxid oder Natriumcarbonat.

Lösungsmittel sind beispielsweise Halogenkohlenwasserstoffe wie Methylenchlorid oder 1,2-Di- chlorethan, Alkohole wie Methanol, Ethanol oder iso-Propanol, oder Wasser.

Vorzugsweise wird die Umsetzung mit Natriumhydroxid in Wasser oder Natriumcarbonat in Methanol durchgeführt.

Die Verbindungen der Formel (V) sind bekannt oder können hergestellt werden, indem Verbindungen der Formel

worin R ² , R ⁴ und R ⁵ die oben angegebene Bedeutung haben, und

R ¹⁷ gleich Benzyl, Methyl oder Ethyl ist,

mit einer Säure oder durch Hydrogenolyse, wie für die zweite Stufe des Verfahrens [B] beschrieben, gegebenenfalls durch anschließende Umsetzung mit einer Base zur Verseifung des Methyl- oder Ethylesters, umgesetzt werden.

Die Verseifung kann zum Beispiel erfolgen, wie bei der Umsetzung von Verbindungen der Formel (VI) zu Verbindungen der Formel (IV) beschrieben.

Die Verbindungen der Formel (IV) sind bekannt oder können hergestellt werden, indem in Verbindungen der Formel (VI) der Benzyl-, Methyl- oder Ethylester verseift wird.

Die Umsetzung erfolgt im Allgemeinen in einem Lösungsmitteln, in Gegenwart einer Base, bevorzugt in einem Temperaturbereich von 0°C bis 40°C bei Normaldruck.

Basen sind beispielsweise Alkalihydroxide wie Lithium-, Natrium- oder Kaliumhydroxid, bevorzugt ist Lithiumhydroxid.

Lösungsmittel sind beispielsweise Halogenkohlenwasserstoffe wie Dichlormethan oder Trichlor- methan, Ether wie Tetrahydrofuran oder Dioxan, oder Alkohole wie Methanol, Ethanol oder Iso- propanol, oder Dimethylformamid. Ebenso ist es möglich, Gemische der Lösungsmittel oder Gemische der Lösungsmittel mit Wasser einzusetzen. Besonders bevorzugt sind Tetrahydrofuran oder ein Gemisch aus Methanol und Wasser.

Die Verbindungen der Formel (VI) sind bekannt oder können hergestellt werden, indem Verbindungen der Formel

worin R ² , R ⁴ , R ⁵ und R ¹⁷ die oben angegebene Bedeutung haben,

in der ersten Stufe mit Säuren, wie für die zweite Stufe der Verfahren [A] und [B] beschrieben, und in der zweiten Stufe mit Basen umgesetzt werden.

In der zweiten Stufe erfolgt die Umsetzung mit Basen im Allgemeinen in einem Lösimgsrnitteln, bevorzugt in einem Temperaturbereich von 0°C bis 40°C bei Normaldruck.

Basen sind beispielsweise Alkalihydroxide wie Natrium- oder Kaliumhydroxid, oder Alkalicarbo- nate wie Cäsiumcarbonat, Natrium- oder Kaliumcarbonat, oder andere Basen wie DBU, Triethyl- amin oder Diisopropylethylamin, bevorzugt ist Triethylamin.

Lösungsmittel sind beispielsweise Halogenkohlenwasserstoffe wie Chloroform, Methylenchlorid oder 1,2-Dichlorethan, oder Tetrahydrofuran, oder Gemische der Lösungsmittel, bevorzugt ist Methylenchlorid oder Tetrahydrofuran.

Die Verbindungen der Formel (VII) sind bekannt oder können hergestellt werden, indem Verbindungen der Formel

worin R , R , R und R die oben angegebene Bedeutung haben,

mit Pentafluorphenol in Gegenwart von Dehydratisierungsreagenzien, wie für die erste Stufe der Verfahren [A] und [B] beschrieben, umgesetzt werden.

Die Umsetzung erfolgt bevorzugt mit DMAP und EDC in Dichlormethan in einem Temperaturbereich von -40 ⁰ C bis 40 ⁰ C bei Normaldruck.

Die Verbindungen der Formel (VIH) sind bekannt oder können hergestellt werden, indem Verbindungen der Formel

worin R ² , R ⁴ , R ⁵ und R ¹⁷ die oben angegebene Bedeutung haben,

mit Fluorid, insbesondere mit Tetrabutylammoniumfluorid, umgesetzt werden.

Die Umsetzung erfolgt im Allgemeinen in einem Lösungsmitteln, bevorzugt in einem Temperaturbereich von -10 ⁰ C bis 30 ⁰ C bei Normaldruck.

Inerte Lösungsmittel sind beispielsweise Halogenkohlenwasserstoffe wie Dichlormethan, oder Kohlenwasserstoffe wie Benzol oder Toluol, oder Ether wie Tetrahydrofuran oder Dioxan, oder Dimethylformamid. Ebenso ist es möglich, Gemische der Lösemittel einzusetzen. Bevorzugte Lösungsmittel sind Tetrahydrofuran und Dimethylformamid.

Die Verbindungen der Formel (IX) sind bekannt oder können hergestellt werden, indem Verbindungen der Formel

worin R ² , R ⁴ und R ¹⁷ die oben angegebene Bedeutung haben,

mit Verbindungen der Formel

worin R ⁵ die oben angegebene Bedeutung hat,

in Gegenwart von Dehydratisierungsreagenzien, wie für die erste Stufe der Verfahren [A] und [B] beschrieben, umgesetzt werden.

Die Verbindungen der Formel (X) sind bekannt oder können analog den im Beispielteil beschriebenen Verfahren hergestellt werden.

Die Verbindungen der Formel (XI) sind bekannt oder können analog bekannten Verfahren herge- stellt werden.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen zeigen ein nicht vorhersehbares, wertvolles pharmakologisches und pharmakokinetisches Wirkspektrum.

Sie eignen sich daher zur Verwendung als Arzneimittel zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Krankheiten bei Menschen und Tieren.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen können aufgrund ihrer pharmakologischen Eigenschaften allein oder in Kombination mit anderen Wirkstoffen zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Infektionskrankheiten, insbesondere von bakteriellen Infektionen, eingesetzt werden.

Beispielsweise können lokale und/oder systemische Erkrankungen behandelt und/oder verhindert werden, die durch die folgenden Erreger oder durch Mischungen der folgenden Erreger verursacht werden:

Gram-positive Kokken, z.B. Staphylokokken (Staph. aureus, Staph. epidermidis) und Streptokokken (Strept. agalactiae, Strept. faecalis, Strept. pneumoniae, Strept. pyogenes); gram-negative Kokken (neisseria gonorrhoeae) sowie gram-negative Stäbchen wie Enterobakteriaceen, z.B. Escherichia coli, Hämophilus influenzae, Citrobacter (Citrob. freundii, Citrob. divernis), Salmonella und Shigella; ferner Klebsiellen (Klebs. pneumoniae, Klebs. oxytocy), Enterobacter (Ent. aerogenes, Ent. agglomerans), Hafnia, Serratia (Serr. marcescens),

Proteus (Pr. mirabilis, Pr. rettgeri, Pr. vulgaris), Providentia, Yersinia, sowie die Gattung Acinetobacter. Darüber hinaus umfaßt das antibakterielle Spektrum die Gattung Pseudomonas (Ps. aeruginosa, Ps. maltophilia) sowie strikt anaerobe Bakterien wie z.B. Bacteroides fragilis, Vertreter der Gattung Peptococcus, Peptostreptococcus sowie die Gattung Clostridium; ferner My- koplasmen (M. pneumoniae, M. hominis, M. urealyticum) sowie Mykobakterien, z.B. Mycobacterium tuberculosis.

Die obige Aufzählung von Erregern ist lediglich beispielhaft und keineswegs beschränkend aufzufassen. Als Krankheiten, die durch die genannten Erreger oder Mischinfektionen verursacht und durch die erfmdungsgemäßen topisch anwendbaren Zubereitungen verhindert, gebessert oder geheilt werden können, seien beispielsweise genannt:

Infektionskrankheiten beim Menschen wie z. B. septische Infektionen, Knochen- und Gelenk- infektionen, Hautinfektionen, postoperative Wundinfektionen, Abszesse, Phlegmone, Wundinfektionen, infizierte Verbrennungen, Brandwunden, Infektionen im Mundbereich, Infektionen nach Zahnoperationen, septische Arthritis, Mastitis, Tonsillitis, Genital-Infektionen und Augeninfektio- nen.

Außer beim Menschen können bakterielle Infektionen auch bei anderen Spezies behandelt werden. Beispielhaft seien genannt:

Schwein: Coli-diarrhoe, Enterotoxamie, Sepsis, Dysenterie, Salmonellose, Metritis-Mastitis-Aga- laktiae-Syndrom, Mastitis;

Wiederkäuer (Rind, Schaf, Ziege): Diarrhoe, Sepsis, Bronchopneumonie, Salmonellose, Pasteurellose, Mykoplasmose, Genitalinfektionen;

Pferd: Bronchopneumonien, Fohlenlähme, puerperale und postpuerperale Infektionen, Salmonellose;

Hund und Katze: Bronchopneumonie, Diarrhoe, Dermatitis, Otitis, Harnwegsinfekte, Prostatitis;

Geflügel (Huhn, Pute, Wachtel, Taube, Ziervögel und andere): Mycoplasmose, E. coli-Infektionen, chronische Luftwegserkrankungen, Salmonellose, Pasteurellose, Psittakose.

Ebenso können bakterielle Erkrankungen bei der Aufzucht und Haltung von Nutz- und Zierfischen behandelt werden, wobei sich das antibakterielle Spektrum über die vorher genannten Erreger hinaus auf weitere Erreger wie z.B. Pasteurella, Brucella, Campylobacter, Listeria, Erysipelothris, Corynebakterien, Borellia, Treponema, Nocardia, Rikettsie, Yersinia, erweitert.

Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist der Einsatz der erfindungsgemäßen Verbindungen zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Erkrankungen, vorzugsweise von bakteriellen Krankheiten, insbesondere von bakteriellen Infektionen.

Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindungen zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Erkrankungen, insbesondere der zuvor genannten Erkrankungen.

Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindungen zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Erkrankungen, insbesondere der zuvor genannten Erkrankungen.

Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Erkrankungen, insbesondere der zuvor genannten Erkrankungen, unter Verwendung einer antibakteriell wirksamen Menge der erfindungsgemäßen Verbindungen.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen können systemisch und/oder lokal wirken. Zu diesem Zweck können sie auf geeignete Weise appliziert werden, wie z.B. oral, parenteral, pulmonal, nasal, sublingual, lingual, buccal, rectal, dermal, transdermal, conjunctival, otisch oder als Implantat bzw. Stent.

Für diese Applikationswege können die erfindungsgemäßen Verbindungen in geeigneten Applikationsformen verabreicht werden.

Für die orale Applikation eignen sich nach dem Stand der Technik funktionierende schnell und/oder modifiziert die erfindungsgemäßen Verbindungen abgebende Applikationsformen, die die erfindungsgemäßen Verbindungen in kristalliner und/ oder amorphisierter und/oder gelöster

Form enthalten, wie z.B. Tabletten (nichtüberzogene oder überzogene Tabletten, beispielsweise mit magensaftresistenten oder sich verzögert auflösenden oder unlöslichen Überzügen, die die

Freisetzung der erfindungsgemäßen Verbindung kontrollieren), in der Mundhöhle schnell zerfal- lende Tabletten oder Filme/Oblaten, Filme/Lyophylisate, Kapseln (beispielsweise Hart- oder

Weichgelatinekapseln), Dragees, Granulate, Pellets, Pulver, Emulsionen, Suspensionen, Aerosole oder Lösungen.

Die parenterale Applikation kann unter Umgehung eines Resorptionsschrittes geschehen (z.B. intravenös, intraarteriell, intrakardial, intraspinal oder intralumbal) oder unter Einschaltung einer Resorption (z.B. intramuskulär, subcutan, intracutan, percutan oder intraperitoneal). Für die parenterale Applikation eignen sich als Applikationsformen u.a. mjektions- und Infusionszubereitungen in Form von Lösungen, Suspensionen, Emulsionen, Lyophilisaten oder sterilen Pulvern.

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Für die sonstigen Applikationswege eignen sich z.B. Inhalationsarzneiformen (u.a. Pulverinhalatoren, Nebulizer), Nasentropfen, -lösungen, -sprays; lingual, sublingual oder buccal zu applizierende Tabletten, Filme/Oblaten oder Kapseln, Suppositorien, Ohren- oder Augenpräparationen, Vaginalkapseln, wässrige Suspensionen (Lotionen, Schüttelmixturen), lipophile Suspensionen, Salben, Cremes, transdermale therapeutische Systeme (wie beispielsweise Pflaster), Milch, Pasten, Schäume, Streupuder, Implantate oder Stents.

Die erfϊndungsgemäßen Verbindungen können in die angeführten Applikationsformen überführt werden. Dies kann in an sich bekannter Weise durch Mischen mit inerten, nichttoxischen, pharmazeutisch geeigneten Hilfsstoffen geschehen. Zu diesen Hilfsstoffen zählen u.a. Trägerstoffe (bei- spielsweise mikrokristalline Cellulose, Laktose, Mannitol), Lösungsmittel (z.B. flüssige PoIy- ethylenglycole), Emulgatoren und Dispergier- oder Netzmittel (beispielsweise Natriumdode- cylsulfat, Polyoxysorbitanoleat), Bindemittel (beispielsweise Polyvinylpyrrolidon), synthetische und natürliche Polymere (beispielsweise Albumin), Stabilisatoren (z.B. Antioxidantien wie beispielsweise Ascorbinsäure), Farbstoffe (z.B. anorganische Pigmente wie beispielsweise Eisen- oxide) und Geschmacks- und / oder Geruchskorrigentien.

Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind Arzneimittel, die mindestens eine erfindungsgemäße Verbindung, üblicherweise zusammen mit einem oder mehreren inerten, nichttoxischen, pharmazeutisch geeigneten Hilfsstoffen enthalten, sowie deren Verwendung zu den zuvor genannten Zwecken.

Im Allgemeinen hat es sich als vorteilhaft erwiesen, bei parenteraler Applikation Mengen von etwa 5 bis 250 mg/kg Körpergewicht je 24 h zur Erzielung wirksamer Ergebnisse zu verabreichen. Bei oraler Applikation beträgt die Menge etwa 5 bis 100 mg/kg Körpergewicht je 24 h.

Trotzdem kann es gegebenenfalls erforderlich sein, von den genannten Mengen abzuweichen, und zwar in Abhängigkeit von Körpergewicht, Applikationsweg, individuellem Verhalten gegenüber dem Wirkstoff, Art der Zubereitung und Zeitpunkt bzw. Intervall, zu welchem die Applikation erfolgt. So kann es in einigen Fällen ausreichend sein, mit weniger als der vorgenannten Mindestmenge auszukommen, während in anderen Fällen die genannte obere Grenze überschritten werden muss. Im Falle der Applikation größerer Mengen kann es empfehlenswert sein, diese in mehreren Einzelgaben über den Tag zu verteilen.

Die Prozentangaben in den folgenden Tests und Beispielen sind, sofern nicht anders angegeben, Gewichtsprozente; Teile sind Gewichtsteile. Lösungsmittelverhältnisse, Verdünnungsverhältnisse und Konzentrationsangaben von fiüssig/flüssig-Lösungen beziehen sich jeweils auf das Volumen.

A. Beispiele

Verwendete Abkürzungen:

abs. absolut aq. wässrig

Bn Benzyl boc tert-Butoxycarbonyl

Bsp. Beispiel

CDCl ₃ Chloroform

CH Cyclohexan d dublett (im ¹ H-NMR) dd dublett von dublett (im ¹ H-NMR)

DC Dünnschichtchromatographie

DCC Dicyclohexylcarbodiimid

DIC Diisopropylcarbodiimid

DDEA Diisopropylethylamin (Hünig-Base)

DMSO Dimethylsulfoxid

DMAP 4-N,N-Dimethylaminopyridin

DMF Dimethylformamid d. Th. der Theorie

EDC N'-(3-Dimethylaminopropyl)-N-ethylcarbodiimid x HCl

EE Ethylacetat (Essigsäureethylester)

ESI Elektrospray-Ionisation (bei MS)

Fmoc 9-Fluorenylmethoxycarbonyl ges. gesättigt

HATU O-(7-Azabenzotriazol-l-yl)-N,N,N',N-tetramethyluronium hexafluorophosphat

HBTU O-(Benzotriazol-l-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium- hexafluorophosphat

HOBt 1-Hydroxy-lH-benzotriazol x H ₂ O h Stunde(n)

HPLC Hochdruck-, Hochleistungsfiüssigchromatographie

LC-MS Flüssigchromatographie-gekoppelte Massenspektroskopie m multiplett (im ¹ H-NMR) min Minute

MS Massenspektroskopie

NMR Kernresonanzspektroskopie

MTBE Methyl-fer/-butylether

Pd/C Palladium/Kohle

PFP Pentafluorphenol proz. Prozent

PyBOP Benzotriazol-l-yloxytris(pyrrolidino)-phosphoniumhexafluoro- phosphat q quartett (im ¹ H-NMR)

Rf Retentionsindex (bei DC)

RP Reverse Phase (bei HPLC)

RT Raumtemperatur

Rt Retentionszeit (bei HPLC)

S singulett (im ¹ H-NMR) t triplett (im ¹ H-NMR)

TBS fer/^Butyldimethylsilyl

TFA Trifluoressigsäure

THF Tetrahydrofuran

TMSE 2-(Trimethylsilyl)-ethyl

TPTU 2-(2-Oxo-l (2H)-pyridyl)- 1,1,3,3 -tetramethyluroniumtetrafluoroborat

Z Benzyloxycarbonyl

LC-MS- und HPLC-Methoden;

Methode 1 (LC-MSl; Gerätetyp MS: Micromass ZQ; Gerätetyp HPLC: Waters Alliance 2795; Säule: Phenomenex Synergi 2μ Hydro-RP Mercury 20 mm x 4 mm; Eluent A: 1 1 Wasser + 0.5 ml 50%ige Ameisensäure, Eluent B: 1 1 Acetonitril + 0.5 ml 50%ige Ameisensäure; Gradient: 0.0 min 90%A -> 2.5 min 30%A -> 3.0 min 5%A -> 4.5 min 5%A; Fluss: 0.0 min 1 ml/min, 2.5 min/3.0 min/4.5 min 2 ml/min; Ofen: 5O ⁰ C; UV-Detektion: 210 nm.

Methode 2 (LC-MSl: Gerätetyp MS: Micromass ZQ; Gerätetyp HPLC: HP 1100 Series; UV DAD; Säule: Phenomenex Synergi 2μ Hydro-RP Mercury 20 mm x 4 mm; Eluent A: 1 1 Wasser + 0.5 ml 50%ige Ameisensäure, Eluent B: 1 1 Acetonitril + 0.5 ml 50%ige Ameisensäure; Gradient: 0.0 min 90%A -> 2.5 min 30%A -> 3.0 min 5%A -> 4.5 min 5%A; Fluss: 0.0 min 1 ml/min!, 2.5 min/3.0 min/4.5 min. 2 ml/min; Ofen: 5O ⁰ C; UV-Detektion: 210 nm.

Methode 3 OLC-MS): Instrument: Micromass Quattro LCZ mit HPLC Agilent Serie 1100; Säule: Phenomenex Synergi 2μ Hydro-RP Mercury 20 mm x 4 mm; Eluent A: 1 1 Wasser + 0.5 ml 50%ige Ameisensäure, Eluent B: 1 1 Acetonitril + 0.5 ml 50%ige Ameisensäure; Gradient: 0.0 min 90%A -> 2.5 min 30%A -> 3.0 min 5%A -» 4.5 min 5%A; Fluss: 0.0 min 1 ml/min, 2.5 min/3.0 min/4.5 min 2 ml/min; Ofen: 50 ⁰ C; UV-Detektion: 208- 400 nm.

Methode 4 (LC-MS); Gerätetyp MS: Micromass ZQ; Gerätetyp HPLC: Waters Alliance 2795; Säule: Merck Chromolith SpeedROD RP-18e 50 mm x 4.6 mm; Eluent A: Wasser + 500 μl 50%ige Ameisensäure / 1; Eluent B: Acetonitril + 500 μl 50%ige Ameisensäure / 1; Gradient: 0.0 min 10%B -> 3.0 min 95%B -> 4.0 min 95%B; Ofen: 35°C; Fluss: 0.0 min 1.0 ml/min -> 3.0 min 3.0 ml/min -> 4.0 min 3.0 ml/min; UV-Detektion: 210 nm.

Methode 5 (LC-MS): Instrument: Micromass Platform LCZ mit HPLC Agilent Serie 1100; Säule: Thermo HyPURITY Aquastar 3μ 50 mm x 2.1 mm; Eluent A: 1 1 Wasser + 0.5 ml 50%ige Ameisensäure, Eluent B: 1 1 Acetonitril + 0.5 ml 50%ige Ameisensäure; Gradient: 0.0 min 100%A -> 0.2 min 100%A -» 2.9 min 30%A -» 3.1 min 10%A -> 5.5 min 10%A; Ofen: 50 ⁰ C; Fluss: 0.8 ml/min; UV-Detektion: 210 nm.

Methode 6 (LC-MS): Instrument: Micromass Platform LCZ mit HPLC Agilent Serie 1100; Säule: Thermo Hypersil GOLD-3μ 20 x 4 mm; Eluent A: 1 1 Wasser + 0.5 ml 50%ige Ameisensäure, Eluent B: 1 1 Acetonitril + 0.5 ml 50%ige Ameisensäure; Gradient: 0.0 min 100%A ^■ » 0.2 min 100%A -> 2.9 min 30%A ^■ » 3.1 min 10%A -> 5.5 min 10%A; Ofen: 50 ⁰ C; Fluss: 0.8 ml/min; UV-Detektion: 210 nm.

Ausgangsverbindungen

Beispiel IA

Benzyl-{(15)-4-[(tert-butoxycarbonyl)amino]-l-[({2-[(tert -butoxycarbonyl)amino]ethyl}amino)- carbonyljbutyl} carbamat

Unter Argon werden 300 mg (0.82 mmol) N ² -[(Benzyloxy)carbonyl]-N ⁵ -(tert-butoxycarbonyl)-Z,- ornithin und 171 mg (1.06 mmol) fert-Butyl-(2-aminoethyl)carbamat in 6 ml Dimethylformamid gelöst. Bei 0 ⁰ C (Eisbad) werden dann 204 mg (1.06 mmol) EDC und 33 mg (0.25 mmol) HOBt zugegeben. Es wird langsam auf RT erwärmt und für 12 h bei RT gerührt. Die Lösung wird im Vakuum eingeengt und der Rückstand wird mit Essigsäureethylester aufgenommen. Die organische Phase wird nacheinander mit gesättigter Νatriumhydrogencarbonat- und Νatrium- chlorid-Lösung gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und im Vakuum eingedampft. Der verbleibende Feststoff wird im Hochvakuum getrocknet.

Ausbeute: 392 mg (94% d. Th.)

LC-MS (Methode 1): R _t = 2.36 min.

MS (ESI): m/z = 509 (M+H) ⁺

Beispiel 2A

Eine Lösung von 390 mg (0.77 mmol) Benzyl- toxycarbonyl)ainino]-l- butoxycarbonyl)amino]ethyl}amino)carbonyl]butyl}carbamat (Beispiel IA) in 50 ml Ethanol wird nach Zugabe von 40 mg Palladium auf Aktivkohle (10%ig) 4 h bei RT und Normaldruck hydriert. Es wird über Kieselgur filtriert und der Rückstand mit Ethanol gewaschen. Das Filtrat wird im Vakuum zur Trockne eingeengt. Das Produkt wird ohne weitere Reinigung umgesetzt.

Ausbeute: 263 mg (91% d. Th.)

MS (ESI): m/z = 375 (M+H) ⁺ ; 397 (M+Na) ⁺ .

Beispiel 3A

Unter Argon werden 48 mg (0.194 mmol) l-[(Benzyloxy)carbonyl]-Z-prolin und 94 mg (0.25 mmol) der Verbindung aus Beispiel 2A in 6 ml Dimethylformamid gelöst. Bei 0 ⁰ C (Eisbad) werden dann 48 mg (0.25 mmol) EDC und 7.8 mg (0.058 mmol) HOBt zugegeben. Es wird langsam auf RT erwärmt und für 12 h bei RT gerührt. Die Lösung wird im Vakuum eingeengt und der Rückstand mit Dichlormethan aufgenommen und mit gesättigter Νatriumhydrogencarbonat-

Lösung, 0.1 N Salzsäure und Wasser gewaschen. Die vereinigten organischen Phasen werden im Vakuum eingeengt und der so erhaltene Feststoff ohne Reinigung weiter umgesetzt.

Ausbeute: 117 mg (95% d. Th.)

LC-MS (Methode 3): R ₁ = 2.36 min.

MS (ESI): m/z = 606 (M+H) ⁺

Beispiel 4A

117 mg (0.193 mmol) der Verbindung aus Beispiel 3A werden in 50 ml Ethanol gelöst und mit 20 mg Palladium auf Aktivkohle (10%ig) versetzt. Man hydriert 12 h bei Normaldruck, filtriert über Kieselgur und engt das Filtrat im Vakuum ein. Der so erhaltene Feststoff wird ohne Reinigung weiter umgesetzt.

Ausbeute: 86 mg (94% d. Th.)

MS (ESI): m/z = 472 (M+H) ⁺

Beispiel 5A

Eine Lösung von 475 mg (0.90 mmol) cyclohexanamin (1:1) in 10 ml Tetrahydrofuran wird bei -10 ⁰ C mit 91 mg (0.90 mmol) 4-Me-

thylmorpholin und 98 mg (0.90 mmol) Chlorameisensäureethylester versetzt und 30 min gerührt. Bei dieser Temperatur werden 1.81 ml (1.81 mmol) einer IM Lösung von Lithium- aluminiumhydrid in Tefrahydrofuran langsam zugetropft. Es wird langsam auf RT erwärmt und für 12 h bei RT gerührt. Unter Eiskühlung gibt man vorsichtig 0.1 ml Wasser und 0.15 ml 4.5%ige Natriumhydroxid-Lösung hinzu und rührt weitere 3 h bei RT. Der Ansatz wird filtriert und das Filtrat wird im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wird in Essigsäureethylester gelöst, mit Wasser gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und erneut im Vakuum zur Trockne eingeengt. Das Produkt wird ohne weitere Reinigung umgesetzt.

Ausbeute: 250 mg (83% d. Th.)

MS (ESl): m/z = 333 (M+H) ⁺ .

Beispiel 6A

Eine Lösung von 250 mg (0.75 mmol) der Verbindung aus Beispiel 5A in 20 ml Dichlormethan wird mit 103 mg (0.90 mmol) Methansulfonsäurechlorid und 0.21 ml (1.5 mmol) Triethylamin versetzt und für 16 h bei RT gerührt. Es wird mit Dichlormethan verdünnt und zweimal mit 0.1N Salzsäure gewaschen. Die organische Phase wird über Magnesiumsulfat getrocknet und im Vakuum bis zur Trockne eingeengt. Das Produkt wird ohne weitere Reinigung umgesetzt.

Ausbeute: 264 mg (86% d. Th.)

MS (DCl): m/z = 428 (M+NH ₄ ) ⁺ .

Beispiel 7A

/e7t-Butyl-{(5<S)-6-azido-5-[(fer^-butoxycarbonyl)amin o]hexyl}carbamat

Eine Lösung von 264 mg (0.64 mmol) der Verbindung aus Beispiel 6A in 15 ml Dimethyl- formamid wird mit 42 mg (0.64 mmol) Natriumazid versetzt und 12 h bei 70°C gerührt. Ein Großteil des Lösungsmittel wird im Vakuum abdestilliert und der Rückstand wird mit Essigsäureethylester verdünnt. Es wird mehrmals mit gesättigter Natriumhydrogencarbonat- Lösung gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und im Vakuum zur Trockne eingeengt. Das Produkt wird ohne weitere Reinigung umgesetzt.

Ausbeute: quant.

MS (ESI): m/z = 358 (M+H) ⁺ .

Beispiel 8A

Eine Lösung von 229 mg (0.64 mmol) der Verbindung aus Beispiel 7A in 10 ml Ethanol wird nach Zugabe von 20 mg Palladium auf Aktivkohle (10%ig) 12 h bei RT und Normaldruck hydriert. Es wird über Kieselgur filtriert und der Rückstand mit Ethanol gewaschen. Das Filtrat wird im Vakuum zur Trockne eingeengt. Das Produkt wird ohne weitere Reinigung umgesetzt.

Ausbeute: 161 mg (76% d. Th.)

MS (ESI): m/z = 332 (M+H) ⁺ .

Beispiel 9A

Die Herstellung erfolgt analog zu Beispiel 3A aus 57 mg (0.216 mmol) (4i?)-l-[(Benzyl- oxy)carbonyl]-4-hydroxy-Z-prolin und 93 mg (0.28 mmol) der Verbindung aus Beispiel 8A in 6 ml Dimethylformamid unter Zusatz von 54 mg (0.28 mmol) EDC und 8.7 mg (0.065 mmol) HOBt. Das Produkt wird mittels präparativer RP-HPLC gereinigt (Laufmittel Wasser / Acetonitril Gradient: 90:10 -» 5:95).

Ausbeute: 42 mg (34% d. Th.)

LC-MS (Methode 1): R ₁ = 2.08 min.

MS (ESI): m/z = 579 (M+H) ⁺

Beispiel IQA

Die Herstellung erfolgt analog Beispiel 4A aus 41 mg (0.071 mmol) der Verbindung aus Beispiel 9A in 20 ml Ethanol unter Zusatz von 7.5 mg Palladium auf Aktivkohle (10%ig). Das Produkt wird ohne weitere Reinigung umgesetzt.

Ausbeute: quant.

MS (ESI): m/z = 445 (M+H) ⁺

Beispiel IIA

2-{[(Benzyloxy)carbonyl]arnino}ethyl-methansulfonat

Zu einer Lösung von 16 g (82.0 mmol) Benzyl-(2-hydroxyethyl)carbamat und 16.60 g (64.02 mmol) Triethylamin in 1 1 Dichlormethan werden 11.3 g (98.4 mmol) Methansulfonsäurechlorid hinzugegeben. Das Reaktionsgemisch wird über Nacht bei RT gerührt. Man gibt Wasser hinzu, und die organische Phase wird nacheinander mit Wasser und Natriumchlorid-Lösung gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und im Vakuum eingedampft. Der verbleibende Feststoff wird im Hochvakuum getrocknet. Das Rohprodukt wird durch präparative HPLC aufgereinigt.

Ausbeute 7 g (31% d. Th.)

LC-MS (Methode 3): R _t = 1.84 min.

MS (ESI): m/z = 273 (M+H) ⁺ .

Beispiel 12A

Benzyl- {2-[(2-hydroxyethyl)amino] ethyl} carbamat

Zu einer Lösung von 226 mg (3.66 mmol) 2-Aminoethanol in 25 ml Acetonitril werden 500 mg (1.83 mmol) 2-{[(Benzyloxy)carbonyl]amino}ethyl-methansulfonat (Beispiel I IA) und 758 mg (5.48 mmol) Kaliumcarbonat hinzugegeben. Das Reaktionsgemisch wird über Nacht bei 50 ⁰ C gerührt. Das Lösungsmittel wird dann eingedampft und der Rückstand in Dichlormethan aufgenommen. Die organische Phase wird mit Wasser gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und eingeengt. Das Rohprodukt wird durch präparative HPLC aufgereinigt.

Ausbeute 131 mg (29% d. Th.)

LC-MS (Methode 3): R _t = 0.78 min.

MS (ESI): m/z = 239 (M+H) ⁺ .

Beispiel 13A

Benzyl-[2-({2-[(tert-butoxycarbonyl)(methyl)amino]eth.yl} amino)ethyl]carbamat

Die Herstellung erfolgt analog zum Beispiel 12A aus 300 mg (1.098 mmol) 2- {[(Benzyloxy)carbonyl]amino}ethyl-methansulfonat (Beispiel IIA), 386 mg (2.19 mmol) tert- Butyl-(2-aminoethyl)methylcarbamat und 455 mg (3.30 mmol) Kaliumcarbonat in 10 ml Acetonitril.

Ausbeute: 360 mg (82% d. Th.)

LC-MS (Methode 4): R _t = 1.51 min.

MS (ESI): m/z = 352 (M+H) ⁺ .

Beispiel 14A

Benzyl [2-({3-[(tert-butoxycarbonyl)amino]-2-hydroxypropyl}amino)et hyl]carbamat

Die Herstellung erfolgt analog zum Beispiel 12A aus 270 mg (0.98 mmol) 2- {[(Ben- zyloxy)carbonyl]amino}ethyl-methansulfonat (Beispiel IIA), 379 mg (1.98 mmol) tert-Butyl-(3- amino-2-hydroxypropyl)carbamat und 409 mg (2.96 mmol) Kaliumcarbonat in 10 ml Acetonitril.

Ausbeute: 209 mg (45% d. Th.)

LC-MS (Methode 2): R _t = 1.44 min.

MS (ESl): m/z = 368 (M+H) ⁺ .

Beispiel 15A

Unter Argon werden 5 g (16.15 mmol) no]-5- pentansäure und 2.45 ml (17.60 mmol) Triethylamin in 80 ml THF gelöst und auf 0 ⁰ C abgekühlt. Dazu gibt man 1.68 g (17.77 mmol) Methylchloroformiat und lässt 3 Stunden bei O ⁰ C nachrühren. Die Reaktionsmischung wird über Kieselgur filtriert. Das Filtrat wird direkt umgesetzt.

Beispiel 16A

fert-Butyl-N-(terf-butoxycarbonyl)-5-hydroxy-i-norvalinat

Das Filtrat von (l-ter^-Butyl-5-(methoxycarbonyl)-N-(ter/-butoxycarbonyl)-i- glutamat (Beispiel 15A) wird zu einer Suspension von 1.52 g (40.38 mmol) Νatriumborhydrid in 4.5 ml Wasser bei 0 ⁰ C tropfenweise hinzugegeben. Die Mischung erwärmt sich langsam auf RT und wird über Nacht gerührt. Die Reaktionslösung wird im Vakuum eingeengt und der Rückstand wird zur Aufarbeitung mit Essigsäureethylester und Wasser versetzt. Die organische Phase wird mit gesättigter Natriumchlorid-Lösung gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und im Vakuum eingedampft. Das Rohprodukt wird ohne weitere Reinigung umgesetzt.

Ausbeute: 4.5 g (48% d.Th.)

LC-MS (Methode 2): R _t = 2.04 min.

MS (ESI): m/z= 290 (M+H) ⁺

Beispiel 17A

ter/-Butyl-N-(tert-butoxycarbonyl)-5-[(meth.ylsulfonyl)ox y]-Z,-norvalinat

Zu einer Mischung von 4.5 g (7.79 mmol norvalinat (Beispiel 16A) und 2.17 ml (5.58 mmol) Triethylamin in 200 ml Dichlormethan werden 1.07 g (9.35 mmol) Methansulfonsäurechlorid hinzugegeben. Die Mischung wird bei RT über Nacht gerührt und dann mit Wasser versetzt. Die organische Phase wird nacheinander mit Wasser und gesättigter Natriumchlorid-Lösung gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und im Vakuum eingedampft. Das Rohprodukt wird durch präparative HPLC aufgereinigt.

Ausbeute: quant.

LC-MS (Methode 1): 2.16 min. MS (ESI): m/z = 368 (M+H) ⁺ .

Beispiel 18A

Die Herstellung erfolgt analog zum Beispiel 12A aus 2 g (5.443 mmol) tert-Buty\-N-(tert- butoxycarbonyl)-5-[(methylsulfonyl)oxy]-L-norvalinat (Beispiel 17A), 1.78 g (10.89 mmol) tert- Butyl-(2-aminoethyl)carbamat und 2.26 g (16.33mmol) Kaliumcarbonat in 100 ml Acetonitril. Das Rohprodukt wird ohne weitere Reinigung umgesetzt.

Ausbeute: 4.2 g (53% d. Th.)

LC-MS (Methode 3): R _t = 1.61 min.

MS (ESI): m/z = 432 (M+H) ⁺ .

Beispiel 19A

terf-Butyl 2-{[(2-{[(benzyloxy)carbonyl]amino}ethyl)amino]methyl}piperi din-l-carboxylat

Die Herstellung erfolgt analog zum Beispiel 12A aus 1 g (3.66 mmol) 2-{[(Benzyloxy)carbonyl]- amino}ethyl-methansulfonat (Beispiel IIA), 1.56 g (7.31 mmol) fer^Butyl-2-(aminomethyl)- piperidin-1-carboxylat und 1.52 g (10.98 mmol) Kaliumcarbonat in 70 ml Acetonitril.

Ausbeute: 680 mg (45% d. Th.)

LC-MS (Methode 1): R _t = 1.47 min.

MS (ESI): m/z = 392 (M+H) ⁺ .

2

6 002564

- 37 -

Zu einer Lösimg von 169 mg (0.462 mmol) N ⁵ -[(Benzyloxy)carbonyl]-N ² -(fer^butoxycarbonyl)-Z-

^• Ornithin in 10 ml wasserfreiem DMF werden 193 mg (0.51 mmol) HATU und 0.247 ml

(1.39 mmol) N,N-Diisopropylethylamin hinzugegeben. Nach 30 min Rühren bei RT werden 116 mg (0.46 mmol) Benzyl-{2-[(2-hydroxyethyl)amino]ethyl}carbamat (Beispiel 12A) hinzugegeben. Das Reaktionsgemisch wird 15 h bei RT gerührt. Das Lösungsmittel wird dann eingedampft und der Rückstand in Essigsäureethylester und Wasser versetzt Die organische Phase wird nacheinander mit IN Salzsäure und gesättigter wässriger Natriumchlorid-Lösung gewaschen, über

Natriumsulfat getrocknet und eingeengt. Das Rohprodukt wird durch präparative HPLC aufgereinigt.

Ausbeute 188 mg (70% d. Th.)

LC-MS (Methode 1): R ₁ = 2.17 min.

MS (ESI): m/z = 587 (M+H) ⁺ .

Beispiel 21A

Benzyl-{(45)-4-amino-5-[(2-{[(benzyloxy)carbonyl]ammo}eth yl)(2-hydroxyethyl)amino]-5- oxopentyl}carbamatHydrochlorid

Zu einer Lösung von 176 mg (0.30 mmol) Benzyl-{2-[{(2S)-5-{[(benzyloxy)carbonyl]amino}-2- [(/ert-butoxycarbonyl)amino]pentanoyl}(2-hydroxyethyl)amino] ethyl}carbamat (Beispiel 20A) in 1 ml Dioxan werden 2 ml einer 4 M Chlorwasserstoff-Dioxan-Lösung hinzugegeben. Nach 3 h bei RT wird die Reaktionslösung im Vakuum eingeengt, mehrmals mit Dichlormethan coevaporiert und im Hochvakuum getrocknet. Das Rohprodukt wird ohne weitere Reinigung umgesetzt.

Ausbeute: 160 mg (85% d. Th.)

LC-MS (Methode 1): R _t = 1.53 min.

Beispiel 22A

fert-Butyl-3-[(3iS)-3-(3-{[(benzyloxy)carbonyl]amino}prop yl)-5-(2-hydroxyethyl)-4,9-dioxo-ll- phenyl-lO-oxa-2,5,8-1riazaundecan-l-oyl]piperidin-l-carboxyl at

Unter Argon werden 47 mg (0.206 mmo 130 mg (0.206 mmol) Benzyl-{(4iS)-4-amino-5-[(2-{[(benzyloxy)carbonyl]amino}eth. yl)(2-hydroxyethyl)- amino]-5-oxopentyl}carbaiinat Hydrochlorid (Beispiel 21A) und 0.08 ml Triethylamin (0.56 mmol) in 10 ml Dimethylformamid gelöst. Bei 0°C (Eisbad) werden dann 67 mg (0.350 mmol) EDC und 9 mg (0.068 mmol) HOBt zugegeben. Es wird langsam auf RT erwärmt und für 12 h bei RT gerührt. Die Lösung wird im Vakuum eingeengt und der Rückstand wird mit Dichlormethan aufgenommen. Die organische Phase wird nacheinander mit Wasser, 1 N Salzsäure und gesättigter wässriger Natriumchlorid-Lösung gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und eingeengt. Das Rohprodukt wird ohne weitere Reinigung umgesetzt.

Ausbeute: quant.

LC-MS (Methode 1) = 2.26 min. MS (ES]): m/z = 698 (M+H) ⁺ .

Beispiel 23A

Benzyl- {(4S)-5-[(2- { [(benzyloxy)carbonyl]amino} ethyl)(2-hydroxyethyl)amino]-5-oxo-4- [(piperidm-3-ylcarbonyl)amino]pentyl}carbamat Hydrochlorid

Zu einer Lösung von 180 mg (0.196 mmol) ter*-Butyl-3-[(3<S)-3-(3-{[(benzyloxy)carbonyl]- amino}propyl)-5-(2-hydroxyethyl)-4,9-dioxo-ll-phenyl-10-oxa- 2,5,8-triazaundecan-l-oyl]- piperidin-1-carboxylat (Beispiel 22A) in 1 ml Dioxan werden 2 ml einer 4 M Chlorwasserstoff- Dioxan-Lösung hinzugegeben. Nach 3 h bei RT wird die Reaktionslösung im Vakuum eingeengt, mehrmals mit Dichlormethan coevaporiert und im Hochvakuum getrocknet Das Rohprodukt wird durch präparative HPLC aufgereinigt.

Ausbeute: 18 mg (14% d. Th.)

LC-MS (Methode 2): R _t = 1.84 min.

MS (ESI): m/z = 598 (M-HC1+H) ⁺ .

Analog zu der oben aufgeführten Vorschrift von Beispiel IA werden die in der folgenden Tabelle aufgeführten Beispiele 24A bis 29A aus den entsprechenden Edukten hergestellt:

Analog zu der oben aufgeführten Vorschrift von Beispiel 2A werden die in der folgenden Tabelle aufgeführten Beispiele 30A bis 35A aus den entsprechenden Edukten hergestellt:

Beispiel 36A

Zu einer Lösung von 30 mg (0.046 mmo 3- [(ter/-butoxycarbonyl)amino]propyl}-5,17-dihydroxy-10,13-dio xo-9,12-diazatricyclo[14.3.1.1 ² ' ⁶ ]- henicosa-l(20),2(21) ₅ 3,5,16,18-hexaen-8-carbonsäure (Beispiel 83A aus WO03/106480) in 2 ml wasserfreiem DMF werden 19.2 mg (0.050 mmol) HATU und 0.010 ml (0.137 mmol) N,N-Diiso- propylethylamin hinzugegeben. Nach 30 min Rühren bei RT werden 12.7 mg (0.046 mmol) Benzyl-{2-[(2-hydroxyethyl)amino]ethyl}carbamat (Beispiel 12A) hinzugegeben. Das Reaktionsgemisch wird 15 h bei RT gerührt. Das Lösungsmittel wird dann eingedampft und der Rückstand in Dichlormethan aufgenommen. Die organische Phase wird mit Wasser gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und eingeengt. Das Rohprodukt wird durch präparative HPLC aufgereinigt.

Ausbeute: 8 mg (20% d. Th.)

LC-MS (Methode 2): R ₄ = 2.29 min.

MS (ESI): m/z = 877 (M+H) ⁺ .

Analog zur Vorschrift des Beispiels 36A werden die in der folgenden Tabelle aufgeführten Beispiele 37A bis 45A hergestellt.

Beispiel 46A

Zu einer Lösung von 30 mg (0.046 mmol) (8S,l lS,14S)-14-[(^erf-Butoxycarbonyl)amino]-l l-{3- [(terf-butoxycarbonyl)amino]propyl}-5,17-dihydroxy-10, 13-dioxo-9, 12-diazatricyclo[14.3.1.1 ² ' ⁶ ]- henicosa-l(20),2(21),3,5,16,18-hexaen-8-carbonsäure (Beispiel 83A aus WO03/106480) in 10 ml wasserfreiem DMF werden bei 0 ⁰ C 26 mg (0.050 mmol) PyBOP und 0.020 ml (0.14 mmol) NN-Diisopropylethylamin hinzugegeben. Nach 30 min bei 0 ⁰ C werden 23.7 mg (0.05 mmol) L- Prolyl-N ⁵ -(tert-butoxycarbonyl)-N- {2-[(/ert-butoxycarbonyl)amino] ethyl} -Z-ornithinamid (Beispiel 4A) hinzugegeben. Das Reaktionsgemisch wird 15 h bei RT gerührt. Das Lösungsmittel wird dann eingedampft und der Rückstand mit Wasser ausgerührt, abfiltriert und im Vakuum getrocknet. Das Rohprodukt wird chromatographisch an Sephadex-LH20 (Laufmittel: Methanol / Essigsäure (0.25%)) gereinigt.

Ausbeute: 34 mg (66% ά. Th.)

LC-MS (Methode 2): R _t = 2.49 min.

MS (ESI): m/z = 1110 (M+H) ⁺ .

Analog zur Vorschrift des Beispiels 46A werden die in der folgenden Tabelle aufgeführten Beispiele 47A bis 50A hergestellt.

Beispiel 51A

Es werden 11 mg (0.01 mmol) Benzyl utoxycarbonyl)armno]- ll-{3- [(ter/-butoxycarbonyl)amino]proρyl}-5,17-dihydrox [14.3.1.1 ² ' ⁶ ]- henicosa-l(20),2(21),3,5,16,18-hexaen-8-yl]carbony yl)amino]- ethyl}amino)ethyl]carbamat (Beispiel 37A) in 4 ml Essigsäure/Wasser (4: 1) gelöst. Dazu gibt man 5 mg Palladium auf Aktivkohle (10%ig) und hydriert anschließend 15 h bei Normaldruck. Das Reaktionsgemisch wird über vorgewaschenem Kieselgur filtriert und das Filtrat im Vakuum einrotiert. Das Rohprodukt wird ohne weitere Reinigung umgesetzt.

Ausbeute: quant.

LC-MS (Methode 1 80 min. MS (ESI): m/z = 856 (M-HOAc+H) ⁺ .

Analog zur Vorschrift des Beispiels 51A werden die in der folgenden Tabelle aufgeführten Beispiele 52A bis 56A hergestellt.

Ausfflhrungsbeispiele

Beispiel 1

Zu einer Lösung von 26.9 mg (0.024 mmol) der Verbindung aus Beispiel 46A in 1 ml Dioxan werden bei 0 ⁰ C 0.363 ml einer 4N Chlorwasserstoff-Dioxan-Lösung hinzugegeben. Nach 3 h bei RT wird die Reaktionslösung im Vakuum eingeengt und mehrmals mit Dichlormethan coevaporiert. Der zurückbleibende Feststoff wird im Hochvakuum bis zur Gewichtskonstanz getrocknet.

Ausbeute: 20 mg (96% d. Th.)

LC-MS (Methode 5 1.82 min. MS (ESl): m/z = 710 (M-4HC1+H) ⁺ .

¹ H-NMR (400 MHz, D ₂ O): δ = 1.26 (m-, IH), 1.55-2.1 (m, 10H), 2.27 K IH), 2.75 (Hi ₀ , IH), 2.9- 3.2 (m, 7H), 3.3-3.8 (m, 6H), 4.25 (m,, IH), 4.44 (In ₀ , 2H), 4.7-4.9 (m, 2H, unter D ₂ O), 6.85-7.0 (m, 3H), 7.27 (s, IH), 7.34 (d, IH), 7.4 (d, IH).

Beispiel 2

Beispiel 1 als Tetrahydrochlorid-Salz wird durch präparative HPLC (Reprosil ODS-A, Laufmittel Acetonitril / 0.2% wässrige Trifluoressigsäure 5:95 -> 95:5) in das Tetra(hydrotrifluoracetat) überfuhrt.

Beispiel 3

(8S,l lS,145)-14-Amino-N-(2-aminoethyl)-ll-(3-aminopropyl)-5,17-di hydroxy-N-[2-(methyl- amino)ethyl]-10,13-dioxo-9,12-diazatricyclo[14.3.1.1 ² ' ⁶ ]hemcosa-l(20),2(21),3,5,16,18-hexaen-8- carboxamid Tetrahydrochlorid

Eine Mischung von 9 mg (0.011 mmol) butoxycarbonyl)a 9,12-diazatricyclo methylcarbamat (Beispiel 51A) und 1.5 ml einer 4 M Chlorwasserstoff-Dioxan-Lösung wird 20 min bei RT gerührt. Die Reaktionslösung wird eingeengt, mehrmals mit Dichlormethan coevaporiert und im Hochvakuum getrocknet.

Ausbeute: quant.

LC-MS (Methode 1 0.27 min. MS (ESI): m/z = 555 (M-4HC1+H) ⁺ .

¹ H-NMR (400 MHz, D ₂ O): δ = 1.60-1.90 (m, 5H), 2.73 (d, 3H), 2.86-3.11(m, 4H), 3.23-3.38 (m, 4H), 3.50-3.95 (m, 8H), 5.09 (m, 2H), 6.96 (d, 2H), 7.01 (s, IH), 7.33 (s, IH), 7.40 (d, IH), 7.46 (d, IH).

Beispiel 4

pro nam r s y roc or

Zu einer Lösung von 26.9 mg (0.024 mmol) der Verbindung aus Beispiel 47A in 1 ml Dioxan werden bei 0°C 0.363 ml einer 4Ν Chlorwasserstoff-Dioxan-Lösung hinzugegeben. Nach 3 h bei RT wird die Reaktionslösung im Vakuum eingeengt und mehrmals mit Dichlormethan coevaporiert. Der zurückbleibende Feststoff wird im Hochvakuum bis zur Gewichtskonstanz getrocknet.

Ausbeute: 20 mg (96% d. Th.)

LC-MS (Methode 5): R ₄ = 1.82 min.

MS (ESI): m/z = 710 (M-3HC1+H) ⁺ .

¹ H-NMR (400 MHz, D ₂ O): δ = 1.26 (DJ ₀ , IH), 1.5-2.1 (m, 8H), 2.26 (In ₀ , IH), 2.76 (m-, IH), 2.9- 3.2 (m, 7H), 3.3-3.6 (m, 2H), 4.37 K, IH), 4.45 (Di ₀ , IH), 4.7-4.9 (m, 2H, unter D ₂ O), 6.85-7.0 (m, 3H), 7.27 (s, IH), 7.34 (d, IH), 7.4 (d, IH).

Beispiel 5

Zu einer Lösung von 19.9 mg (0.023 mmol) der Verbindung aus Beispiel 43A in 1 ml Dioxan werden bei 0°C 0.343 ml einer 4Ν Chlorwasserstoff-Dioxan-Lösung hinzugegeben. Nach 3 h bei RT wird die Reaktionslösung im Vakuum eingeengt und mehrmals mit Dichlormethan coevaporiert. Der zurückbleibende Feststoff wird im Hochvakuum bis zur Gewichtskonstanz getrocknet.

Ausbeute: 13.6 mg (88% d. Th.)

LC-MS (Methode 5): R _t = 1.9 min.

MS (ESl): m/z = 570 (M-3HC1+H) ⁺ .

Analog zur Vorschrift des Beispiels 1 werden die in der folgenden Tabelle aufgeführten Beispiele 5 bis 14 hergestellt, entsprechend der jeweiligen Isolierungsmethode als Hydrochlorid- oder Hydro(trifluoracetat)-Salz.

B. Bewertung der physiologischen Wirksamkeit

Verwendete Abkürzungen:

AMP Adenosinmonophosphat

ATP Adenosintriphosphat

BHI Medium Brain heart infusion medium

CoA Coenzym A

DMSO Dimethylsulfoxid

DTT Dithiothreitol

EDTA Ethylendiamintetraessigsäure

KCl Kaliumchlorid

KH ₂ PO ₄ Kaliumdihydrogenphosphat

MgSO ₄ Magnesiumsulfat

MHK Minimale Hemmkonzentration

MTP Mikrotiterplatte

NaCl Natriumchlorid

Na ₂ HPO ₄ Dinatriumhydrogenphosphat

NH ₄ CI Ammoniumchlorid

NTP • Nukleotidtriphosphat

PBS Phosphat Buffered Saline

PCR Polymerase Chain Reaction

PEG Polyethylenglykol

PEP Phosphoenolpyruvat

Tris Tris[hydroxymethyl]aminomethan

Die in vzϊro-Wirkung der erfindungsgemäßen Verbindungen kann in folgenden Assays gezeigt werden:

In vitro Transkription-Translation mit E. coli Extrakten

Zur Herstellung eines S30-Extraktes werden logarithmisch wachsende Escherichia coli MRE 600 (M. Müller; University Freiburg) geerntet, gewaschen und wie beschrieben für den in vitro Transkriptions-Translations-Test eingesetzt (Müller, M. and Blobel, G. Proc Natl Acad Sei U S A (1984) 81, pp.7421-7425).

Dem Reaktionsmix des in vitro Transkriptions-Translations-Tests werden zusätzlich 1 μl cAMP (11.25 mg/ml) je 50 μl Reaktionsmix zugegeben. Der Testansatz beträgt 105 μl, wobei 5 μl der zu

testenden Substanz in 5%igem DMSO vorgelegt werden. Als Transkriptionsmatrize werden 1 μg/100μl Ansatz des Plasmides pBESTLuc (Promega, Deutschland) verwendet. Nach Inkubation für 60 min bei 30 ⁰ C werden 50 μl Luziferinlösung (20 mM Tricine, 2.67 mM MgSO ₄ , 0.1 mM EDTA, 33.3 mM DTT pH 7.8, 270 μM CoA, 470 μM Luziferin, 530 μM ATP) zugegeben und die entstehende Biolumineszenz für 1 Minute in einem Luminometer gemessen. Als IC ₅₀ wird die Konzentration eines Inhibitors angegeben, die zu einer 50%igen Inhibition der Translation von Firefly Luziferase fuhrt.

In vitro Transkription-Translation mit S aureus Extrakten

Konstruktion eines S. aureus Luziferase Reporterplasmids

Zur Konstruktion eines Reporterplasmids, welches in einem in vitro Transkriptions-Translations- Assay aus S. aureus verwendet werden kann, wird das Plasmid pBESTluc (Promega Corporation, USA) verwendet. Der in diesem Plasmid vor der Firefly Luziferase vorhandene E. coli tac Promoter wird gegen den capAl Promoter mit entsprechender Shine-Dalgarno Sequence aus S. aureus ausgetauscht. Dazu werden die Primer CAPFor 5 '-CGGCC- AAGCTTACTCGGATCCAGAGTTTGCAAAATATACAGGGGATTATATATAATGGAAAAC AAGAAAGGAAAATAGGAGGTTTATATGGAAGACGCCA-S' und CAPRev 5 ¹ - GTCATCGTCGGGAAGACCTG-3' verwendet. Der Primer CAPFor enthält den capAl Promotor, die Ribosomenbindestelle und die 5'-Region des Luziferase Gens. Nach PCR unter Verwendung von pBESTluc als Template kann ein PCR-Produkt isoliert werden, welches das Firefly Luziferase Gen mit dem fusionierten capAl Promotor enthält. Dieses wird nach einer Restriktion mit CIaI und HindlH in den ebenfalls mit CIaI und Hindm verdauten Vektor pBESTluc ligiert. Das entstandene Plasmid pla kann in E. coli repliziert werden und als Template im S. aureus in vitro Transkriptions-Translations-Test verwendet werden.

Herstellung von S30 Extrakten aus S. aureus

Sechs Liter BHI Medium werden mit einer 250 ml Übernachtkultur eines S. aureus Stammes inokuliert und bei 37°C bis zu einer OD600nm von 2-4 wachsen gelassen. Die Zellen werden durch Zentrifugation geerntet und in 500 ml kaltem Puffer A (10 mM Tris-acetat, pH 8.0, 14 mM Magnesiumacetat, 1 mM DTT, 1 M KCl) gewaschen. Nach erneutem Abzentrifugieren werden die Zellen in 250 ml kaltem Puffer A mit 50 mM KCl gewaschen und die erhaltenen Pellets bei -20°C für 60 min eingefroren. Die Pellets werden in 30 bis 60 min auf Eis aufgetaut und bis zu einem Gesamtvolumen von 99 ml in Puffer B (10 mM Tris-acetat, pH 8.0, 20 mM Magnesiumacetat, 1 mM DTT, 50 mM KCl) aufgenommen. Je 1.5 ml Lysostaphin (0.8 mg/ml) in Puffer B werden in 3 vorgekühlte Zentrifugenbecher vorgelegt und mit je 33 ml der Zellsuspension vermischt. Die

Proben werden für 45 bis 60 min bei 37°C unter gelegentlichem Schütteln inkubiert, bevor 150 μl einer 0.5 M DTT Lösung zugesetzt werden. Die lysierten Zellen werden bei 30.000 x g 30 min bei 4°C abzentrifugiert. Das Zellpellet wird nach Aufnahme in Puffer B unter den gleichen Bedingungen nochmals zentrifugiert und die gesammelten Überstände werden vereinigt. Die Überstände werden nochmals unter gleichen Bedingungen zentrifugiert und zu den oberen 2/3 des Überstandes werden 0.25 Volumen Puffer C (670 mM Tris-acetat, pH 8.0, 2O mM Magnesiumacetat, 7 mM Na ₃ -Phosphoenolpyruvat, 7 mM DTT, 5.5 mM ATP, 70 μM Aminosäuren (complete von Promega), 75 μg Pyruvatkinase (Sigma, Deutschland))/ml gegeben. Die Proben werden für 30 min bei 37°C inkubiert. Die Überstände werden über Nacht bei 4 ⁰ C gegen 2 1 Dialysepuffer (10 mM Tris-acetat, pH 8.0, 14 mM Magnesiumacetat, 1 mM DTT, 60 mM Kaliumacetat) mit einem Pufferwechsel in einem Dialyseschlauch mit 3500 Da Ausschluss dialysiert. Das Dialysat wird auf eine Proteinkonzentration von etwa 10 mg/ml konzentriert, indem der Dialyseschlauch mit kaltem PEG 8000 Pulver (Sigma, Deutschland) bei 4°C bedeckt wird. Die S30 Extrakte können aliquotiert bei -70 ⁰ C gelagert werden.

Bestimmung der ICgn im S. aureus in vitro Transcriptions-Translations-Assay

Die Inhibition der Proteinbiosynthese der Verbindungen kann in einem in vitro Transkriptions- Translations-Assay gezeigt werden. Der Assay beruht auf der zellfreien Transkription und Translation von Firefly Luziferase unter Verwendung des Reporterplasmids pla als Template und aus S. aureus gewonnenen zellfreien S30 Extrakten. Die Aktivität der entstandenen Luziferase kann durch Lumineszenzmessung nachgewiesen werden.

Die Menge an einzusetzenden S30 Extrakt bzw. Plasmid pla muss für jede Präparation erneut ausgetestet werden, um eine optimale Konzentration im Test zu gewährleisten. 3 μl der zu testenden Substanz gelöst in 5% DMSO werden in eine MTP vorgelegt. Anschließend werden 10 μl einer geeignet konzentrierten Plasmidlösung pla zugegeben. Anschließend werden 46 μl eines Gemisches aus 23 μl Premix (500 mM Kaliumacetat, 87.5 mM Tris-acetat, pH 8.0, 67.5 mM Ammoniumacetat, 5 mM DTT, 50 μg Folsäure/ml, 87.5 mg PEG 8000/ml, 5 mM ATP, 1.25 mM je NTP, 20 μM je Aminosäure, 50 mM PEP (Na ₃ -SaIz), 2.5 mM cAMP, 250 μg je E. coli tRNA/ml) und 23 μl einer geeigneten Menge S. aureus S30 Extrakt zugegeben und vermischt. Nach Inkubation für 60 min bei 3O ⁰ C werden 50 μl Luziferinlösung (20 mM Tricine, 2.67 mM MgSO ₄ , 0.1 mM EDTA, 33.3 mM DTT pH 7.8, 270 μM CoA, 470 μM Luziferin, 530 μM ATP) und die entstehende Biolummeszenz für 1 min in einem Luminometer gemessen. Als IC ₅ 0 wird die Konzentration eines Inhibitors angegeben, die zu einer 50%igen Inhibition der Translation von Firefly Luziferase führt.

Bestimmung der Minimalen Hemmkonzentratiόn (MMK)

Die minimale Hemmkonzentration (MHK) ist die minimale Konzentration eines Antibiotikums, mit der ein Testkeim in seinem Wachstum über 18-24 h inhibiert wird. Die Hemmstoffkonzentration kann dabei nach mikrobiologischen Standardverfahren bestimmt werden (siehe z.B. The National Committee for Clinical Laboratory Standards. Methods for dilution antimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically; approved standard-fifth edition. NCCLS document M7-A5 [ISBN 1-56238-394-9]. NCCLS, 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, Pennsylvania 19087-1898 USA, 2000). Die MHK der erfmdungsgemäßen Verbindungen wird im Flüssigdilutionstest im 96er-Mikrotiter-Platten-Maßstab bestimmt. Die Bakterienkeime werden in einem Minimalmedium (18.5 mM Na ₂ HPO ₄ , 5.7 mM KH ₂ PO ₄ , 9.3 mM NH ₄ Cl, 2.8 mM MgSO ₄ , 17.1 mM NaCl, 0.033 μg/ml Thiaminhydrochlorid, 1.2 μg/ml Nicotinsäure, 0.003 μg/ml Biotin, 1% Glucose, 25 μg/ml von jeder proteinogenen Aminosäure mit Ausnahme von Phenylalanin; [H.- P. Kroll; unveröffentlicht]) unter Zusatz von 0.4% BH-Bouillon kultiviert (Testmedium). Im Fall von Enterococcus faecium L4001 wird dem Testmedium hitzeinaktiviertes fötales Kälberserum (FCS; GibcoBRL, Deutschland) in einer Endkonzentration von 10% zugesetzt. Übernachtkulturen der Testkeime werden auf eine OD ₅₇₈ von 0.001 (im Falle der Enterokokken auf 0.01) in frisches Testmedium verdünnt und 1:1 mit Verdünnungen der Testsubstanzen (Verdünnungsstufen 1:2) in Testmedium inkubiert (200 μl Endvolumen). Die Kulturen werden bei 37°C für 18-24 Stunden inkubiert; Enterokokken in Gegenwart von 5% CO ₂ .

Die jeweils niedrigste Substanzkonzentration, bei der kein sichtbares Bakterienwachstum mehr auftritt, wird als MHK definiert.

Alternative Bestimmungsmethode der Minimalen Hemmkonzentration (MHK)

Die minimale Hemmkonzentration (MHK) ist die minimale Konzentration eines Antibiotikums, mit der ein Testkeim in seinem Wachstum über 18-24 h inhibiert wird. Die Hemmstoff- konzentration kann dabei nach mikrobiologischen Standardverfahren mit modifiziertem Medium im Rahmen eines Agardilutionstests bestimmt werden (siehe z.B. The National Committee for Clinical Laboratory Standards. Methods for dilution antimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically; approved standard-fifth edition. NCCLS document M7-A5 [ISBN 1-56238- 394-9]. NCCLS, 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, Pennsylvania 19087-1898 USA, 2000). Die Bakterienkeime werden auf 1.5%igen Agarplatten kultiviert, die 20% defibriniertes Pferdeblut enthalten. Die Testkeime, die über Nacht auf Columbia-Blutagarplatten (Becton- Dickinson) inkubiert werden, werden in PBS verdünnt, auf eine Keimzahl von ca. 5x10 ⁵ Keime/ml eingestellt und auf Testplatten getropft (1-3 μl). Die Testsubstanzen enthalten unterschiedliche

Verdünnungen der Testsubstanzen (Verdünnungsstufen 1:2). Die Kulturen werden bei 37°C für 18-24 Stunden in Gegenwart von 5% CO ₂ inkubiert.

Die jeweils niedrigste Substanzkonzentration, bei der kein sichtbares Bakterienwachstum mehr auftritt, wird als MHK definiert und in μg/ml angegeben.

Tabelle A (mit Vergleichsbeispiel Biphenomycin B)

Konzentrationsangaben: MHK in μg/ml; IC ₅₀ in μM.

Systemische Infektion mit S. aureus 133

Die Eignung der erfindungsgemäßen Verbindungen zur Behandlung von bakteriellen Infektionen kann in verschiedenen Tiermodellen gezeigt werden. Dazu werden die Tiere im allgemeinen mit einem geeigneten virulenten Keim infiziert und anschließend mit der zu testenden Verbindung, die in einer an das jeweilige Therapiemodell angepassten Formulierung vorliegt, behandelt. Speziell kann die Eignung der erfindungsgemäßen Verbindungen zur Behandlung von bakteriellen Infektionen in einem Sepsismodell an Mäusen nach Infektion mit S. aureus demonstriert werden.

Dazu werden S. aureus 133 Zellen über Nacht in BH-Bouillon (Oxoid, Deutschland) angezüchtet. Die Übernachtkultur wurde 1 : 100 in frische BH-Bouillon verdünnt und für 3 Stunden hochgedreht. Die in der logarithmischen Wachstumsphase befindlichen Bakterien werden abzentrifugiert und zweimal mit gepufferter, physiologischer Kochsalzlösung gewaschen. Danach wird am Photometer (Dr. Lange LP 2W) eine Zellsuspension in Kochsalzlösung mit einer Extinktion von 50 Einheiten eingestellt. Nach einem Verdünnungsschritt (1:15) wird diese Suspension 1:1 mit einer 10%-igen Mucinsuspension gemischt. Von dieser Infektionslösung wird 0.2 ml/20 g Maus i.p. appliziert. Dies entspricht einer Zellzahl von etwa 1-2 x 10 ⁶ Keimen/Maus. Die i.v.-Therapie erfolgt 30

Minuten nach der Infektion. Für den Infektionsversuch werden weibliche CFWl -Mäuse verwendet. Das Überleben der Tiere wird über 6 Tage protokolliert. Das Tiermodell ist so eingestellt, daß unbehandelte Tiere innerhalb von 24 h nach der Infektion versterben. Für die Beispielverbindung 2 konnte in diesem Modell eine therapeutische Wirkung von EDioo = 1.25 mg/kg demonstriert werden.

Bestimmung der Spontanresistenzfrequenzen gegen S. aureus

Die Spontanresistenzraten der erfindungsgemäßen Verbindungen werden wie folgt bestimmt: die Bakterienkeime werden in 30 ml eines Minimalmediums (18.5 mM Na ₂ HPO ₄ , 5.7 mM E-H ₂ PO ₄ , 9.3 mM NH ₄ Cl, 2.8 mM MgSO ₄ , 17.1 mM NaCl, 0.033 μg/ml Thiaminhydrochlorid, 1.2 μg/ml Nicotinsäure, 0.003 μg/ml Biotin, 1% Glucose, 25 μg/ml von jeder proteinogenen Aminosäure unter Zusatz von 0,4% BH Bouillon) bei 37°C über Nacht kultiviert, 10 min bei ό.OOOxg abzentrifugiert und in 2 ml phosphat-gepufferter physiologischer NaCl-Lösung resuspendiert (ca. 2xlO ⁹ Keime/ml). 100 μl dieser Zellsuspension bzw. 1:10 und 1:100 Verdünnungen werden auf vorgetrockneten Agarplatten (1.5% Agar, 20% defibriniertes Pferdeblut bzw. 1.5% Agar, 20% Rinderserum in 1/10 Müller-Hinton-Medium verdünnt mit PBS), welche die zu testende erfϊndungsgemäße Verbindung in einer Konzentration entsprechend 5xMHK bzw. 1 OxMHK enthalten, ausplattiert und 48 h bei 37°C bebrütet. Die entstehenden Kolonien (cfu) werden ausgezählt.

Isolierung der Biphenomycin-resistenten S. aureus Stämme RN4220Bi ^R und T17

Der S. aureus Stamm RN4220Bi ^R wird in vitro isoliert. Dazu werden jeweils 100 μl einer S. aureus RN4220 Zellsuspension (ca. 1.2x10 ⁸ cfu/ml) auf einer antibiotikafreien Agarplatte (18.5 mM Na ₂ HPO ₄ , 5.7 mM KH ₂ PO ₄ , 9.3 mM NH ₄ Cl, 2.8 mM MgSO ₄ , 17.1 mM NaCl, 0.033 μg/ml Thiaminhydrochlorid, 1.2 μg/ml Nicotinsäure, 0.003 μg/ml Biotin, 1% Glucose, 25 μg/ml von jeder proteinogenen Aminosäure unter Zusatz von 0.4% BH-Bouillon und 1% Agarose) und einer Agarplatte, die 2 μg/ml Biphenomycin B (1 OxMHK) enthält, ausplattiert und über Nacht bei 37 ⁰ C bebrütet. Während auf der antibiotikafreien Platte ca. IxIO ⁷ Zellen wachsen, wachsen auf der antibiotikahaltigen Platte ca. 100 Kolonien, entsprechend einer Resistenzfrequenz von IxIO ^"5 . Einige der auf der antibiotikahaltigen Platte gewachsenen Kolonien werden auf MHK gegen Biphenomycin B getestet. Eine Kolonie mit einer MHK > 50 μM wird zur weiteren Verwendung ausgewählt und der Stamm mit RN4220Bi ^R bezeichnet.

Der S. aureus Stamm T17 wird in vivo isoliert. CFWl-Mäuse werden mit 4x10^ S. aureus 133 - Zellen pro Maus intraperitoneal infiziert. 0.5 Std. nach der Infektion werden die Tiere mit 50 mg/kg Biphenomycin B intravenös behandelt. Den überlebenden Tieren werden am Tag 3 nach

der Infektion die Nieren entnommen. Nach dem Homogenisieren der Organe werden die Homogenate, wie bei RN4220Bi ^R beschrieben, auf antibiotikafreien und antibiotikahaltigen Agarplatten, ausplattiert und über Nacht bei 37°C bebrütet. Etwa die Hälfte der aus der Niere isolierten Kolonien zeigen ein Wachstum auf den antibiotikahaltigen Platten (2.2xlO ⁶ Kolonien), was die Anreicherung von Biphenomycin B resistenten S. aureus Zellen in der Niere der behandelten Tiere belegt. Ca. 20 dieser Kolonien werden auf MHK gegen Biphenomycin B getestet und eine Kolonie mit einer MHK > 50 μM wird zur Weiterkultivierung ausgewählt und der Stamm mit T17 bezeichnet.

C. Ausführungsbeispiele für pharmazeutische Zusammensetzungen

Die erfϊndungsgemäßen Verbindungen können folgendermaßen in pharmazeutische Zubereitungen überführt werden:

Intravenös applizierbare Lösung:

Zusammensetzung:

1 mg der Verbindung von Beispiel 1, 15 g Polyethylenglykol 400 und 250 g Wasser für Injektionszwecke.

Herstellung:

Die erfindungsgemäße Verbindung wird zusammen mit Polyethylenglykol 400 in dem Wasser unter Rühren gelöst. Die Lösung wird sterilfütriert (Porendurchmesser 0.22 μm) und unter aseptischen Bedingungen in hitzesterilisierte Infusionsflaschen abgefüllt. Diese werden mit Infusionsstopfen und Bördelkappen verschlossen.